2020-015227

本願は、平成２７年 ７月１６日（パリ条約による優先権主張 ２０１４年 ７月１８日 欧州特許庁）を国際出願日とする出願であって、その手続の経緯は以下のとおりである。

発明の詳細な説明には、次の事項が記載されている。

「【技術分野】

【0001】

本発明は、乾燥処理したたばこ製品の特性を変化させるためにたばこ中に発現されるプロテアーゼの使用に関する。特に本発明は、一つ以上のたばこプロテアーゼ遺伝子の発現を調節することによって、たばこ葉の乾燥処理を変化させ、かつたばこの葉の組成を調節するための工程を提供する。」

「【背景技術】

【0002】

たばこの乾燥処理は、各品種のたばこの芳香および風味を引き出す物理的および生化学的な変化の工程である。たばこが収穫された後、その風味を改善するために摂取前にこれを乾燥処理し、次にエージングする必要がある。四つの一般的な乾燥処理の方法があり、使用される方法はたばこのタイプおよびその意図される使用に依存する。」

「【0009】

今日まで、提唱されてきた乾燥処理工程を変化させるための唯一の方法は、選ばれた乾燥処理手順でたばこが露出される実際の条件を変化させることに基づいていた。乾燥処理の間のたばこ内での遺伝子発現についてはほとんど知られておらず、さらに、たばこ葉およびそれらから得られる製品内のプロテアーゼの活性に関しては少数のデータしか報告されていない。

【0010】

発明者らは、バーレー種、バージニア種、およびオリエント種の三つの主要なたばこのタイプで、葉の乾燥処理の間に活性化された８０個のプロテアーゼ遺伝子を特定した。発明者らは、特異的なプロテアーゼ発現がたばこ内の特定の風味プロファイルと関連付けられることを見出した。」

「【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

空気乾燥処理の時にバーレー種たばこで、熱風送管乾燥処理の時にバージニア種たばこで、および日光乾燥処理の時にオリエント葉たばこで上方調節される８０個のプロテアーゼ遺伝子（配列番号１～８０）が特定された。異なるたばこのタイプの一つ以上におけるこのような上方調節の詳細が、図２および表１および表２に要約されている。

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【0012】

乾燥処理の間にプロテアーゼ活性を調節または修飾するために、このような遺伝子配列およびその調節配列を使用することができる。配列番号１～８０のポリヌクレオチド配列はエクソン配列およびイントロン配列を含む。配列番号１～８０のポリヌクレオチド配列のコード配列部分に関するタンパク質配列は、配列番号８１～１６０に図示される。

【0013】

従って、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えのたばこ植物体細胞であって、

（ｉ）機能的プロテアーゼをコードし、かつ配列番号１～配列番号８０のうちのいずれか一つと少なくとも９５％の配列同一性を持つ配列を含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリヌクレオチド、

（ｉｉ）（ｉ）に記載したポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、

（ｉｉｉ）プロテアーゼをコードし、かつ配列番号８１～配列番号１６０と少なくとも９５％の配列同一性を持つ配列を含むか、それから成るか、またはそれから実質的に成るポリペプチド、または

（ｉｖ）（ｉ）に記載した単離ポリヌクレオチドを含む構築物、ベクター、または発現ベクターを含み、

かつプロテアーゼの発現または活性が、前記プロテアーゼの発現または活性が変化されなかった対照のたばこ植物体細胞と比較して調節される、たばこ植物体細胞が提供される。

【0014】

乾燥処理工程の間のたばこ細胞内のプロテアーゼ発現の変更は、乾燥処理したたばこおよびこれらから製造された製品に異なる風味を付与する。異なるたばこ風味プロファイルに対する異なる遺伝子の効果は、以下でさらに考察される。

【0015】

実施形態では、前記プロテアーゼの発現または活性は、対照たばこ植物体細胞と比較して上方調節される。ところが、一定の実施形態において、前記プロテアーゼの発現または活性は対照たばこ植物体細胞と比較して下方調節される。またさらなる実施形態において、同一の細胞内で少なくとも一つのプロテアーゼを下方調節するのと同時に少なくとも一つのプロテアーゼを上方調節することができる。」

「【図面の簡単な説明】

【0046】

・・・

【図2】 三つの主要なたばこのタイプで増大された８０の老化活性化したプロテアーゼ遺伝子の発現。」

「【0204】

実施例２

差次的発現。組織試料は、ＲＮＡ配列を使用して配列決定され、読取値はＴｏｐｈａｔ２を使用して３つの品種のゲノムにマッピングされる。以前出版された遺伝子モデルが、差次的遺伝子発現分析に対するベースとして使用される。乾燥処理間の発現の変化は、Ｃｕｆｆｄｉｆｆ２ソフトウェアを使用してマッピングした読取値に基づいて計算される。その発現レベルが乾燥処理の最初の４８時間の間に著しく増大した場合、および変化が著しくないかまたは低下した場合、遺伝子は上方調節されたと見なされる。たばこタンパク質は、３つの品種の転写物のデータベースに対するＢＬＡＳＴ検索によって特定され、また３つの品種の中で等価な遺伝子転写物は、３つの品種（バーレー種、バージニア種、およびオリエント種）の相互の最も良好なＢＬＡＳＴヒット検索によって特定される（ｅ－値カットオフ１ｅ－８０）。

【0205】

データ（図２）は、３つの乾燥処理した品種での老化活性化した遺伝子の数を示す。」

「【0206】

実施例３

実施例２で特定されたプロテアーゼ遺伝子は、既知のプロテアーゼファミリーのメンバーシップについて分析された。結果は表１に記載される。

【0207】

８０個の乾燥処理で活性化されるプロテアーゼ遺伝子は、２１個の異なるプロテアーゼファミリーに属することが分かっている。

【0208】

表において、ＡＣは空気乾燥、ＦＣは熱風送管乾燥処理、ＳＣは日光乾燥処理である。ＡＣ＋ＦＣ＋ＳＣは三つすべてのタイプのたばこで上方調節され、ＡＣ＋ＦＣは空気乾燥処理および熱風送管乾燥処理したたばこで上方調節され、ＡＣ＋ＳＣは空気乾燥処理および日光乾燥処理したたばこで上方調節され、ＦＣ＋ＳＣは熱風送管乾燥処理および日光乾燥処理したたばこで上方調節され、ＡＣ、ＦＣ、およびＳＣはそれぞれのたばこのタイプでのみ上方調節された。

【表1】

［図：0001395557000001.jpg］

」

「【0210】

実施例５ 表２は、空気乾燥処理したバーレー種（ＡＣ）、熱風送管乾燥処理したバージニア種（ＦＣ）および日光乾燥処理したオリエント種（ＳＣ）の三つのたばこのタイプの中の配列番号１～８０の差次的上方調節を例証する。

【表2】

［図：0001395557000002.jpg］

［図：0001395557000003.jpg］

［図：0001395557000004.jpg］

」

「【図2】

［図：0001395557000005.jpg］

」

審判請求人が、審判請求書、令和３年９月７日付け上申書、または令和４年６月６日付け意見書においてした主張とそれらに対する合議体の判断は次のとおりである。

ア 本願発明の課題について

（ア）審判請求人の主張

本願発明の最終的な課題は、拒絶理由で指摘されたとおり、乾燥処理したたばこ製品の特性を変化させることであるが、当該変化には多数の酵素やタンパク質（アミノ酸）が複雑に関係しており、当該最終的な課題を解決しうる手段を特定することは容易ではない。一方、アミノ酸がたばこ製品の風味や香りに寄与することは既に当該技術分野において確立された事実であり、タンパク質をアミノ酸に分解するプロテアーゼが乾燥処理の間にたばこの風味を変更する役割を有していることは従来知られていたといえるのだから、乾燥処理によるたばこの風味の変更において調節されるプロテアーゼを特定することは重要である。

したがって、本願発明の課題は、乾燥処理の間にプロテアーゼ活性が調節される遺伝子及びその配列を特定し、提供することであり、特に、補正後の本願発明の課題は、「オリエント種タイプ、バージニア種タイプ、またはバーレー種タイプであ」るたばこ植物において、「乾燥処理の間にプロテアーゼの発現又は活性の上方調節を直接もたらす」プロテアーゼ遺伝子及びその遺伝子配列を特定することである。

そして、発明の詳細な説明の実施例には、バーレー種、バージニア種及びオリエント種の三つの主要なたばこのタイプで、葉の乾燥処理の間に活性化されたプロテアーゼ遺伝子を具体的に特定したことが記載されているのだから、上記課題は解決していると当業者は理解しうる。

（イ）判断

請求人が主張する「乾燥処理の間にプロテアーゼ活性が調節される遺伝子及びその配列を特定し、提供する」という課題では、プロテアーゼ活性の調節により「乾燥処理したたばこ製品の風味をヒトが官能できる程度に変化させる」ことが可能であるとは限らず、本願発明の遺伝子及びその配列が、乾燥処理したたばこ製品の風味を変化させるうえにおいて有用なものであることまでは求められていない。

しかし、上記（２）でも述べたとおり、本願発明は、たばこ中に発現されるプロテアーゼ遺伝子の発現を調節するという手段を用いることで、乾燥処理したたばこ製品の特性を変化させることを企図したものであるから、当該遺伝子の調節が「たばこ製品の風味をヒトが官能できる程度に変化させる」ことを含めずに本願発明の課題を認定することはできないといえる。したがって、請求人が主張する課題は妥当性を欠くものである。

もっとも、上記（４）のとおり、発明の詳細な説明には、本願発明の「配列番号１、５または１０のうちのいずれか一つ」の遺伝子によりコードされる「配列番号８１、８５または９０のうちのいずれか一つ」のポリペプチドがプロテアーゼとして機能することを当業者が認識できるように記載されていないのだから、請求人が主張する課題についてさえも、解決できると当業者が認識できるように記載されてはいない。

イ プロテアーゼとしての機能について

（ア）審判請求人の主張

たばこ植物の既知の配列に対する配列の単純なＢＬＡＳＴ検索の結果からポリペプチドの名称（酵素名）、ひいては機能を理解し、特定することが可能である。令和３年９月７日付けで提出した、配列番号８１、８５及び９０について公的データベースを検索した結果（資料１）及びＢＬＡＳＴ整列で最も近い配列の特定の結果（資料２。本願優先日前の日付を有する最も近い配列を特定した。）のとおり、配列番号８１、８５及び９０のポリペプチドはシステインプロテアーゼであると理解し、特定することが可能である。

（イ）判断

特許法第３６条第６項第１号（サポート要件）は、特許請求の範囲の記載について「特許を受けようとする発明が発明の詳細な説明に記載したものであること。」を規定するものであるから、本願発明がサポート要件を満たすためには、発明の詳細な説明及び図面の記載事項に加えて本願出願時の技術常識を考慮することにより、配列番号１、５及び１０がコードする配列番号８１、８５及び９０のポリペプチドがプロテアーゼとして機能すると当業者が認識できることが必要である。

それに対して、審判請求人が主張する、既知の配列に対する配列のＢＬＡＳＴ検索の結果から配列番号８１、８５及び９０のポリペプチドをシステインプロテアーゼであると理解し、特定することは、発明の詳細な説明及び図面の記載事項に加え本願出願時の技術常識を考慮しても、当業者が認識できる範囲を超えている。

すなわち、発明の詳細な説明には、配列番号８１、８５及び９０のポリペプチドがシステインプロテアーゼであることは記載されていないし、アミノ酸配列や塩基配列を目視しただけではそれらの機能をできないというのが本願出願時の技術常識であるから、当業者といえども、発明の詳細な説明の記載に接し、配列表に記載された配列番号８１（３７０アミノ酸）、８５（３５７アミノ酸）及び９０（３５７アミノ酸）のアミノ酸配列やそれらをコードする配列番号１（２６９５塩基）、５（３４９６塩基）及び１０（３８７２塩基）の塩基配列といった長大な配列を目視しても、それらがプロテアーゼやシステインプロテアーゼである（をコードする）と認識することはできない。

そして、たとえ、あるアミノ酸配列のポリペプチドの機能を推定するために、既知の配列に対するＢＬＡＳＴ検索を行うという手法自体が本願出願時の技術常識であるとしても、発明の詳細な説明に記載された個別具体的な配列について当該手法を適用して得た個別具体的な結果は、本願発明の内容を理解、認識するために考慮できる本願出願時の技術常識ではない。

さらに、審判請求人が主張するように、既知のアミノ酸配列に対する配列のＢＬＡＳＴ検索の結果からポリペプチドが有する活性を推定できる場合があり得るとしても、アミノ酸配列の同一性の程度やアミノ酸の置換位置によっては、推定されたものとは異なる活性を示す場合があることは特段珍しくない。そして、本願明細書の実施例２には、例えば、どのようなデータベースを用いてＢＬＡＳＴ検索を行い、どのプロテアーゼ遺伝子とどの程度の同一性を有していたかなどの情報が不足しているため、本願出願時の技術常識を勘案しても、配列表に記載された配列番号８１、８５及び９０のアミノ酸配列やそれらをコードする配列番号１、５及び１０の塩基配列のみを手かがりに、それらがシステインプロテアーゼとしての機能を有することを推定はできない。もっとも、配列番号８１、８５及び９０のポリペプチドが、システインプロテアーゼとしての機能を有することを推定できたとしても、上記のとおり、推定されたものとは異なる活性を有する場合は特段珍しくないから、いずれにしても、配列番号８１、８５及び９０のポリペプチドが、システインプロテアーゼとしての機能を有することを当業者が理解し、特定することはできないといえる。

したがって、審判請求人の上記主張は失当である。

ウ アミノ酸含有量について

（ア）審判請求人の主張

酵素的加水分解によって生じた遊離アミノ酸がたばこ中に存在する風味化合物を生成するのに重要であることが知られていたから、当業者であれば、本願で特定されたプロテアーゼが乾燥処理の間の遊離アミノ酸含量の変化やそれによる風味プロファイルの変化の要因であることを理解し得る。

（イ）判断

上記（４）のとおり、配列番号１、５及び１０の遺伝子によりコードされる配列番号８１、８５及び９０のポリペプチドが「機能的プロテアーゼ」であることは、発明の詳細な説明によって裏付けられておらず、それらが酵素的加水分解を行い、遊離アミノ酸を生じさせることを当業者は認識できないから、審判請求人の上記主張は前提において誤りである。

仮に、上記ポリペプチドが加水分解を行うことが可能であったとしても、たばこの乾燥処理において発現レベルが上方調節される遺伝子は、上記の８０個以外にも、機能を特定できないものやプロテアーゼ以外の機能を有するもの等も含め多数存在すると考えられるから、「配列番号１、５または１０のうちのいずれか一つ」の遺伝子によりコードされる「配列番号８１、８５または９０のうちのいずれか一つ」のポリペプチドだけを上方調節するだけで、たばこ製品の風味をヒトが官能できる程度に変化させるように遊離アミノ酸含量や組成を変化させることができるとは、当業者といえども発明の詳細な説明から認識し得ないといえる。