2023-004020

特願２０２０－５０００２４「聴覚損失の治療のための遺伝子治療構成物および方法」拒絶査定不服審判事件〔平成３０年 ９月２０日国際公開、ＷＯ２０１８／１７０４０２、令和 ２年 ４月 ２日国内公表、特表２０２０－５０９７８６〕について、次のとおり審決する。

結 論 本件審判の請求は、成り立たない。

理 由 第１ 手続の経緯 本願は、平成３０年 ３月１６日（パリ条約による優先権主張 ２０１７年 ７月１２日 （ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１７年 ３月１７日 （ＵＳ）アメリカ合衆国）を国際出願日とする出願であって、令和 ４年１０月２８日付けで拒絶査定がなされ、これに対して、令和 ５年 ３月 ８日に拒絶査定不服審判請求がなされるとともに手続補正がなされたものである。その後の当審における手続の経緯は、以下のとおりである。 令和 ７年 ２月１３日付け 拒絶理由通知書 令和 ７年 ８月１８日 意見書、手続補正書、手続補足書の提出 （以下、この手続補正書による手続き補正を「本件補正」という。） 第２ 本願発明 本願の請求項に係る発明は、本件補正によって補正された特許請求の範囲における請求項１～７に記載された事項により特定されるものと認められるところ、その請求項２に係る発明（以下、「本願発明」という。）は、以下のとおりのものである。 「 【請求項２】 聴覚損失の治療または予防のための方法において使用のための医薬組成物であって、 核酸であって、核酸配列が配列ＩＤ ＮＯ：１に示される核酸、およびプロモーターを含むＡＡＶ２アデノ－関連ウイルス発現ベクターを含み、前記プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーターである、 医薬組成物。」 （下線は、本件補正において、補正箇所として請求人が付したものである。） 第３ 拒絶の理由の概要 令和 ７年 ２月１３日付けの拒絶理由通知書で当審が本件補正前の請求項３～１１に係る発明に対して通知した拒絶理由は、概略、次のとおりのものである。 理由１．（実施可能要件） 過度の試行錯誤を要することなく、核酸配列が配列ＩＤ ＮＯ：１に示される核酸、およびヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）を含むＡＡＶ２アデノ－関連ウイルス発現ベクターを含む医薬組成物が、聴覚損失の治療または予防に、当業者が使用できる程度に、発明の詳細な説明が明確かつ十分に記載されているとはいえないから、この出願は、発明の詳細な説明の記載が、特許法第３６条第４項第１号に規定する要件を満たしていない。 理由２．（サポート要件） 本願明細書の発明の詳細な説明において、核酸配列が配列ＩＤ ＮＯ：１に示される核酸、およびヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）を含むＡＡＶ２アデノ－関連ウイルス発現ベクターを含む医薬組成物が、聴覚損失を治療または予防することについて、当業者が理解できるように記載されているとはいえないから、本願発明は、発明の詳細な説明に記載されたものであるとはいえず、特許法第３６条第６項第１号に規定する要件を満たしていない。 なお、本願発明の「核酸であって、核酸配列が配列ＩＤ ＮＯ：１に示される核酸」という事項は、本件補正前の請求項３を引用する形式で記載された請求項４において特定されていた事項であるから、以下、本件補正前の請求項４に対して通知した拒絶理由について、検討する。 第４ 当審の判断 １．本願明細書の記載事項 本願明細書には、以下の事項が記載されている。 （ア）【００３３】段落 「【００３３】 ・・・本発明は、変異したＴＭＰＲＳＳ３またはＬＯＸＨＤ１遺伝子の活性を回復させ、有毛細胞の生存を促進し、聴覚損失または難聴で苦しむ患者の聴覚を回復させるために、内耳にＴＭＰＲＳＳ３またはＬＯＸＨＤ１のウイルスベクター遺伝子を伝達する組成物および方法、並びに当該組成物および方法を試験するための細胞に基づくモデル、および動物に基づくモデルを記述する。」 （イ）【００３４】段落 「【００３４】 本願に開示されるのは、配列ＩＤ Ｎｏ：１もしくは配列ＩＤ Ｎｏ：２の核酸配列を含む、または配列ＩＤ ＮＯ：１もしくは配列ＩＤ Ｎｏ：２の核酸に少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む発現ベクターであり、ここで、核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結される。さらに本願に開示されるのは、聴覚損失の治療または予防のための方法に使用するための医薬組成物であり、配列ＩＤ Ｎｏ：１もしくは配列ＩＤ Ｎｏ：２の核酸配列を有する、または配列ＩＤ ＮＯ：１もしくは配列ＩＤ Ｎｏ：２の核酸に少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を有する発現ベクターを含み、ここで、核酸配列はプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、核酸配列は、配列ＩＤ ＮＯ：１または配列ＩＤ Ｎｏ：２の核酸配列に少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、アデノ－関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ヘルバー依存的アデノウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターから選択される。いくつかの実施形態において、ベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４３、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡｎｃ８０から選択されるアデノ－関連ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、アデノ－関連ウイルスベクターは、ＡＡＶ２またはＡｎｃ８０である。いくつかの実施形態において、プロモーターは、任意の有毛細胞プロモーターから選択され、発達初期に作動可能に連結される核酸の発現を誘導し、例えば、ＴＭＰＲＳＳ３プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス／チキンベータ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、Ｍｙｏ７ａプロモーター、またはＰｏｕ４ｆ３プロモーター等の発現を生涯にわたって維持する。」 （ウ）【００３６】段落 「【００３６】 本願に開示されるのは、配列ＩＤ Ｎｏ：１もしくは配列ＩＤ Ｎｏ：２の核酸配列を含む、または配列ＩＤ ＮＯ：１もしくは配列ＩＤ Ｎｏ：２の核酸に少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む発現ベクターの有効量を必要な被検体に投与することを含む、聴覚損失を治療する、または予防する方法であり、ここで、核酸配列はプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、核酸配列は、配列ＩＤ ＮＯ：１または配列ＩＤ ＮＯ：２の核酸配列に少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、アデノ－関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ヘルバー依存的アデノウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターから選択される。いくつかの実施形態において、ベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４３、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡｎｃ８０から選択されるアデノ－関連ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、アデノ－関連ウイルスベクターは、ＡＡＶ２またはＡｎｃ８０である。いくつかの実施形態において、プロモーターは、任意の有毛細胞プロモーターから選択され、発達初期に作動可能に連結される核酸の発現を誘導し、例えば、ＴＭＰＲＳＳ３プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス／チキンベータ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、Ｍｙｏ７ａプロモーター、またはＰｏｕ４ｆ３プロモーター等の発現を生涯にわたって維持する。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、被検体の内耳に、例えば、注射によって投与される。いくつかの実施形態において、伝達方法は、蝸牛開口術、蝸牛窓膜、半規管開口術（ｃａｎａｌｏｓｔｏｍｙ）、およびそれらの任意の組み合わせから選択される（Ｅｒｉｎ Ｅ．Ｌｅａｒｙ Ｓｗａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００８）聴覚適用のための内耳薬物伝達（Ｉｎｎｅｒ Ｅａｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｆｏｒ Ａｕｄｉｔｏｒｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．６０（１５）：１５８３－１５９９）。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、内リンパ嚢を介して中央階に伝達される（Ｃｏｌｌｅｔｔｉ Ｖ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）ヒト内耳における内リンパ嚢から内リンパ部分へのガドリニウム分布の証拠（Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｇａｄｏｌｉｎｉｕｍ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｅｎｄｏｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｓａｃ ｔｏ ｔｈｅ ｅｎｄｏｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｎｎｅｒ ｅａｒ）．Ａｕｄｉｏｌ Ｎｅｕｒｏｏｔｏｌ．１５（６）：３５３－６３；Ｍａｒｃｏ Ｍａｎｄａｌａ，ＭＤ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）メニエール病における内リンパ嚢から蝸牛への誘導された内リンパ流入（Ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｎｄｏｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｆｌｏｗ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｅｎｄｏｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｓａｃ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｃｈｌｅａ ｉｎ Ｍｅｎｉｅｒｅ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）．Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ－Ｈｅａｄ ａｎｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇｅｒｙ．１４３，６７３－６７９；Ｙａｍａｓｏｂａ Ｔ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）内リンパ嚢でのアデノウイルスベクター接種後の内耳導入遺伝子発現（Ｉｎｎｅｒ ｅａｒ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｆｔｅｒ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｄｏｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｓａｃ）．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０（５）：７６９－７４）。いくつかの実施形態において、被検体は、聴覚損失と関連する一つ以上の遺伝的危険因子を有する。いくつかの実施形態において、遺伝的危険因子の一つは、ＴＭＰＲＳＳ３遺伝子の変異である。いくつかの実施形態において、ＴＭＰＲＳＳ３遺伝子の変異は、聴覚損失の原因となる公知の任意の一つ以上のＴＭＰＲＳＳ３変異から選択される（例えば、表２参照）。いくつかの実施形態において、遺伝的危険因子の一つは、ＬＯＸＨＤ１遺伝子の変異である。いくつかの実施形態において、ＬＯＸＨＤ１遺伝子の変異は、聴覚損失の原因となる公知の任意の一つ以上のＬＯＸＨＤ１変異から選択される（例えば、表３参照）。いくつかの実施形態において、被検体は、聴覚損失の任意の臨床指標を示さない。」 （エ）【００４４】～【００４８】段落 「【００４４】 本願に使用される用語「活性剤」は、本願に記述される組成物および方法において使用されることを目的とする、および例えば聴覚損失を治療する目的のために生物学的に活性化することを目的とする分子（例えば、本願に記述されるＡＡＶベクター）に関する。 【００４５】 本願に使用される用語「医薬組成物」は、本願に記述される少なくとも一つの活性剤または二つ以上の活性剤の組み合わせ、または、例えば担体、安定化剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、賦形剤などのような薬物伝達において使用のために適している一つ以上の成分、を含む組成物に関する。 【００４６】 本願において同じ意味で使用される用語「被検体（ｓｕｂｊｅｃｔ）」または「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」は、ヒト、非－ヒト患者、齧歯動物（ラット、マウスおよびモルモットのような）などを含む哺乳類を包含するが限定されない。本発明のいくつかの実施形態において、被検体はヒトである。 【００４７】 本発明における活性剤の用量は、活性剤の有効性および／または有効量を決定するために行われるヒトまたは他の哺乳類における試験に基づいて算出されてもよい。投与量、および投与頻度または投与時期は、当該技術分野において公知の方法によって決定されてもよく、活性剤の医薬品形態、投与経路、単一の活性剤が使用されるのか複数の活性剤が使用されるのか（例えば、必要とされる第一の活性剤の用量は、当該活性剤が第二の活性剤と組み合わせて使用される場合より低くなってもよい）、および年齢、体重または薬物代謝に影響を及ぼす任意の医学的状態の存在を含む患者の特徴、などのような要因に依存してもよい。 【００４８】 一実施形態において、単回投与で投与されてもよい。他の実施形態において、複数回投与は、ある期間にわたって、例えば１日４回、１日２回、１日１回、週に１回、月に１回などのような特定の間隔で、投与されてもよい。 ・・・」 （オ）【００５５】段落 「【００５５】 ・・・ ［ＴＭＰＲＳＳ３遺伝子変異は聴覚損失を誘導する］：ＴＭＰＲＳＳ３（ＤＦＮＡ８/１０）の変異に関連する聴覚損失は、様々な異なる表現型で存在することができる。生まれつき深刻な聴覚損失、および成人で発症する進行性聴覚損失が記述されている（Ｗｅｅｇｅｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。現在のところ、Ｔｍｐｒｓｓ３機能障害によるメカニズムは知られていない。出生時の聴覚損失マウス、および少し遅い時期であるがまだ聴覚の成熟前に聴覚損失を発症するマウス、の２つのマウスモデルが、今まで発展されている。Ｆａｓｑｕｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．は、Ｔｍｐｒｓｓ３におけるタンパク質ー短縮型ナンセンス変異を有するエチル－ニトロソウレア－誘導変異マウスを生成した。これは、出生後１２日、聴覚の成熟の前後における有毛細胞の損失および聴覚の悪化を示した。加えて、嚢状の有毛細胞に影響を及ぼし、螺旋神経節の遅延型変性が観察された（Ｆａｓｑｕｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．２０１１）。螺旋神経節の変性が、コルチ器官の変性に関連するのか、螺旋神経節におけるＴｍｐｒｓｓ３の機能障害に起因するのかはマウスモデルから明確でない。多くの研究では、マウス内耳におけるＴｍｐｒｓｓ３の分布を評価しており、有毛細胞および螺旋神経節細胞におけるＴｍｐｒｓｓ３の存在を証明している（Ｆａｎ，Ｚｈｕ，Ｌｉ，Ｊｉ，＆Ｗａｎｇ，２０１４；Ｆａｓｑｕｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１)。マウスＴｍｐｒｓｓ３の発現を、抗体抗－ＴＭＰＲＳＳ３を用いて１月齢のＣ５７Ｂ１５マウスで評価した（１：１００，ａｂ１６７１６０，アブカム社（Ａｂｃａｍ），ケンブリッジ、マサチューセッツ）。標識は、内有毛細胞および外有毛細胞、血管条、並びに螺旋神経節細胞の約５０％において観察された（図５）。このことは、蝸牛内電位の変化がないことがＦａｓｑｕｅｌｌｅマウスモデルにおいて観察されたけれども（Ｆａｓｑｕｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１）、Ｔｍｐｒｓｓ３機能の損失は、さらに、ｓｔｒｉａｌ機能の損失をもたらす恐れがあることを示す。」 （カ）【００５６】段落 「【００５６】 Ｔｍｐｒｓｓ３遺伝型－表現型研究は、生まれつき～成人に発症する深刻な進行性聴覚損失に至るまでの聴覚損失における広範な異なる型を証明する（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｗｅｅｇｅｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。研究では、Ｔｍｐｒｓｓ３変異に起因する聴覚損失は、成人の人工内耳移植を受けている患者の２％～５％を構成し得ることを示す（Ｊｏｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｍｉｙａｇａｗａ，Ｎｉｓｈｉｏ，＆Ｕｓａｍｉ，２０１６；Ｓｌｏａｎ－Ｈｅｇｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。これらの変異を有する多くの患者は、かなりの量の残聴を有する。このことは、治療可能な細胞の基質があることになるので、可能性のある救援治療のために魅力的な標的になるだろう。この変異を有する患者の人工内耳移植の成功についてのいくつかの異なる研究がある。Ｔｍｐｒｓｓ３の損失によって誘導される少なくともいくつかの聴覚損失の形態は、遺伝的難聴の他の形態より、人工内耳移植を伴なう聴覚損失を有する形態と同様に研究できない（Ｓｈｅａｒｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１７）。このことは、Ｔｍｐｒｓｓ３遺伝子が有毛細胞および最大５０％のらせん神経節細胞の両方に発現されるという事実に潜在的に関する（図５参照）。これらの相違は、伝達のためのベクターシステムを選択する場合に考慮される必要がある。ベクターは、強い有毛細胞指向性、並びに有毛細胞と、らせん神経節との組み合わされた指向性を用いて試験されるだろう。ベクター指向性における相違は、新生児の内耳伝達および成人の内耳伝達を比較する場合にも見られている（Ｓｈｕ，Ｔａｏ，Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｓｈｕ，Ｔａｏ，Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２０１６ａ）。標的の臨床集団は成熟した聴覚システムを有するヒトであるので、本願に開示されるのは、聴覚の成熟後に聴覚損失の発症を有するマウスモデルであり、病気の進行（実施例１参照）および成人の蝸牛への救援治療のモデル伝達（実施例２参照）の両方のためのモデルとして使用されることができる。 ［内耳への伝達のためのＡＡＶ血清型］：広範囲の異なるＡＡＶ血清型は、内耳組織へトランスフェクションするのに有用であることが証明されている（Ｇｙｏｒｇｙ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｓｈｕ，Ｔａｏ，Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２０１６ｂ；Ｘｉａ，Ｙｉｎ，＆Ｗａｎｇ，２０１２）。新生児の、および成人の動物においてベクター伝達導入遺伝子の分布に明らかな違いがあり、さらに、有毛細胞へのトランスフェクションを評価する場合、内リンパ、対、内リンパへの伝達に違いがある（Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。マウスモデルにおいて、内リンパへのベクター伝達は、有毛細胞における向上したトランスフェクションをもたらすが、残聴の損失をもたらし、このことは、進行性聴覚損失のモデルを作ることを難しくする。潜在的に多くの動物またはヒトにおいて、ベクターは、聴覚損失を引き起こすことなく内リンパ嚢へ伝達することが可能であるので、トランスフェクション効率を上昇させることが可能である（Ｃｏｌｌｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。プラスミド研究の目的のために、外リンパへの伝達は、マウスの聴覚を評価することを可能にするだろう。ＡＡＶ２は、成人動物における有毛細胞、および螺旋神経節への伝達を示している（Ｔａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。ＡＡＶ２の付加的利点は、ヒト遺伝子治療臨床試験において、すでに広範囲の実績および安全性データを有していることである（Ｓａｎｔｉａｇｏ－Ｏｒｔｉｚ＆Ｓｃｈａｆｆｅｒ，２０１６）。最近、様々な研究は、合成ＡＡＶ（ＡＡＶ２/Ａｎｃ８０）が有毛細胞への伝達を向上させるが、天然の（ｎａｔｉｖｅ）ＡＡＶ２と同等の螺旋神経節への伝達を提供しないことを示している（Ｌａｎｄｅｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｘｉａｏ，Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ，＆Ｌｉｂｅｒｍａｎ，２０１７）。本発明は、聴覚損失を成人で発症し、およびＡＡＶ２またはＡＡＶ２/Ａｎｃ８０ Ｔｍｐｒｓｓ３遺伝子治療が聴覚および螺旋神経節機能におけるより良い救出をもたらすかどうかを比較するためのマウスモデルを提供する。 ・・・」 （キ）【００５７】～【００６６】段落 「【００５７】 ［実施例１－患者に見られる出生後に発症する進行性聴覚損失を正確に映し出すＴＭＰＲＳＳ３変異のマウスモデル］ ［マウスにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを有するヒトＴＭＰＲＳＳ３変異［ｃ．９１６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ３０６Ｔｈｒ）］の標的化変異］：存在するマウスモデルは、ＴＭＰＲＳＳ３遺伝子の完全なノックアウトを有し、生まれつきの聴覚損失、または出生後１２日で聴覚の発症時の有毛細胞の変性をもたらす（Ｆａｓｑｕｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。この例は、ヒトＴＭＰＲＳＳ３変異を有するノックインマウスの発展を記述する。ＴＭＰＲＳＳ３におけるｃ．９１６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ３０６Ｔｈｒ）は、最も一般的な変異であり、中国、ドイツ、オランド、および韓国からの１０以上の様々な民族の聴覚障害のある患者で同定されており、この変異がＤＦＮＢ８/ＤＦＮＢ１０表現型の主な原因になることを示す（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｅｌｂｒａｃｈｔ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｗｅｅｇｅｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ヒト変異を有するマウスモデルは、Ｈａｒｍｓ ｅｔ ａｌ．の以前の研究において詳細に記述されるようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いて生成されるだろう（Ｈａｒｍｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。簡潔に、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）設計ツールは、遺伝子および対象の変異のための適切なｇＲＮＡを選択するために使用され；最小限の予測されたオフ－ターゲットゲノム部位編集を有するｇＲＮＡが選択され、対象のゲノム遺伝子座および他の予測されたオフ－ターゲットゲノム部位を増幅するためのプライマーと共に、サービスプロバイダーによって合成されるだろう。 【００５８】 一旦設定されると、マウスは遺伝子型が同定され、ＡＢＲおよびＤＰＯＡＥを用いて２週齢、４週齢、および１２週齢での聴覚損失を評価されるだろう。遅れて発症する聴覚損失において、ＡＢＲ試験およびＤＰＯＡＥ試験の比較は、Ｔｍｐｒｓｓ３機能の減少が有毛細胞機能または螺旋神経節機能に非対称に影響を与えるかどうかを証明し得る。このことは、Ｓｈｅａｒｅｒ ｅｔ ａｌ．の観察で与えられた臨床発展のためのベクターの選択に影響を及ぼすだろう（Ｓｈｅａｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。ヒトにおける顕著な表現型はないけれども、マウス変異は、嚢状有毛細胞のわずかな変性を示している。前庭系の組織学的評価およびロータロッド試験は、平衡機能障害を検査するために使用されるだろう。蝸牛における変異Ｔｍｐｒｓｓ３の発現は、定量的ＲＴ ＰＣＲによって決定されるだろう。結果は、野生型マウスおよびホモ接合体Ｔｍｐｒｓｓ３ｃ．９１６Ｇ＞Ａのために分析されるだろう。出生後３日齢、並びに２週齢、４週齢および１２週齢の蝸牛における組織学的および免疫組織化学的分析は、有毛細胞損失のパターンを特定するために行われるだろう。組織化学的データに基づいて、選択された時点は、有毛細胞生存における基礎頂端勾配があるかどうか決定するための有毛細胞生存における全載分析のために選択されるだろう。示された試料は、不動毛束形態を評価するために走査型電子顕微鏡法によって評価されてもよい。統計学的分析は、反復測定のためにＡＮＯＶＡを用いてグラフバッド（Ｇｒａｐｈｐａｄ） プリズム（Ｐｒｉｓｍ）第７版によって行われるだろう。推定された動物は、変異体では時点につきｎ＝１０を使用し、対照では時点につきｎ＝３を使用する。 【００５９】 ［ｃ．９１６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ３０６Ｔｈｒ）］によって誘導される聴覚損失の経時変化の確立は、救出研究を行うための時点を設定するだろう。うまくいく場合には、側音（ｌａｔｅｒａｌ）臨床前安全性研究の経時変化を定義することにもなるだろう。 【００６０】 標的変異が、マウスにおいて完全な生まれつきの聴覚損失をもたらす場合、誘導型ノックアウトマウスが設計されてもよい。ヒトは非常に様々な表現型を示すので、このことはマウスにおいて観察されてもよく、統計学的分析を難しくする。このことは、救出実験のために対照として反対側未処理耳を用いることによって対処されることが可能である。交互に、Ｔｍｐｒｓｓ３の役割を、ヒトｉＰＳＣモデルにおいて評価してもよい（実施例４に記述されるように）。聴覚損失の進行は、実験的観察が６月齢にまで拡大される場合に遅延されるかもしれない。［実施例２－マウスモデルにおける聴覚損失は、ＴＭＰＲＳＳ３遺伝子治療によって阻害される、または回復されることができるかどうかの評価］ 様々なベクターが内耳へ遺伝子を伝達するために提案されている。より小さい遺伝子の長期伝達のために、ＡＡＶベクターは広範囲に研究されており、安全であり、広範囲の細胞への伝達を提供する。しかしながら、外有毛細胞へのＡＡＶ伝達は、より高力価のベクターでさえ不完全であることが示されている。最近、合成アデノ関連ウイルスベクターＡＡＶ２/Ａｎｃ８０が開発されており、内有毛細胞および外有毛細胞への優れた伝達を提供する。２つの異なるベクターシステムが試験され、Ｔｍｐｒｓｓ３機能が螺旋神経節の救出にも必要とされ得るという潜在性に基づかれるものである。聴覚の救出は、これらの２つのベクターシステムを用いるマウスモデルで比較されるだろう。潜在性結果は、ＡＡＶ２/Ａｎｃ８０の場合においてより悪いＡＢＲを伴なうＤＰＯＡＥの救出を含み、このことは有毛細胞に加えて螺旋神経節を治療することの必要性を示すだろう。簡潔にベクターは、実施例１の結果に基づいて聴覚損失の発症を確認される前の１～２週間で後半規管に半規管開口術で伝達されるだろう。対数倍異なる３つの濃度のベクターはマイクロポンプを用いて注入されるだろう。動物の聴覚は、実施例１で決定された時点で一連のＡＢＲおよびＤＰＯＥＡを用いて評価されるだろう。３～６月齢の動物において、蝸牛における組織学的、免疫組織化学的および全載評価によって有毛細胞生存が評価されるだろう。対照は、ベクター（ＡＡＶ２．ｈＣＭＶ．ＧＦＰ、またはＡＡＶ２/Ａｎｃ８０．ｈＣＭＶ．ＧＦＰ）を発現するＧＦＰのみで処理された動物からなる。マウスは、任意の前庭システムをさらに示す場合、前庭システム組織学およびロータロッド試験によって評価もされるだろう。加えて、Ｔｍｐｒｓｓ３治療の毒性は、Ｔｍｐｒｓｓ３発現する両ベクターを用いてトランスフェクションする野生型マウスによって評価されるだろう。統計学的分析は、反復測定のためにＡＮＯＶＡを用いてグラフバッド（Ｇｒａｐｈｐａｄ）プリズム（Ｐｒｉｓｍ）第７版によって行われるだろう。結果は、ベクター力価当たりの聴覚に基づいて評価されるだろう。推測される動物は、変異体では時点当たりｎ＝６０（２つのベクター、３つの濃度のベクター、組織学的および全載評価）を使用し、対照では時点当たりｎ＝３を使用する。過剰発現研究は、２つのベクターを用いてｎ＝５を使用するだろう。 【００６１】 Ｔｍｐｒｓｓ３遺伝子治療は、聴覚損失の進行を防ぐことを予期される。Ｔｍｐｒｓｓ３遺伝子治療では、量的効果と同じように聴覚を救出するための種々のベクターで違いがあってもよい。 【００６２】 聴覚の救出が不完全であることが明らかにされる場合、異なるベクターを設計してもよい。潜在的にＴｍｐｒｓｓ３の発現は、異なる長さのプロモーターを使用することによって、またはＴｍｐｒｓｓ３の調節領域を含むことによって最適化される必要があるかもしれない。潜在的にＴｍｐｒｓｓ３遺伝子治療は、非常に速い時点で内耳に提供されなければならないかもしれない。 ［ＡＡＶ２ＴＭＰＲＳＳ３伝達システムの評価］：ヒトＣＭＶ（ｈＣＭＶ）プロモーターによって引き起こされるヒトＴＭＰＲＳＳ３（ＢＣ０７４８４７）は、ＡＡＶ２ベクターシステムにおいてクローン化された。ベクターは、塩化セシウム勾配で精製された。力価はｐＰＣＲによって決定された（１．１×１０１３ＧＣ／ｍｌ）。合成および精製後、ベクターを２０μｌ体積にアリコートし、５％グリセロールを有するＰＢＳ中に８０℃で保存した。 ［ＴＭＰＲＳＳ３伝達のためのアッセイシステムの発展］：ベクター機能の効率性を評価するために、我々はＴＭＰＳＳ３産生を分析するためのシステムを発展させたかった。これは、異なるプロモーターを用いるベクター設計を後に評価するために、およびベクター安全性を評価するためにも役立つだろう。細胞系列は、異なるＡＡＶ血清型を用いるトランスフェクション効率について様々である（Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。様々な細胞系列は、ＡＡＶ２を用いてトランスフェクションされる能力の検査を受けた。残念ながら、ＡＡＶ２を用いてトランスフェクションすることができるいくつかの一般的に使用される細胞系列は、天然の（ｎａｔｉｖｅ）ＴＭＰＲＳＳ３を発現する。様々なヒト癌細胞系列が検査され、ＴＭＰＲＳＳ３を発現することがないＲＮＡｓｅｑが確認されている。原発性若年性鼻咽頭血管線維種（ＪＮＡ）細胞は、ＡＡＶ２ｈｃｍｖ．ｇｆｐを用いてトランスフェクションすることが明らかになった。細胞を、ＤＭＥＭおよび１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールスバッド、カリフォルニア）を補充されたＴ－７５フラスコに、３７℃で５％ＣＯ２を維持しながらプレートに置いた。培地交換は４８時間ごとに行った。細胞がＰ４に達し９０～１００％密集になった時、３ｍｌの０．０５％トリプシンを洗浄のために加え、吸引し、その後、細胞を除去するために３ｍｌのトリプシンを加えた。インキュベーションを３７度で３～５分間行った。トリプシンを１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを用いて中和した。細胞溶液を１５ｍｌの円すい状の瓶に集め、１２００ｒｐｍで５分間、４度で回転した。細胞を、その後、１０ｍｌの１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭで懸濁し、プレートに置き、２４時間付着させた。ＡＡＶ２－ＴＭＰＲＳＳ３の導入は、細胞を４ウェルチャンバーミリセル（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ）ＥＺ スライド（ＰＥＺＧＳ０４１６、ミリポアシグマ社、バーリントン、マサチューセッツ）に置き、５００μＬの培地に２μｌ／ｍｌ濃度のＡＡＶ２．ｈｃｍｖ．ＴＭＰＲＳＳ３を有する培地に細胞を播種することによって行った。細胞培地を２４時間後に交換し、その後、トランスフェクション後４８時間ごとに細胞が分析されるまで交換した。 ［ＡＡＶ２－ＴＭＰＲＳＳ３トランスフェクション細胞の免疫細胞化学］：トランスフェクションされたＪＮＡ細胞を、ＰＢＳを用いて最初に洗浄し、その後ＰＢＳ中に４％パラホルムアルデヒドを有する溶液を用いて室温で１０分間固定化した。細胞を、１％トリトン－Ｘ１００／１％ウシ胎児血清／１０％正常血清を用いて、１時間室温でブロッキングし透過処理した。一次抗体（１：１００、ａｂ１６７１６０、アブカム社（Ａｂｃａｍ）、ケンブリッジ、マサチューセッツ／１：５０、ＧＴＸ８１６４４、ジェーンテックス（ＧｅｎｅＴｅｘ）社、アーバイン、カリフォルニア）を、４℃で一晩インキュベーションした。次の日、細胞を、ＰＢＳを用いてリンスし、その後、アレクサ（Ａｌｅｘａ）フルオロ（Ｆｌｕｏｒ）４８８（１：５００、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社、カールスバッド、カリフォルニア）を用いて標識化した。これらの細胞を、ＰＢＳを用いてさらに洗浄し、その後、プロロング（ＰｒｏＬｏｎｇ）ゴールド（Ｇｏｌｄ）退色防止封入培地（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社、カールスバッド、カリフォルニア）を用いて０．２μｇ／ｍｌ ４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドールと共に染色した。 【００６３】 ［ＡＡＶ／Ａｎｃ８０－ＴＭＰＲＳＳ３－ＩＲＥＳ－ＧＦＰの構築］我々は、ヒトＴＭＰＲＳＳ３全長ｃＤＮＡをＡＡＶ／Ａｎｃ８０ベクターにｅＧＦＰマーカーと共にクローン化するだろう。このため、ウイルス感染した細胞をＧＦＰ発現によって確認することができる。我々は証明された配列を有するヒトＴＭＰＲＳＳ３全長ｃＤＮＡを得る。我々は、クローン化するためにＡＡＶ／Ａｎｃ８０ベクターを使用するだろう。以前に、ヒトＩＳＬ１遺伝子を同じベクターにクローン化し、新生児のマイスの内耳および成人のマウスの内耳に、蝸牛開口術および半規管開口術それぞれによって、ＡＡＶ／Ａｎｃ８０－ＩＳＬ１－ＩＲＥＳ－ＧＦＰを注入した。ＡＡＶ／Ａｎｃ８０は、有毛細胞損傷または聴覚損失を引き起こすことなく、新生児の有毛細胞および成人の有毛細胞に効率的に遺伝子伝達を仲介する。導入遺伝子の更なる発現は経時的に維持され、このことは、遺伝子発現を修復するために、および聴覚を回復させるために、Ｔｍｐｒｓｓ３－／－有毛細胞におけるＴＭＰＲＳＳ３遺伝子を発現するという我々の目標に理想的である（Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｔａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。 【００６４】 ＴＭＰＲＳＳ３をＡＡＶ／Ａｎｃ８０－ＴＭＰＲＳＳ３－ＩＲＥＳ－ＧＦＰベクターにクローン化後、ベクターは１０１２のウイルス価を達成する目的で増幅され、パッケージ化されるだろう。我々は、感染ヒト細胞によってＡＡＶ／Ａｎｃ８０－ＴＭＰＲＳＳ３－ＩＲＥＳ－ＧＦＰを最初に試験するだろう。我々は、ＴＭＰＲＳＳ３およびＧＦＰが同じ細胞に発現したかどうか試験するために、抗－ＴＭＰＲＳＳ抗体と共に免疫標識を行い、ＧＦＰと共局在化するだろう。インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）研究のために、我々は、蝸牛開口術によって野生型新生児内耳に、半規管開口術によって成人の内耳にそれぞれ、注入することによってベクターを試験するだろう。注入後２週間、ＧＦＰ信号が有毛細胞に限定されるかどうか試験するために、マウスの蝸牛を採取するだろう。我々の以前の研究において、我々は１００％の内有毛細胞で強いＧＦＰ発現、および９５％を超える外有毛細胞で減速した発現を観察した。したがって、我々はＴＭＰＲＳＳ３遺伝子と同様の発現パターンを観察することを期待する。 【００６５】 ＡＡＶ／Ａｎｃ８０－ＴＭＰＲＳＳ３－ＧＦＰを、続いて、聴覚研究された１月後に蝸牛開口術によってＴｍｐｒｓｓ３－／－蝸牛に注入するだろう。我々は、注入されていない対照内耳と比較して注入された内耳がより良い聴覚を観察することを期待する。このことは、特にＴｍｐｒｓｓ３－／－マウスが深刻な早期に発症する聴覚損失を患う場合に明白になるだろう。Ｔｍｐｒｓｓ３－／－における聴覚損失が、遅発型の進行性である場合に、我々は、例えば２月齢および３月齢などの後の段階で聴覚救出を観察し始めるかもしれない。聴覚研究はＡＢＲおよびＤＰＯＡＥによって行われるだろう。ＡＢＲおよびＤＰＯＡＥ閾値が、注入された耳において任意の周波数で重大に低い場合に、Ｔｍｐｒｓｓ３－／－マウスにおけるＡＡＶ－介在聴覚救出の兆候である。我々は、聴覚回復が維持されるかどうか決定するために、６月間、聴覚救出の進行を観察するだろう。 【００６６】 Ｔｍｐｒｓｓ３－／－マウスにおいて、有毛細胞は最終的に死亡するだろう。ＡＡＶ－介在遺伝子伝達を用いて、有毛細胞機能の回復は、経時的に有毛細胞生存につながるようであり、経時的に有毛細胞を蝸牛の長さに沿って数えることによって確認されるだろう。我々は、注入されていない対照の蝸牛と比較して、注入された蝸牛において著しく有毛細胞を観察することを期待する。聴覚結果と細胞生存との比較は、救出治療のために最適なベクターおよびベクター量を決定するだろう。 ［実施例３－ＴＭＰＲＳＳ３］ ［ＴＭＰＲＳＳ３－変異マウスモデルの発展］ヒトの状態とできる限り近く似ているマウスモデルの発展は、更なる治療への鍵となる。ノックアウトＴｍｐｒｓｓ３マウスモデルは、商業業者から入手でき、これらの実施例に記述される実験において使用されてもよい。しかしながら、上述されるような聴覚損失を引き起こす公知のヒト変異体を心にとどめることは、マウスモデルを発展させることに、より関連性があるだろう。モデルは、ヒト変異がヒトと同様にマウスにおいても聴覚損失を引き起こすことを示すことを期待され、このことは、そのモデルを治療のために研究されるのに役立つものにする。遺伝子導入マウス系列を産生する方法は、当該技術分野において日常的に使用され、当業者に公知であるだろう。重要なことに、マウスモデルを生成する時間は、わずか数年前では平均２年であり近頃ではＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いると数か月になり著しく短くなっている。したがって、マウスモデルを産生するのにかかる時間は、もはや速度制限因子ではない。我々は、我々の研究のためにヒト変異を有するＴＭＰＲＳＳ３マウスモデルを作成することを提案している。ＴＭＰＲＳＳ３ノックアウトマウスにおいて、有毛細胞は死に、マウスは深刻な聴覚損失を示す。Ｔｍｐｒｓｓ３ノックインマウスモデルの作成後、我々はＡＢＲおよびＤＰＯＡＥによって有毛細胞の生存および聴覚損失を研究するだろう。マウスモデルが有毛細胞の損失における進行性聴覚損失を示す場合、そのことは我々がヒトＤＦＮＢ８のためのＴｍｐｒｓｓ３マウスモデルを生成しているという証明である。 ［遺伝子治療用のＡＡＶ－ＴＭＰＲＳＳ３を産生するために］我々は、Ｔｍｐｒｓｓ３変異マウスを治療するためにＡＡＶ－介在遺伝子治療を使用するだろう。我々は、研究用に２つのＡＡＶベクター（Ａｎｃ８０およびＡＡＶ２）を同定しているが、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ヘルバー依存的アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、または例えば、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４３、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、もしくはＡＡＶ８のような他のアデノ関連ウイルスベクターのような、他の発現ベクターを試験してもよい。Ａｎｃ８０およびＡＡＶ２は共に、正常な聴覚に副作用を及ぼすことなく哺乳類の新生児有毛細胞に遺伝子を高効率的に伝達する。さらに最近、Ａｎｃ８０およびＡＡＶ２は共に、正常な聴覚に影響を及ぼすことなく成人のマウス有毛細胞に遺伝子を伝達するために使用されることができることを示す（Ｚｉｎｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，ウイルス進化系統におけるインシリコ再構築は、潜在的な遺伝子治療ベクターを生成する（Ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｖｉｒａｌ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｌｉｎｅａｇｅ Ｙｉｅｌｄｓ ａ Ｐｏｔｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｖｅｃｔｏｒ），Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２０１５ Ａｕｇ １１；１２（６）：１０５６－６８；およびＡｓｋｅｗ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｍｃ遺伝子治療は、聴覚障害マウスにおける聴覚機能を回復させる（Ｔｍｃ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ａｕｄｉｔｏｒｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｄｅａｆ ｍｉｃｅ），Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１５ Ｊｕｌ ８；７（２９５）：２９５ｒａ１０８）。我々は、ＡＡＶ－ＴＭＰＲＳＳ３ウイルスを産生するためにヒトＴＭＰＲＳＳ３ｃＤＮＡをベクターにクローン化するだろう。我々は、ＴＭＰＲＳＳ３がインビトロ（ｉｎ Ｖｉｔｒｏ）培養システムにおいて使用するために産生されるということを示すために研究を行うだろう。その確認に続いて、ＡＡＶ－ＴＭＰＲＳＳ３が、内耳の細胞分析によって、および聴覚研究（ＡＢＲおよびＤＰＯＡＥ）によって示されるように副作用を有さないことを示すために、ＡＡＶ－ＴＭＰＲＳＳ３を新生児の野生型マウス内耳に注入するだろう。 ［聴覚の回復におけるＡＡＶ－ＴＭＰＲＳＳ３の研究］我々は、ＡＡＶ－ＴＭＰＲＳＳ３を新生児のＴｍｐｒｓｓ３ノックイン変異マウス内耳に注入するだろう。分析は、ＡＡＶ－ＴＭＰＲＳＳ３注入マウスおよびＡＡＶ－ＧＦＰを注入された対照マウスで行われ、分析には聴覚試験、細胞分子生物学研究、および長期効果を含むだろう。細胞レベルにおいて、我々は、ＡＡＶ－ＴＭＰＲＳＳ３が１月齢で有毛細胞生存を促進するかどうか決定するだろう。ＡＡＶ－ＧＦＰを注入された対照変異耳において、我々はこの時点における有毛細胞の損失を観察することを期待する。対照的に、我々はＡＡＶ－ＴＭＰＲＳＳ３を注入されると有毛細胞の生存が観察されることを期待する。我々は、注入工程（蝸牛開口術、蝸牛窓膜、半規管開口術）および聴覚回復をより良くするための用量を最適化するだろう。重要なことに、我々は、成人（１月～６月齢）マウスに注入を行い、聴覚回復を評価するだろう。成人への注入結果は、新生児への注入結果と比較され、そのことは、介入が未だ効果的である時間窓について我々に情報を与えるだろう。 ・・・ ［実施例６－実験方法］ ［ＡＢＲ測定］：ＡＢＲ閾値を知的聴覚システムスマートＥＰプログラム（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｈｅａｒｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｓｍａｒｔ ＥＰ ｐｒｏｇｒａｍ）（ＩＨＳ社，マイアミ，フロリダ，米国）を用いて記録した。動物は上述されるように麻酔され、温熱パッドで保温した（３７℃）。針電極を、頂点（＋）、左耳の後ろ（－）、反対の耳の後ろ（グランド）に置いた。トーンバーストを、高周波数変換器を用いて５００μｓの期間で、４ｋＨｚ、８ｋＨｚ、１６ｋＨｚ、および３２ｋＨｚにおいて示した。記録は、１００Ｋと等しい総ゲインを用いて、高周波および低周波通過フィルターのための１００Ｈｚ設定および１５ｋＨｚ設定を用いて行われた。最小の１２８スイープを９０ｄＢ ＳＰＬで示した。ＳＰＬは１０ｄＢステップで減少した。閾値レベルに近い、最大１０２４プレゼンテーションまで用いて５ｄＢ ＳＰＬステップを各周波数で行った。閾値は、少なくとも一つの波が２以上の反復記録で同定されることが可能であるＳＰＬとして定義された。術前閾値は最初の操作前に測定され、最後の術後閾値は動物を犠牲にする前に測定された。我々は、各ベクター伝達前および最後のベクター伝達後３日にマウスを試験した。 ［ＤＰＯＡＥ測定］：ＯＨＣにおける機能的損傷を評価するために、歪成分耳音響放射（ＤＰＯＡＥ）および入／出力関数（Ｉ／Ｏ関数）を上述のＩＨＳプログラムを用いて両側で記録した。歪成分を、ＩＨＳ高周波数変換器を用いて２ｋＨｚ～３２ｋＨｚの純音のために測定した。エティモティック（Ｅｔｙｍｏｔｉｃ）１０Ｂ＋プローブを外耳管に挿入した。Ｌ１レベルを６５ｄＢに設定し、Ｌ２レベルを５５ｄＢに設定した。周波数は、１６スイープを用いてＦ２－Ｆ１比が１．２２と得られた。Ｉ／Ｏ関数は、１６ｋＨｚの周波数で得られた。６５ｄＢ ＳＰＬ～３１ｄＢ ＳＰＬの範囲の９つの刺激レベルを５ｄＢステップで使用した。マウスは、各ベクター伝達前および最後のベクター伝達後３日に試験された。 ［内耳へのＴＭＰＲＳＳ３発現ＡＡＶの伝達］全ての手順は、適切な動物実験委員会によって検査され承認された。成人マウスを、０．９％塩化ナトリウム液中にケタミン（１５０ｍｇ／ｋｇ）、キシロカイン（６ｍｇ／ｋｇ）、およびアセプロマジン（２ｍｇ／ｋｇ）の混合物を有する溶液のｉ．ｐ．注射で麻酔した。ベクターは、後部半規管にいずれも伝達された。背面耳介後部切開を行って、後部または外側半規管を露出した。マイクロドリルを用いて、蝸牛開口術によって、外リンパ空間を作成し露出した。続いて、０．５μｌのベクターを、０．１μｌ目盛りを有するハミルトンマイクロシリンジ、および３６ゲージ針を用いて注射した。蝸牛開口術は、骨ろうを用いて密封され、動物を回復させることができた。 ・・・」 ２．本願発明の実施可能要件・サポート要件の判断 （１）実施可能要件の判断規範 発明の詳細な説明の記載が実施可能要件に適合するか否かは、明細書の発明の詳細な説明に、当業者が明細書の発明の詳細な説明の記載及び出願時の技術常識に基づいて、過度の試行錯誤を要することなく、その発明を実施できる程度に明確かつ十分に記載されているか否かを検討して判断すべきものと解され、医薬の用途発明においては、一般に物質名、化学構造等が示されることのみによっては、当該用途の有用性及びそのための当該医薬の有効量を予測することは困難であり、当該医薬を当該用途に使用することができないから、医薬用途発明において実施可能要件を満たすためには、本願明細書の発明の詳細な説明は、その医薬を製造することができるだけでなく、出願時の技術常識に照らして、医薬としての有用性を当業者が理解できるように記載される必要があると解される。 （２）実施可能要件の判断 上記（ア）によれば、内耳にＴＭＰＲＳＳ３のウイルスベクター遺伝子を伝達し、変異したＴＭＰＲＳＳ３遺伝子の活性を回復させ、有毛細胞の生存を促進し、聴覚損失または難聴で苦しむ患者の聴覚を回復させる、という本願発明の概略が記載され、上記（イ）及び（ウ）によれば、配列ＩＤ ＮＯ：１の核酸、発現ベクターとしてのＡＡＶ２ウイルスベクター、発現ベクターの投与方法が公知であることが記載され、上記（エ）によれば、上記医薬組成物を上記患者に投与する際に必要な投与量、投与回数や製剤化方法が記載され、上記（オ）によれば、ＴＭＰＲＳＳ３遺伝子変異は聴覚損失を誘導することが公知であることが記載され、上記（カ）によれば、ＡＡＶ２は、成人動物における有毛細胞、および螺旋神経節への伝達を示していること、ＡＡＶ２の付加的利点は、ヒト遺伝子治療臨床試験において、すでに広範囲の実績および安全性データを有していること、及び、合成ＡＡＶ（ＡＡＶ２/Ａｎｃ８０）が有毛細胞への伝達を向上させるが、天然の（ｎａｔｉｖｅ）ＡＡＶ２と同等の螺旋神経節への伝達を提供しないことが記載されている。 また、上記（キ）の実施例１には、患者に見られる出生後に発症する進行性聴覚損失を正確に映し出すＴＭＰＲＳＳ３変異のマウスモデルの作成方法が記載され、実施例２には、前記マウスモデルを用いた薬理試験方法、及び、ヒトＴＭＰＲＳＳ３遺伝子をＨＣＭＶプロモーターに動作可能に連結した核酸配列を含むＡＡＶ２発現ベクターを構築したこと、前記発現ベクターの機能の効率性を評価するためのアッセイシステムを構築したことが記載され、実施例３には、ＴＭＰＲＳＳ３変異のマウスモデルの作成方法、及び、前記マウスモデルを用いた薬理試験方法が記載され、実施例６には、ＡＢＲ及びＤＰＯＡＥを用いた聴力検査の方法、及び、内耳有毛細胞へのＴＭＰＲＳＳ３発現ＡＡＶの伝達方法が記載されているが、これらはいずれも実験の目的や背景、使用する動物、試薬及び器具、実験の具体的な手順を開示したに過ぎない。 さらに、実施例１～３には、存在するマウスモデルは、ＴＭＰＲＳＳ３遺伝子の完全なノックアウトを有し、生まれつきの聴覚損失、または出生後１２日で聴覚の発症時の有毛細胞の変性をもたらすこと（実施例１）、我々は、注入されていない対照内耳と比較して注入された内耳がより良い聴覚を観察することを期待すること（実施例２）、分析は、ＡＡＶ－ＴＭＰＲＳＳ３注入マウス及びＡＡＶ－ＧＦＰを注入された対照マウスで行われ、分析には聴覚試験、細胞分子生物学研究、及び長期効果を含むこと、細胞レベルにおいて、我々は、ＡＡＶ－ＴＭＰＲＳＳ３が１月齢で有毛細胞生存を促進するかどうか決定するだろうこと（実施例３）等が記載されているが、聴覚機能全体を回復させることができた具体的な実験結果は何ら示されていない。 実施例１に記載されたとおり、ＴＭＰＲＳＳ３遺伝子に係る体内における全ての働きや聴覚を司る有毛細胞等の分化及び内耳組織構成のメカニズムは出願時において明らかではなく、当該遺伝子の異常により聴覚に関連する有毛細胞の変性がもたらされる他、どのような悪影響が聴覚を司る内耳組織又はそれ以外の神経組織に及ぼされているかさえ不明なのであり、その可逆性も明らかではない。 したがって、単にＴＭＰＲＳＳ３遺伝子を補うことにより既に変性したり死滅した細胞の機能が復活したり、聴覚機能全体を回復させることができるか否かは仮説の域を出るものではなく、そのことは実施例２に期待すると記載され、今後分析の上で決定されることが記載されている（実施例３）とおりであるから、上記実施例の各記載を含め上記（ア）～（キ）の記載いずれも、上記医薬組成物が上記薬理作用を示すことを当業者が認識できるに足る薬理試験結果の記載であるということはできない。 また、上記医薬組成物が上記薬理作用を示すことは本願発明の出願時の技術常識に属する事項であったというような、薬理試験結果の記載がなされていなくても上記組成物が上記薬理作用を示すこと、特に内耳有毛細胞が失われた状態における聴覚損失を治療できることを当業者が認識できるといえる、格別の事情も見いだせない。 してみると、本願明細書の発明の詳細な説明は、出願時の技術常識に照らして、医薬としての有用性を当業者が理解できるように記載されているとはいえない。 （３）サポート要件の判断規範 次に、特許請求の範囲の記載が、明細書のサポート要件に適合するか否かは、特許請求の範囲の記載と明細書の記載とを対比し、特許請求の範囲に記載された発明が、明細書に記載された発明で、明細書の記載により当業者が発明の課題を解決できると認識できる範囲のものであるか否か、また、その記載や示唆がなくとも当業者が出願時の技術常識に照らし発明の課題を解決できると認識できる範囲のものであるか否かを検討して判断すべきものであり、本願明細書のサポート要件の存在は、本願出願人すなわち審判請求人が証明責任を負うと解される。 （４）サポート要件の判断 ここで、本願発明は、第２に記載のとおり、聴覚損失の治療または予防のための方法において使用のための医薬組成物の発明であるから、その課題は、聴覚損失を治療または予防するという薬理作用をもたらすことにほかならない。 しかしながら、上記したように、本願明細書には、上記医薬組成物が上記薬理作用を示すことを当業者が認識できるに足る記載がなされているとはいえないし、上記医薬組成物が上記薬理作用を示すことについて、具体例をもって示さなくとも当業者が認識できると認めるに足る、格別の事情も見いだせない。 してみると、本願明細書の記載により当業者が本願発明の課題を解決でき ず、その記載や示唆がなくとも当業者が出願時の技術常識に照らし本願発明の課題を解決できると認識できないものとするほかはないから、本願明細書の特許請求の範囲の記載は、明細書のサポート要件に適合するものとはいえない。 したがって、本願発明は、本願明細書に記載したものでない。 （５）審判請求人の主張ア 審判請求人は、令和７年８月１８日提出の意見書において、上記薬理作用について、以下のように主張している。 「また、本願明細書には、当業者が、医薬組成物が薬理効果、すなわちＴＭＰＲＳＳ３の不足に起因する聴覚損失の治療効果を発揮することを認識できる十分な記載がなされていると考えます。本願明細書には、ＴＭＰＲＳＳ３の変異が聴覚損失を引き起こす可能性があること、そのような変異を有する多くの患者が人工内耳に反応しないことが教示されています（本願明細書の段落［０００７］等）。さらに、本願明細書には、ｈＴＭＰＲＳＳ－３（配列番号１）と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を有するＡＡＶ２ベクターが記載されています（本願明細書の段落［００３４］等）。本願明細書に記載されているＴＭＰＲＳＳ３を発現するためのＡＡＶ２などの発現ベクターを送達するためには、ウイルスベクターがしばしば用いられます。当業者は、ウイルスベクターが発現ベクターを送達し、ＴＭＰＲＳＳ３を発現することができると合理的に予測するであろうと考えます。また、当業者であれば、ＡＡＶ２－ｈＴＭＰＲＳＳ３などのＡＡＶ２ベクターを当技術分野で既知の方法で作製できます。」 しかしながら、上記（１）及び（３）で述べたように、本願明細書の発明の詳細な説明は、その医薬を製造することができるだけでなく、出願時の技術常識に照らして、医薬としての有用性を当業者が理解できるように記載される必要がある。 そして、ＴＭＰＲＳＳ３遺伝子に係る体内における全ての働きは出願時において明らかではなく、当該遺伝子の異常により聴覚に関連する有毛細胞の変性がもたらされる他、どのような悪影響を聴覚を司る体内の機構におよぼされているかさえ不明なのであり、その可逆性も明らかでなく、単にＴＭＰＲＳＳ３遺伝子を補うことにより既に変性したり死滅した細胞の機能が復活したり、聴覚機能全体を回復させることができることは、出願時点における技術常識でもなく、発明の詳細な説明に医薬としての有用性を当業者が理解できるように記載されてもいないのであるから、請求人の主張を採用することはできない。 （６）審判請求人の主張イ また、審判請求人は、上記薬理作用について、令和４年７月１１日付けの意見書及び令和５年３月８日付けの審判請求書において、「参考文献２」として提出した、米国の審査の過程で提出された宣誓書と、令和７年８月１８日付けで提出した手続補足書において、参考文献（Ｗａｎ Ｄｕらによる論文）として提出したＳｔａｅｃｋｅｒ博士が共著者として記載されている学術文献を根拠に、令和７年８月１８日提出の意見書において、以下のように主張している。 「上述の宣誓書において試験されたＡＡＶ２のプロモーターはｈＣＭＶプロモーターでした。本参考文献中の図５Ｃは参考文献２の宣誓書の図３と同一です。そして、本参考文献の２８０６ページ左欄の２番目の段落には、プロモーターがｈＣＭＶプロモーターであることが示されています。また、ＡＡＶ２－ｈＴＭＰＲＳＳ３の有効性を示す追加の実験が、本参考文献に記載されています。本参考文献において注目すべきは、驚くべきことに、マウスＴＭＰＲＳＳ３が重度の有毛細胞喪失と重度の聴覚損失を引き起こすのに対し、ヒトＴＭＰＲＳＳ３はマウスＴＭＰＲＳＳ３とタンパク質配列が８８％同一という高い相同性を持つにもかかわらず、有毛細胞喪失や聴覚損失を引き起こさないことが明らかになったことです（本参考文献２８０４ページから２８０５ページにかけての段落）。マウスでは、注入後４ヶ月で聴力の改善が確認されました（本参考文献２８０５ページ左欄）。 このような参考文献の記載、及び本願明細書の実施例及び令和４年７月１１日付けの意見書及び令和５年３月８日付けの審判請求書において「参考文献２」として提出した米国の審査の過程で提出された宣誓書に基づき、必ずしもヒトでの臨床試験のデータがなくとも、動物モデルから得られたこれらのデータにより、ヒト治療の実施可能性を示すのには十分であると考えます。」 しかしながら、（１）に示したとおり、医薬用途発明において実施可能要件を満たすためには、本願明細書の発明の詳細な説明は、その医薬を製造することができるだけでなく、出願時の技術常識に照らして、医薬としての有用性を当業者が理解できるように記載される必要があり、（３）に示したとおり、明細書の記載により当業者が発明の課題を解決できると認識である範囲のものであるか、その記載や示唆がなくとも当業者が出願時の技術常識に照らし発明の課題を解決できると認識できる範囲のものである必要があるから、明細書に記載されていなかった医薬としての有用性を当業者が理解できるような事項や当業者が出願時の技術常識に照らし発明の課題を解決できると認識できる事項について、本願出願後の２０２２年６月１５日付けの宣誓書（参考文献２）や２０２３年９月に公開されたＷａｎ Ｄｕらによる論文に補充した実験結果等を参酌することは許されない。 そして、審判請求人が主張する宣誓書の実験結果のＡＡＶ２－ｈＴＭＰＲＳＳ３のプロモーターがｈＣＭＶプロモーターであったとしても、宣誓書に記載される（ｃ.９１６Ｇ－＞Ａ）を有するノックインＣＢＡ／Ｊマウスの難聴が、１０．５ヶ月後のある時点で始まり、すべての周波数を通して、約２２．５ヶ月まで進行し続けること（第２～３頁：７．）、当該事実に基づき、１８．５ヶ月の時点でＡＡＶ２－ｈＴＭＰＲＳＳ３を治療し、２０．５ヶ月で聴覚機能を評価すること（第７頁：１５．）は、本願の当初明細書（キ）に記載された、ＡＡＶ－ＴＭＰＲＳＳ３を１月～６月齢マウスに注入し、聴覚回復を評価するものとは明らかに別異のものである。 さらに、参考文献（Ｗａｎ Ｄｕらによる論文）によると、ＡＡＶ２－ｈＴＭＰＲＳＳ３に用いられた、ｈＴＭＰＲＳＳ３遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号がＢＣ０７４８４６である塩基配列１３６２ｂｐ、４５３アミノ酸残基からなるコーディング配列であり、当該遺伝子がコードするｈＴＭＰＲＳＳ３のアミノ酸配列と、本願発明の配列ＩＤ ＮＯ：１に示される核酸配列がコードするｈＴＭＰＲＳＳ３のアミノ酸配列を比較すると以下のようになり、 ［図：0001434428000001.jpg］ 参考文献（Ｗａｎ Ｄｕらによる論文）において用いられているｈＴＭＰＲＳＳ３遺伝子がコードするｈＴＭＰＲＳＳ３アミノ酸配列は、本願発明の配列ＩＤ ＮＯ：１に示される核酸配列がコードするｈＴＭＰＲＳＳ３のアミノ酸配列の３５０番目のアラニンを欠いたものであるから、本願発明と参考文献（Ｗａｎ Ｄｕらによる論文）で用いられたＡＡＶ２－ｈＴＭＰＲＳＳ３は別異のものである。 したがって、上記宣誓書の実験結果は、明細書記載の実験条件を忠実に追試し、発明の詳細な説明の記載を再現したものですらない。 （７）小括 よって、審判請求人の主張ア及びイはいずれも採用できないから、本願の発明の詳細な説明の記載は、本願発明を当業者が実施できる程度に明確かつ十分に記載されているとは認められない。 第５ むすび 以上のとおり、本願は、請求項３に係る発明について、特許法第３６条第４項第１号及び同法第３６条第６項第１号に規定する要件を満たしておらず、特許を受けることができないものである。 したがって、他の請求項に係る発明について検討するまでもなく、本願は拒絶すべきものである。 よって、結論のとおり審決する。