2022-700781

特許第７００８３３７号発明「ヒト機能性角膜内皮細胞およびその応用」の特許異議申立事件について、次のとおり決定する。

結 論 特許第７００８３３７号の請求項１～２２に係る特許を維持する。

理 由 第１ 手続の経緯 特許第７００８３３７号の請求項１～２２に係る特許についての出願は、平成２９年２月１４日（優先権主張 ２０１６年２月１５日 ４件、 ２０１６年４月７日）を出願日とする出願であって、令和４年１月１３日に特許権の設定登録がされ、同年２月１０日に特許掲載公報が発行された。その後、その特許に対し、同年８月９日に特許異議申立人上田精一（以下、「異議申立人１」という。）により、同年同月１０日に特許異議申立人神谷高伸（以下、「異議申立人２」という。）により、特許異議の申立てがされたものである。その後の主な手続の経緯は、以下のとおりである。 令和４年１２月 ６日付け 取消理由通知書 令和５年 ２月 ７日 訂正請求書及び意見書の提出（特許権者） 同年 ３月３０日 意見書の提出（異議申立人１） 同年 ３月３０日 意見書の提出（異議申立人２） 同年 ７月 ５日付け 取消理由通知書（決定の予告） 同年 ９月 ８日 訂正請求書及び意見書の提出（特許権者） 同年１０月１８日付け 訂正拒絶理由通知書 第２ 本件発明 上記第１の手続の経緯のとおり、令和５年９月８日に訂正請求がされたので、令和５年２月７日にされた訂正請求は、特許法第１２０条の５第７項の規定により、取り下げられたものとみなす。また、令和５年９月８日にされた訂正請求に対して、令和５年１０月１８日付けで訂正拒絶理由を通知し、期間を指定して意見書を提出する機会を与えたが、特許権者からは何らの応答もなかった。そして、上記訂正拒絶理由は妥当なものと認められるので、令和５年９月８日にされた訂正請求はこの理由により拒絶すべきものである。 したがって、本件特許の請求項１～２２に係る発明は、その特許権設定登録時の特許請求の範囲の請求項１～２２に記載された事項により特定される、次のとおりのものである。 「【請求項１】 ヒト眼前房内への注入時にヒト角膜内皮機能特性を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞であって、該細胞の細胞表面抗原の表現型は、ＣＤ４４陰性～弱陽性表現型、ＣＤ１６６陽性表現型、ＣＤ１３３陰性表現型、ＣＤ１０５陰性～弱陽性表現型、ＣＤ２４陰性表現型、およびＣＤ２６陰性表現型を含む、細胞。 【請求項２】 前記細胞の細胞表面抗原の表現型は、ＣＤ１０５陰性表現型、ＣＤ２４陰性表現型、ＣＤ２６陰性表現型、ＣＤ１６６陽性表現型、ＣＤ１３３陰性表現型、およびＣＤ４４陰性表現型を含む、請求項１に記載の細胞。 【請求項３】 前記細胞表面抗原の表現型は、さらに、ＣＤ２００陰性表現型を含む、請求項１または２に記載の細胞。 【請求項４】 前記細胞表面抗原の表現型は、さらに、ＣＤ９０陰性表現型を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞。 【請求項５】 前記細胞表面抗原の表現型は、さらに、ＬＧＲ５陰性表現型、ＳＳＥＡ３陰性表現型、ＭＨＣ１弱陽性表現型、ＭＨＣ２陰性表現型、ＺＯ－１陽性表現型、およびＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ陽性表現型からなる群より選択される少なくとも１つの表現型を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の細胞。 【請求項６】 前記細胞の平均細胞面積は、２５０μｍ２以下である、請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞。 【請求項７】 ミトコンドリア系におけるエネルギー代謝系の酵素を含むことを特徴とする、請求項１～６のいずれか１項に記載の細胞。 【請求項８】 ＯＸＰＨＯＳ活性が亢進していることを特徴とする、請求項１～７のいずれか１項に記載の細胞。 【請求項９】 前記細胞は、ＰＤＧＦ－ＢＢ高産生、ＩＬ－８低産生、ＭＣＰ－１低産生、ＴＮＦ－α高産生、ＩＦＮγ高産生、およびＩＬ－１Ｒアンタゴニスト高産生からなる群より選択される少なくとも一つの特性を有する、請求項１～８のいずれか１項に記載の細胞。 【請求項１０】 前記細胞は、成熟分化角膜内皮機能性細胞ａ５の細胞特性を有する少なくとも１つのｍｉＲＮＡを有し、ここで、該ａ５の細胞表面抗原の特性は、ＣＤ４４陰性～弱陽性およびＣＤ２４陰性ＣＤ２６陰性である、請求項１～９のいずれか１項に記載の細胞。 【請求項１１】 請求項１～１０のいずれか１項に記載の細胞を含む細胞集団。 【請求項１２】 前記細胞集団の飽和細胞培養（培養コンフルエント）時平均細胞密度が、少なくとも１５００個／ｍｍ２以上である、請求項１１に記載の細胞集団。 【請求項１３】 前記細胞集団を注入した後にヒトの角膜内皮面に生着した細胞の平均細胞密度が、少なくとも１０００個／ｍｍ２以上となる、請求項１１または１２に記載の細胞集団。 【請求項１４】 前記細胞集団における少なくとも７０％の細胞が、請求項１～１０のいずれか一項に記載の特徴を有する、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の細胞集団。 【請求項１５】 前房内への注入時にアロ（同種異系）拒絶反応を生じさせない、請求項１～１０のいずれか１項に記載の細胞または請求項１１～１４のいずれか１項に記載の細胞集団。 【請求項１６】 前記細胞または細胞集団は、血清のサイトカインプロファイルにおいて、生体への投与後に血清炎症性サイトカインの増量などのヒト角膜内皮組織再建に関連しない目的外生体応答を実質的に惹起しない、請求項１～１０のいずれか１項に記載の細胞または請求項１１～１４のいずれか１項に記載の細胞集団。 【請求項１７】 ヒトの眼前房内への注入時にヒト角膜内皮機能特性を惹起し得る培養ヒト機能性角膜内皮細胞の品質管理または工程管理の方法であって、細胞表面マーカー；タンパク質性産物および該産物の関連生体物質；ＳＡＳＰ関連タンパク質；細胞内および分泌型ｍｉＲＮＡ；エキソゾーム；アミノ酸を含む細胞代謝産物および該代謝産物の関連生体物質；細胞の大きさ；細胞の密度および自己抗体反応性細胞の存在からなる群より選択される少なくとも１つの細胞機能指標を測定する工程を包含し、前記ヒト機能性角膜内皮細胞の細胞表面抗原の表現型が、ＣＤ４４陰性～弱陽性表現型、ＣＤ１６６陽性表現型、ＣＤ１３３陰性表現型、ＣＤ１０５陰性～弱陽性表現型、ＣＤ２４陰性表現型、およびＣＤ２６陰性表現型を含む、方法。 【請求項１８】 請求項１～１６のいずれか１項に記載の少なくとも１つの角膜機能特性によって、前記培養機能性角膜内皮細胞の亜集団を同定する工程をさらに包含する、請求項１７に記載の方法。 【請求項１９】 培養ヒト角膜内皮細胞に混在する角膜内皮非機能性細胞の検出方法であって、細胞表面マーカー；タンパク質性産物および該産物の関連生体物質；ＳＡＳＰ関連タンパク質；細胞内および分泌型ｍｉＲＮＡ；エキソゾーム；アミノ酸を含む細胞代謝産物および該代謝産物の関連生体物質；細胞の大きさ；細胞の密度および自己抗体反応性細胞の存在からなる群より選択される少なくとも１つの細胞機能指標を測定する工程を包含し、前記ヒト角膜内皮細胞の細胞表面抗原の表現型が、ＣＤ４４陰性～弱陽性表現型、ＣＤ１６６陽性表現型、ＣＤ１３３陰性表現型、ＣＤ１０５陰性～弱陽性表現型、ＣＤ２４陰性表現型、およびＣＤ２６陰性表現型を含む、方法。 【請求項２０】 ヒトの眼前房内への注入時にヒト角膜機能特性を惹起し得る培養ヒト機能性角膜内皮細胞の品質管理もしくは工程管理の方法、または培養ヒト角膜内皮細胞に混在する角膜内皮非機能性細胞の検出方法であって、以下： （１）培養上清ＥＬＩＳＡによる純度試験 ＴＩＭＰ－１：５００ｎｇ／ｍＬ以下 ＩＬ－８：５００ｐｇ／ｍＬ以下 ＰＤＧＦ－ＢＢ：３０ｐｇ／ｍＬ以上 ＭＣＰ－１：３０００ｐｇ／ｍＬ以下 （２）細胞ＦＡＣＳによる純度試験 ＣＤ１６６＝９５％以上 ＣＤ１３３＝５％以下 ＣＤ１０５陰性～低陽性＝９５％以上 ＣＤ４４陰性～低陽性＝７０％以上 ＣＤ４４中程度～高陽性＝１５％以下 ＣＤ２４＝５％以下 ＣＤ２６陽性＝５％以下 ＣＤ２００＝５％以下 （３）バリア機能（ＺＯ－１）陽性 （４）ポンプ機能（Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ）陽性 （５）細胞生存率 トリパンブルー染色で７０％以上 （６）細胞形態 外観試験で形質転換細胞を認めない （７）Ｃｌａｕｄｉｎ１０ 陽性 （８）エフェクター細胞（Ｅ－ｒａｔｉｏ）＞５０％ （９）非目的細胞 非目的細胞Ａ（ＣＤ４４強陽性細胞）＜１５％、非目的細胞Ｂ（ＣＤ２６陽性細胞）＜５％、非目的細胞Ｃ（ＣＤ２４陽性細胞）＜５％ （１０）核型異常陰性 （１１）ミトコンドリア代謝系に係る酵素の発現、および （１２）ＯＸＰＨＯＳ活性 の１または複数を確認する工程を包含し、前記ヒト機能性角膜内皮細胞 の細胞表面抗原の表現型が、ＣＤ４４陰性～弱陽性表現型、ＣＤ１６６陽性表現型、ＣＤ１３３陰性表現型、ＣＤ１０５陰性～弱陽性表現型、ＣＤ２４陰性表現型、およびＣＤ２６陰性表現型を含む、方法。 【請求項２１】 ヒトの眼前房内への注入時にヒト角膜機能特性を惹起し得る培養ヒト機能性角膜内皮細胞の品質管理もしくは工程管理の方法であって、対象細胞について、（１）内皮ポンプ・バリア機能の保持、（２）特定のラミニンに対する接着・結合性、（３）分泌サイトカインプロファイル、（４）産生する代謝産物プロファイル（５）インビトロ培養時の飽和細胞密度、（６）培養時に得られる細胞の空間的大きさおよびその分布、ならびに（８）マウス角膜に対する液体窒素低温凍結損傷後に細胞注入した場合の細胞維持の１または複数の特徴を判定する工程を包含し、前記ヒト機能性角膜内皮細胞の細胞表面抗原の表現型が、ＣＤ４４陰性～弱陽性表現型、ＣＤ１６６陽性表現型、ＣＤ１３３陰性表現型、ＣＤ１０５陰性～弱陽性表現型、ＣＤ２４陰性表現型、およびＣＤ２６陰性表現型を含む、方法。 【請求項２２】 前記細胞は角膜内皮組織由来細胞、角膜内皮前駆細胞、多能性幹細胞、間葉系幹細胞、または、角膜内皮から採取した角膜内皮前駆細胞、角膜内皮から採取した細胞、ならびにダイレクトプログラミング法で作製される角膜内皮前駆細胞および角膜内皮様細胞からなる群より選択される細胞を起源として作製されたものである請求項１～１６のいずれか１項記載の細胞もしくは細胞集団。」 （以下、「本件発明１」、「本件発明２」等という。まとめて「本件発明」ということもある。） 第３ 異議申立理由の概要 異議申立人１、２が主張する異議申立理由の概要は、次のとおりのものである。（以下、異議申立理由については、異議申立人番号と理由番号により「異議１理由１」等といい、証拠方法についても同様に、異議申立人番号と証拠番号により「異議１甲１」等という。） １ 異議申立人１が申し立てた異議申立理由の概要 （１）異議１理由１（発明非該当性） 本件特許の請求項１～１６に記載されたものは、天然物を単に発見したものであり、「発明」に該当しないから、請求項１～１６に係る特許は、特許法第２９条第１項柱書に規定する要件を満たしていない特許出願に対してされたものである。 （２）異議１理由２（新規性欠如） 本件発明１～１１、１３、１６は、甲第１号証に記載された発明であるから、本件発明１～１１、１３、１６に係る特許は、特許法第２９条第１項第３号の規定に違反してされたものである。 （３）異議１理由３（進歩性欠如） 本件発明１～１６、２２は、甲第１～１６、１９号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、本件発明１～１６、２２に係る特許は、特許法第２９条第２項の規定に違反してされたものである。 （４）異議１理由４（実施可能要件違反）、５（サポート要件違反） 本件特許は、下記ア、イの点で、特許請求の範囲の記載が発明の詳細な説明に記載したものということができず、同様の理由により、発明の詳細な説明の記載が当業者が実施できる程度に明確かつ十分に記載したものということもできないから、特許法第３６条第６項第１号及び第４項第１号に規定する要件を満たしていない特許出願に対してされたものである。 ア 本件発明１～２２の「ＣＤ１３３陰性表現型」 イ 本件発明１～２２の表現型の記載 （５）異議１理由６（明確性要件違反） 本件特許は、下記ア、イの点で、特許請求の範囲の記載が明確でないから、特許法第３６条第６項第２号に規定する要件を満たしていない特許出願に対してされたものである。 ア 本件発明１～２２の表現型の記載 イ 本件発明１５、１６における達成すべき結果の記載 （６）証拠方法 異議１甲１：国際公開第２０１５／０１６３７１号 異議１甲２：Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub., vol.154(4), pp.321-326 (2010) 異議１甲３：Pathology International, vol.62, pp.792-801 (2012) 異議１甲４：PLOS ONE, vol.8(2), e56380 (2013) 異議１甲５：Cellular & Molecular Immunology, vol.7, pp.100-103 (2010) 異議１甲６：Br J Ophthalmol, vol.91, pp.94-99 (2007) 異議１甲７：Rom J Morphol Embryol, vol.54(1), pp.29-36 (2013) 異議１甲８：Molecular vision, vol.21, pp.644-648 (2015) 異議１甲９：International Journal of Molecular Medicine, vol.29, pp.871-876 (2012) 異議１甲１０：Trends in Glycoscience and Glycotechnology, vol.21, pp.197-206 (2009) 異議１甲１１：特開２００５－６０３６０号公報 異議１甲１２：鈴木範男著「分子細胞生物学の基礎」（２００４年３月１日 三共出版発行）２０８～２０９頁 異議１甲１３：杏林医会誌、２３巻３号、４６５～４７６頁（１９９２） 異議１甲１４：林純一著「ミトコンドリア・ミステリー」（２０１３年４月１日 講談社発行）２６～２９頁、５２～５７頁 異議１甲１５：大橋裕一編「専門医のための眼科診療クオリファイ １２」（２０１２年７月９日 中山書店発行）２～７頁、２８～２９頁 異議１甲１６：日眼会誌、１１８巻２号、８１～８３頁（平成２６年） 異議１甲１７：RT2 Profiler PCR Array(Rotor-Gene(R) Format)Human Extracellular Matrix & Adhesion Moleculesの製品説明書 異議１甲１８：BD LyoplateTM Screening panels Human Cell Surface Markers/Mouse Cell Surface Markersの製品説明書 異議１甲１９：Invest Ophthalmol Vis Sci, vol.55, pp.216-225 (2014) 異議１甲２０：眼科術語集付録１ 視覚障害の定義と標準視力検査 第６版、５２４～５２７頁 異議１甲２１：Trans Vis Sci Tech, vol.8(6), Article 13 (2019) ２ 異議申立人２が申し立てた異議申立理由の概要 （１）異議２理由１（新規性欠如） 本件発明１～８、１０～１３、１５、１６、２２は、甲第１号証に記載された発明であるから、本件発明１～８、１０～１３、１５、１６、２２に係る特許は、特許法第２９条第１項第３号の規定に違反してされたものである。 （２）異議２理由２（進歩性欠如） 本件発明１～２２は、甲第１～５号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、本件発明１～２２に係る特許は、特許法第２９条第２項の規定に違反してされたものである。 （３）異議２理由３（実施可能要件違反）、４（サポート要件違反） 本件特許は、下記ア～ウの点で、特許請求の範囲の記載が発明の詳細な説明に記載したものということができず、同様の理由により、発明の詳細な説明の記載が当業者が実施できる程度に明確かつ十分に記載したものということもできないから、特許法第３６条第６項第１号及び第４項第１号に規定する要件を満たしていない特許出願に対してされたものである。 ア 本件発明１７～２１の課題解決手段 イ 本件発明１１～１３、１５、１６の「細胞」の割合 ウ 本件発明１４の「少なくとも７０％」 （４）証拠方法 異議２甲１：国際公開第２０１５／０１６３７１号 異議２甲２：Cellular & Molecular Immunology, vol.7, pp.100-103 (2010) 異議２甲３：Clin Cancer Res, vol.14(1), pp.123-129 (2008) 異議２甲４：Cytotherapy, vol.9(3), pp.252-258 (2007) 異議２甲５：基礎老化研究、３５巻３号、２９～３１頁（２０１１） 異議２甲６：Invest Ophthalmol Vis Sci, vol.58, pp.2011-2020 (2017) なお、上記理由のうち、異議１理由２、異議１理由３、異議２理由１、異議２理由２及び異議２理由３、４イは令和４年１２月６日付け取消理由通知で通知し、それらのうち異議１理由２、異議１理由３、異議２理由１及び異議２理由２は令和５年７月５日付け取消理由通知（決定の予告）で通知したものである。これらを含め、それぞれの理由についての判断を下記第４に示す。 第４ 当合議体の判断 １ 異議１理由１（発明非該当性）についての判断 （１）異議申立理由の具体的内容 請求項１～１０に記載の細胞は、角膜組織及び新鮮なヒト角膜内皮に対するマーカーの発現の分析に基づいて、天然物であるヒト角膜組織中に存在する角膜内皮細胞を単に発見したものであるから、特許法第２９条第１項柱書でいう「発明」に該当しない。請求項１１～１６に記載の細胞集団も同様である。 （２）判断 発明の詳細な説明の【課題を解決するための手段】に、 「【０００３】 本発明者らは、培養ヒト角膜内皮細胞が培養中の細胞の相転移（線維化、上皮間葉系移行、老化、脱分化等）により複数の亜集団から構成されていることを世界において初めて見出し、培養中の亜集団を選択的に増殖する技術を考案することで、特定の亜集団、すなわち成熟分化ヒト角膜内皮細胞の機能を十分に有する機能性細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ（エフェクター）細胞とも称する。）が、細胞注入療法に最適な小型で六角形の敷石様形状を形成し、主にミトコンドリア機能によるエネルギー代謝系を利用する成熟分化内皮細胞であることを確認し、革新的な本発明を完成した。」 と記載されたとおり、本件発明は、培養ヒト角膜内皮細胞が複数の亜集団から構成されていること、及び、その中の特定の亜集団が、細胞注入療法に最適な細胞であることを見いだして完成したものである。 培養ヒト角膜内皮細胞自体、ヒト角膜内皮細胞を人為的に培養することで得られる細胞であるうえ、本件発明１～１０の細胞は、当該培養ヒト角膜内皮細胞の中から人為的に単離された特定の細胞であるのだから、創作性があり、特許法第２９条第１項柱書でいう「発明」に該当する。「発明」に該当する細胞を含む、本件発明１１～１６に係る細胞集団についても同様である。 したがって、異議１理由１は理由がない。 ２ 異議１理由２、３及び異議２理由１、２（新規性欠如、進歩性欠如）についての判断 異議１理由２、３及び異議２理由１、２は、上記第３の１（２）、（３）及び２（１）、（２）のとおり、本件発明について、第１優先日前に頒布された刊行物である国際公開第２０１５／０１６３７１号（異議１甲１、異議２甲１。以下、単に「甲１」という。）により新規性及び／又は進歩性を欠如することを主張する、同趣旨のものであるから、まとめて判断する。 （１）甲１の記載事項 本件特許優先日前に日本国内又は外国において電気通信回線を通じて公衆に利用可能となった甲１には、次の事項が記載されている。 ア 「請求の範囲 【請求項１】 ＣＤ１６６、ＨＬＡ－Ａ２、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ９８、ＣＤ５９、ＣＤ５４、ＣＤ３４０、ＣＤ４７、ＥＧＦ－Ｒ、ＣＤ２９、ＣＤ７４、ＣＤ１６５、ＣＤ２２１、ＣＤ４９ａ、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ１３０およびＣＤ４９ｆからなる群より選択される遺伝子の核酸および／または該核酸によってコードされるタンパク質を含む正常角膜内皮細胞マーカー：ならびに ＣＤ２６、ＣＤ９、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ１３、ＣＤ９９、ＣＤ１０５、ＣＤ６３、ＣＤ５８、ＣＤ２０１、ＣＤ５６、ＣＤ４４、ＣＤ５５、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ９１、ＨＬＡ－ＤＱ、ＣＤ１６４、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ９０、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＣＤ４６、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ８１、ＣＤ１５１、ＣＤ２００およびＣＤ１０なる群より選択される遺伝子の核酸および／または該核酸によってコードされるタンパク質を含む形質転換角膜内皮細胞マーカーから選択される少なくとも１つを含む、角膜内皮細胞の正常細胞・形質転換細胞を識別するためのマーカー。 ・・・ 【請求項１８】 ａ）角膜内皮細胞を含む試料を提供する工程；および ｂ）該サンプルにおいて、請求項１～７のいずれか１項に記載のマーカーを指標として、正常角膜内皮細胞の割合を上昇させる工程 を含む、正常角膜内皮細胞の割合が上昇した角膜内皮細胞試料を調製するための方法。 ・・・ 【請求項２０】 請求項１～７のいずれか１項に記載のマーカーを、角膜内皮細胞を含む試料を作製する際の純度検定の指標とする方法。」（６８頁２行～７０頁１１行） イ 「【課題を解決するための手段】 本発明は、角膜細胞、特に角膜内皮細胞の正常細胞と形質転換細胞とを識別するマーカーを提供する。」（３頁１～３行） ウ 「【発明の効果】 本発明によれば、角膜内皮細胞に存在する細胞の分化能を識別することができ、機能が高い細胞を識別することができ、その結果従来不可能または困難であった、角膜内皮の疾患や障害を治療または予防することができる。また、細胞を含む試料を作製する際の純度検定の方法、角膜内皮細胞の純化方法、純化された角膜内皮細胞を調製するための方法もまた提供される。」（８頁３～８行） エ 「本明細書において「正常角膜内皮細胞マーカー」とは、正常な角膜内皮細胞において発現し、形質転換を受けると、発現量が有意に減少するマーカーをいう。」（２７頁３０～３２行） オ 「本明細書において「形質転換角膜内皮細胞マーカー」とは、形質転換を起こした角膜内皮細胞において発現し、正常細胞では有意に発現が低いマーカーをいう。」（２８頁３～５行） カ 「本明細書において「形質転換」とは、細胞の形質が正常ではない状態に変化することをいい、正常な動物細胞が無制限に分裂を行うようになる、つまりがん化の意味、または化生の中で特にダイナミックなもの（幹細胞まで脱分化したり組織の基本形の壁を越えて変化したりするもの）の意味を含む。」（２８頁１３～１６行） キ 「本明細書において、角膜内皮細胞が正常に培養されているかどうかは、角膜内皮細胞が本来有している機能（本明細書では「正常（な）機能」ともいい、そのような細胞を「正常細胞」ともいう。）等の特徴を少なくとも１つは維持しているかを確認することによって判定することができる。そのような機能としては、ＺＯ－１およびＮａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ、角膜移植への適応能（・・・）等が挙げられるがそれらに限定されない。すなわち、「正常な機能」は、角膜移植を実現するのに必要な機能または十分であることを示す指標でありうることが理解される。例えば、正常化の判断方法としては、ＺＯ－１およびＮａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅのような角膜内皮細胞における機能タンパク質を指標としてその発現の変化を観察したり、あるいはサル等への移植によって生着し、機能するかどうかを調べることによって実行することができる。」（２８頁１７～３６行） ク 「（細胞培養） ヒト角膜内皮細胞初代培養では、角膜組織から内皮細胞層を含むデスメ膜を剥離し、ＯＰＴＩＭＥＭ－Ｉに溶解した２ｍｇ／ｍｌ Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ａ（カタログ番号：７０１６４９２３；Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｅｎｚｂｅｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に入れて３７℃でインキュベートした。１２時間後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除去後、沈殿している角膜内皮細胞塊に培養培地を加えて混和し、ＦＮＣ Ｃｏａｔｉｎｇ Ｍｉｘ（カタログ番号：０４０７；Ａｔｈｅｎａ Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）をコートした１２ウェルプレートへ全量を播種した。培養培地はＯＰＴＩＭＥＭ－Ｉ（カタログ番号：５１９８５；Ｇｉｂｃｏ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）に８％ウシ胎仔血清（カタログ番号：１０４３７－０２８；ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ；ＢｉｏＷｅｓｔ，Ｆｒａｎｃｅ）、５０μｇ／ｍｌ Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ（Ｉｎｖｔｉｒｏｇｅｎ）、１０μＭ Ｙ－２７６３２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を加えたものを使用した。 ・・・ ヒト角膜は、初代培養までの期間が１４日未満のものを用いた。ヒトおよびサルの角膜内皮細胞（ＣＥＣ）の培養には、以前に報告した系［Ｋｏｉｚｕｍｉ Ｎ ｅｔ ａｌ．、Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．，２０１２；９５：６０－６７；Ｋｏｉｚｕｍｉ Ｎ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．．２００７；４８：４５１９－４５２６；Ｏｋｕｍｕｒａ Ｎ ｅｔ ａｌ．、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ． ２０１２；１８１：２６８－２７７］を使用した。 培地交換は２日ごとに行った。継代は５０～８０％コンフルエントになった時点で行った。継代方法は、Ｃａ２＋Ｍｇ２＋非含有（ｆｒｅｅ）ＰＢＳ（ＰＢＳ－；Ｎｉｓｓｕｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．， Ｔｏｋｙｏ． Ｊａｐａｎ）で細胞を洗浄し、ＴｒｙｐＬＥＴＭ Ｓｅｌｅｃｔ（カタログ番号：１２５６３；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、３７℃で５分間インキュベートした。プレートから細胞を剥離して回収し、１０００ｒｐｍ ５分間遠心分離後、培養培地を加えて細胞懸濁液とした。ＦＮＣ Ｃｏａｔｉｎｇ Ｍｉｘをコートしたプレートへ１：２～３の密度で細胞を播種した。」（５４頁２２行～５５頁２０行） ケ 「（実施例１：形質転換角膜内皮細胞および正常角膜内皮細胞におけるフローサイトメトリー） 本発明者らは、フローサイトメトリーを用いたハイスループット解析により、正常ヒト角膜内皮細胞および形質転換した細胞の表面マーカーのスクリーニングを行い、候補マーカーの選定を進めた。 ヒト角膜内皮細胞を上述の（実験材料と方法）に記載の方法で培養して、細胞形態が正常の細胞と形質転換した細胞をＨｕｍａｎ Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍａｒｋｅｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｐａｎｅｌ （ＢＤ ＬｙｏｐｌａｔｅＴＭ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてフローサイトメトリーを用いたハイスループット解析を行った。そこで、正常細胞および形質転細胞におけるそれぞれの表面抗原の発現を比較して、正常細胞において増強しているものを正常細胞のマーカー候補とした（表２）。一方、同様に形質転換細胞で発現が増強しているものを形質転換細胞のマーカーとした（表３）。 （表２ 正常転換ヒト角膜内皮細胞において強発現である表面抗原） ［図：0001409068000001.jpg］ （表３ 形質転換ヒト角膜内皮細胞において強発現である表面抗原） ［図：0001409068000002.jpg］ 」（５８頁１８行～６０頁） コ 「（実施例２：培養サル角膜内皮細胞における解析） 本実施例では、培養サル角膜内皮細胞を用いて、形質転換細胞および正常細胞におけるこれらの細胞表面マーカーの解析を行った。 ・・・同様の方法で培養した際に、正常の形態に培養できた角膜内皮細胞を正常角膜内皮細胞として、線維芽細胞様に形質転換を生じた細胞を形質転換細胞として以下の検討に用いた。図２の位相差顕微鏡像において左側に示す正常角膜内皮細胞は、１つ１つの細胞が小さく、六角形を主とする多角形細胞から成る様子が示されている。それに対し、右側に示す、線維芽細胞様に形質転換を起こしている細胞では、１つ１つの細胞が大きく、細長い形状をしている。」（６２頁４～２４行） サ 「（実施例４：不死化ヒト角膜内皮細胞における解析） 本実施例では、調製例にて調製した不死化ヒト角膜内皮細胞を用いて、形質転換細胞および正常細胞におけるこれらの細胞表面マーカーの解析を行った。 ・・・作製したヒト角膜内皮不死化細胞から、正常の細胞形態または線維芽細胞様に形質転換した細胞をそれぞれクローニングして、正常細胞、形質転換細胞として以下の検討に用いた。 そのヒト角膜内皮不死化細胞の位相差顕微鏡像を図７に示す。左は正常角膜内皮細胞を示し、右は形質転換細胞を示す。培養サル細胞と同様に、左側に示す正常角膜内皮細胞は、１つ１つの細胞が小さく、六角形を主とする多角形細胞から成る様子が示されている。それに対し、右側に示す、線維芽細胞様に形質転換を起こしている細胞では、１つ１つの細胞が大きく、細長い形状をしている。 次に、ＣＤ７３を例として、本特許におけるマーカーを用いることで、正常細胞をソーティングして純化できるか否かの試験を行った。正常形態および形質転換不死化ヒト角膜内皮細胞の混合培養細胞をＣＤ７３によりフローサイトメトリー解析を行った。 結果を図８に示す。ＣＤ７３によるフローサイトメトリーにより、ＣＤ７３の高発現の細胞群と低発現の細胞群の２群からなることが分かる。次に、図８のＰ４で示されるＣＤ７３低発現の細胞と、Ｐ５で示されるＣＤ７３高発現の細胞をソーティングして細胞培養を行った。 結果を図９に示す。左はＣＤ７３低発現の細胞（ＣＤ７３（－））、中はＣＤ７３高発現の細胞（ＣＤ７３（＋））のソーティング後の位相差顕微鏡写真である。ＣＤ７３（－）では、正常細胞の形態である多角形形態の細胞であるのに対してＣＤ７３（＋）では、形質転換した線維芽細胞様形態となった細胞である。右はコントロールとしてソーティングを行わずに培養した位相差顕微鏡像であるが、正常の形態での細胞と、形質転換した細胞が混在する。これらのことから、ＣＤ７３をマーカーとして用いることで、正常細胞と形質転換して線維芽状となった細胞とをソーティングに用いることが可能であることが示された。 次に、ＣＤ７３によりソーティングした後の候補マーカーの発現解析を行った。ここでは、ＣＤ７３、ＣＤ１６６の発現解析を行った。プロトコールは、（実験材料および方法）に記載したものに準じた。 結果を図１０に示す。上段がＣＤ７３（－）としてソーティングした細胞を示し、下段がＣＤ７３（＋）としてソーティングした細胞を示す。左側はＣＤ７３による染色、右側はＣＤ１６６による染色を示す。ＣＤ７３（－）では、ＣＤ７３が染色されないが、ＣＤ１６６が強く染色された。また、ＣＤ７３（＋）ではＣＤ７３が染色される一方で、ＣＤ１６６の発現がＣＤ７３（－）と比べて減弱を認めた。 次に、ＣＤ７３によりソーティング下後の機能関連マーカーの発現解析を行った。ここでは、ＺＯ－１およびＮａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅの発現を解析した。プロトコールは、（実験材料および方法）に記載したものに準じた。 結果を図１１に示す。上段がＣＤ７３（－）を示し、下段がＣＤ７３（＋）を示す。左側は、ＺＯ－１の発現を示し、右側は、Ｎａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅの発現を示す。ＣＤ７３（－）では、正常機能を示すＺＯ－１およびＮａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅがいずれも有意に多く発現していることが示される。したがって、ＣＤ７３（－）は、機能的な面でも、正常細胞を形質転換した細胞から区別することができるマーカーであることが示される。」（６３頁３５行～６５頁１３行） （２）甲１に記載された発明 甲１は、培養した角膜内皮細胞を細胞形態が正常な正常細胞と正常でない形質転換細胞とに分離して、両者における各種表面抗原の発現を比較して、正常細胞において増強しており、形質転換を受けると有意に減少するものを正常角膜内皮細胞マーカー、形質転換細胞において増強しており、正常細胞では有意に発現が低いものを形質転換角膜内皮細胞マーカーとして選定したことが記載されている（上記（１）ア～カ、ケ）。 そして、甲１の表２及び表３に記載される、正常ヒト角膜内皮細胞において発現が増強している表面抗原及び形質転換した細胞において発現が増強している表面抗原の解析結果から（上記（１）ケ）、次のとおりの細胞の発明が記載されていると認められる。 「培養した角膜内皮細胞を細胞形態が正常な正常細胞と正常でない形質転換細胞とに分離した場合の、細胞形態が正常なヒト角膜内皮細胞であって、該細胞の細胞表面抗原の表現型は、ＣＤ１６６、ＨＬＡ－Ａ２、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ９８、ＣＤ５９、ＣＤ５４、ＣＤ３４０、ＣＤ４７、ＥＧＦ－Ｒ、ＣＤ２９、ＣＤ７４、ＣＤ１６５、ＣＤ２２１、ＣＤ４９ａ、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ１３０及びＣＤ４９ｆが強陽性表現型、ＣＤ２６、ＣＤ９、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ１３、ＣＤ９９、ＣＤ１０５、ＣＤ６３、ＣＤ５８、ＣＤ２０１、ＣＤ５６、ＣＤ４４、ＣＤ５５、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ９１、ＨＬＡ－ＤＱ、ＣＤ１６４、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ９０、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＣＤ４６、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ８１、ＣＤ１５１、ＣＤ２００及びＣＤ１０が弱陽性～陰性表現型である、細胞。」（以下、「甲１発明」という。） （３）本件発明１について ア 対比 本件発明１と甲１発明とを対比すると、両者は、「ヒト角膜内皮細胞であって、該細胞の細胞表面抗原の表現型は、ＣＤ４４陰性～弱陽性表現型、ＣＤ１６６陽性表現型、ＣＤ１０５陰性～弱陽性表現型、およびＣＤ２６陰性表現型を含む、細胞。」である点で一致し、次の点で相違する。 （相違点１） 本件発明１は、「ヒト眼前房内への注入時にヒト角膜内皮機能特性を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞」であって、該細胞の細胞表面抗原の表現型として、「ＣＤ１３３陰性表現型」および「ＣＤ２４陰性表現型」も特定されているのに対して、甲１発明は、「培養した角膜内皮細胞を細胞形態が正常な正常細胞と正常でない形質転換細胞とに分離した場合の、細胞形態が正常なヒト角膜内皮細胞」であって、ＣＤ１３３およびＣＤ２４の表現型は特定されていない点。 イ 判断 甲１発明は、上記（２）のとおり、「培養した角膜内皮細胞」を「細胞形態が正常な正常細胞と正常でない形質転換細胞」という２種類の細胞に分離したときの、「細胞形態が正常なヒト角膜内皮細胞」である。 一方、本件発明は、「本発明者らは、培養ヒト角膜内皮細胞が培養中の細胞の相転移（線維化、上皮間葉系移行、老化、脱分化等）により複数の亜集団から構成されていることを世界において初めて見出し、培養中の亜集団を選択的に増殖する技術を考案することで、特定の亜集団、すなわち成熟分化ヒト角膜内皮細胞の機能を十分に有する機能性細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ（エフェクター）細胞とも称する。）が、細胞注入療法に最適な小型で六角形の敷石様形状を形成し、主にミトコンドリア機能によるエネルギー代謝系を利用する成熟分化内皮細胞であることを確認し、革新的な本発明を完成した。」（本件発明の詳細な説明【０００３】）というものであって、実施例１の表１Ｇａには、【０２９９】記載の条件で培養したヒト角膜内皮細胞は、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ２４及びＣＤ１０５の４種類のマーカーの発現の有無により４～１０の亜集団に分離できることが具体的データを伴って記載されており、本件発明１と甲１発明との一致点に含まれる表現型である、ＣＤ４４陰性、ＣＤ１６６陽性、ＣＤ１０５陰性という表現型の細胞の中に、ＣＤ２４陰性の細胞もＣＤ２４陽性の細胞も存在することが見て取れる。 また、甲１の実施例４には、不死化ヒト角膜内皮細胞のうちＣＤ７３が低発現である細胞は、ＣＤ１６６は高発現であって、「正常機能を示すＺＯ－１およびＮａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅがいずれも有意に多く発現していることが示される。したがって、ＣＤ７３（－）は、機能的な面でも、正常細胞を形質転換した細胞から区別することができるマーカーであることが示される。」（上記（１）サ）と記載されているが、本件の発明の詳細な説明には、「ＺＯ１およびＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅの発現からは均一性は保証されない」というタイトルで、「ＨＣＥＣのマーカーとして周知であるＺＯ１およびＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅの両方は、ＣＤ４４－の亜集団について染色されただけではなく、層状かつ線維芽細胞様の形態を有するＣＤ４４＋＋ＣＤ２４－の亜集団およびＣＤ４４＋＋ＣＤ２４＋の亜集団についても染色された(図３)。典型的な層状かつ線維芽細胞様の形態を有するＣＤ４４＋＋＋ＣＤ２４＋の亜集団はこれらを発現していなかった(図３)。」（【０３１４】）と記載されていることから、甲１発明の細胞は均一な細胞であるとは認められない。 以上によれば、甲１発明の細胞は均一ではなく、複数種類の亜集団を含むのに対して、本件発明１の細胞は、甲１発明の細胞よりも均一性の高い亜集団細胞であると認められるから、上記相違点１は実質的な相違点であり、本件発明１と甲１発明は同一であるとはいえない。 また、甲１においては、その請求項１に記載された「角膜内皮細胞の正常細胞・形質転換細胞を識別するためのマーカー」により、機能性が高い細胞を識別することができ、その結果従来不可能または困難であった疾患や障害を治療または予防することができるものとされており、当該両マーカーにより選択された細胞である甲１発明がさらなる亜集団からなるものであることをうかがわせる記載はなく、甲１発明をさらに選別して上記相違点１に係る構成をする動機付けは見いだせないから、上記相違点１に係る構成は当業者といえども、導き出すことはできない。したがって、本件発明１は、甲１発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものということもできない。 （４）本件発明２～１６、２２について 上記（３）のとおり、本件発明１は甲１発明に対して新規性及び進歩性を有するものであるから、本件発明１にさらなる限定を加えた本件発明２～１０、２２及び本件発明１の細胞を含む本件発明１１～１６、２２も同様に、甲１発明に対して新規性及び進歩性を有する。 （５）本件発明１７～２１について 本件発明１７、１８、２０、２１の「培養ヒト機能性角膜内皮細胞の品質管理または工程管理の方法」において品質管理又は工程管理される「培養ヒト機能性角膜内皮細胞」、及び本件発明１９、２０の「培養ヒト角膜内皮細胞に混在する角膜内皮非機能性細胞の検出方法」における「ヒト角膜内皮細胞」は、「細胞表面抗原の表現型が、ＣＤ４４陰性～弱陽性表現型、ＣＤ１６６陽性表現型、ＣＤ１３３陰性表現型、ＣＤ１０５陰性～弱陽性表現型、ＣＤ２４陰性表現型、およびＣＤ２６陰性表現型を含む」ものであって、本件発明１の細胞に他ならないから、本件発明１７～２１も、本件発明１と同様に、甲１発明に対して新規性及び進歩性を有する。 （６）異議申立人の主張について 異議申立人１は、上記相違点１について、正常角膜内皮細胞である甲１発明が、周知のがん幹細胞マーカーであるＣＤ１３３（異議１甲２～４）及び周知のがん細胞マーカーであるＣＤ２４（異議１甲５）が陰性であるという性質を有していることは、甲１に記載されているに等しい、又は、移植に用いる甲１発明を当該がん（幹）細胞マーカー陰性により選別することは当業者が容易に推考しうることである旨主張する。 また、異議申立人２は、上記相違点１について、正常角膜内皮細胞である甲１発明が、角膜実質細胞で発現が多いことが知られたＣＤ１３３（異議２甲４）及び周知のがん細胞マーカーであるＣＤ２４（異議２甲２、３）が陰性であるという性質を有していることは、甲１に記載されているに等しい、又は、移植に用いる甲１発明を当該がん（幹）細胞マーカー陰性により選別することは当業者が容易に推考しうることである旨主張する。 しかし、上記（３）イで判断したとおり、本件発明１の細胞は、甲１発明の細胞よりも均一性の高い亜集団細胞であると認められ、本件発明１と甲１発明は同一であるとはいえないし、甲１発明をさらに選別する動機付けは見いだせないから、たとえ異議申立人１及び２が主張するように、ＣＤ１３３及びＣＤ２４が周知のマーカーであったとしても、それらのマーカーに基づいて甲１発明の細胞をさらに選別することを当業者が容易に想到し得たとは認められない。 したがって、異議申立人１及び２の上記主張は採用することができない。 （７）小括 以上のとおりであるから、異議１理由２、３及び異議２理由１、２は、理由がない。 ３ 異議１理由４、５及び異議２理由３、４（実施可能要件違反、サポート要件違反）についての判断 （１）異議申立理由の具体的内容 ア 異議１理由４、５のア（本件発明１～２２の「ＣＤ１３３陰性表現型」） 本件発明１の「ヒト機能性角膜内皮細胞」は、「ＣＤ１３３陰性表現型」という発明特定事項を含むのに対して、実施例１ではＣＤ１３３について記載はあるものの、【０３１９】～【０３２１】の記載によれば、実施例１の実験手法はＣＤ１３３について解析できるものではない。また、その他のいずれの実施例にも、ＣＤ１３３の表現型について記載されていない。 したがって、発明の詳細な説明には、本件発明１の細胞が課題を解決できること、本件発明１の細胞をいかにして取得するのか、いかにして用いるかについて記載されていないといえる。 イ 異議１理由４、５のイ（本件発明１～２２の表現型の記載） 本件発明１では、細胞表面抗原の表現型について、「陰性～弱陽性表現型」、「陽性表現型」及び「陰性表現型」といった表現で規定している。 それに対して、発明の詳細な説明（【０１１８】～【０１２１】）には、細胞指標マーカーのＦＡＣＳにおけるシグナル強度に関する記載があるが、特定の測定条件におけるシグナル強度範囲の定義が記載されただけである。細胞表面抗原の表現型は、ＦＡＣＳに用いる装置の種類、装置の個体差、抗体のロットといった測定条件によって蛍光強度の結果が変化するため、測定条件や蛍光強度範囲が定義されていない本件発明１の範囲まで発明の詳細な説明の開示を拡張ないし一般化することはできない。また、当業者が本件発明１の細胞を得るには、測定条件を設定するのに過度の試行錯誤を要するといえる。本件発明２～２２についても同様である。 ウ 異議２理由３、４のア（本件発明１７～２１の課題解決手段） 発明の詳細な説明の【００９７】や【０１００】によれば、本件発明は、機能性ヒト角膜内皮細胞と非機能性ヒト角膜内皮細胞を識別する細胞表面マーカー（ＣＤ４４等）を特定し、これを利用して角膜内皮組織由来の細胞を培養した細胞集団の品質を管理することを特徴とする発明であると解される。 しかし、本件発明１７～２１は、角膜内皮組織由来の細胞を培養した細胞集団について、上記細胞表面マーカーの表現型を調べ、機能性ヒト角膜内皮細胞を検出する工程、すなわち課題解決手段を含んでいないから、発明の詳細な説明に記載された発明であるとはいえない。また、発明の詳細な説明は、本件発明１７～２１の全範囲を実施することができるように記載したものとはいえない。 エ 異議２理由３、４のイ（本件発明１１～１３、１５、１６の「細胞」の割合） 本件発明１１～１３、１５、１６では、「細胞集団」が「請求項１～１０のいずれか１項に記載の細胞」をどの程度含むかについて特定されていないから、上記発明には上記細胞をごく微量しか含まない細胞集団も含まれる。そのような細胞集団は、本件発明の効果を奏さないから、発明の詳細な説明に記載された発明とはいえない。また、発明の詳細な説明は、本件発明１１～１３、１５、１６を実施することができるように記載したものとはいえない。 オ 異議２理由３、４のウ（本件発明１４の「少なくとも７０％」） 本件発明１４の「細胞集団」は、本件発明１の細胞を少なくとも７０％含むことを特徴とする。 それに対して、発明の詳細な説明の【０１６４】の記載によれば、本件発明１４の「細胞集団」を得るためには、細胞亜集団をきっちりと確実に識別し分離することができる技術及び情報を確率することなどの、特別な手法が必要であるといえる。 また、フローサイトメトリーの結果において、閾値をどこに設定するかに応じて、陰性、陽性、中陽性及び強陽性の割合は変動し得るし、フローサイトメトリーの蛍光強度は測定条件や測定装置に応じてばらつきが出るから、細胞集団中の本件発明１の細胞の割合を特定できるとはいえない。 したがって、本件発明１４は、発明の詳細な説明に記載された発明とはいえない。また、発明の詳細な説明は、本件発明１４を実施することができるように記載したものとはいえない。 （２）判断 ア 異議１理由４、５のア（本件発明１～２２の「ＣＤ１３３陰性表現型」） 発明の詳細な説明の実施例１において、（結果）として、 「【０３１８】 フローサイトメトリー分析を、前房内への細胞注入に適応可能な亜集団を規定するためにさらに実施した。cHCECの表現型を、CD166、CD133、CD105、CD90、CD44、CD26、CD24、HLA-ABC、HLA-DR/DP/DQおよびPDL1について調べた。また、摘出直後の角膜組織中でのこれらのマーカーの発現も確認し、CD133、CD105、CD90、CD44、CD26、CD24、HLA-DR/DP/DQは発現されていないことを確認した(図６－Ｂ)。免疫組織学的試験に基づいて、CD133、CD105、CD90、CD44、CD26、CD24およびHLA-DR/DP/DQが陰性、かつCD166およびHLA-ABCが陽性である亜集団をエフェクター細胞（本発明の成熟分化角膜内皮機能性細胞に該当する）として定義して、細胞注入療法への適用を確実にした。代表的な免疫細胞学的染色を図６－Ｂに示した。本発明者らによる予備的ではあるがさらなる実験において、新鮮なヒト角膜内皮は、CD24、CD26、CD44、CD90およびCD133のいずれの存在も示さなかったが、明らかにCD166を強く発現していた。このことから、ここで示したcHCECの異数性を全く示さない亜集団の表現型は新鮮な角膜内皮組織中のHCECの亜集団と符合することが示される。」 と記載され、（結論）として、 「【０３３５】 本研究によって、cHCECが様々な細胞から構成されていることおよびCD44-、CD166+、CD133-、CD105-、CD24-、CD26-という表面発現を示すcHCECの特定の亜集団はCSTもEMTも起こさずに再現性良く培養できることを示した。上述のＣＤマーカーの組み合わせによって、ミトコンドリア依存的OXHOSへの傾倒を示すが、嫌気的解糖への傾倒は示さない亜集団を品質評価できる。このように識別した亜集団は核型異常を示さず、これにより安全かつ安定して治療のためにこの培養細胞を提供できるようになり、すなわち、水疱性角膜症の処置のための細胞懸濁液の形態でcHCECを前房中に移植することができるようになる。」 と記載されている。 上記記載によれば、実施例１において、ｃＨＣＥＣ（培養ヒト角膜内皮細胞）にフローサイトメトリー分析を実施してＣＤ１３３をはじめとする請求項１記載の６種類の細胞表面マーカーを含む１０種類のマーカーについて表現型を調べ、摘出直後の角膜組織や新鮮なヒト角膜内皮の表現型と符号する、ＣＤ１３３陰性をはじめとする請求項１記載の細胞表面マーカー表現型を示す細胞亜集団をエフェクター細胞と定義したこと、ｃＨＣＥＣ（培養ヒト角膜内皮細胞）のうち、ＣＤ１３３陰性をはじめとする請求項１記載の細胞表面マーカー表現型を示す細胞亜集団はＣＳＴやＥＭＴといった相転移を起こさずに再現性よく培養できることが具体的に示されているといえる。 異議申立人１は、【０３１９】～【０３２１】の記載によれば、実施例１の実験手法はＣＤ１３３について解析できるものではない旨主張するが、当該段落は、上記【０１３８】及び【０３３５】に記載された事項に関する実験手法とは認められないから、失当である。 したがって、異議１理由４、５のアは理由がない。 イ 異議１理由４、５のイ（本件発明１～２２の表現型の記載） 発明の詳細な説明においては、【０１１８】に、「陰性」は「発現が実質的にないもの」、「陽性」は「発現が有意に観察されるもの」、「弱陽性」は「その（発現レベルの）強度を３段階に分類」した場合の一番弱いものであることと、技術常識どおりの用語の意味が記載され、「標識の蛍光の種類、機器設定により蛍光強度が異なる」（【０１２０】）と注釈を付けたうえで、【０１１９】～【０１２２】に具体的な検出装置や条件下でのシグナル強度を例示しているのだから、本件発明１～２２に記載された細胞表面マーカーの表現型について、当業者が理解し、実施できる程度に明確に記載されていると認められる。 したがって、異議１理由４、５のイは理由がない。 ウ 異議２理由３、４のア（本件発明１７～２１の課題解決手段） 本件発明１７、１８、２０、２１の「培養ヒト機能性角膜内皮細胞の品質管理もしくは工程管理の方法」の対象となる「培養ヒト機能性角膜内皮細胞」、及び本件発明１９の「培養ヒト角膜内皮細胞に混在する角膜内皮非機能性細胞の検出方法」の「培養ヒト角膜内皮細胞」は、「ＣＤ４４陰性～弱陽性表現型、ＣＤ１６６陽性表現型、ＣＤ１３３陰性表現型、ＣＤ１０５陰性～弱陽性表現型、ＣＤ２４陰性表現型、およびＣＤ２６陰性表現型を含む」細胞、すなわち、本件発明が提供した課題解決手段であるヒト機能性角膜内皮細胞の細胞マーカー表現型を示す細胞であるから、本件発明１７～２１は、課題解決手段を含むものである。 したがって、異議２理由３、４のアは理由がない。 エ 異議２理由３、４のイ（本件発明１１～１３、１５、１６の「細胞」の割合） 発明の詳細な説明の冒頭には、 「【０００１】本発明は、ヒトの眼前房内への注入時にヒト角膜内皮機能特性を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞、その細胞を含む医薬、その製造法、およびその製造された細胞および製造工程の品質管理等の応用に関する。」 とあり、【０１６３】には、 「本発明の細胞集団は、機能性成熟分化角膜内皮細胞の比率が、天然に存在する比率よりも高められた比率で存在することが特徴である。」 と記載され、続く【０１６４】には、 「好ましい実施形態では、本発明の細胞集団における少なくとも５％以上の、約１０％以上の、約１５％以上の、約２０％以上の、約２５％以上の、約３０％以上の、約３５％以上の、約４０％以上の、約４５％以上の、約５０％以上の、約５５％以上の、約６０％以上の、約６５％以上の、約７０％以上の、約７５％以上の、約８０％以上の、約８５％以上の、約９０％以上の、約９５％以上の、約９８％以上の、約９９％以上の細胞が機能性成熟分化角膜内皮細胞であることが有利である。」 と記載されている。 これらの記載によれば、本件発明１１～１３、１５、１６の「細胞集団」における「請求項１～１０のいずれか１項に記載の細胞」、すなわち「ヒト機能性角膜内皮細胞」の比率は、天然に存在する比率よりも高められた、例えば【０１６４】に記載された程度のものであることが自明である。 したがって、異議２理由３、４のイは理由がない。 オ 異議２理由３、４のウ（本件発明１４の「少なくとも７０％」） 発明の詳細な説明の【０１６４】には、 「さらに好ましい実施形態では、本発明の細胞集団は、少なくとも約７０％以上の、より好ましくは少なくとも８０％以上の、さらにより一層好ましくは少なくとも約９０％以上の細胞が機能性成熟分化角膜内皮細胞であることが有利である。このレベルの機能性細胞の存在比を達成しようとした場合は、偶然の手法ではできず、細胞亜集団をきっちりと確実に識別し分離することができる技術および情報を確立することが必要であるからであり、従来の技術ではこのようなことは大凡不可能であったといえるからである。なお、発明の技術を用いることにより、機能性成熟分化角膜内皮細胞の比率は、さらに高めることができ、例えば、少なくとも約９５％以上の、少なくとも約９６％以上の、少なくとも約９７％以上の、少なくとも約９８％以上の、少なくとも約９９％以上の細胞が機能性成熟分化角膜内皮細胞である細胞集団も提供することができる。」 と記載されており、従来の技術では機能性成熟分化角膜内皮細胞を約７０％以上含むような細胞集団を確実に識別し分離することは大凡不可能であったところ、本件発明の細胞表面マーカー表現型を用いた選別により、約７０％にとどまらず、約９５％以上等の機能性成熟分化角膜内皮細胞を含む細胞集団を提供することができるようになったものと解される。そして、上記イで判断したとおり、陰性、弱陽性、陽性といった細胞表面マーカーの発現の程度（表現型）は、【０１１８】～【０１２２】の記載に基づいて当業者が決定できるものであり、細胞集団中の機能性成熟分化角膜内皮細胞の割合も決定できるものである。 したがって、異議２理由３、４のウは理由がない。 カ 小括 以上のとおりであるから、異議１理由４、５及び異議２理由３、４は理由がない。 ５ 異議１理由６（明確性要件違反） （１）異議申立理由の具体的内容 ア 異議１理由６のア（本件発明１～２２の表現型の記載） 本件発明１では、細胞表面抗原の表現型について、「陰性～弱陽性表現型」、「陽性表現型」及び「陰性表現型」といった表現で規定している。 それに対して、発明の詳細な説明（【０１１８】～【０１２１】）には、細胞指標マーカーのＦＡＣＳにおけるシグナル強度に関する記載があるが、特定の測定条件におけるシグナル強度範囲の定義が記載されただけである。細胞表面抗原の表現型は、ＦＡＣＳに用いる装置の種類、装置の個体差、抗体のロットといった測定条件によって蛍光強度の結果が変化するため、測定条件や蛍光強度範囲が定義されていない本件発明１の範囲は不明確である。本件発明２～２２についても同様である。 イ 異議１理由６のイ（本件発明１５、１６における達成すべき結果の記載） 本件発明１５の「前房内への注入時にアロ（同種異系）拒絶反応を生じさせない」及び本件発明１６の「血清のサイトカインプロファイルにおいて、生体への投与後に血清炎症性サイトカインの増量などのヒト角膜内皮組織再建に関連しない目的外生体応答を実質的に惹起しない」という発明特定事項は、発明が達成すべき結果であって、本件発明１５及び１６では達成するための事項は特定されていない。そして、異議１理由４、５アのとおり、発明の詳細な説明には、本件発明の細胞や細胞集団の実施例は記載されておらず、本件発明の細胞や細胞集団が、上記達成すべき結果を達成できると認識できるとはいえないから、本件発明１５及び１６は明確でない。 （２）判断 ア 異議１理由６のア（本件発明１～２２の表現型の記載） 発明の詳細な説明において、【０１１８】に、「陰性」は「発現が実質的にないもの」、「陽性」は「発現が有意に観察されるもの」、「弱陽性」は「その（発現レベルの）強度を３段階に分類」した場合の一番弱いものであることと、技術常識どおりの用語の意味が記載され、「標識の蛍光の種類、機器設定により蛍光強度が異なる」（【０１２０】）と注釈を付けたうえで、【０１１９】～【０１２２】に具体的な検出装置や条件下でのシグナル強度を例示しているのだから、本件発明１～２２における細胞表面マーカーの表現型の記載は、第三者に不測の不利益を及ぼすほどに不明確であるとはいえない。 したがって、異議１理由５のイは理由がない。 イ 異議１理由６のイ（本件発明１５、１６における達成すべき結果の記載） 本件発明１５の「前房内への注入時にアロ（同種異系）拒絶反応を生じさせない」は、文言上、第三者に不測の不利益を及ぼすほどに不明確であるとは認められない。そして、それに関連して、発明の詳細な説明には、本件発明のヒト機能性角膜内皮細胞は、他の亜集団に比較して免疫拒絶反応に係るＨＬＡクラスＩ抗原や細胞変性関連抗原の発現が低いこと（【００９５】、【０１６５】、【０２３８】）や、さらなる指標として、免疫拒絶反応に関連するＭＨＣ－１やＭＨＣ－２といった免疫関連抗原の発現強度を用いること（【０１２３】）が記載されており、本件発明のヒト機能性角膜内皮細胞を用いるだけで、あるいは、さらにＭＨＣ－１やＭＨＣ－２といった免疫関連抗原の発現強度により選別することで「前房内への注入時にアロ（同種異系）拒絶反応を生じさせない」ことを達成できると認識できる。 また、本件発明１６の「血清のサイトカインプロファイルにおいて、生体への投与後に血清炎症性サイトカインの増量などのヒト角膜内皮組織再建に関連しない目的外生体応答を実質的に惹起しない」文言上、第三者に不測の不利益を及ぼすほどに不明確であるとは認められない。そして、当該目的外生体応答に関連して、発明の詳細な説明には、従来の低品質の角膜内皮細胞は生体への投与後に目的外生体応答を惹起するのに対して、本件発明の機能性角膜内皮細胞は実質的に惹起しないことが具体的に示されている（図６１～６３、【０１７０】）から、本件発明のヒト機能性角膜内皮細胞自体が、「血清のサイトカインプロファイルにおいて、生体への投与後に血清炎症性サイトカインの増量などのヒト角膜内皮組織再建に関連しない目的外生体応答を実質的に惹起しない」ことが認識できる。 したがって、異議１理由６のイは理由がない。 ウ 小括 このとおり、異議１理由６は理由がない。 第５ むすび 以上のとおり、異議申立人１が主張する異議１理由１～６及び異議申立人２が主張する異議２理由１～４によっては、請求項１～２２に係る特許を取り消すことはできない。また、他に請求項１～２２に係る特許を取り消すべき理由を発見しない。 したがって、結論のとおり決定する。