2023-700989

特許第７２４４９２２号発明「化学修飾された一本鎖ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチド」の特許異議申立事件について、次のとおり決定する。

結 論 特許第７２４４９２２号の請求項１～２６に係る特許を維持する。

理 由 第１ 手続の経緯 特許第７２４４９２２号の請求項１～２６に係る特許についての出願は、平成２９年８月３１日（パリ条約による優先権主張 ２０１６年９月１日、２０１６年９月２７日、２０１６年１２月１６日、２０１７年２月２４日、２０１７年５月１０日 いずれも（ＧＢ）英国（グレートブリテン及び北アイルランド連合王国））を国際出願日とする出願であって、令和５年３月１４日にその特許権の設定登録がされ、同年３月２３日に特許掲載公報が発行された。その後、その請求項１～２６に係る特許について、同年９月２０日に特許異議申立人 吉川 雅也により特許異議の申立てがされたものである。 第２ 本件発明 特許第７２４４９２２号の請求項１～２６の特許に係る発明（以下、「本件発明１～２６」という。）は、その特許請求の範囲の請求項１～２６に記載された次の事項により特定されるとおりのものである。 「【請求項１】 細胞内の標的ＲＮＡ配列と二本鎖複合体を形成することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を含む、細胞内に存在するＡＤＡＲ酵素による標的ＲＮＡ配列中の標的アデノシンの脱アミノ化のための組成物であって、前記ＡＯＮは、３つの連続したヌクレオチドのセントラルトリプレットを含み、前記標的アデノシンの真向かいのヌクレオチドは、セントラルトリプレットの中央のヌクレオチドであり、前記セントラルトリプレット中の１、２または３個のヌクレオチドは糖修飾および／または塩基修飾を含み、前記ＡＯＮをより安定に、および／または、標的アデノシンの脱アミノ化の誘導をより効果的にし、ただし中央のヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル修飾を有さず、哺乳動物のＡＤＡＲ酵素に結合できる分子内ステム－ループ構造を形成できる部分を含まない、組成物。 【請求項２】 前記細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の組成物。 【請求項３】 前記セントラルトリプレットの２または３個のヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル修飾を有しない、請求項１または２に記載の組成物。 【請求項４】 前記セントラルトリプレットの２または３個のヌクレオチドが２’－Ｏ－アルキル修飾を有しない、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。 【請求項５】 前記セントラルトリプレットの１または２個のヌクレオチドが、イノシンで置換されている、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。 【請求項６】 前記セントラルトリプレットにおける中央のヌクレオチド以外の１または２個のヌクレオチドがイノシンで置換されている、請求項５に記載の組成物。 【請求項７】 前記糖修飾が、デオキシリボース（ＤＮＡ）、アンロック核酸（ＵＮＡ）および２’－フルオロリボースからなる群から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。 【請求項８】 前記ＡＯＮが、ホスホロチオエート、３’－メチレンホスホネート、５’－メチレンホスホネート、３’－ホスホロアミデートおよび２’－５’ホスホジエステルからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシド間連結修飾を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。 【請求項９】 前記ＡＯＮの５’および３’末端の２、３、４、５、または６個の末端ヌクレオチドが、ホスホロチオエート連結で連結している、請求項８に記載の組成物。 【請求項１０】 前記ＡＯＮの前記５’および３’末端の５個の末端ヌクレオチドが、ホスホロチオエート連結で連結している、および／またはロックド核酸（ＬＮＡ）を含む、請求項８に記載の組成物。 【請求項１１】 前記塩基修飾が、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、３－デアザアデノシン、７－デアザアデノシン、７－メチルアデノシン、８－アジドアデノシン、８－メチルアデノシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－メチルシチジン、ピロロシチジン、７－アミノメチル－７－デアザグアノシン、７－デアザグアノシン、７－メチルグアノシン、８－アザ－７－デアザグアノシン、チエノグアノシン、イノシン、４－チオ－ウリジン、５－メトキシウリジン、ジヒドロウリジン、およびシュードウリジンからなる群から選択される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。 【請求項１２】 前記セントラルトリプレットの中央のヌクレオチドが、シチジンまたはウリジンである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。 【請求項１３】 前記ＡＯＮ中の前記セントラルトリプレットの外側の１つまたは複数のヌクレオチドが、ＤＮＡ、２’－Ｏ－メチル基などの２’－Ｏ－アルキル基、２’－Ｏ－ＭＯＥ基、２’－Ｆ基、２’－ＮＨ２基、およびＬＮＡ；またはそれらの組み合わせからなる群から選択される修飾を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。 【請求項１４】 前記ＡＯＮが１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７ヌクレオチドより長く、前記ＡＯＮが１００ヌクレオチドよりも短い、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物。 【請求項１５】 前記ＡＯＮが６０ヌクレオチドよりも短い、請求項１４に記載の組成物。 【請求項１６】 前記ＡＯＮが１８～７０ヌクレオチドを含む、請求項１４に記載の組成物。 【請求項１７】 前記ＡＯＮが１８～６０ヌクレオチドを含む、請求項１４に記載の組成物。 【請求項１８】 前記ＡＯＮが１８～５０ヌクレオチドを含む、請求項１４に記載の組成物。 【請求項１９】 前記標的ＲＮＡ配列が、ＣＦＴＲ、ＣＥＰ２９０、アルファ１－抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）、グアニンヌクレオチド結合タンパク質（ＧＮＡＱ）、もしくはＬＲＲＫ２をコードするか、または前記標的ＲＮＡがＩＤＵＡ遺伝子によってコードされる、請求項１～１８のいずれか一項に記載の組成物。 【請求項２０】 前記標的ＲＮＡ配列が、ｃ．１０９６Ｇ＞Ａ変異を有するＡ１ＡＴをコードするか、または 前記標的ＲＮＡが、ｃ．１２０５Ｇ＞Ａ（Ｗ４０２Ｘ）変異を有するＩＤＵＡ遺伝子によってコードされる、 請求項１９に記載の組成物。 【請求項２１】 請求項１～２０のいずれか一項に記載の組成物であって、医薬的に許容される担体を含み、医薬組成物である、組成物。 【請求項２２】 細胞内の標的ＲＮＡ配列に存在する少なくとも１つの特定の標的アデノシンの脱アミノ化のためのインビトロの方法であって： （ｉ）請求項１～２０のいずれか一項に記載の組成物を前記細胞に提供するステップ； （ｉｉ）前記組成物中の前記ＡＯＮを前記細胞に取り込ませるステップ； （ｉｉｉ）前記ＡＯＮを前記標的ＲＮＡ配列にアニーリングさせるステップ；および （ｉｖ）野生型酵素に見出されるような天然ｄｓＲＮＡ結合ドメインを含む哺乳動物のＡＤＡＲ酵素により、前記標的ＲＮＡ配列中の前記標的アデノシンをイノシンに脱アミノ化させるステップ を含む、方法。 【請求項２３】 （ｖ）前記ＲＮＡ配列中の前記イノシンの存在を同定するステップをさらに含む、請求項２２に記載の方法。 【請求項２４】 前記ステップ（ｖ）が： ａ）前記標的ＲＮＡ配列を配列決定するステップ； ｂ）脱アミノ化によってＵＧＧコドンに編集されたＵＧＡまたはＵＡＧ終止コドン内に前記標的アデノシンが位置する場合、機能的な、伸長した、全長のおよび／または野生型のタンパク質の存在を評価するステップ； ｃ）両方の標的アデノシンの脱アミノ化によってＵＧＧコドンに編集されたＵＡＡ終止コドン内に２つの標的アデノシンが位置する場合、機能的な、伸長した、全長のおよび／または野生型のタンパク質の存在を評価するステップ； ｄ）プレｍＲＮＡのスプライシングが脱アミノ化によって変化したか否かを評価するステップ；または ｅ）機能的読み出しを使用するステップであって、ここで前記脱アミノ化後の前記標的ＲＮＡが、機能的な、全長の、伸長したおよび／または野生型のタンパク質をコードする、ステップ を含む、請求項２３に記載の方法。 【請求項２５】 前記標的ＲＮＡ配列が、ＣＦＴＲ、ＣＥＰ２９０、アルファ１－抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）、グアニンヌクレオチド結合タンパク質（ＧＮＡＱ）、もしくはＬＲＲＫ２をコードするか、または前記標的ＲＮＡが、ＩＤＵＡ遺伝子によってコードされる、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の方法。 【請求項２６】 前記標的ＲＮＡ配列が、ｃ．１０９６Ｇ＞Ａ変異を有するＡ１ＡＴをコードするか、または 前記標的ＲＮＡが、ｃ．１２０５Ｇ＞Ａ（Ｗ４０２Ｘ）変異を有するＩＤＵＡ遺伝子によってコードされる、請求項２５に記載の方法。」 第３ 申立理由の概要及び証拠方法 特許異議申立人が、本件の請求項１～２６に係る特許に対して申し立てた特許異議申立理由の概要及び証拠方法は、次のとおりである。 １ 申立理由の概要 （１）理由１：特許法第２９条第１項第３号（甲第１号証を主引用例とする新規性欠如） 本件発明１～５、１４～１８、２２は、甲第１号証に記載された発明であって、特許法第２９条第１項第３号に該当し、特許を受けることができないものであるから、本件発明１～５、１４～１８、２２に係る特許は、同法第１１３条第２号の規定により取り消すべきものである。 （２）理由２：特許法第２９条第２項（甲第１号証を主引用例とする進歩性欠如） 本件発明１～２６は、甲第１号証に記載された発明及び甲第２～５号証に記載された事項に基いて、当業者が容易に発明をすることができたものであり、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであるから、本件発明１～２６に係る特許は、同法第１１３条第２号の規定により取り消すべきものである。 （３）理由３、４：特許法第３６条第４項第１号、特許法第３６条第６項第１号 本件発明のＡＯＮ中のセントラルトリプレットは、１、２または３個のヌクレオチドに糖修飾および／または塩基修飾を含むことを規定しているが、どのような糖修飾および／または塩基修飾をどの位置に用いれば、ＡＯＮをより安定に、および／または、標的アデノシンの脱アミノ化の誘導をより効果的にできるのか不明であり、任意の修飾ヌクレオシドを任意の位置、組み合わせで使用することは、本件明細書にサポートがなく、当業者といえども実施することは不可能である。 よって、本件発明の詳細な説明は、当業者が、本件発明１～２６の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されたものではない。 したがって、本件発明の詳細な説明は、本件発明１～２６について、特許法第３６条第４項第１号に規定する要件を満たしていないから、本件発明１～２６に係る特許は、同法第１１３条第４号の規定により取り消すべきものである。 また、本件発明１～２６は、発明の詳細な説明に記載されたものではない。 したがって、本件発明１～２６は、特許法第３６条第６項第１号に規定する要件を満たしていないから、本件発明１～２６に係る特許は、同法第１１３条第４号の規定により取り消すべきものである。 ２ 証拠方法 （１）甲第１号証：Angew.Chem.Int.Ed.(2014)Vol.53,p.6267-6271 （２）甲第２号証：Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)Vol.92,p.8298-8302 （３）甲第３号証：米国特許第９６５０６２７号明細書 （４）甲第４号証：Genes Cells(2015)Vol.20,No.10,p.834-846 （５）甲第５号証：国際公開第２０１６／０９７２１２号 第４ 甲号証の記載 甲第１号証～甲第５号証には、以下の事項が記載されている（英語で記載されている証拠は、日本語訳で摘記する。下線は合議体による。）。 １ 甲第１号証：Angew.Chem.Int.Ed.(2014)Vol.53,p.6267-6271 （甲１－１）「ＲＮＡ編集を指示するために、我々は、タンパク質誘導ヒトＡＤＡＲ１（ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ）を、そのＣ末端触媒ドメインをＳＮＡＰタグに融合させることにより、ガイドＲＮＡ依存性酵素に設計した（スキーム１）［２］。ＳＮＡＰタグ［３］により、５’末端にＯ６－ベンジルグアニン（ＢＧ）修飾を有するガイドＲＮＡとの完全に１対１に規定されたコンジュゲートの形成が可能になる。」（第６２６７頁左欄下から第１３行～第７行） （甲１－２）「２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－フッ素、ＬＮＡなどの様々な修飾が報告されている。」（第６２６８頁左欄第１６行～第１８行） （甲１－３）「ＢＧ－ガイドＲＮＡ依存のＡ－ｔｏ－Ｉ ＲＮＡ編集における２’－Ｏ－メチル基の受け入れを試験するために、我々は、我々の最適化された１７ｎｔガイドＲＮＡを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ［２］において、ナンセンスＳｔｏｐ６６ ｅＣＦＰｍＲＮＡに対する、そのような修飾の影響を体系的に研究した。予想されるように、ｅＣＦＰｍＲＮＡ基質の編集は、標的アデノシンの反対塩基を中心として３つの２’－メトキシ基を有するガイドＲＮＡを含むタンパク質－ＲＮＡコンジュゲートによって完全に阻害された（図１Ｂ対１Ａ）。高密度に修飾された核酸類似体がＲＮＡ編集を阻害することは、以前に示されていた［１６］。しかし、標的アデノシンの反対塩基のみを１つの２’－メトキシ基で修飾すると、完全ではなく、およそ５０％の阻害が得られた（図１Ｃ）。とりわけ、当該反対塩基から１ヌクレオチド上流または下流の単一の修飾は、全体的な編集収量にほとんど影響を与えないが、ごくわずかしか影響を与えなかった（図１Ｄ、Ｅ）。したがって、完全な阻害は、いくつかの近接した２’修飾の協調的な作用によってのみ達成できる。」（第６２６８頁左欄第２７行～第４４行） （甲１－４）「 ［図：0001407855000001.jpg］ 図１．ｅＣＦＰｍＲＮＡにおけるＳｔｏｐ６６コドンの編集に対する化学修飾ガイドＲＮＡの影響（ｍＲＮＡ 黒；ガイドＲＮＡ グレー；標的アデノシンはアスタリスクでマークされている；２’－Ｏ－メチル修飾塩基は、赤の小文字で表され、ホスホロチオエート連結は、緑の「ｓ」で表される。）編集収量は、ＳＮＡＰ－ＡＤＡＲ１（左）およびＳＮＡＰ－ＡＤＡＲ２（右）を使用したそれぞれのシーケンストレースにおけるアデノシン（赤）とグアノシン（青）の面積から推定される。」（図１） （甲１－５）「そのアプローチをさらに説明するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内におけるＣＭＶプロモーターの制御下でＳＮＡＰｆ－ＡＤＡＲ１と蛍光レポーター遺伝子を一過的に発現させ、ガイドＲＮＡのトランスフェクションにより転写修飾を刺激した。このために、ＳＮＡＰｆ－ＡＤＡＲ１とＳｔｏｐ６６ ｅＣＦＰをｐｃＤＮＡ３．１ベクターにサブクローニングした。野生型（Ｔｒｐ６６）ｅＣＦＰは、陽性対照として機能した。両方のプラスミドの１対１の比率での同時トランスフェクションは、２４ウェル形式のリポフェクタミン２０００で達成された。２４時間後、トランスフェクトされた細胞をトリプシンで剥がし、９６ウェルプレートのいくつかのウェルに均等に分配し、２４時間インキュベートしてから、様々なガイドＲＮＡ（ウェルほとに１５０ｍＬにおける５０ｐＭｏｌ）でリポフェクションを行った。インキュベーションの１日後、蛍光表現型を顕微鏡で分析した。 陽性対照（図２Ａ）は、はっきりと見える蛍光シグナルを与えたのに対し、非機能的Ｓｔｏｐ６６ ｅＣＦＰがＳＮＡＰｆ－ＡＤＡＲ１またはＢＧ修飾ａｎｔａｇｏｍｉｒ様ガイドＲＮＡのみの存在下でトランスフェクトされた場合、蛍光は観察されなかった（図２Ｂ、Ｃ）詳細なコントロールについては、図Ｓ６を参照されたい。対照的に、Ｓｔｏｐ６６ ｅＣＦＰをＳＮＡＰｆ－ＡＤＡＲ１と共発現させ、続いて２’－メトキシおよびホスホロチオエート修飾を欠く我々の標準ＢＧ修飾ガイドＲＮＡでトランスフェクトした場合、ＣＦＰ蛍光が検出可能であった（図２Ｄ）。しかし、陽性対照と比較して明るい蛍光を発する細胞の数は少なかった。さらなる化学修飾の効果を推定するために、Ｓｔｏｐ６６ ｅＣＦＰ／ＳＮＡＰｆ－ＡＤＡＲ１共発現細胞にＢＧ修飾ａｎｔａｇｏｍｉｒ様ガイドＲＮＡをトランスフェクトした。標準的なガイドＲＮＡ（図２Ｄ）と比較して、化学的に安定化されたガイドＲＮＡは蛍光細胞の数が著しく増加し（図１Ｅ）、細胞環境における化学修飾の期待される有益な効果を明確に示している。」（第６２６８頁右欄第９行～第６２６９頁右欄第３行） （甲１－６）「 ［図：0001407855000002.jpg］ 図２．２９３Ｔ細胞内における指示されたＲＮＡ編集。細胞に等量のレポーター遺伝子（Ｓｔｏｐ６６ ｅＣＦＰまたは野生型）とＳＮＡＰｆ－ＡＤＡＲ１（または空のｐｃＤＮＡ３．１）を同時にトランスフェクションした。２４時間後にガイドＲＮＡをトランスフェクトし、２４時間後に蛍光表現型を蛍光顕微鏡で分析した。）ポジティブコントロール（ＢＧ－ａｎｔａｇｏｍｉｒガイドＲＮＡおよびＳＮＡＰｆ－ＡＤＡＲ１を含むｅＣＦＰ）；Ｂ）ネガティブコントロール１（Ｓｔｏｐ６６ ｅＣＦＰ／空のｐｃＤＮＡ３．１／ＢＧ－ａｎｔａｇｏｍｉｒガイドＲＮＡ）；Ｃ）ネガティブコントロール２（Ｓｔｏｐ６６ ｅＣＦＰ／ＳＮＡＰｆ－ＡＤＡＲ１／ガイドＲＮＡなし）；Ｄ）－Ｇ）Ｓｔｏｐ６６ ｅＣＦＰ／ＳＮＡＰｆ－ＡＤＡＲ１および様々なガイドＲＮＡを使用した実験：Ｄ）標準ＢＧガイドＲＮＡ；Ｅ）ＢＧ－ａｎｔａｇｏｍｉｒガイドＲＮＡ；Ｆ）標準ＮＨ２－ガイドＲＮＡ；Ｇ）ＮＨ２－ａｎｔａｇｏｍｉｒガイドＲＮＡ。スケールバーは２００mmを表す。Ｈ）実験（Ｅ）のように処理された細胞から抽出されたＲＮＡのサンガーシーケンス。細胞培養の詳細については、補足情報を参照されたい。」（図２） （甲１－７）「５’－ＢＧ修飾したガイドＲＮＡの代わりに５’－アミノ（ＮＨ２）修飾したガイドＲＮＡを適用すると、通常、インビトロ編集条件に応じて編集活性が低下するか、さらには消滅する。［２］」（第６２６９頁右欄第６行～第９行） （甲１－８）「要約すると、我々は、ＲＮＡ修復のための合理的なアプローチとしての部位特異的ＲＮＡ編集の強度と適用可能性を実証した。化学修飾は、過剰反応を抑制し、選択性を操作するための信頼できる手段であることが判明した。重要なことに、３つの非修飾リボヌクレオチドの小さなギャップが維持される限り、全体的な２’－メトキシおよび末端のホスホロチオエート基を含む大規模な化学修飾でさえ十分に受け入れられることを見出した。さらに、我々は、細胞内のツールの機能を実証した。我々の知る限り、これは、生きた細胞内での酵素的に活性な共有結合性タンパク質核酸（類似体）コンジュゲートのアセンブリの最初の例であり、一般的に、タンパク質アレイの空間的または時間的に制御されたアセンブリのための魅力的な戦略を表しうる［２１］。ＭＳ２またはλＮファージシステムを使用したタンパク質－ＲＮＡ認識をアセンブリに適用する競合する戦略とは対照的に［２２、２１］、我々のガイドＲＮＡは特に短く（２０ｎｔ）、認識とスペーシングに必要であり、他のガイドＲＮＡを長さ６０ｎｔにする［２２］、追加のＢｏｘＢＲＮＡヘアピン（１９ｎｔ）とリンカー（１０－２０ｎｔ）モチーフを欠いている。我々の安定化された２０ｎｔの短いガイドＲＮＡは、トランスフェクションに特に適しており、免疫応答を誘発するには小さすぎると考えられている［７ー１５］。ガイドＲＮＡを発現させる代わりにトランスフェクトする必要性は、光活性化などの追加の制御の層を我々のプローブに与える化学修飾をさらに導入することを検討することを我々に奨励する。我々の知見は、基礎生物学の研究と医学におけるｉｎ ｖｉｖｏでの応用のための指示されたＲＮＡ編集の見通しを劇的に改善する。このことには、ｈＡＤＡＲ１からのＳＮＡＰ融合タンパク質のデアミナーゼドメインを、ｈＡＤＡＲ２のものに交換し、ガイドＲＮＡを慎重に化学修飾して、その非常に困難なアデノシンリッチシーケンスコンテキストにおいてコドンをターゲットにする必要があった。ＳＮＡＰ－デアミナーゼの高いモジュール性と、化学修飾に対するその有用な耐性との組み合わせは、部位特異的ＲＮＡ修復に対するこのアプローチの可能性を強調している。」（第６２７０頁右欄第１９行～最終行） ２ 甲第２号証：Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)Vol.92,p.8298-8302 （甲２－１）「治療への応用のためには、修正を行うＲＮＡオリゴヌクレオチドがヌクレアーゼに対して安定されている必要がある。そこで、我々は、ヌクレアーゼ耐性である修正ＲＮＡオリゴヌクレオチドについて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで復帰活性を調べた。」（第８３００頁右欄第２４行～第２７行） ３ 甲第３号証：米国特許第９６５０６２７号明細書 （甲３－１）「ヌクレオシドへの化学修飾は、塩基または糖のいずれかに導入できる。リボヌクレオシドの代わりにデオキシヌクレオチドを使用することができる。」（第６欄第１７行～第１９行） ４ 甲第４号証：Genes Cells(2015)Vol.20,No.10,p.834-846 （甲４－１）「 ［図：0001407855000003.jpg］ 」（図１） （甲４－２）「 ［図：0001407855000004.jpg］ 」（図２） ５ 甲第５号証：国際公開第２０１６／０９７２１２号 （甲５－１）「編集特異性 オリゴヌクレオチドコンストラクトとの重なりの領域における標的ＲＮＡ配列中のアデノシンの望ましくない編集を防ぐために、オリゴヌクレオチドコンストラクトのターゲティング部分を、化学的に修飾してもよい。標的ＲＮＡ配列中のアデノシンに向かい合ったヌクレオシドのリボシル－部分の２’－Ｏ－メチル化が、ＡＤＡＲによるそのアデノシンの脱アミノ化を劇的に低減することが、当該技術分野において示されている（Vogel et al. 2014 Angewandte Chemie Int. Ed. 53, 6267-71）。故に、オリゴヌクレオチドコンストラクトの所望の位置に２’－メトキシ（２’－ＯＭｅ）ヌクレオチドを含むことにより、編集の特異性が、劇的に改善されてもよい。２’－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）および２’－Ｏ－ジメチルアリル基のような、リボシル部分の他の２’－Ｏ置換が、標的ＲＮＡ配列中の対応する（向かい合った）アデノシンの望まない編集も低減し得ることが予想される。他の化学修飾は、オリゴヌクレオチド合成および設計の当業者にとって容易に入手可能である。かかる化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドコンストラクトの合成、およびそれを本発明による方法において試験することは、不当な負担をもたらさず、他の修飾は、本発明により包含される。」（第１６頁第１行～第１５行） （甲５－２）「両方のターゲティング部分およびリクルート部分は、ヌクレアーゼ抵抗性を変更し、結合の親和性（融点として表される）または他の特性を変更する化学修飾を有するヌクレオチドを含むか、またはからなってもよい。化学修飾の例は、上で特定された長さを有する、糖（リボース）部分内の架橋結合している置換基（例えば、ＬＮＡ、または固定した核酸などで）によるもの、２’－Ｏ原子のアルキル基での置換（例えば、２’－Ｏ－メチル）、アルキニル基での置換（２’－Ｏ－アルキニル）、アルケニル基での置換（２’－Ｏ－アルケニル）、アルコキシアルキル基での置換（例えば、メトキシエチル、２’－ＭＯＥ）によるものを含む、糖部分の修飾である。加えて、骨格のホスホジエステル基を、チオエート化、ジチオエート化、アミド化などにより修飾して、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミダートなどのヌクレオシド間結合を生じてもよい。ヌクレオチド間結合を、ペプチド性結合により、完全または一部置き換えて、ペプチド核酸配列などとしてもよい。あるいは、または加えて、核酸塩基を、（脱）アミノ化により修飾して、イノシン、または２’６’－ジアミノプリンなどを生じてもよい。」（第１７頁第９行～第２１行） 第５ 当審の判断 １ 特許法第２９条第１項第３号（甲第１号証を主引用例とする新規性欠如）について （１）本件発明１について ア．甲第１号証に記載された発明 上記記載事項（甲１－１）から、上記記載事項（甲１－４）中の図１Ｄ）のガイドＲＮＡは、５’－ＢＧ－ＧＡＡＣＡＣＣｃＣＡＧＣＡＣＡＧＡで表されるガイドＲＮＡであり、上記記載事項（甲１－４）中の図１Ｅ）のガイドＲＮＡは、５’－ＢＧ－ＧＡＡＣＡＣＣＣＣａＧＣＡＣＡＧＡで表されるガイドＲＮＡ（下線は、標的アデノシンの真向かいのヌクレオチド）であると認められる。 そうすると、上記記載事項（甲１－１）、（甲１－３）～（甲１－４）から、甲第１号証には、「ＡＤＡＲ酵素による標的ＲＮＡ配列中の標的アデノシンの脱アミノ化のための、細胞内の標的ＲＮＡ配列と二本鎖複合体を形成することができるガイドＲＮＡであって、 ５’－ＢＧ－ＧＡＡＣＡＣＣｃＣＡＧＣＡＣＡＧＡ または、 ５’－ＢＧ－ＧＡＡＣＡＣＣＣＣａＧＣＡＣＡＧＡ で表されるガイドＲＮＡ（下線は、標的アデノシンの真向かいのヌクレオチド）。」の発明が記載されていると認められる。 イ．本件発明１と甲第１号証に記載された発明の対比 本件発明１と甲第１号証に記載された発明を対比すると、甲第１号証に記載された発明の「ガイドＲＮＡ」は、本件発明１の「ＡＯＮ」に相当する。 甲第１号証に記載されているガイドＲＮＡは、３つの連続したヌクレオチドのセントラルトリプレットを含み、標的アデノシンの真向かいのヌクレオチドは、セントラルトリプレットの中央のヌクレオチドであることは明らかであり（上記記載事項（甲１－４））、また、標的アデノシンの真向かいのヌクレオチドが、シチジンであり、その５’側または３’側のヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル修飾塩基である（上記記載事項（甲１－４））から、セントラルトリプレット中の１、２または３個のヌクレオチドは糖修飾および／または塩基修飾を含み、中央のヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル修飾を有さないものである。 そして、甲第１号証に記載されているガイドＲＮＡは、哺乳動物のＡＤＡＲ酵素に結合できる分子内ステム－ループ構造を形成できる部分を含まないことは明らかである（上記記載事項（甲１－４））。 そうすると、本件発明１と甲第１号証に記載された発明は、「細胞内の標的ＲＮＡ配列と二本鎖複合体を形成することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を含む、ＡＤＡＲ酵素による標的ＲＮＡ配列中の標的アデノシンの脱アミノ化のための組成物であって、前記ＡＯＮは、３つの連続したヌクレオチドのセントラルトリプレットを含み、前記標的アデノシンの真向かいのヌクレオチドは、セントラルトリプレットの中央のヌクレオチドであり、前記セントラルトリプレット中の１、２または３個のヌクレオチドは糖修飾および／または塩基修飾を含み、ただし中央のヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル修飾を有さず、哺乳動物のＡＤＡＲ酵素に結合できる分子内ステム－ループ構造を形成できる部分を含まない、組成物。」に係る発明である点で一致し、以下の点で相違する。 （相違点１）標的ＲＮＡ配列中の標的アデノシンの脱アミノ化のための組成物が、本件発明１は、細胞内に存在するＡＤＡＲ酵素によるのに対し、甲第１号証に記載された発明は、そのような特定はされていない点。 （相違点２）本件発明１は、ＡＯＮをより安定に、および／または、標的アデノシンの脱アミノ化の誘導をより効果的にするのに対し、甲第１号証に記載された発明は、そのような特定はされていない点。 ウ．相違点についての検討 相違点１について検討する。 上記記載事項（甲１－１）、（甲１－３）～（甲１－８）から、甲第１号証に記載されているガイドＲＮＡは、５’末端にＯ６－ベンジルグアニン（ＢＧ）修飾を有することを必須としており、ＡＤＡＲ酵素のＣ末端触媒ドメインをＳＮＡＰタグに融合させた融合タンパク質とのコンジュゲートにより、ＲＮＡ編集が可能になるものである。 そして、その「ＡＤＡＲ酵素のＣ末端触媒ドメインをＳＮＡＰタグに融合させた融合タンパク質」は、遺伝子組換えにより発現させたものであり（上記記載事項（甲１－１）、（甲１－５）～（甲１－６））、「細胞内に存在するＡＤＡＲ酵素」であるとはいえないから、甲第１号証には、「細胞内に存在するＡＤＡＲ酵素による標的ＲＮＡ配列中の標的アデノシンの脱アミノ化のための組成物」が記載されているとはいえない。 したがって、本件発明１は、相違点２について検討するまでもなく、甲第１号証に記載された発明であるとはいえない。 （２）本件発明２～５、１４～１８、２２について 本件発明２～５、１４～１８、２２は、本件発明１の発明特定事項と同様の発明特定事項を含むものであり、本件発明１と同様の理由により、甲第１号証に記載された発明であるとはいえない。 （３）まとめ 以上のとおり、本件発明１～５、１４～１８、２２は、甲第１号証に記載された発明であるとはいえないから、特許法第２９条第１項第３号に該当し、特許を受けることができない、とすることはできない。 ２ 特許法第２９条第２項（甲第１号証を主引用例とする進歩性欠如）について （１）本件発明１について 上記１（１）イ．で述べたように、本件発明１と甲第１号証に記載された発明は、「細胞内の標的ＲＮＡ配列と二本鎖複合体を形成することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を含む、ＡＤＡＲ酵素による標的ＲＮＡ配列中の標的アデノシンの脱アミノ化のための組成物であって、前記ＡＯＮは、３つの連続したヌクレオチドのセントラルトリプレットを含み、前記標的アデノシンの真向かいのヌクレオチドは、セントラルトリプレットの中央のヌクレオチドであり、前記セントラルトリプレット中の１、２または３個のヌクレオチドは糖修飾および／または塩基修飾を含み、ただし中央のヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル修飾を有さず、哺乳動物のＡＤＡＲ酵素に結合できる分子内ステム－ループ構造を形成できる部分を含まない、組成物。」に係る発明である点で一致し、以下の点で相違する。 （相違点１）標的ＲＮＡ配列中の標的アデノシンの脱アミノ化のための組成物が、本件発明１は、細胞内に存在するＡＤＡＲ酵素によるのに対し、甲第１号証に記載された発明は、そのような特定はされていない点。 （相違点２）本件発明１は、ＡＯＮをより安定に、および／または、標的アデノシンの脱アミノ化の誘導をより効果的にするのに対し、甲第１号証に記載された発明は、そのような特定はされていない点。 相違点１について検討する。 上記記載事項（甲１－１）、（甲１－３）～（甲１－８）から、甲第１号証に記載されているガイドＲＮＡは、５’末端にＯ６－ベンジルグアニン（ＢＧ）修飾を有することを必須としており、ＡＤＡＲ酵素のＣ末端触媒ドメインをＳＮＡＰタグに融合させた融合タンパク質とのコンジュゲートにより、ＲＮＡ編集が可能になるものである。 そして、上記記載事項（甲１－７）の「５’－ＢＧ修飾したガイドＲＮＡの代わりに５’－アミノ（ＮＨ２）修飾したガイドＲＮＡを適用すると、通常、インビトロ編集条件に応じて編集活性が低下するか、さらには消滅する。」という記載は、ＡＤＡＲ酵素とコンジュゲートできない場合には、編集活性が低下するか消滅することを意味しており、「ＡＤＡＲ酵素のＣ末端触媒ドメインをＳＮＡＰタグに融合させた融合タンパク質」の代わりに、「細胞内に存在するＡＤＡＲ酵素」を使用することを妨げる記載であり、また、甲第１号証には、「ＡＤＡＲ酵素のＣ末端触媒ドメインをＳＮＡＰタグに融合させた融合タンパク質」の代わりに、「細胞内に存在するＡＤＡＲ酵素」を使用することを動機付ける記載はないから、甲第１号証に記載された発明において、「細胞内に存在するＡＤＡＲ酵素」を使用することは、当業者が容易に想到し得ることとはいえない。 したがって、本件発明１は、相違点２について検討するまでもなく、甲第１号証に記載された発明に基いて、当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえない。 また、甲第２～５号証に記載された事項を参照しても、甲第１号証に記載された発明において、「細胞内に存在するＡＤＡＲ酵素」を使用することは、当業者が容易に想到し得ることとはいえない。 したがって、本件発明１は、相違点２について検討するまでもなく、甲第１号証に記載された発明及び甲第２～５号証に記載された事項に基いて、当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえない。 （２）本件発明２～２６について 本件発明２～２６は、本件発明１の発明特定事項と同様の発明特定事項を含むものであり、本件発明１と同様の理由により、甲第１号証に記載された発明及び甲第２～５号証に記載された事項に基いて、当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえない。 （３）まとめ 以上のとおり、本件発明１～２６は、甲第１号証に記載された発明及び甲第２～５号証に記載された事項に基いて、当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえないから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない、とすることはできない。 ３ 特許法第３６条第４項第１号、特許法第３６条第６項第１号について （１）本件明細書に記載された事項 本件明細書の発明の詳細な説明には、以下の事項が記載されている（下線は合議体による。）。 ア．「【００８４】 図１、２および４に例示されるように、セントラルトリプレットはＹＸＺまたはＸＸＹとして表される。異なる塩基修飾が提供される。当業者は、これらの塩基修飾がセントラルトリプレット内のヌクレオチドと反対側のヌクレオチドに、ある程度依存することを理解している。したがって、Ｘが標的アデノシンの反対側の中央のヌクレオチドであるＹＸＺの例では、Ｘはシチジン、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、ウリジン、またはピロロシチジンであり得るが、Ｙおよび／またはＺは、セントラルトリプレットの反対側のヌクレオチドに応じて、イノシン、５－メチルシチジン、ピロロシチジン、シュードウリジン、４－チオウリジン、チエノウリジン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、チエノグアノシン、５－メトキシウリジン、ジヒドロウリジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－メチルウリジン、８－アザ－７－デアザグアノシン、７－アミノメチル－７－デアザグアノシン、７－メチルアデノシン、８－メチルアデノシン、３－デアザアデノシン、７－デアザアデノシン、８－アジドアデノシンなどであり得：それゆえ、標的ＲＮＡ配列およびそれに関連する疾患に依存する。ゆえに、好ましい実施形態では、前記塩基修飾は、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、３－デアザアデノシン、７－デアザアデノシン、７－メチルアデノシン、８－アジドアデノシン、８－メチルアデノシン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－メチルシチジン、ピロロシチジン、７－アミノメチル－７－デアザグアノシン、７－デアザグアノシン、７－メチルグアノシン、８－アザ－７－デアザグアノシン、チエノグアノシン、イノシン、４－チオ－ウリジン、５－メトキシウリジン、５－メチルウリジン、ジヒドロウリジン、シュードウリジン、およびチエノウリジンからなる群から選択される。 【００８５】 別の好ましい実施形態では、糖修飾はデオキシリボース（すなわちＤＮＡ）、アンロック核酸（ＵＮＡ）および２’－フルオロリボースからなる群から選択される。特に好ましい態様において、本発明は、３個の連続したヌクレオチドのセントラルトリプレットを含むＡＯＮに関し、標的アデノシンの真向かいのヌクレオチドがセントラルトリプレットの中央のヌクレオチドであり、そして前記セントラルトリプレット中の１個、好ましくは２個、さらに好ましくは、３個全てのヌクレオチドは、標的アデノシンの脱アミノ化の誘導において、ＡＯＮをより安定におよび／またはより効果的にするためのＤＮＡヌクレオチドである。別の好ましい態様では、ＡＯＮの残りの部分は、好ましくは（必ずしもそうとは限らないが）２’－Ｏ－メチル修飾されているＲＮＡヌクレオチドからなる。セントラルトリプレットの外側で他の安定化修飾を用いてもよい。本発明による標的編集と完全に互換性のある他のリボース修飾は、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、ＬＮＡ、２’－Ｆおよび２’－ＮＨ２である。セントラルトリプレットの外側のヌクレオチドの糖修飾（本明細書中に列挙されるような）の異なる組み合わせが適用され得る。」（【００８４】～【００８５】） イ．「【０１００】 [実施例１] 安定性を高めるためのヒトＳＥＲＰＩＮＡ１ ＲＮＡを標的とするＡＯＮの化学修飾 未公開特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５４６７は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）の使用による標的化ＡからＩへの編集のための方法を記載している。これらのＡＯＮ中のほとんどのヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル化ＲＮＡであり、ホスホロチオエート連結を有するが、それらはＡＯＮの部分に、標的アデノシンの真向かいの中央のヌクレオチドおよびその２つの隣接ヌクレオチドと共に、いくつか、通常３個の未修飾ＲＮＡヌクレオチド（「セントラルトリプレット」）を含む。これは、セントラルトリプレットのヌクレオチドが２’－Ｏ－メチル化されているとＡ－ｔｏ－Ｉ編集が強く抑制されることが以前に示されていたためである（Vogelら、2014）。しかしながら、修飾されていないＲＮＡヌクレオチドを含むＡＯＮは、これらの位置の残基を加水分解することができるヌクレアーゼのために本質的に生物学的に不安定である。これは、例えば治療薬としてＡＯＮを効率的に使用するためには、それらは標的に到達する前に分解され得るため、不利益となり得る。 【０１０１】 本発明の発明者らは、セントラルトリプレットでの未修飾ＲＮＡヌクレオチドを有するＡＯＮの安定性と、２’－Ｏ－メチル化以外の化学修飾を使用することによってそのようなＡＯＮの安定性を高めることができるか否かについて調べた。 【０１０２】 まず、非限定的な例として、ＲＮＡ編集のために選択された標的は、Ａ１ＡＴ欠損症（Ａ１ＡＴＤ）の原因となるＳＥＲＰＩＮＡ１ ＲＮＡ中のｃ．１０９６Ｇ＞Ａ変異である。Ａ１ＡＴＤは、本明細書に概説したような手法を用いたＲＮＡ編集のための疾患標的の一例である。図１ＡおよびＢでは、ＳＥＲＰＩＮＡ１標的に対する例示的なＡＯＮの相補性が概略的に示されている。標的配列に対するＡＤＡＲ６０－１の相補性を図１Ａに示し、ＡＤＡＲ６０シリーズのセントラルトリプレット（５’－ＹＸＺ－３’）を図１Ｂに示す。骨格およびセントラルトリプレットのヌクレオチドの塩基に様々な修飾を有する変異体ＲＮＡを標的とするいくつかのＡＯＮを、１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む細胞培養培地（ＭＥＭ）中でそれらを＋３７℃で３０分間（ＲＸ）インキュベートすることによって安定性を試験した。陰性対照として、ＡＯＮをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ＣＴＬ）中でインキュベートした。次に試料を変性ポリアクリルアミドゲル（８Ｍ尿素を含む１５％ＰＡＧＥゲル）で分離し、続いてこれをトルイジンブルーで染色してＡＯＮおよびその断片を可視化した。そのＡＯＮをそれぞれの配列およびそれらの修飾と共に図２に示す。図３の３つのパネルは、ＡＤＡＲ６０シリーズのＡＯＮを使用した安定性アッセイの結果を示している。修飾されていない５’－ＵＣＧ－３’ ＲＮＡセントラルトリプレットを含むＡＤＡＲ６０－１は、ＦＢＳの存在下で３０分以内に効率的に切断（～分解）される（およそ５０％まで）。対照緩衝液中でＡＯＮをインキュベートした場合、いくらかの分解はさらに明らかである。３つのＲＮＡヌクレオチドの位置がシフトしても、分解速度は低下しない（ＡＤＡＲ６０－３）。重要なことに、未修飾ＲＮＡヌクレオチドの数を（３個の代わりに）２個に減らすと、分解が減少する（ＡＤＡＲ６０－２）。ここで陰性対照として働く完全な２’－Ｏ－メチル化ＡＯＮは、セントラルトリプレットがＤＮＡヌクレオチドに変更されたＡＯＮ（ＡＤＡＲ６０－６）のように、これらの条件下で安定している（ＡＤＡＲ６０－４）。これは少なくとも、セントラルトリプレットが２’－Ｏ－メチル化されていない場合、ＡＯＮは分解される傾向があり、セントラルトリプレットに少なくとも１つの２’－Ｏ－メチル化ヌクレオチドを付加すること、またはセントラルトリプレット全体をＤＮＡヌクレオチドに修正することによりそれを解決することができることを示している。セントラルトリプレットの３つの位置のうち２つの位置における他の糖の修飾、ロック解除核酸（ＵＮＡ）によるＲＮＡの置換は安定性の増加をもたらし（ＡＤＡＲ６０－８）、さらにトリプレットの中位における塩基修飾５－メチルシトシンと組み合わせるとさらに安定になる（ＡＤＡＲ６０－９）。セントラルトリプレットの最初の位置の後に１つのホスホロチオエート連結を含んでいても（５’－Ｕ＊ＣＧ－３、星印はホスホロチオエート連結を表す）、安定性はそれほど向上しない（ＡＤＡＲ６０－５）。ホスホロチオエート連結の数の増加に向けたさらなる実験については、下記の実施例２を参照。 【０１０３】 また、グアノシンをイノシンで置き換えると、分解が著しく減少する（ＡＤＡＲ６０－１０）。この修飾をシチジンの５－メチルシチジンについての置き換え（ＡＤＡＲ６０－１１）と組み合わせると、安定性は維持され、両方の修飾をウリジンのシュードウリジンについての置き換えと組み合わせると（ＡＤＡＲ６０－１２）さらに向上する。 【０１０４】 セントラルトリプレットの３つの全てのヌクレオチドを修飾ヌクレオチドで置き換えると、安定性に最大の効果があるように見えた。各位置における精密な修飾は変えることができ、これはＡＯＮの安定性に大きく影響する。ＡＤＡＲ６０－１２以外のＡＯＮでは、シュードウリジンを４－チオウリジンで置換したもの（ＡＤＡＲ６０－１３）または２，６－ジアミノプリンで置換したもの（ＡＤＡＲ６０－１６）は、同等の安定性のＡＯＮが得られるが、対照的に５－メチルウリジン（ＡＤＡＲ６０－１４）は安定性を減少させ、チエノウリジン（ＡＤＡＲ６０－１５）は、未修飾ＲＮＡトリプレットを使用した場合よりもさらに、ＡＯＮをほぼ完全に分解させる。 【０１０５】 セントラルトリプレットの中央のＣをピロロシチジンで置換すると、５－メチルシチジンよりもさらに有意に安定化される：ピロロシチジンおよびイノシンを有するＡＯＮは、トリプレットの最初の位置にシュードウリジンまたは未修飾ウリジンを含むか否かにかかわらず、これらの条件下でほぼ完全に安定である（それぞれＡＤＡＲ６０－１８とＡＤＡＲ６０－１７）。この場合も、ウリジンをチエノウリジン（ＡＤＡＲ６０－１９）で置き換えると安定性が減少するが、ＡＤＡＲ６０－１５と同程度ではない。 【０１０６】 セントラルトリプレットの他の２つの位置と同様に、最後の位置も安定化を達成するために異なる塩基修飾で修飾することができる。ここでは、イノシンの代わりに、チエノグアノシンをシュードウリジンおよび５－メチルシチジンまたはピロロシチジン（それぞれＡＤＡＲ６０－２０およびＡＤＡＲ６０－２１）と組み合わせて使用した。両方のＡＯＮはこれらの条件下で完全に安定している；チエノグアノシンによる安定性の向上は、他の点では類似のＡＤＡＲ６０－１２およびＡＤＡＲ６０－２０と比較すると顕著である。 【０１０７】 安定化を増大させるための同様の効果を達成するためのさらなる組み合わせとしては、例えば、グアノシンについては７－メチルグアノシン、７－デアザグアノシン、８－アザ－７－デアザグアノシン、または７－アミノメチル－７－デアザグアノシン（それぞれＡＤＡＲ６０－２９、－３０、－３１および－３２参照）、またはシチジンについては５－ヒドロキシメチルシトシン（ＡＤＡＲ６０－２８を参照）、またはウリジンでは５－メトキシウリジンまたはジヒドロウリジン（それぞれＡＤＡＲ６０－２６および－２７を参照）の置き換えが考えられる。２’－フルオロ、３’－メチレンホスホネート、５’－メチレンホスホネート、３’－ホスホロアミデート、または２’－５’ホスホジエステル修飾（２’－５’骨格連結；それぞれＡＤＡＲ６０－７、－２２、－２３、－２４、および－２５を参照）を含むセントラルトリプレットの糖および骨格修飾によっても安定化が達成された。 【０１０８】 この実施例に示された結果は、全ての修飾がＲＮＡ編集アンチセンスオリゴヌクレオチドの分解を減少させるのに有用であるとは限らないが多くの修飾により安定性が実際に増すこと、そしてセントラルトリプレット内およびおそらくその周辺の修飾は慎重に選択されるべきであることを示す。セントラルトリプレットのヌクレオチドを特定の化学的性質で修飾すると、オリゴヌクレオチドの安定性が確実に高まる。全体として、この実施例に提示された結果は、セントラルトリプレットにおけるヌクレオチドの（の組み合わせ）修飾が安定性を改善させることができ、一度にいくつかの塩基の修飾が徐々に安定化をもたらすことを示す。」（【０１００】～【０１０８】） ウ．「【０１０９】 [実施例２] 安定性を高めるためのマウスＩｄｕａ ＲＮＡを標的とするＡＯＮにおけるホスホロチオエート連結 前の例では、セントラルトリプレット内の最初の位置の後に１つのホスホロチオエート連結を含ませても、安定性はそれほど向上しないことが示された（図３Ａ；ＡＤＡＲ６０－５）。これをより深く調査するために、セントラルトリプレット領域内により多くのホスホロチオエート連結を含むことがなおも影響を及ぼしそして安定性を高めることができるか否かを試験した。 【０１１０】 このために、本発明の発明者らは、ヒトにおいてＩＤＵＡ遺伝子のｃ．１２０５Ｇ＞Ａ（Ｗ４０２Ｘ）変異によって引き起こされる、ムコ多糖症Ｉ型－ハーラー（mucopolysaccharidosis type I-Hurler；ＭＰＳ Ｉ－Ｈ）としても知られるモデル系としてハーラー症候群（Hurler syndrome）を選択した。変異ヒト遺伝子の標的配列は５’－ＵＡＧ－３’（中位に標的Ａ、図４Ａ参照）であり、そしてＡＯＮのセントラルトリプレットは５’－ＣＣＡ－３’（中央のミスマッチＣを含む；５’－ＸＸＹ－３’表記については図４Ｂを参照）または５’－ＣＵＡ－３’であろう。この変異についてのマウスモデルも存在し（Ｗ３９２Ｘ）、そこではＩｄｕａ遺伝子が変異している。Ｈｕｒｌｅｒマウスモデルはまた、さらなるインビボ実験にも使用された（下記参照）。シリアル番号ＡＤＡＲ６５を有するオリゴヌクレオチド（図２参照）は、変異マウスＩｄｕａ遺伝子を標的とするように設計された。さらなるホスホロチオエート連結がオリゴヌクレオチドの安定性を増すか否かを見るために、ＡＤＡＲ６５－１、ＡＤＡＲ６５－１８、ＡＤＡＲ６５－２０、ＡＤＡＲ６５－２１、およびＡＤＡＲ６５－２２を試験した。驚くべきことに、セントラルトリプレット領域に３つ以上のホスホロチオエートを含めると、ＡＯＮの安定性が向上した（図５）。ＡＤＡＲ６５－１にはセントラルトリプレット領域にさらなるホスホロチオエート連結がなく、明らかに分解されているが、ＡＤＡＲ６５－２２にはセントラルトリプレット領域内およびその周辺に６個のホスホロチオエート連結があり、ＦＢＳで１８時間インキュベートした後も明らかにより安定である。同様に、セントラルトリプレット領域に５および３個のホスホロチオエート連結をそれぞれ有するＡＤＡＲ６５－２０およびＡＤＡＲ６５－２１の安定性は、（ＡＤＡＲ６５－１のように）オリゴヌクレオチドの末端連結を除いてセントラルトリプレット領域にさらなるホスホロチオエートを有さないＡＤＡＲ６５－１８と比較したとき、増加した。 【０１１１】 ５－メチルシチジンおよびデオキシ２－アミノプリンなどの塩基修飾を、デオキシリボース（ＤＮＡ）、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロおよびリン酸骨格（ホスホロチオエート連結）などのリボース修飾と組み合わせた。ＡＤＡＲ６５－１３、－１４、－１５、－１６、－１９、－２０、－２１、－２２、－２３、－２４、－２５、－２６、－２７、－２８、－２９、および－３０（図２）を上に記したものと同じアッセイを用いて安定性について試験した。図６に示される結果は、ＦＢＳ中で１８時間インキュベートした後でも、安定性を得るために様々な組み合わせを使用できることを示している。」（【０１０９】～【０１１１】） エ．「【０１１４】 [実施例３] セントラルトリプレットにおける化学塩基修飾を組み合わせたＡＯＮのＲＮＡ編集活性 ヌクレオチドホスホジエステル、糖および塩基修飾は、ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの安定性を高めるために使用される。重要なことには、そのような化学的ヌクレオチド修飾は、より良好な認識を得るためにおよび／またはＡＯＮとその特異的な標的ＲＮＡ配列との二本鎖複合体において作用するタンパク質の酵素活性を高めるために、それらの標的ＲＮＡに対するＡＯＮの結合の増加などの他の目的にも使用できることが本発明の本発明者によって考えられた。 【０１１５】 本発明者らは、ＡＯＮのセントラルトリプレットにおけるヌクレオチド塩基化学修飾の組み合わせがＡＤＡＲ２の編集活性を増強し得るか否かを最初に知りたかった。このために、ＡＤＡＲ６０－１およびＡＤＡＲ６０－１５（図２および３参照）を使用して、ヒト変異ＳＥＲＰＩＮＡ１標的ＲＮＡ分子に対するＡＤＡＲ２酵素の編集活性の増強に対するそのような影響を調べた。これら２つのＡＯＮは同じ配列と長さを共有し、どちらもセントラルトリプレットの外側にリン酸基の化学的ホスホロチオエート修飾およびリボース糖の２’－Ｏ－メチル修飾を有する。図２に示すように、ＡＤＡＲ６０－１のセントラルトリプレットのヌクレオチドは修飾されていないが、ＡＤＡＲ６０－１５のセントラルトリプレットのヌクレオチド塩基は化学修飾されている。５－メチルシチジンは編集のための標的アデノシンの反対側である。ＡＤＡＲ６０－１とＡＤＡＲ６０－１５の両方を、ＡＤＡＲ２の過剰発現されたアイソフォーム２（ＡＤＡＲ２ａ）を有するＨＥＫ２９３細胞溶解物、およびｃ．１０９６Ｇ＞Ａ変異を有するＳＥＲＰＩＮＡ１標的ＲＮＡを用いたインビトロ編集アッセイで試験した。細胞溶解物を含まないＡＤＡＲ６０－１５、および過剰発現させたＡＤＡＲ２ａを含むが、オリゴヌクレオチドを含まないＨＥＫ２９３細胞溶解物を陰性対照として用いた。ＳＥＲＰＩＮＡ１テンプレートｓｓＲＮＡは、Ｔ１プロモーターＦ１フォワードプライマー（５’－ＧＣＧＡＡＧＣＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣ－３’；配列番号３）およびＳｅｒｐｉｎａ１－Ｒ２リバースプライマー（５’－ＣＣＡＴＧＡＡＧＡＧＧＧＧＡＧＡＣＴＴＣ－３’；配列番号４）を用いて当業者に公知の一般的技術を適用し、製造業者のプロトコールに従って、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて５００ｎｇのＳＥＲＰＩＮＡ１ｍｕｔ ＤＮＡ配列（ＳＥＲＰＩＮＡ１ｍｕｔ ｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）遺伝子断片からＰＣＲによって増幅された）のインビトロ転写によって得られた。ＳＥＲＰＩＮＡ１ｍｕｔ ＤＮＡテンプレートは、以下の配列を有する（標的アデノシンを太字の下線付きで示す）： ・・・・・・・・・・・・ 【０１２０】 図８は、ＡＤＡＲ６０－１をＳＥＲＰＩＮＡ１ｍｕｔ ｓｓＲＮＡ標的とインキュベートした場合、ＡからＧへの変化が検出されないことを示している（パネルＡ、矢印で示す位置）。しかしながら、対照的に、ＡＤＡＲ６０－１５を使用すると（パネルＢ）、明らかに検出可能で有意なＡからＧへの変化を示し、標的ＳＥＲＰＩＮＡ１ ＲＮＡの編集を裏付ける。陰性対照反応（パネルＣおよびＤ）は、ＡからＧへの編集を示さない。ＡＤＡＲ６０－１５におけるヌクレオチド塩基の化学修飾は、そのような修飾を有さないオリゴヌクレオチド（ＡＤＡＲ６０－１）と比較して、ＡＤＡＲ２のＲＮＡ編集活性を増強することができると結論づけられる。 【０１２１】 [実施例４] セントラルトリプレットにおける２－アミノプリン修飾を含むＡＯＮを用いたＧＦＰ標的ＲＮＡにおける非センス変異のＲＮＡ編集 細胞ゲノムに安定に組み込まれた緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする発現構築物を含む細胞においてＲＮＡ編集も調べた（詳細および構築物については国際公開第２０１６／０９７２１２号パンフレットを参照）。この構築物において、終止コドン（ＴＡＧ）がコドン位置５７に導入され、標的ＲＮＡ中にトリプレットＵＡＧをもたらした。このトリプレットの中央にあるアデノシンでのＲＮＡの編集は、最終的にはＴｒｐをコードするコドンを生じさせ、その後、全長タンパク質を発現させるであろう。構築物および細胞株（安定に組み込まれたＧＦＰ Ｗ５７Ｘプラスミドを含む細胞）は、当業者に知られている技術を使用して生成された。標的ＲＮＡ内の他のアデノシンが編集されないようにするために、終止コドンの反対側のＡＯＮ内の３つのヌクレオチド（オリゴヌクレオチド内の５’－ＣＣＡ－３’、中央のミスマッチＣと共に、図２のＡＤＡＲ５９－２およびＡＤＡＲ５９－１０参照）は２’－Ｏ－メチル修飾を含まないが、アンチセンスオリゴヌクレオチド中の他の全てのヌクレオチドは含む。さらに、試験した全てのオリゴヌクレオチドの両側の末端の５つのヌクレオチドはホスホロチオエート連結によってつながっているが、残りの連結は正常な連結であった。ＡＤＡＲ５９－１０では、オリゴヌクレオチドのセントラルトリプレットのＡが２－アミノプリンになるように化学修飾されているが、ＡＤＡＲ５９－２にはそのような特別な修飾はない。Matthewsら（2016）の図５Ｂは、この位置での２－アミノプリン修飾が、活性化の減少（しかし消滅しない）をもたらすことを示す。しかしながら、修飾は、例えば増強されたヌクレアーゼ耐性を潜在的に提供すること、または細胞プロセスを増強することによって、依然として間接的にＲＮＡ編集を増強することができる。 【０１２２】 安定なＧＦＰ Ｗ５７Ｘ含有細胞を最初に１μｇのＡＤＡＲ２過剰発現プラスミドでトランスフェクトし（先の実施例を参照）、次いで２４時間後に別々のバッチで１５０ｎＭの各オリゴをトランスフェクトした（両方ともリポフェクタミン２０００を用いる）。その後、ＡＯＮトランスフェクションの２４時間後、ＲＮＡをｃＤＮＡ合成およびその後のＲＴ－ＰＣＲのために単離し、そして配列決定を行ってＲＮＡ編集が起こったか否かを明らかにした。 【０１２３】 図９に示すように、ＡＤＡＲ５９－１０で観察された編集レベルは、２－アミノプリン修飾の無いコントロール（ＡＤＡＲ５９－２）よりも改善されている。このことは、触媒活性自体への悪影響にもかかわらず、ＡＯＮの修飾は間接的な手段によって全体的な編集レベルに良い影響を及ぼし得ることを示している。そのような修飾を安定性および／または編集活性の増強を支持する他の修飾ヌクレオチドと組み合わせることにより（ここに開示されるように）、ＲＮＡ編集を効率的に活性化するＡＯＮを安定に作成することが今や可能である。」（【０１１４】～【０１２３】） オ．「【０１３６】 [実施例９] ＲＮＡ編集のためのマウスＩＤＵＡ ＲＮＡを標的とするＡＯＮの化学修飾 次に、本発明者らは、安定化をもたらした修飾をさらに組み合わせることができるか否か、およびそのような組み合わせを有するＡＯＮがＨｕｒｌｅｒモデルにおけるＲＮＡ編集において機能的であるか否かを検証した（実施例２もまた参照）。野生型配列の復帰におけるこれらのＡＯＮの効果を、マウスＩｄｕａ遺伝子によってコードされるアルファ－Ｌ－イズロニダーゼ酵素の活性を測定するアッセイで試験した。このために、Ｗ３９２Ｘ変異マウス由来の不死化マウス胚性線維芽細胞（１試料あたり７００００個）を増殖培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ）中で培養し、リポフェクタミン３０００を用いて全長Ｉｄｕａ Ｗ３９２Ｘ ｃＤＮＡを有する発現プラスミド１μｇをトランスフェクトした。２４時間後、細胞をＡＤＡＲ６５シリーズの各ＡＯＮをそれぞれ１００ｎＭ（最終濃度）で同様にトランスフェクトし（安定性の結果については図５および６を参照）、さらに４８時間培養した。次いで細胞を回収し、そしてｍＰＥＲ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃７８５０１）中で溶解した。細胞断片を遠心分離により溶解物から除去し、そして２５μｌの上清を酵素５アッセイに使用した：２５μｌの３６０μＭ ４－メチルウンベリフェリルアルファ－Ｌ－イズロニド（０．４Ｍギ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）中）を溶解物試料に添加し、その後、３７℃で２時間インキュベートした。２００μｌの０．１７Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ９．９）を添加することによって反応を停止させ、次いで得られた蛍光強度を測定した（励起波長３６５ｎｍおよび発光４５０ｎｍ）。結果は、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって１０測定されるように、試料の総タンパク質濃度に対して正規化させた。 【０１３７】 図１４に提供された結果は、トランスフェクトされたＡＤＡＲ６５オリゴヌクレオチドの全てが、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ酵素活性を非トランスフェクト（ＮＴ）レベルを超えて増加させることができたことを示しており、標的（ｐｒｅ－）ｍＲＮＡが編集されたことを示す。実際に適用されたＡＯＮのほとんどは、標的ＲＮＡを非常に効率的に編集しているようである。安定性アッセイ（図５および６）と比較して分かるように、多くのＡＯＮ（特にＡＤＡＲ６５－２３からＡＤＡＲ６５－３０）は高い安定性を示し、そしてまたアルファ－Ｌ－イズロニダーゼの酵素活性を回復する良好な能力を示している。このことは、ＤＮＡヌクレオチドの使用、ならびにセントラルトリプレット内のホスホロチオエート連結および２’－フルオロ修飾が有用であり、したがって本発明の好ましい実施形態を示す。」（【０１３６】～【０１３７】） カ．「 ［図：0001407855000005.jpg］ ［図：0001407855000006.jpg］ ［図：0001407855000007.jpg］ ［図：0001407855000008.jpg］ 」（図２） キ．「 ［図：0001407855000009.jpg］ 」（図３） ク．「 ［図：0001407855000010.jpg］ 」（図５） ケ．「 ［図：0001407855000011.jpg］ 」（図６） コ．「 ［図：0001407855000012.jpg］ 」（図８） サ．「 ［図：0001407855000013.jpg］ 」（図９） シ．「 ［図：0001407855000014.jpg］ 」（図１４） （２）本件発明１～２６について 本件明細書の発明の詳細な説明には、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）のセントラルトリプレットにおける「塩基修飾」、「糖修飾」について、どのような化合物を使用することができるのか具体的に記載されており（上記記載事項ア．）、当業者であれば、それらの化合物をＡＯＮのセントラルトリプレットにおける「塩基修飾」、「糖修飾」として使用することができることを理解することができる。また、ＡＯＮのセントラルトリプレットの中央のヌクレオチドとして、どのような塩基修飾を使用することができるのか、ＡＯＮのセントラルトリプレットの中央以外のヌクレオチドとして、どのような塩基修飾を使用することができるのか具体的に記載されており（上記記載事項ア．）、当業者であれば、どのような塩基修飾をＡＯＮのセントラルトリプレットのどの位置に使用することができることについて理解することができる。 そして、本件明細書の発明の詳細な説明には、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）の具体例として、様々な「塩基修飾」、「糖修飾」を含むＡＯＮが記載されており（上記記載事項カ．）、それらのＡＯＮについて、安定性を調べた実験結果（上記記載事項イ．～ウ．及びキ．～ケ．）、編集効率を調べた実験結果（上記記載事項エ．～オ．及びコ．～シ．）が記載されている。 塩基修飾については、ＡＯＮのセントラルトリプレットの中央のヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド以外の、５－メチルシチジン、ピロロシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジンなどの塩基修飾を使用した場合に、ＡＯＮをより安定にすることができたことが実施例等により具体的に記載されており（上記記載事項イ．及びキ．）、また、標的アデノシンの脱アミノ化の誘導をより効果的にすることができたことが実施例等により具体的に記載されている（上記記載事項エ．及びコ．～サ．）。また、ＡＯＮのセントラルトリプレットの中央以外のヌクレオチドとして、イノシンを含むＡＯＮ（ＡＤＡＲ６０－１０、ＡＤＡＲ６０－１１）、シュードウリジンを含むＡＯＮ（ＡＤＡＲ６０－１２）、４－チオウリジンを含むＡＯＮ（ＡＤＡＲ６０－１３）、２，６－ジアミノプリンを含むＡＯＮ（ＡＤＡＲ６０－１６）、チエノグアノシンを含むＡＯＮ（ＡＤＡＲ６０－２０、ＡＤＡＲ６０－２１）は、ＡＯＮをより安定にすることができたことが実施例等により具体的に記載されている（上記記載事項イ．及びキ．）。 糖修飾については、セントラルトリプレットにＤＮＡを含むＡＯＮ（ＡＤＡＲ６０－６）、アンロック核酸（ＵＮＡ）を含むＡＯＮ（ＡＤＡＲ６０－８）、２’－フルオロ修飾を含むＡＯＮ（ＡＤＡＲ６０－７）は、ＡＯＮをより安定にすることができたことが実施例等により具体的に記載されている（上記記載事項イ．及びキ．）。 また、図１４に示されている実施例９の実験結果（上記記載事項シ．）については、「トランスフェクトされたＡＤＡＲ６５オリゴヌクレオチドの全てが、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ酵素活性を非トランスフェクト（ＮＴ）レベルを超えて増加させることができた」と記載されている（上記記載事項オ．）ように、セントラルトリプレットにＤＮＡ、２’－フルオロ修飾を含むＡＯＮについても、有意な編集活性が得られたことが示されていると認められる。 そうすると、本件明細書の発明の詳細な説明には、ＡＯＮのセントラルトリプレットのヌクレオチドとして、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド以外の、様々な塩基修飾、糖修飾を含むＡＯＮについて、ＡＯＮをより安定にすることができた実施例、標的アデノシンの脱アミノ化の誘導をより効果的にすることができた実施例が複数例示されているといえるから、本件明細書の実施例で実際に使用されている塩基修飾、糖修飾以外の塩基修飾、糖修飾を含む本件発明１に包含されるＡＯＮについても、多少の効果上の差異を伴うものの本件明細書の実施例で実際に用いられているＡＯＮの実験結果から同様の効果が得られることを当業者が容易に理解することができるといえる。 よって、本件発明の詳細な説明は、本件発明１について、当業者がその実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。本件発明２～２６は、本件発明１の発明特定事項と同様の発明特定事項を含むものであるから、本件発明１と同様の理由により、本件発明の詳細な説明は、本件発明２～２６についても、当業者がその実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。 したがって、本件発明の詳細な説明は、本件発明１～２６について、特許法第３６条第４項第１号に規定する要件を満たしていない、とすることはできない。 また、本件発明の詳細な説明の記載及び本件出願時の技術常識を考慮すると、本件発明１～２６は、発明の詳細な説明に記載されたものといえる。 したがって、本件特許請求の範囲の記載は、特許法第３６条第６項第１号に規定する要件を満たしていない、とすることはできない。 第６ むすび 以上のとおりであるから、特許異議申立の理由によっては、本件発明１～２６に係る特許を取り消すことはできない。また、他に本件発明１～２６に係る特許を取り消すべき理由を発見しない。 よって、結論のとおり決定する。