2023-007294

特願２０１９－５４５２７３「操作されたトランスフェリン受容体結合ポリペプチド」拒絶査定不服審判事件〔平成３０年 ８月２３日国際公開、ＷＯ２０１８／１５２３２６、令和 ２年 ３月１９日特許出願公表、特表２０２０－５０８０４９〕について、次のとおり審決する。

結 論 本件審判の請求は、成り立たない。

理 由 第１ 手続の経緯 本願は、２０１８年２月１５日（パリ条約による優先権主張 ２０１７年２月１７日、２０１７年８月１０日、２０１７年１１月８日、いずれも米国）を国際出願日とする出願であって、その手続の概要は次のとおりである。 令和２年 ２月 ２日 ：手続補正書の提出 令和４年 ３月１１日付け：拒絶理由通知 令和４年 ９月 ８日 ：意見書、手続補正書の提出 令和４年１２月２７日付け：拒絶査定 令和５年 ５月 ２日 ：審判請求書、手続補正書提出 令和５年 ６月 ８日 ：審判請求書の請求の理由に対する手続補正書提出 第２ 補正却下の決定 令和５年 ５月 ２日にされた手続補正についての補正の却下の決定 ［補正却下の決定の結論］ 令和５年 ５月 ２日にされた手続補正（以下「本件補正」という。）を却下する。 ［理由］ １ 本件補正について 本件補正は、本件補正前の特許請求の範囲の請求項１を引用する請求項８を引用する請求項１０（以下、「本件補正前の請求項１０」という。」を、本件補正後の特許請求の範囲の請求項１を引用する請求項６を引用する請求項８（以下、「本件補正後の請求項８」という。）のように補正することを含むものである。 （補正前） 「【請求項１】 ヒトトランスフェリン受容体タンパク質１（ＴｆＲ１）に結合し、かつ血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して輸送され得る、改変ＣＨ３ドメインを含むＦｃ領域。」 「【請求項８】 ＣＨ３ドメイン内のアミノ酸の組を置換することで前記改変ＣＨ３ドメインが生成される、請求項１～７のいずれか１項に記載のＦｃ領域。」 「【請求項１０】 前記改変ＣＨ３ドメインが、１５７位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１８６位、１８９位、及び１９４位を含むアミノ酸位置の組において、５個、６個、７個、８個、または９個の置換を含み、前記置換及び前記位置がＣＨ３ドメイン配列である配列番号１のアミノ酸１１４～２２０を基準として決められる、請求項８または９に記載のＦｃ領域。」 とあったものを、 （補正後） 「【請求項１】 ヒトトランスフェリン受容体タンパク質１（ＴｆＲ１）に結合し、かつ血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して輸送され得る、改変ＣＨ３ドメインを含むＦｃ領域を含む、Ｆｃ－Ｆａｂポリペプチド二量体であって、ここで、該Ｆｃ領域は、ヒトＴｆＲ１との結合について、配列番号４～４６、２３６～２９９、３０２、及び３４７～５５３で示されるポリペプチドのいずれか１つと競合する、Ｆｃ－Ｆａｂポリペプチド二量体。」 「【請求項６】 ＣＨ３ドメイン内のアミノ酸の組を置換することで前記改変ＣＨ３ドメインが生成される、請求項１～５のいずれか１項に記載のＦｃ－Ｆａｂポリペプチド二量体。」 「【請求項８】 前記改変ＣＨ３ドメインが、１５７位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１８６位、１８９位、及び１９４位を含むアミノ酸位置の組において、５個、６個、７個、８個、または９個の置換を含み、前記置換及び前記位置が配列番号１を基準として決められる、請求項６または７に記載のＦｃ－Ｆａｂポリペプチド二量体。」 とする補正事項を含むものである。（下線は補正箇所である。） なお、便宜のため、請求項の引用形式を、引用形式を使用しない方式で書き下すと、以下のとおりとなる。 「（本件補正前の請求項１０） ヒトトランスフェリン受容体タンパク質１（ＴｆＲ１）に結合し、かつ血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して輸送され得る、改変ＣＨ３ドメインを含むＦｃ領域であって、 ＣＨ３ドメイン内のアミノ酸の組を置換することで前記改変ＣＨ３ドメインが生成され、 前記改変ＣＨ３ドメインが、１５７位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１８６位、１８９位、及び１９４位を含むアミノ酸位置の組において、５個、６個、７個、８個、または９個の置換を含み、前記置換及び前記位置がＣＨ３ドメイン配列である配列番号１のアミノ酸１１４～２２０を基準として決められる、 Ｆｃ領域。」 「（本件補正後の請求項８） ヒトトランスフェリン受容体タンパク質１（ＴｆＲ１）に結合し、かつ血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して輸送され得る、改変ＣＨ３ドメインを含むＦｃ領域を含む、Ｆｃ－Ｆａｂポリペプチド二量体であって、ここで、該Ｆｃ領域は、ヒトＴｆＲ１との結合について、配列番号４～４６、２３６～２９９、３０２、及び３４７～５５３で示されるポリペプチドのいずれか１つと競合する、Ｆｃ－Ｆａｂポリペプチド二量体であって、 ＣＨ３ドメイン内のアミノ酸の組を置換することで前記改変ＣＨ３ドメインが生成され、 前記改変ＣＨ３ドメインが、１５７位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１８６位、１８９位、及び１９４位を含むアミノ酸位置の組において、５個、６個、７個、８個、または９個の置換を含み、前記置換及び前記位置が配列番号１を基準として決められる、 Ｆｃ－Ｆａｂポリペプチド二量体。」 ２ 補正の適否 本件補正は、本件補正前の請求項１０の「Ｆｃ領域」を、「Ｆｃ領域を含む」「Ｆｃ－Ｆａｂポリペプチド二量体」に限定した上で、当該「Ｆｃ－Ｆａｂポリペプチド二量体」について「Ｆｃ領域は、ヒトＴｆＲ１との結合について、配列番号４～４６、２３６～２９９、３０２、及び３４７～５５３で示されるポリペプチドのいずれか１つと競合する」という限定を付加するものであって、本件補正前の請求項１０に記載された発明と、本件補正後の請求項８に記載される発明の産業上の利用分野及び解決しようとする課題は同一である。 また、本件補正は、本件補正前の請求項１０の「前記置換及び前記位置がＣＨ３ドメイン配列である配列番号１のアミノ酸１１４～２２０を基準として決められる」という表現を、「前記置換及び前記位置が配列番号１を基準として決められる」とすることで、アミノ酸の置換と位置の基準が配列番号１自体であることを明確化するものである。そして、当該補正は、令和４年３月１１日付け拒絶理由通知の理由２で「『前記改変ＣＨ３ドメインが、１５３位、１６４位、１６５位、及び１８８位を含む位置に１個、２個、３個、または４個の置換を更に含み、前記置換及び前記位置がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸１１４～２２０を基準として決められる』と記載されているが、この場合『ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸１１４～２２０を基準として』とは、アミノ酸の置換及び位置の決定においてどのような意味を有するかが理解できない。」とする拒絶理由に対応しようとするものである。 このため、上記の本件補正前の請求項１０に係る補正は、特許法第１７条の２第５項第２号に掲げる特許請求の範囲の減縮を目的とするもの、および、特許法第１７条の２第５項第４号に掲げる明りようでない記載の釈明（拒絶理由通知に係る拒絶の理由に示す事項についてするものに限る。）を目的とするものに、該当する。 上述のとおり、本件補正は特許法第１７条の２第５項第２号に掲げる特許請求の範囲の減縮を目的とするものを含むため、本件補正後の請求項８に係る発明（以下、「本件補正発明」という。）が、特許出願の際独立して特許を受けることができるものであるか（特許法第１７条の２第６項において準用する同法第１２６条第７項の規定に適合するか）について以下に検討する。 ３ 独立特許要件について （１）発明の詳細な説明等の記載内容 本願の発明の詳細な説明および図面には以下の記載がある。（下線は合議体が付与した。） 「【0406】 実施例２ 操作されたトランスフェリン受容体結合ポリペプチドの設計及び特性分析 ・・・ 【0446】 ＣＨ３Ｃクローンの作製及び特性分析 トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に対するＣＨ３Ｃライブラリーによる選択 ＣＨ３Ｃに対する酵母ライブラリーを上記に述べたようにしてＴｆＲに対してパニングし、分取した。最初の３回の分取ラウンドの集団濃縮ＦＡＣＳプロットを図６に示す。更なる２ラウンドの分取後、１種類のクローンをシークエンシングし、４個の固有の配列（すなわち、クローンＣＨ３Ｃ．１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ＣＨ３Ｃ．２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、ＣＨ３Ｃ．３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、及びＣＨ３Ｃ．４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７））を特定した。これらの配列は、１６１位に保存的Ｔｒｐを有し、いずれも１９４位に芳香族残基（すなわち、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＨｉｓ）を有していた。他の位置では高い多様性がみられた。 【0447】 第１世代ＣＨ３Ｃクローンの特性分析 ＣＨ３Ｃライブラリーから選択した４種類のクローンを、ＣＨＯまたは２９３細胞でＦａｂフラグメントとのＦｃ融合体として発現させ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ及びサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した後、ＥＬＩＳＡによりホロＴｆの存在下または非存在下でカニクイザル及びヒトＴｆＲに対する結合についてスクリーニングした。図７に示されるように、各クローンはいずれもヒトＴｆＲに結合し、結合は過剰量（５μＭ）のホロＴｆの添加によって影響されなかった。しかしながら、各クローンはカニクイザルＴｆＲにはそれほど結合しなかった。各クローンをヒトＴｆＲを内因性に発現する２９３Ｆ細胞に対する結合についても試験した。図８は、各クローンは２９３Ｆ細胞に結合したものの、全体的な結合は高親和性の陽性対照と比較して大幅に弱かったことを示している。 【0448】 次に、クローンＣＨ３Ｃ．３がＴｆＲ発現細胞内に内在化するかについて試験を行った。接着性ＨＥＫ２９３細胞を９６ウェルで約８０％コンフルエンスにまで増殖させ、培地を除去し、以下の各試料を１μＭの濃度で加えた。すなわち、ＣＨ３Ｃ．３抗ＴｆＲベンチマーク陽性対照抗体（Ａｂ２０４）、抗ＢＡＣＥ１ベンチマーク陰性対照抗体（Ａｂ１０７）、及びヒトＩｇＧアイソタイプ対照（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈより入手したもの）。細胞を３７℃及び８％ＣＯ２濃度で３０分間インキュベートした後、洗浄し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００で透過処理し、抗ヒトＩｇＧ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８二次抗体で染色した。更なる洗浄後、細胞をハイコンテント蛍光顕微鏡（すなわちＯｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘ（商標）システム）下でイメージングし、図９に示されるように細胞当たりの斑点の数を定量した。１μＭでは、クローンＣＨ３Ｃ．３は、抗ＴｆＲ陽性対照と同様の内在化の傾向を示したが、陰性対照は内在化を示さなかった。 【0449】 ＣＨ３Ｃクローンの二次操作 ヒトＴｆＲに対する初期のＣＨ３Ｃのヒットの親和性を改善し、カニクイザルＴｆＲに対する結合を導入する試みとして更なるライブラリーを作製した。ソフトランダム化のアプローチを用い、ＤＮＡオリゴを作製して最初の４つのヒットのそれぞれに基づいてソフト突然変異誘発を導入した。レジスターの第１の部分（ＷＥＳＸＧＸＸＸＸＸＹＫ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３）とレジスターの第２の部分（ＴＶＸＫＳＸＷＱＱＧＸＶ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４）を別々のフラグメントにより構築することにより、ソフトランダム化された各レジスターをＰＣＲ増幅でシャッフルした（例えば、クローンＣＨ３Ｃ．１からのレジスターの第１の部分が、クローンＣＨ３Ｃ．１、ＣＨ３Ｃ．２、ＣＨ３Ｃ．３、及びＣＨ３Ｃ．４からのレジスターの第２の部分と混合される、といった具合）。各フラグメントをすべて混合してから、表面発現及び選択を行うために酵母に導入した。 【0450】 選択スキームを図１０に示す。１ラウンドのＭＡＣＳと３ラウンドのＦＡＣＳの後、個々のクローンをシークエンシングした（クローンＣＨ３Ｃ．１７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、ＣＨ３Ｃ．１８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、ＣＨ３Ｃ．２１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、ＣＨ３Ｃ．２５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、ＣＨ３Ｃ．３４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、ＣＨ３Ｃ．３５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、ＣＨ３Ｃ．４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、及びＣＨ３Ｃ．５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５））。選択されたクローンは２つの大きな配列グループに分類された。グループ１のクローン（すなわち、クローンＣＨ３Ｃ．１８、ＣＨ３Ｃ．２１、ＣＨ３Ｃ．２５、及びＣＨ３Ｃ．３４）は、１５７位に半保存的Ｌｅｕを、１５９位にＬｅｕまたはＨｉｓを、１６０及び１６２位にそれぞれ保存的及び半保存的Ｖａｌを、１８６、１８９、及び１９４位にそれぞれ半保存的Ｐ－Ｔ－Ｗモチーフを有していた。グループ２のクローンは、１５７位に保存的Ｔｙｒを、１５９～１６３位にモチーフＴＸＷＳＸ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０２）を、１８６、１８９、及び１９４位にそれぞれ保存的モチーフＳ／Ｔ－Ｅ－Ｆを有していた。クローンＣＨ３Ｃ．１８及びＣＨ３．３５を、それぞれの配列グループの代表的な構成員として更なる実験で使用した。クローンＣＨ３Ｃ．５１は、そのレジスターの第１の部分はグループ１から、そのレジスターの第２の部分はグループ２からのものを有する点が着目された。 【0451】 ソフト突然変異誘発ライブラリーからのＣＨ３Ｃクローンの結合特性分析 ソフト突然変異誘発ライブラリーからの各クローンをＦｃ－Ｆａｂ融合ポリペプチドとして再フォーマット化し、上記に述べたようにして発現させ、精製した。図１２に示されるように、これらの変異体は、最初のライブラリーセレクションからの最も上のクローン（ＣＨ３Ｃ．３）と比較してヒトＴｆＲに対する改善されたＥＬＩＳＡ結合を有し、また、ホロＴｆと競合もしなかった。下記表７に示されるＥＣ５０値は、ホロＴｆの存在または非存在によって実験の誤差の範囲を超えて大きく影響されなかった。 【0452】 （表７）ホロＴｆの存在下または非存在下でのＴｆＲに対するＣＨ３Ｃ変異体のＥＬＩＳＡ結合のＥＣ５０値（ｎＭ） ［図：0001426197000001.jpg］ 【0453】 注目すべき点として、クローンＣＨ３Ｃ．３５は、高親和性の抗ＴｆＲ対照抗体Ａｂ２０４と概ね同程度にヒトＴｆＲに結合した。図１３に示されるように、ソフトランダム化ライブラリーから選択された各クローンは、２９３Ｆ細胞に対しても改善された細胞結合を有していた。同様な細胞結合アッセイにおいて、これらのクローンを、その表面に高いレベルのヒトまたはカニクイザルＴｆＲを安定的に発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞に対する結合について試験した。ソフトランダム化ライブラリーから選択された各クローンは、カニクイザルＴｆＲ（図１４（Ｂ））と同程度に、ヒトＴｆＲを発現する細胞に結合した（図１４（Ａ））が、親ＣＨＯ－Ｋ１細胞には結合しなかった（図１４（Ｃ））。その大きさ及び結合ＥＣ５０値は、ヒトＴｆＲと比較してカニクイザルＴｆＲでは大幅に低かった。データを下記表８に要約する。 【0454】 （表８）細胞に結合するＣＨ３ＣクローンのＥＣ５０及び最大ＭＦＩ（蛍光強度中央値）値 ［図：0001426197000002.jpg］ 【0455】 エピトープマッピング 操作されたＣＨ３Ｃ Ｆｃ領域がＴｆＲのアピカルドメインに結合するかを調べるため、ＴｆＲアピカルドメイン（ヒト及びカニクイザルについてそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７及び１０８）をファージの表面で発現させた。アピカルドメインを適正にフォールディングしてディスプレイするには、ループの１つを短縮する必要があり、配列を環状に並び替える必要がある（ファージ上で発現された配列は、ヒト及びカニクイザルでそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９及び１１０として特定される）。クローンＣＨ３Ｃ．１８及びＣＨ３Ｃ．３５をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、上記に述べたファージＥＬＩＳＡプロトコールに従った。要約すると、１％ＰＢＳＡによる洗浄及びブロッキング後、ファージディスプレイの各希釈液を加え、室温で１時間インキュベートした。次いで各プレートを洗浄し、抗Ｍ１３－ＨＲＰを加え、更なる洗浄後、各プレートをＴＭＢ基質で発色させ、２ＮのＮ２ＳＯ４でクエンチした。このアッセイではＣＨ３Ｃ．１８及びＣＨ３Ｃ．３５の両方ともアピカルドメインに結合した。 【0456】 カニクイザルＴｆＲに対する結合はヒトＴｆＲに対する結合よりも大幅に弱いことが知られているため、カニクイザルとヒトのアピカルドメインのアミノ酸の相違の１つ以上が、結合の差の要因となっている可能性が高いと仮説を立てた。したがって、ヒトの残基を対応するカニクイザル残基に置き換えた６つの一連の点突然変異をヒトＴｆＲのアピカルドメインに導入した。これらの変異体をファージ上にディスプレイさせ、ファージ濃度をＯＤ２６８により正規化し、ＣＨ３Ｃ．１８及びＣＨ３Ｃ．３５に対する結合をファージＥＬＩＳＡ滴定により試験した（図１６（Ｂ）及び（Ｃ））。抗Ｍｙｃ抗体９Ｅ１０への捕捉は、すべての変異体のディスプレイレベルが同様であったことを示した（図１６（Ａ））。ヒトＴｆＲ変異に対する結合によって、Ｒ２０８Ｇ変異の強い影響が明らかに示され、この残基がエピトープの重要部分であり、カニクイザル残基によってこの位置で負の影響が及ぼされることが示唆された。ファージにディスプレイさせたカニクイザルアピカルドメインにＧ２０８Ｒ変異を導入したところ、この変異がカニクイザルアピカルドメインに対する結合を著しく改善することが示された（図１６（Ｄ）及び（Ｅ））。これらの結果は、各ＣＨ３ＣクローンがＴｆＲのアピカルドメインに結合したこと、及び２０８位が結合に重要であるのに対して２４７、２９２、３６４、３７０、及び３７２位は重要度が大幅に低かったことを示すものである。 【0457】 パラトープマッピング Ｆｃドメイン内のどの残基がＴｆＲへの結合に最も重要であるかを理解するため、各変異体のＴｆＲ結合レジスター内の１個の位置を野生型に復帰変異させた変異体ＣＨ３Ｃ．１８及びＣＨ３Ｃ．３５の一連のクローンを作製した。得られた変異体を組換えによりＣＨ３Ｃ Ｆｃ－Ｆａｂ融合体として発現させ、ヒトまたはカニクイザルＴｆＲに対する結合について試験した（図１７）。ＣＨ３Ｃ．３５では、１６１及び１９４位は結合に絶対的に重要であり、これらのいずれかの野生型への復帰変異はヒトＴｆＲに対する結合を完全に消失させた。驚くべきことに、１６３位を野生型に復帰変異させることで、カニクイザルＴｆＲへの結合が顕著に上昇したのに対して、ヒトへの結合に影響はほとんどなかった。これに対して、残基１６３の野生型への復帰変異はＣＨ３Ｃ．１８ではほとんど影響がなかったが、この変異体では１８９及び１９４位の復帰変異がヒトＴｆＲへの結合を完全に消失させた。どちらの変異体においても、他の単一の復帰変異はヒトＴｆＲへの結合に若干の（負の）影響を示したのに対して、多くの場合でカニクイザルＴｆＲに対する結合は消失した。 【0458】 カニクイザルＴｆＲに対する結合を改善するための更なる操作 カニクイザルＴｆＲに対するＣＨ３Ｃ変異体の親和性を更に高めるために更なるライブラリーを調製した。これらのライブラリーは、理論上の多様性に関しておよそ１０７種類よりも少ないクローンとなるように設計されており、酵母表面ディスプレイを用いて多様性空間全体を網羅することが可能なものであった。これらのライブラリーの設計を図１８に示す。４つのライブラリーの設計を用い、すべてのライブラリーはＮＮＫまたは他の縮重コドン位置で縮重オリゴを使用して作製し、上記に述べたようにしてオーバーラップＰＣＲにより増幅した。 【0459】 第１のライブラリーは、ＣＨ３Ｃ．３５様配列のコンセンサスに基づいたものとした（図１８（Ａ））。この場合、１５７～１６１位をＹＧＴＥＷ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５）として一定に保つ一方で、１６２、１６３、１８６、１８９、及び１９４位を飽和突然変異誘発を用いて変異させた。 【0460】 第２のライブラリーは、ＣＨ３Ｃ．１８様配列のコンセンサスに基づいたものとした（図１８（Ｂ））。この場合、１５７位をＬｅｕ及びＭｅｔに限定し、１５９位をＬｅｕ及びＨｉｓに限定し、１６０位をＶａｌとして一定に保ち、１６１位をＴｒｐ及びＧｌｙに限定し、１６２位をＶａｌ及びＡｌａに限定し、１６３位を完全にランダム化し、１６４位をレジスターに追加して完全にランダム化し、１８６位をソフトランダム化し、１８９位を完全にランダム化し、１９４位を芳香族アミノ酸及びＬｅｕに限定した。 【0461】 第３のライブラリーでは、新たなランダム化された位置をライブラリーに追加した（図１８（Ｃ））。ＣＨ３Ｃ．１８及びＣＨ３Ｃ．３５をそれぞれ出発レジスターとする２つのバージョンを作製し、次いで、Ｅ１５３、Ｅ１５５、Ｙ１６４、Ｓ１８８、及びＱ１９２の更なる位置を飽和突然変異誘発によりランダム化した。 【0462】 第４のライブラリーは、ＣＨ３Ｃ．１８の特定の位置を一定に保ったが、コンセンサスライブラリーよりも低いバイアスで他の位置を変異させた（図１８（Ｄ））。１６０、１６１、及び１８６位を固定し、１５７、１５９、１６２、１６３、及び１８９位を飽和突然変異誘発によりランダム化し、１９４位は変異させたが芳香族残基及びＬｅｕに限定した。 【0463】 上記に述べたようにして、各ライブラリーを酵母でカニクイザルＴｆＲに対して４～５ラウンド選択し、単一のクローンをシークエンシングしてポリペプチド－Ｆａｂ融合体に変換した。カニクイザルＴｆＲへの結合における最大の濃縮が第２のライブラリー（すなわちＣＨ３．１８親の誘導体）から観察されたが、ヒトＴｆＲへの結合に若干の低下もみられた。 【0464】 ＣＨ３Ｃ成熟クローンの結合の特性分析 上記に述べたようにして、精製したＣＨ３Ｃ Ｆｃ－Ｆａｂ融合変異体と、プレートにコーティングしたヒトまたはカニクイザルＴｆＲとの結合ＥＬＩＳＡを行った。ＣＨ３Ｃ．１８成熟ライブラリーからの変異体であるＣＨ３Ｃ３．２－１、ＣＨ３Ｃ．３．２－５、及びＣＨ３Ｃ．３．２－１９がヒト及びカニクイザルＴｆＲとおおよそ等しいＥＣ５０値で結合したのに対して、親クローンのＣＨ３Ｃ．１８及びＣＨ３Ｃ．３５は、カニクイザルＴｆＲに対してヒトＴｆＲに、１０倍よりも高い結合を示した（図１９）。 【0465】 次に、新規なポリペプチドがヒト及びサルの細胞内に内在化するかについて試験を行った。「第１世代ＣＨ３Ｃクローンの特性分析」と題したセクションで上記に述べたプロトコールを用いて、ヒトＨＥＫ２９３細胞及びアカゲザルＬＬＣ－ＭＫ２細胞における内在化を試験した。図２０に示されるように、ヒト及びカニクイザルＴｆＲに対して同様に結合した変異体であるＣＨ３Ｃ．３．２－５及びＣＨ３Ｃ．３．２－１９は、ＣＨ３Ｃ．３５と比較して顕著に改善された内在化をＬＬＣ－ＭＫ２において示した。 【0466】 ＣＨ３Ｃクローンの更なる操作 更なる親和性成熟クローンであるＣＨ３Ｃ．１８及びＣＨ３Ｃ．３５に対する更なる操作において、骨格（すなわちレジスター以外の）位置に更なる変異を加えて、直接的相互作用、第２水和殻相互作用、または構造的安定化を介して結合を向上させた。これは、「ＮＮＫウォーク」または「ＮＮＫパッチ」ライブラリーの作製、及びこれらのライブラリーからの選択を行うことによって実現された。ＮＮＫウォークライブラリーでは、パラトープの近傍の残基に１つずつＮＮＫ変異を導入した。ＦｃｇＲＩに結合したＦｃ（ＰＤＢ ＩＤ：４Ｗ４Ｏ）の構造をみることにより、図２１に示されるように、元のライブラリーレジスターの近くの４４個の残基が調査の候補として特定された。詳細には、以下の残基、すなわち、Ｋ２１、Ｒ２８、Ｑ１１５、Ｒ１１７、Ｅ１１８、Ｑ１２０、Ｔ１３２、Ｋ１３３、Ｎ１３４、Ｑ１３５、Ｓ１３７、Ｋ１４３、Ｅ１５３、Ｅ１５５、Ｓ１５６、Ｇ１５８、Ｙ１６４、Ｋ１６５、Ｔ１６６、Ｄ１７２、Ｓ１７３、Ｄ１７４、Ｓ１７６、Ｋ１８２、Ｌ１８３、Ｔ１８４、Ｖ１８５、Ｋ１８７、Ｓ１８８、Ｑ１９１、Ｑ１９２、Ｇ１９３、Ｖ１９５、Ｆ１９６、Ｓ１９７、Ｓ１９９、Ｑ２１１、Ｓ２１３、Ｓ２１５、Ｌ２１６、Ｓ２１７、Ｐ２１８、Ｇ２１９、及びＫ２２０をＮＮＫ突然変異誘発の標的とした。Ｋｕｎｋｅｌ突然変異誘発を用いてこれらの４４種類のシングルポイントＮＮＫライブラリーを作製し、他の酵母ライブラリーについて上記に述べたように各産物をプールして電気穿孔法により酵母に導入した。 【0467】 これらのミニライブラリー（それぞれ１個の位置を変異させ、２０種類の変異体を生じる）の組み合わせによって小さいライブラリーが作製され、このライブラリーを、酵母表面ディスプレイを用いてより高い親和性の結合を生じる位置について選択した。ＴｆＲアピカルドメインタンパク質を用い、上記に述べたようにして選択を行った（図２２）。３ラウンドの分取の後、濃縮された酵母ライブラリーからのクローンをシークエンシングしたところ、特定の点突然変異がアピカルドメインタンパク質に対する結合を顕著に改善させるいくつかの「ホットスポット」位置が特定された。ＣＨ３Ｃ．３５では、これらの変異として、Ｅ１５３（Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、またはＧｌｎに変異させた）及びＳ１８８（Ｇｌｕに変異させた）が含まれた。ＣＨ３Ｃ．３５の単一変異体及び複合変異体の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１～２３、２３６～２４１、及び２９７～２９９に記載される。ＣＨ３Ｃ．１８では、これらの変異には、Ｅ１５３（Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＬｅｕに変異させた）及びＫ１６５（Ｇｌｎ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓに変異させた）が含まれた。ＣＨ３Ｃ．１８の単一変異体の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４２～２４７に記載される。 【0468】 「ＮＮＫパッチ」アプローチは、ＣＨ３Ｂライブラリーについて上記に述べたものと似ているが、各パッチはＣＨ３レジスターに直接隣接している。クローンＣＨ３Ｃ．３５を出発点として使用して以下のライブラリーを作製した。すなわち、 ＣＨ３Ｃパッチ１：アミノ酸位置：Ｋ２１、Ｒ２８、Ｙ１６４、Ｋ１６５、及びＴ１６６。 ＣＨ３Ｃパッチ２：アミノ酸位置：Ｑ１１５、Ｒ１１７、Ｅ１１８、Ｑ１２０、及びＫ１４３。 ＣＨ３Ｃパッチ３：アミノ酸位置：Ｔ１３２、Ｋ１３３、Ｎ１３４、Ｑ１３５、及びＳ１３７。 ＣＨ３Ｃパッチ４：アミノ酸位置：Ｅ１５３、Ｅ１５５、Ｓ１５６、及びＧ１５８。 ＣＨ３Ｃパッチ５：アミノ酸位置：Ｄ１７２、Ｓ１７３、Ｄ１７４、Ｓ１７６、及びＫ１８２。 ＣＨ３Ｃパッチ６：アミノ酸位置：Ｌ１８３、Ｔ１８４、Ｖ１８５、Ｋ１８７、及びＳ１８８。 ＣＨ３Ｃパッチ７：アミノ酸位置：Ｑ１９１、Ｑ１９２、Ｇ１９３、Ｖ１９５、及びＦ１９６。 ＣＨ３Ｃパッチ８：アミノ酸位置：Ｓ１９７、Ｓ１９９、Ｑ２１１、Ｓ２１３、及びＳ２１５；ならびに ＣＨ３Ｃパッチ９：アミノ酸位置：Ｌ２１６、Ｓ２１７、Ｐ２１８、Ｇ２１９、及びＫ２２０。 ＴｆＲアピカルドメインタンパク質を用い、上記に述べたようにして選択を行った。しかしながら、結合が向上したクローンは特定されなかった。 【0469】 別の態様では、本開示は、標的（例えば、トランスフェリン受容体）に対する非天然結合部位を有する改変Ｆｃポリペプチドの結合性を高めるための方法であって、（ａ）非天然部位の１０Å以内（例えば、９Å、８Å、７Å、６Å、５Å、４Å、３Å、２Å、１Å以内）の１つ以上の位置に１つ以上の置換を導入することと、（ｂ）標的への結合について改変Ｆｃポリペプチドを試験することと、を含む方法を特徴とする。標的（例えばトランスフェリン受容体）に対する改変Ｆｃポリペプチドの結合特性は、例えば、ファージ及び酵母選択法、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、すなわち、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）装置を使用するもの）、及びＦＡＣＳなどの当該技術分野で利用可能な方法を用いて測定することができる。 【0470】 いくつかの実施形態では、非天然結合部位は、以下の位置、すなわち、１５７位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１８６位、１８９位、及び１９４位のうちの１つ以上に置換を含む。 【0471】 いくつかの実施形態では、非天然結合部位の１０Å以内の１つ以上の位置における１つ以上の置換は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を基準として、Ｋ２１、Ｒ２８、Ｑ１１５、Ｒ１１７、Ｅ１１８、Ｑ１２０、Ｔ１３２、Ｋ１３３、Ｎ１３４、Ｑ１３５、Ｓ１３７、Ｋ１４３、Ｅ１５３、Ｅ１５５、Ｓ１５６、Ｇ１５８、Ｙ１６４、Ｋ１６５、Ｔ１６６、Ｄ１７２、Ｓ１７３、Ｄ１７４、Ｓ１７６、Ｋ１８２、Ｌ１８３、Ｔ１８４、Ｖ１８５、Ｋ１８７、Ｓ１８８、Ｑ１９１、Ｑ１９２、Ｇ１９３、Ｖ１９５、Ｆ１９６、Ｓ１９７、Ｓ１９９、Ｑ２１１、Ｓ２１３、Ｓ２１５、Ｌ２１６、Ｓ２１７、Ｐ２１８、Ｇ２１９、及びＫ２２０からなる群から選択される。 【0472】 ＣＨ３Ｃ．３５の親和性を改善するための更なる成熟ライブラリー ＮＮＫウォークライブラリーから変異の組み合わせを特定する一方でこれらの周辺にいくつかの更なる位置を追加するための更なるライブラリーを、上記の酵母ライブラリーについて述べたようにして作製した。このライブラリーでは、ＹｘＴＥＷＳＳ及びＴｘｘＥｘｘｘｘＦモチーフを一定に保ち、以下の６つの位置、すなわちＥ１５３、Ｋ１６５、Ｋ１８７、Ｓ１８８、Ｓ１９７、及びＳ１９９を完全にランダム化した。位置Ｅ１５３及びＳ１８８は、これらの位置がＮＮＫウォークライブラリーにおいて「ホットスポット」であったことから含めた。位置Ｋ１６５、Ｓ１９７、及びＳ１９９は、これらの位置が結合領域の位置を決定し得るコアの部分を構成することから含め、Ｋ１８７は、１８８位に隣接していることから選択した。 【0473】 このライブラリーを、上記に述べたようにして、カニクイザルＴｆＲのアピカルドメインのみによって分取した。５ラウンドの後に濃縮されたプールをシークエンシングし、特定された固有のクローンのＣＨ３領域の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８～２６５に記載される。 【0474】 ＣＨ３Ｃ．３５．２１の元のレジスター内の許容される多様性及びホットスポットの調査 次のライブラリーは、主要な結合パラトープ内の許容される多様性の全体像を調べるために設計した。用いたアプローチは、ＮＮＫウォークライブラリーと同様のものであった。元のレジスター位置（１５７、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１８６、１８９、及び１９４）のそれぞれ、ならびに２個のホットスポット（１５３及び１８８）をＮＮＫコドンで個々にランダム化することにより、酵母上で一連の単一位置飽和突然変異誘発ライブラリーを作製した。更に、それぞれの位置を個々に野生型残基に復帰変異させ、これらの個々のクローンを酵母上にディスプレイさせた。図２３は、野生型復帰変異及び単一位置のＮＮＫライブラリーと比較した親クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１の結合を示す。１５３、１６２、１６３、及び１８８位は、野生型残基に復帰変異させた際にＴｆＲに対する相当の結合を維持した唯一の位置であった点が着目された（１８６位の野生型への復帰変異で若干の残留はあるものの大幅に消失した結合が認められた）。 【0475】 単一位置のＮＮＫライブラリーを、ヒトＴｆＲアピカルドメインに対して３ラウンドで分取して、結合したもののうち、上位の約５％を回収し、次いで少なくとも１６種類のクローンを各ライブラリーからシークエンシングした。これらの結果は、ＣＨ３Ｃ．３５クローンと関連して、各位置でどのアミノ酸がヒトＴｆＲに対する結合を大きく低下させることなく許容され得るかを示している。以下に要約を示す。 位置１５３：Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、またはＧｌｕ； 位置１５７：ＴｙｒまたはＰｈｅ； 位置１５９：Ｔｈｒのみ； 位置１６０：Ｇｌｕのみ； 位置１６１：Ｔｒｐのみ； 位置１６２：Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＶａｌ（野生型のＡｓｎ残基は若干の結合を維持するようにみえたが、その後のライブラリー分取ではそのようにみえなかった点が着目された）； 位置１６３：ＳｅｒまたはＡｓｎ； 位置１８６：ＴｈｒまたはＳｅｒ； 位置１８８：ＧｌｕまたはＳｅｒ； 位置１８９：Ｇｌｕのみ；及び 位置１９４：Ｐｈｅのみ。 【0476】 上記の残基は、１個の変化として、または組み合わせでクローンＣＨ３Ｃ．３５内に置換された場合にＴｆＲアピカルドメインに対する結合を維持するパラトープの多様性を表す。これらの位置に変異を有するクローンが表９に示されており、これらのクローンのＣＨ３ドメインの配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３７～２４１、２６４、及び２６６～２９６に記載される。 【0477】 一価のポリペプチド－Ｆａｂ融合体 一価のＴｆＲ結合ポリペプチド－Ｆａｂ融合体の作製 Ｆｃドメインは自然でホモ二量体を形成するが、一方のＦｃ単位がＴ１３９Ｗのノブ変異（ＥＵ番号付けスキームを用いた場合に３６６位に相当）を有し、他方のＦｃ単位がＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖのホール変異（ＥＵ番号付けスキームを用いた場合にそれぞれ３６６、３６８、及び４０７位に相当）を有する「ノブ・イン・ホール」として知られる一連の非対称的変異によって２個のＦｃフラグメントの選択的ヘテロ二量体化を生じ得る。いくつかの実施形態では、本発明の改変ＣＨ３ドメインは、１３９位にＴｒｐを含む。いくつかの実施形態では、本発明の改変ＣＨ３ドメインは、１３９位にＳｅｒを、１４１位にＡｌａを、１８０位にＶａｌを含む。ヘテロ二量体のＴＦＲ結合ポリペプチドを、２種類のプラスミド（すなわち、ノブＦｃとホールＦｃ）の一過性の同時トランスフェクションにより２９３またはＣＨＯ細胞で発現させる一方で、ポリペプチド－Ｆａｂ融合体を３種類のプラスミド（すなわち、ノブ－Ｆｃ－Ｆａｂ重鎖、ホール－Ｆｃ－Ｆａｂ－重鎖、及び一般的な軽鎖）の一過性の同時トランスフェクションにより発現させた。分泌されたヘテロ二量体ポリペプチドまたはポリペプチド－Ｆａｂ融合体の精製を、ホモ二量体におけるのと同じようにして行った（すなわち、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを使用した２カラム精製に続いてサイズ排除クロマトグラフィーを行い、その後、必要に応じて濃縮及びバッファー交換を行う）。質量分析または疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて形成されたホモ二量体（例えば、ノブ－ノブ、またはホール－ホールで対合したＦｃ）に対するヘテロ二量体の量を決定した。典型的な調製物では、ポリペプチドの９５％超、しばしば９８％超がヘテロ二量体であった。明確さのため、この方法で作製されたすべての一価ＴｆＲ結合物（Ｆｃホモ二量体）を、ＺＺがポリペプチドの名前であるものとし、「．一価」が一価のＴｆＲ結合を示すものとして「ＺＺ．一価」と命名した。特に断らない限り、ヘテロ二量体ポリペプチド及びポリペプチド－Ｆａｂ融合体において、ＴｆＲ結合を与える変異には「ノブ」変異が含まれたのに対して、ＴｆＲに結合しないＦｃ領域は「ホール」領域とともに用いた。ある場合では、これらのコンストラクトには、Ｌ７Ａ／Ｌ８Ａ、Ｍ２５Ｙ／Ｓ２７Ｔ／Ｔ２９Ｅ、Ｎ２０７Ｓ、または改変されたＦｃγＲもしくはＦｃＲｎ結合に対してそれぞれＮ２０７Ｓ／Ｍ２０１Ｌなど、Ｆｃの特性を変化させる更なる変異も含まれていた。 【0478】 ＣＨ３Ｃ．一価Ｆｃポリペプチドの結合の特性分析 一価のＣＨ３Ｃポリペプチドの結合を、上記に述べた方法の改法を用いてＥＬＩＳＡで測定した。ストレプトアビジンをＰＢＳ中、１μｇ／ｍＬで一晩、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにコーティングした。洗浄後、プレートをＰＢＳ中、１％ＢＳＡでブロッキングした後、ビオチン化したヒトまたはカニクイザルＴｆＲを１μｇ／ｍＬで加え、３０分間インキュベートした。更に洗浄した後、ポリペプチドを各プレートに連続希釈で加え、１時間インキュベートした。各プレートを洗浄し、二次抗体（すなわち、抗κ－ＨＲＰ、１：５０００）を３０分間加え、プレートを再び洗浄した。各プレートをＴＭＢ基質で発色させ、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４でクエンチした後、ＢｉｏＴｅｋ（登録商標）プレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を読み取った。結果を図２４に示すが、これはスタンダード（すなわち、二価のＴｆＲ結合）と一価のＴｆＲ結合ポリペプチドとを直接比較したものである。Ａｂ２０４は、高親和性の抗ＴｆＲ対照抗体である。 【0479】 ヒトＴｆＲを内因性に発現する２９３Ｆ細胞、及びヒトＴｆＲまたはカニクイザルＴｆＲを安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ－Ｋ１細胞に対する結合について更に試験を行った（図２５）。 【0480】 一般的に、一価のポリペプチドでは二価のポリペプチドと比較してヒトＴｆＲに対して大幅に低下した結合が観察され、一価のポリペプチドではカニクイザルに対する結合は弱すぎてこれらのアッセイで検出されなかった。 【0481】 次に、ＣＨ３Ｃポリペプチドの一価のバージョンが、ヒトＴｆＲを発現するＨＥＫ２９３細胞内に内在化するかどうかについて試験した。内在化アッセイについて上記に述べた方法を用いた。二価と一価のポリペプチドを比較した図２６に示されるように、一価のペプチドも内在化することができたが、全体的なシグナルは、恐らくは結合アフィニティー／アビディティーの喪失のために対応する二価のバージョンよりも弱かった。 【0482】 バイオレイヤー干渉法によって測定したＣＨ３Ｃポリペプチドの結合速度論 結合速度論を、抗ＢＡＣＥ１ Ｆａｂに融合されたいくつかの一価及び二価ＣＨ３Ｃポリペプチド変異体について測定し、バイオレイヤー干渉法を用いてそれらの二価の相当物と比較した（すなわち、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＲＥＤシステムを用いた）。ＴｆＲをストレプトアビジンセンサー上に捕捉し、次いでＣＨ３Ｃポリペプチドを結合させて洗い流した。センサーグラムを１：１の結合モデルにフィッティングしたところ、二価ポリペプチドのＫＤ（ａｐｐ）値は、ＴｆＲ二量体に対する強い結合を示した。結果を、表１０ならびに図２７及び２８に示す。 【0483】 （表１０）Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＲＥＤを用いたＣＨ３Ｃポリペプチドの速度論 ［図：0001426197000003.jpg］ ｎ．ｄ．＝低すぎる結合シグナルのために測定されず。 【0484】 一価のフォーマットに変換されたポリペプチドは、アビディティーの喪失により、有意に弱いＫＤ（ａｐｐ）値を有した。ＥＬＩＳＡによって上記でヒト及びカニクイザルＴｆＲに対して同様の結合を有することが示されたクローンＣＨ３Ｃ．３．２－１、ＣＨ３Ｃ．３．２－５、及びＣＨ３Ｃ．３．２－１９は、ヒトＴｆＲとカニクイザルＴｆＲ間で極めて近いＫＤ（ａｐｐ）値も有していた。これらのポリペプチドの一価の形態を試験することを試みたが、このアッセイにおける結合は弱すぎて速度論パラメータは計算できなかった。 【0485】 実施例３ Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）を用いた更なるＣＨ３Ｃ変異体の結合の特性分析 組換えＴｆＲのアピカルドメインのクローン変異体の親和性をＢｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００装置を使用して表面プラズモン共鳴により測定した。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）シリーズＳ ＣＭ５のセンサーチップを抗ヒトＦａｂとともに固定化した（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅより販売されるヒトＦａｂ捕捉キット）。５μｇ／ｍＬのポリペプチド－Ｆａｂ融合体を各フローセル上に１分間捕捉させ、ヒトまたはカニクイザルアピカルドメインの連続３倍希釈液を流速３０μＬ／分で室温で注入した。各試料を４５秒間の結合及び３分間の解離により分析した。それぞれの注入後、１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ２．１）を用いてチップを再生した。結合応答を、無関連のＩｇＧを同様の密度で捕捉させたフローセルからのＲＵを引くことによって補正した。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ３．１．を用いて平衡状態の応答を濃度に対してフィッティングすることによって、安定状態の親和性を得た。 【0486】 組換えＴｆＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のクローン変異体の親和性を求めるため、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）シリーズＳ ＣＭ５センサーチップをストレプトアビジンとともに固定化した。ビオチン化したヒトまたはカニクイザルＴｆＲのＥＣＤを各フローセル上に１分間捕捉させ、各クローン変異体の連続３倍希釈液を流速３０μＬ／分で室温で注入した。各試料を４５秒間の結合及び３分間の解離により分析した。結合応答を、同様の密度でＴｆＲ ＥＣＤを有さないフローセルからのＲＵを引くことによって補正した。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ３．１．を用いて平衡状態の応答を濃度に対してフィッティングすることによって、安定状態の親和性を得た。 【0487】 結合親和性を表１１に要約する。親和性は安定状態のフィッティングにより得た。 【0488】 （表１１）更なるＣＨ３Ｃ変異体の結合親和性 ［図：0001426197000004.jpg］ 【0489】 更なるＣＨ３Ｃ変異体としてＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１、ＣＨ３Ｃ．３５．Ｓ４１３、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．３．１、ＣＨ３Ｃ．３５．Ｎ３９０．１、及びＣＨ３Ｃ．３５．２３．６．１を作製し、ヒトＴｆＲに対するそれらの結合親和性を上記に述べたものと同じプロトコールに従って測定した。ＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１、ＣＨ３Ｃ．３５．Ｓ４１３、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．３．１、ＣＨ３Ｃ．３５．Ｎ３９０．１、及びＣＨ３Ｃ．３５．２３．６．１の結合親和性は、それぞれ６２０ｎＭ、６９０ｎＭ、７５０ｎＭ、１７００ｎＭ、１９００ｎＭ、２０００ｎＭ、及び２１００ｎＭである。」 「【0514】 実施例６ ＣＨ３Ｃ．１８Ｆｃ及びトランスフェリン受容体アピカルドメインの結晶化 本実施例では、ＣＨ３Ｃ．１８とトランスフェリン受容体のアピカルドメイン（ＴｆＲ－ＡＤ）との間の結合界面の結晶化及び分析について述べる。 ・・・ 【0522】 結合界面の相互作用 ＣＨ３Ｃ．１８ ＦｃとＴｆＲ－ＡＤとの結合界面が図３５（Ａ）及び図３５（Ｂ）ならびに図３６（Ａ）及び３６（Ｂ）に示されている。図３７（Ａ）及び図３７（Ｂ）に示されるように、 ＣＨ３Ｃ．１８のＴｒｐ１５４と、ＴｆＲ－ＡＤのＡｒｇ２０８； ＣＨ３Ｃ．１８のＧｌｕ１５５と、ＴｆＲ－ＡＤのＡｒｇ２０８； ＣＨ３Ｃ．１８のＳｅｒ１５６と、ＴｆＲ－ＡＤのＡｒｇ２０８及びＬｅｕ２１２； ＣＨ３Ｃ．１８のＬｅｕ１５７と、ＴｆＲ－ＡＤのＳｅｒ１９９及びＡｓｎ２１５； ＣＨ３Ｃ．１８のＨｉｓ１５９と、ＴｆＲ－ＡＤのＬｙｓ１８８、Ｓｅｒ１９９、及びＡｒｇ２０８； ＣＨ３Ｃ．１８のＶａｌ１６０と、ＴｆＲ－ＡＤのＧｌｙ２０７及びＡｒｇ２０８； ＣＨ３Ｃ．１８のＴｒｐ１６１と、ＴｆＲ－ＡＤのＡｒｇ２０８、Ｖａｌ２１０、及びＬｅｕ２１２； ＣＨ３Ｃ．１８のＡｌａ１６２と、ＴｆＲ－ＡＤのＡｒｇ２０８； ＣＨ３Ｃ．１８のＶａｌ１６３と、ＴｆＲ－ＡＤのＬｅｕ２０９； ＣＨ３Ｃ．１８のＳｅｒ１８８と、ＴｆＲ－ＡＤのＴｙｒ２１１； ＣＨ３Ｃ．１８のＴｈｒ１８９と、ＴｆＲ－ＡＤのＴｙｒ２１１及びＬｅｕ２１２； ＣＨ３Ｃ．１８のＧｌｎ１９２と、ＴｆＲ－ＡＤのＬｙｓ１５８及びＧｌｕ２９４； ＣＨ３Ｃ．１８のＴｒｐ１９４と、ＴｆＲ－ＡＤのＬｅｕ２１２、Ｖａｌ２１３、Ｇｌｕ２１４、及びＡｓｎ２１５；ならびに ＣＨ３Ｃ．１８のＰｈｅ１９６と、ＴｆＲ－ＡＤのＡｒｇ２０８ の間で相互作用が認められた。更に、実施例２の「パラトープマッピング」と題したセクションで述べ、また、図３７（Ａ）及び図３７（Ｂ）に示されるように、ＣＨ３Ｃレジスターの外側のいくつかの位置もＴｆＲに対する結合に関与している。」 そして、図３７（Ａ）（Ｂ）はそれぞれ以下のとおりである。 「図３７（Ａ） ［図：0001426197000005.jpg］ 図３７（Ｂ） ［図：0001426197000006.jpg］ 」 「【0523】 実施例７ ＣＨ３Ｃ．３５ Ｆｃ及びトランスフェリン受容体アピカルドメインの結晶化 本実施例では、ＣＨ３Ｃ．３５とトランスフェリン受容体のアピカルドメイン（ＴｆＲ－ＡＤ）との間の結合界面の結晶化及び分析について述べる。 ・・・ 【0531】 結合界面の相互作用 ＣＨ３Ｃ．３５ ＦｃとＴｆＲ－ＡＤとの結合界面が図３９（Ａ）～３９（Ｃ）に示されている。図３９（Ａ）は、３．４ÅにおけるＣＨ３Ｃ．３５ ＦｃとＴｆＲ－ＡＤとの複合体を示す。図３９（Ｂ）は、ＣＨ３Ｃ．３５ Ｆｃ内の残基Ｗ１６１がＴｆＲ－ＡＤ内の残基Ｌ２０９、Ｌ２１２、及びＹ２１１によって安定化されていることを示す。図３９（Ｃ）は、ＣＨ３Ｃ．３５ Ｆｃ内の残基Ｅ１６０とＴｆＲ－ＡＤ内の残基Ｒ２０８間の中心的結合相互作用としての塩橋を示す。この相互作用は、ＦｃポリペプチドのヒトＴｆＲに対する結合親和性（２０８位のＡｒｇ）とカニクイザルＴｆＲに対する結合親和性（２０８位のＧｌｙ）との差を一部説明し得る。図４０（Ａ）は、ＣＨ３Ｃ．３５ ＦｃとＴｆＲ－ＡＤとの複合体と、ＣＨ３Ｃ．１８ ＦｃとＴｆＲ－ＡＤとの複合体（実施例６で述べたもの）とを重ね合わせた構造を示し、ＣＨ３Ｃ．１８とＣＨ３Ｃ．３５との間で大きなＦｃ骨格のコンフォメーション変化がみられないことを示している。図４０（Ｂ）は、図４０（Ａ）の重ね合わせ構造の拡大図を示す。ＣＨ３Ｃ．３５ Ｆｃ／ＴｆＲ－ＡＤ複合体のＴｆＲ－ＡＤ内の残基２０６～２１２は、ＣＨ３Ｃ．１８ Ｆｃ／ＴｆＲ－ＡＤ複合体のＴｆＲ－ＡＤ内の残基とは異なるコンフォメーションを取っていた。ＴｆＲ－ＡＤ内の残基Ｒ２０８は、ＣＨ３Ｃ．１８ Ｆｃ／ＴｆＲ－ＡＤ複合体の表面内に埋もれているようにみえるが、ＣＨ３Ｃ．３５ Ｆｃ／ＴｆＲ－ＡＤ複合体では溶媒に露出しているようにみえる。更に、ＣＨ３Ｃ．３５ Ｆｃ／ＴｆＲ－ＡＤ複合体のＴｆＲ－ＡＤの残基Ｌ２０９は、１８０°回転されて表面に結合しているようにみえるが、ＣＨ３Ｃ．１８ Ｆｃ／ＴｆＲ－ＡＤ複合体では表面から離れているようにみえる。 【0532】 図４１Ａ及び図４１Ｂに示されるように、 ＣＨ３Ｃ．３５のＴｈｒ１５９と、ＴｆＲ－ＡＤのＧｌｙ２０７、Ａｒｇ２０８、Ｌｙｓ１８８、及びＬｅｕ２０９； ＣＨ３Ｃ．３５のＧｌｕ１６０と、ＴｆＲ－ＡＤのＡｒｇ２０８及びＬｅｕ２０９； ＣＨ３Ｃ．３５のＳｅｒ１６２と、ＴｆＲ－ＡＤのＡｒｇ２０８及びＬｅｕ２０９； ＣＨ３Ｃ．３５のＳｅｒ１５６と、ＴｆＲ－ＡＤのＬｅｕ２０９； ＣＨ３Ｃ．３５のＴｒｐ１６１と、ＴｆＲ－ＡＤのＬｅｕ２０９、Ｔｙｒ２１１、及びＬｅｕ２１２； ＣＨ３Ｃ．３５のＧｌｕ１８９と、ＴｆＲ－ＡＤのＴｙｒ２１１及びＬｅｕ２１２； ＣＨ３Ｃ．３５のＰｈｅ１９４と、ＴｆＲ－ＡＤのＬｅｕ２１２、Ａｓｎ２１５、及びＶａｌ２１３； ＣＨ３Ｃ．３５のＴｙｒ１５７と、ＴｆＲ－ＡＤのＬｅｕ２１２、Ａｓｎ２１５、及びＳｅｒ１９９； ＣＨ３Ｃ．３５のＧｌｎ１９２と、ＴｆＲ－ＡＤのＶａｌ２１３及びＬｙｓ１５８；ならびに ＣＨ３Ｃ．３５のＰｈｅ１９６と、ＴｆＲ－ＡＤのＶａｌ２１３及びＬｅｕ２１２ の間で相互作用が認められた。 【0533】 更に、実施例２の「パラトープマッピング」と題したセクションで述べ、また、図４１（Ａ）及び図４１（Ｂ）に示されるように、ＣＨ３Ｃレジスターの外側のいくつかの位置もＴｆＲに対する結合に関与している。」 図４１（Ａ）（Ｂ）は、それぞれ以下のとおりである。 「 図４１（Ａ） ［図：0001426197000007.jpg］ 図４１（Ｂ） ［図：0001426197000008.jpg］ 」 「【0550】 実施例１１ ＣＨ３Ｃ．１８変異体の構築 本実施例では、ＣＨ３Ｃ．１８変異体のライブラリーの構築について述べる。 ・・・ 【0561】 （表６）ＣＨ３Ｃレジスターの位置及び変異 ［図：0001426197000009.jpg］ 【0562】 （表９）ＣＨ３Ｃ．３５．２１のレジスター内の許容される多様性の探索及びホットスポットの位置 ［図：0001426197000010.jpg］ 」 （２）実施可能要件についての検討 ア 実施可能要件の判断規範 物の発明について実施をすることができるとは、その物を作れることが必要である。そして、物の有する機能、特性等からその物の構造等を予測することが困難な技術分野において、機能、特性等で特定された物のうち、発明の詳細な説明に具体的に製造方法が記載された物及びその物から技術常識を考慮すると製造できる物以外の物について、当業者が明細書及び図面の記載並びに出願時の技術常識を考慮しても、どのように作るか理解できない場合(例えば、そのような物を作るために、当業者に期待し得る程度を超える試行錯誤、複雑高度な実験等をする必要がある場合)は、実施可能要件を満たさないと解するべきである。 イ 判断 （ア）本件補正発明は、「Ｆｃ－Ｆａｂポリペプチド二量体」という物に係る発明であって、「ヒトトランスフェリン受容体タンパク質１（ＴｆＲ１）に結合し、かつ血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して輸送され得る」という、機能、特性によって特定された物である。そして、一般的に「Ｆｃ－Ｆａｂポリペプチド二量体」はヒトトランスフェリン受容体タンパク質１（ＴｆＲ１）に結合するものではなく、また、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して輸送され得るものでもない。また、「ヒトトランスフェリン受容体タンパク質１（ＴｆＲ１）に結合し、かつ血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して輸送され得る」という機能や特性を実現するための具体的な構造が明らかにされているといった事情も本願の出願日当時に見当たらない。このため、本件補正発明は、物の有する機能、特性等からその物の構造等を予測することが困難な技術分野に属する発明であるといえる。 とすると、本願明細書の発明の詳細な説明の記載が、本件補正発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者がその実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載したものである、といえるか否かを判断するには、上記アの判断規範にしたがって判断することとなる。 （イ）上記（１）を見るに、本願の発明の詳細な説明や図面からは、ＣＨ３ドメインの１５７位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１８６位、１８９位、及び１９４位がトランスフェリン受容体タンパク質との結合に関与していることがうかがわれる。特に、【0475】には、「位置１５７：ＴｙｒまたはＰｈｅ；位置１５９：Ｔｈｒのみ；位置１６０：Ｇｌｕのみ・・・」のように、当該結合に関与するこれらの位置のアミノ酸の種類が各位置毎に具体的に挙げられ、【0522】や【0532】には、「ＣＨ３Ｃ．１８のＬｅｕ１５７と、ＴｆＲ－ＡＤのＳｅｒ１９９及びＡｓｎ２１５；ＣＨ３Ｃ．１８のＨｉｓ１５９と、ＴｆＲ－ＡＤのＬｙｓ１８８、Ｓｅｒ１９９、及びＡｒｇ２０８；ＣＨ３Ｃ．１８のＶａｌ１６０と、ＴｆＲ－ＡＤのＧｌｙ２０７及びＡｒｇ２０８・・・」のように、ＣＨ３ドメインの各位置のアミノ酸とトランスフェリン受容体タンパク質のアミノ酸とが相互作用することで両者の結合が生じ得ることについても説明されている。 しかしながら、これらに記載されているのは、ＣＨ３ドメインの特定種類のアミノ酸がトランスフェリン受容体タンパク質と相互作用することでＣＨ３ドメインとトランスフェリン受容体タンパク質との結合が生じ得ることであって、いかなる種類のアミノ酸であってもトランスフェリン受容体タンパク質と相互作用することでＣＨ３ドメインとトランスフェリン受容体タンパク質との結合が生じるかについては、何ら記載されていない。 （ウ）ここで、タンパク質同士の結合は、水素結合によるものや、疎水性相互作用によるものが知られている（なお、本願図４１ＡＢにおける「非結合接触」が疎水性相互作用を指し示すものであることは、当業者に自明である。）。そして、水素結合によるものは、水素結合を可能にする側鎖を有するアミノ酸同士で初めて実現し、疎水性相互作用によるものは、疎水性相互作用を可能にする側鎖を有するアミノ酸同士で初めて実現するものであって、あらゆるアミノ酸同士で生じるものではないことは、当業者にとって技術常識である。 （エ）本件補正発明は「改変ＣＨ３ドメインが、１５７位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１８６位、１８９位、及び１９４位を含むアミノ酸位置の組において、５個、６個、７個、８個、または９個の置換を含」むとの特定があるにとどまり、それぞれの位置にどのような種類のアミノ酸を有するかについては何らの特定もなく、タンパク質を構成するアミノ酸が２０種類あることに鑑みると、それぞれの位置に２０種類の選択肢が存在することとなる。 とすると、「改変ＣＨ３ドメインが、１５７位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１８６位、１８９位、及び１９４位を含むアミノ酸位置の組において、５個、６個、７個、８個、または９個の置換を含」む本件補正発明の場合、一番少ない５個の置換を含む場合でも９Ｃ５＊２０５＝４０３，２００，０００通り、９個の置換を含む場合は２０９＝５１２，０００，０００，０００通りもの可能性があり、本願明細書に記載されている例を除いて、それぞれについて、ＣＨ３ドメインを作成し、実際にＣＨ３ドメインと配列番号４～４６、２３６～２９９、３０２、及び３４７～５５３として挙げられた、３１５種類のポリペプチドとトランスフェリン受容体タンパク質との結合について競合するか否かを確認する作業、さらには血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して輸送されることを確認する作業が必要となり、当業者に期待し得る程度を超える試行錯誤が必要であるといわざるを得ない。 さらに、本件補正発明の場合、発明の対象となる「もの」は、「ヒトトランスフェリン受容体タンパク質１（ＴｆＲ１）に結合し、かつ血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して輸送され得る、改変ＣＨ３ドメインを含むＦｃ領域」であって、「該Ｆｃ領域は、ヒトＴｆＲ１との結合について、配列番号４～４６、２３６～２９９、３０２、及び３４７～５５３で示されるポリペプチドのいずれか１つと競合する」、「Ｆｃ－Ｆａｂポリペプチド二量体」という「もの」であるから、当業者は明細書の記載自体から「ヒトトランスフェリン受容体タンパク質１（ＴｆＲ１）に結合し、かつ血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して輸送され得る」ものであって、「ヒトＴｆＲ１との結合について、配列番号４～４６、２３６～２９９、３０２、及び３４７～５５３で示されるポリペプチドのいずれか１つと競合する」ものを化合物自体として特定して把握することができること、いいかえれば、明細書の記載自体からある化学構造の化合物が本願発明に該当するかどうかを認識・判断することができなければならないというべきである。そうすると、当業者がポリペプチド競合試験や血液脳関門通過試験工程を含む試験過程を経なければ発明の対象となる化合物を把握することができないという点において、候補化合物の多寡、スクリーニング対象となる化合物群ないしライブラリーの入手のしやすさ、検出に要する時間の長短、スクリーニング操作が簡便であるかなどにかかわらず、本願明細書の発明の詳細な説明は、その発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が本願発明の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているとはいえない。 （オ）実施可能要件についての小括 以上のとおり、本願の発明の詳細な説明は、当業者がその実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載したものであるとはいえない。 （３）サポート要件についての検討 ア 本件補正発明の課題 本願明細書の「【0003】本発明者らは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に結合可能なＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むポリペプチドを開発した。これらのポリペプチドは、新規なＴｆＲ結合部位を生成するＣＨ２またはＣＨ３ドメイン内の置換により操作されている。ＴｆＲは血液脳関門（ＢＢＢ）で高度に発現され、ＴｆＲはトランスフェリンを血液から脳内に自然に移動させる。これらのポリペプチドはＴｆＲに結合することから、これらのポリペプチドもまた、ＢＢＢを通過して輸送され得て、これらのポリペプチドを更に利用して、結合させた治療剤（例えば、治療ポリペプチド、Ｆａｂのような抗体可変領域、及び小分子など）をＢＢＢを通過して輸送することができる。このアプローチは、治療剤の脳への取り込みを大幅に改善することができるため、脳への送達が効果的である障害及び疾病を治療するうえで極めて有用である。」との記載より、本件補正発明の解決しようとする課題は、「トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に結合可能で、血液脳関門を通過して輸送され得る、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドの開発」であると認められる。 イ 判断 本願明細書には、（表８）及び（表９）に記載されているように１５７～１９４位に対応するＣＨ３Ｃレジスターに変異を導入したクローンＣＨ３Ｃ．１～ＣＨ３Ｃ．３５．２３．６．１が作成されたことが記載され、そのうち、ＣＨ３Ｃ．３、ＣＨ３Ｃ．１７、ＣＨ３Ｃ．１８、ＣＨ３Ｃ．２５、ＣＨ３Ｃ．３５、ＣＨ３Ｃ．５１はヒトトランスフェリン受容体タンパク質と結合したこと（表７）、（表８）、（表１０）、（表１１）が記載されている。 しかしながら、これらはいずれも、例えば１５９位がＴ又はＨ、１６０位がＥ又はＶ、１６１位がＷ、１６２位がＳ、Ｖ又はＡ、１８９位がＤ、Ｅ又はＴ、１９４位がＨ、Ｆ又はＷのような特定のアミノ酸の組み合わせでしかなく、またこれら特定のアミノ酸の組み合わせは発明を特定する事項ではない。 一方で、【0457】には、「ＣＨ３Ｃ．３５では、１６１及び１９４位は結合に絶対的に重要であり、これらのいずれかの野生型への復帰変異はヒトＴｆＲに対する結合を完全に消失させた。」と記載されているように、個々の１アミノ酸の種類によってヒトトランスフェリン受容体タンパク質への結合の有無が左右されることも記載されている。そして本件補正発明の発明特定事項のうち、「Ｆｃ－Ｆａｂポリペプチド二量体」の化学構造を規定する発明特定事項で特定される範囲に、このようなヒトトランスフェリン受容体タンパク質に結合しないものが含まれている。 このように、実施例の記載は、単に上記特定のアミノ酸の組み合わせを有するクローンがヒトトランスフェリン受容体タンパク質と結合したことを示すのみであって、このような実施例の記載から、１５７位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１８６位、１８９位、及び１９４位を含むアミノ酸位置の組において、５個、６個、７個、８個、または９個の置換を含み、前記置換及び前記位置がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸１１４～２２０を基準として決められる、Ｆｃ領域という膨大な組み合わせのうち、どのような変異クローンがヒトトランスフェリン受容体タンパク質と結合するか、さらには血液脳関門を通過して輸送されるかどうかについては、当業者といえども理解することはできない。 したがって、本件補正発明の課題である、「トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に結合可能で、血液脳関門を通過して輸送され得る、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドの開発」が、本件補正発明の発明特定事項によって解決できているとはいえない。 以上のとおり、本件補正発明は特許を受けようとする発明が発明の詳細な説明に記載したものであるとはいえない。 （４）請求人の主張について ア 請求人の主張 請求人は、令和５年 ６月 ８日の手続補正で補正された審判請求書において、概ね以下の主張をしている。 「本発明者らは、CH3ドメインの変異誘発のための適切な出発点を特定し（実施例２参照）、ヒトTfR1結合CH3ドメインを特定するための明確なプロトコルを定め（実施例２～４参照）、そのようなTfR1結合改変CH3ドメインがマウス及びサルの両方においてインビボのBBBを有効に通過することを示しました（実施例５及び８参照）。補正後の請求項で規定される特徴を有する多数の例示的な修飾CH3ドメインは、本願によって提供されています（例えば、実施例１０及び１１、表１～５、６及び９、並びに、段落[0563]から始まる配列リスト参照）。したがって、本願は、当業者が、ヒトTfR1に特異的に結合し、BBBを通過することができる更なる改変CH3ドメインを同定するための全てのツール及び手法を提供するものであります。このようなツールおよび手法は先行技術に欠けていたため、本願におけるこれらの提供は、脳を標的とする治療薬の全く新しい分野を切り開くものであります。」 イ 判断 請求人は、「本願は、当業者が、ヒトTfR1に特異的に結合し、BBBを通過することができる更なる改変CH3ドメインを同定するための全てのツール及び手法を提供するものであります。このようなツールおよび手法は先行技術に欠けていたため、本願におけるこれらの提供は、脳を標的とする治療薬の全く新しい分野を切り開くものであります。」と主張するが、本件補正発明は、「ヒトトランスフェリン受容体タンパク質１（ＴｆＲ１）に結合し、かつ血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して輸送され得る、改変ＣＨ３ドメインを含むＦｃ領域」であって、「該Ｆｃ領域は、ヒトＴｆＲ１との結合について、配列番号４～４６、２３６～２９９、３０２、及び３４７～５５３で示されるポリペプチドのいずれか１つと競合する」、「Ｆｃ－Ｆａｂポリペプチド二量体」という「もの」の発明であって「ツール」や「手法」そのものではなく、これら「ツール」や「手法」を用いて得られる可能性がある全ての「もの」に係る発明である。 そして、本願明細書で所望のＣＨ３ドメインをスクリーニングするプロトコルが記載されていたとしても、上記（２）イで述べたとおり、本件補正発明には天文学的数字ともいえる膨大な選択肢があり、かつ【0457】に、「ＣＨ３Ｃ．３５では、１６１及び１９４位は結合に絶対的に重要であり、これらのいずれかの野生型への復帰変異はヒトＴｆＲに対する結合を完全に消失させた。」と記載されているように、個々の１アミノ酸の種類によってヒトＴｆＲへの結合の有無が左右されるのであるから、当該膨大な選択肢についてプロトコルを実施して所望のＣＨ３ドメインが得られるかを確認することは、当業者に期待し得る程度を超える試行錯誤が必要であって、本件補正発明の課題を解決する手段に対応したものでもない。よって、当該請求人の主張は採用することができない。 ４ 補正却下の決定の小括 よって、本件補正は、特許法１７条の２第６項において準用する同法１２６条７項の規定に違反するので、同法１５９条１項の規定において読み替えて準用する同法５３条１項の規定により却下すべきものである。 よって、上記補正の却下の決定の結論のとおり決定する。 第３ 本願発明 本件補正は、上記のとおり却下されたので、本願の請求項に係る発明は、令和４年 ９月 ８日にされた手続補正により補正された特許請求の範囲の請求項１～２２に記載された事項により特定されるものであるところ、その請求項１を引用する請求項８を引用する請求項１０（すなわち、本件補正前の請求項１０）に係る発明（以下、「本願発明」という。）は、前記第２［理由］１に（補正前）として記載のとおりのものである。 第４ 原査定の概要 拒絶査定の理由は、概略、次のものを含む。 ＣＨ３ドメインは本来ＴｆＲ１に結合しない分子である。また、発明の詳細な説明には、ＴｆＲ１に結合する特定の配列のＣＨ３ドメインが開示されているのみである。そして、一般にタンパク質は、置換されるアミノ酸の位置が決定されたとしても、置換後のアミノ酸の種類によってその性質は大きく変化するが、その変化の正確な予想はおよそ不可能であったといえ、また出願人も認めるように、ヒトＴｆＲ１との結合活性に寄与するアミノ酸の種類はスクリーニングを新たに行うことによって初めて明らかにされるものであったことを鑑みると、上記の位置からおのずと置換するべきアミノ酸の種類が決定されるものではなかったといえ、ＴｆＲ１に結合しないものの方がはるかに多い中から目的のものを得るといったように、当業者といえども過度の負担を要するものであったといえる。 したがって、この出願の発明の詳細な説明は、当業者が請求項１０に係る発明を実施することができる程度に明確かつ十分に記載されたものでなく、特許法第３６条第４項第１号に規定する要件を満たしていない。 また、発明の詳細な説明の記載、及びＣＨ３ドメインに関する出願時の技術常識に照らしても、ヒトＴｆＲ１に対する結合が裏付けられていないＣＨ３ドメインに関する請求項１０に係る発明の範囲まで、発明の詳細な説明に開示された内容を拡張ないし一般化できないため、特許法第３６条第６項第１号に規定する要件を満たしていない。 第５ 判断 第２の３で述べたとおり、本件補正発明は発明の詳細な説明に記載したものとはいえないところ、本願発明は本件補正発明を態様として明らかに含むものであるから、本願の発明の詳細な説明は、当業者が本願発明に係る発明を実施することができる程度に明確かつ十分に記載されたものでなく、特許法第３６条第４項第１号に規定する要件を満たしていないし、本願発明は発明の詳細な説明に記載したものとはいえず、特許法第３６条第６項第１号に規定する要件を満たしていない。 第６ むすび 以上のとおり、本願発明は、特許法第３６条第６項第１号に規定する要件を満たしておらず、また、本願の発明の詳細な説明は特許法第３６条第４項第１号に規定する要件を満たしておらず、特許を受けることができないものであるから、他の請求項に係る発明について言及するまでもなく、拒絶すべきものである。 よって、結論のとおり審決する。