2019-700801

第１　手続の経緯

特許第６４９３２０９号の請求項１～５に係る特許についての出願は、平成２６年８月１日（優先権主張　平成２５年８月６日、平成２６年３月２５日）を国際出願日とする出願であって、平成３１年３月１５日にその特許権の設定登録がされ、同年４月３日に特許掲載公報が発行された。その後、その請求項１～５に係る特許について、同年１０月３日に特許異議申立人　谷口真魚により特許異議の申立てがされたものである。

第２　本件特許発明

特許第６４９３２０９号の請求項１～５の特許に係る発明（以下、「本件特許発明１～５」という。）は、その特許請求の範囲の請求項１～５に記載された次の事項により特定されるとおりのものである。

「【請求項１】精製工程を経ていない、動植物組織、体液、排泄物、細胞、細菌、及びウイルスからなる群から選択される生体試料を核酸増幅反応液に添加し、該生体試料中の標的核酸を増幅する方法であって、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属またはサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌から単離されるファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼと、配列番号２１または配列番号２２で示されるアミノ酸配列において、下記（ａ）および（ｂ）で示される群の位置に存在するアミノ酸残基のうち少なくとも一つの改変を有し、かつ、増幅増強活性を示すポリペプチドからなるＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ　Ｃｅｌｌ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ）を反応液中に含んでいることを特徴とする核酸増幅法。

（ａ）８２、８４および１０９番目のアミノ酸残基群

（ｂ）１３９、１４３および１４７番目のアミノ酸残基群

【請求項２】生体試料が、血液、唾液、白血球、植物ライセート、糞便、爪、髪、及び口腔粘膜からなる群から選択されるいずれかである請求項１に記載の核酸増幅法。

続きを表示（全13行）

【請求項３】ＰＣＮＡが単独でＤＮＡにロードする変異体である、請求項１または２に記載の核酸増幅法。

【請求項４】ＰＣＮＡが、配列番号２１または配列番号２２で示されるアミノ酸配列において、以下の（ｂ１）から（ｂ４）のいずれかの変異体である、請求項１～３のいずれかに記載の核酸増幅方法。

（ｂ１）１４３番目に相当するアミノ酸を塩基性アミノ酸に改変したもの

（ｂ２）８２番目と１４３番目に相当するアミノ酸を共に中性アミノ酸に改変したもの

（ｂ３）１４７番目に相当するアミノ酸を中性アミノ酸に改変したもの

（ｂ４）１０９番目と１４３番目に相当するアミノ酸を共に中性アミノ酸に改変したもの

【請求項５】ＰＣＮＡ変異体が、配列番号２１または配列番号２２で示されるアミノ酸配列において、以下の（ｂ１）または（ｂ２）のいずれかのアミノ酸に置換された変異体である請求項１～４のいずれかに記載の核酸増幅方法。

（ｂ１）１４３番目のアミノ酸がアラニンまたはアルギニンに置換された変異体

（ｂ２）１４７番目のアミノ酸がアラニンまたはアルギニンに置換された変異体」

第３　申立理由の概要及び証拠方法

特許異議申立人が請求項１～５に係る特許に対して申し立てた特許異議申立理由の概要及び証拠方法は、次のとおりである。

１．申立理由の概要

本件特許発明１～５は、甲第１号証又は甲第２号証に記載された発明及び甲第３～４号証に記載された事項並びに甲第５～８号証に記載されている周知技術に基いて、当業者が容易に発明をすることができたものであるから、本件特許発明１～５は、特許法第２９条第２項の規定に違反して特許されたものである。

２．証拠方法

（１）甲第１号証： Ｔｋｓ　ＧｆｌｅｘＴＭ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅのパンフレット（２０１２）

（２）甲第２号証：タカラバイオ　ＰＣＲ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　Ｇｕｉｄｅ　２０１２－２０１３（２０１２）目次、ｐ．５～７、巻末頁

（３）甲第３号証：生化学（２００９）Ｖｏｌ．８１，Ｎｏ．１２，ｐ．１０５６－１０６３

（４）甲第４号証：国際公開第２００７／００４６５４号

（５）甲第５号証：生物工学（２０１２）Ｖｏｌ．９０，Ｎｏ．１０，ｐ．６４９－６５３

（６）甲第６号証：Ａｎａｌ．Ｓｃｉ．（２００９）Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．１２，ｐ．１４８７－１４８９

（７）甲第７号証：ＵＰＬＯＡＤ（２００８）Ｖｏｌ．９２，ｐ．１５－１６

（８）甲第８号証：ＫＯＤ　ＦＸ　実験例集（２００９）表紙、ｐ．１～１４、巻末頁

第４　甲号証の記載

甲第１号証～甲第８号証には、以下の事項が記載されている（英語または中国語で記載されている証拠は、日本語訳で摘記する。）。

１．甲第１号証：Ｔｋｓ　ＧｆｌｅｘＴＭ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅのパンフレット（２０１２）

（甲１－１）「クルードサンプル

ＰＣＲ阻害物質を吸収する成分＆増幅増強成分のバッファー系への添加で対応力アップ！」（第１頁）

（甲１－２）「改良型のα型酵素で鋳型への非特異的結合を抑制

鋳型ＤＮＡに対してＤＮＡポリメラーゼそのものが非特異的に結合することによって、プライマーからの伸長反応が阻害される現象が見られることがあります。一般的にα型酵素はこの非特異的結合が起こりやすく、そのためにＰＣＲ増幅が困難になる面がありました。Ｔｋｓ　ＧｆｌｅｘＴＭ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属細菌由来のＤＮＡポリメラーゼをベースに改良を加え、鋳型ＤＮＡへの過剰な結合を抑制することに成功しました。α型酵素特有の高い正確性に加えて優れた反応性を示します。」（第１頁）

（甲１－３）「独自の伸長因子を採用

生体内で、ＤＮＡポリメラーゼは伸長因子と複合体を形成してＤＮＡ複製を行っています。

上記の改良型酵素とＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（Ｒ）シリーズでも採用している弊社独自の改変型伸長因子を組み合わせることで、優れた伸長性と反応スピードを持つ酵素となりました。」（第１頁）（合議体注：上記（Ｒ）は白抜き丸の中にＲ。以下同じ。）

（甲１－４）「

」（第１頁）

（甲１－５）「クルードサンプルからも強力に増幅

マウス尾ライセートをはじめとする様々なクルードサンプルを鋳型とした場合でも、Ｔｋｓ　ＧｆｌｅｘＴＭを用いることで高効率なＰＣＲが可能です。

」（第３頁）

（甲１－６）「

」（第４頁）

２．甲第２号証：タカラバイオ　ＰＣＲ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　Ｇｕｉｄｅ　２０１２－２０１３（２０１２）目次、ｐ．５～７、巻末頁

（甲２－１）「Ｔｋｓ　ＧｆｌｅｘＴＭ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属古細菌由来のＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅをベースに、反応阻害の要因となる酵素の鋳型ＤＮＡに対する非特異的結合を抑制した改良型ＰＣＲ酵素です。」（第５頁）

（甲２－２）「ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（Ｒ）シリーズでも採用している弊社独自の改変型伸長因子を上記の改良型酵素と組み合わせることで、優れた伸長性と反応スピードを持つ酵素となりました。」（第５頁）

（甲２－３）「クルードサンプル、ＧＣリッチ・ＡＴリッチ・長鎖などの難増幅配列からも特異的な増幅が可能となり、ＰＣＲの反応成功率が大幅にアップしました。」（第５頁）

（甲２－４）「

」（第５頁）

（甲２－５）「一般的に、α型酵素は反応に最適な鋳型濃度の範囲が狭く、特に鋳型ＤＮＡを多量に加えた場合にかえってＰＣＲ反応が阻害される傾向があります。Ｔｋｓ　ＧｆｌｅｘＴＭはＰＣＲ増幅の阻害要因となる過剰な鋳型ＤＮＡへの非特異的結合を抑制した改良型酵素を採用している」（第６頁）

（甲２－６）「

」（第６頁）

（甲２－７）「クルードサンプルからの増幅

」（第７頁）

３．甲第３号証：生化学（２００９）Ｖｏｌ．８１，Ｎｏ．１２，ｐ．１０５６－１０６３

（甲３－１）「真核生物およびアーキアではＰＣＮＡ（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ　ｃｅｌｌ　ｎｕｃｌｅａｒ　ａｎｔｉｇｅｎ）が三量体で環状構造を形成する。筆者らは、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来ＰＣＮＡ（ＰｆｕＰＣＮＡ）の結晶構造から、分子間に働くイオン対が環状構造の安定性に重要であることを見出した。そして、環状構造の安定性を変えることによって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるＤＮＡ合成反応の促進作用を制御できることを発見した。野生型では増幅反応にとってむしろ阻害的に働くＰＣＮＡが、環状構造の安定性を下げる変異の導入によって、劇的に促進作用を発揮することを見出した。このことを利用してＰＣＮＡをＰＣＲに利用することに成功した。」（要約、第３行～第９行）

（甲３－２）「ＤＮＡポリメラーゼが鋳型ＤＮＡ鎖に対して、効率よく相補鎖を合成していく際に、ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ鎖から滑り落ちないように留めておくためにクランプ（スライディングクランプ）分子が働き、そのクランプ分子をＤＮＡ鎖上に乗せる役割を担うクランプローダーが存在する（図１ａ）２）。」（第１０５６頁右欄第１行～第６行）

（甲３－３）「

」（第１０５７頁、図１ａ）

（甲３－４）「

」（第１０５７頁、表１）

（甲３－５）「ＰＣＮＡリングの外側でこのような水素結合が観察されるのに対して、リングの内側では、境界面においてＮ末端側ドメインには正に荷電するアミノ酸が（Ａｒｇ８２、Ｌｙｓ８４、Ａｒｇ１０９）、Ｃ末端側ドメインには負に荷電するアミノ酸（Ｇｌｕ１３９、Ａｓｐ１４３、Ａｓｐ１４７）が分布しており、これらがイオン対ネットワークを形成している（図３ａ）７）。前述のように、このイオン対ネットワークがＰｆｕＰＣＮＡの特徴であるので、これがＰｆｕＰＣＮＡの環状構造形性に果たす役割を調べるために、ＰｆｕＰＣＮＡのＡｓｐ１４３およびＡｓｐ１４７をＡｌａに置換した変異体（Ｄ１４３Ａ、Ｄ１４３Ａ／Ｄ１４７Ａ）、Ａｓｐ１４３を逆電荷のＡｒｇに置換した変異体（Ｄ１４３Ｒ）を作製し、構造および機能解析を行った。」（第１０５８頁右欄第２９行～第１０５９頁左欄第９行）

（甲３－６）「これらの結果は、Ｄ１４３、Ｄ１４７が関与するイオン対形成がＰｆｕＰＣＮＡの正しい環状構造形成に大きく寄与していることを示している。」（第１０５９頁左欄第１７行～第１９行）

（甲３－７）「変異型ＰｆｕＰＣＮＡの２種（Ｄ１４３Ａ、Ｄ１４３Ａ／Ｄ１４７Ａ）を野生型ＰｆｕＰＣＮＡと比べてみたところ、変異型ＰｆｕＰＣＮＡ（Ｄ１４３Ａ／Ｄ１４７Ａ）は予想通りであったが、驚いたことに、変異型ＰｆｕＰＣＮＡ（Ｄ１４３Ａ）は野生型ＰｆｕＰＣＮＡよりもより強くＤＮＡ鎖合成を促進した８）。」（第１０５９頁左欄第２２行～第２６行）

（甲３－８）「ＰｆｕＰＣＮＡの環状構造の安定性がＤＮＡポリメラーゼ活性にどのような影響を及ぼすかについてさらに詳しく調べるために、環状構造の安定性が異なる４種類の（野生型、変異型（Ｄ１４３Ａ、Ｄ１４３Ａ／Ｄ１４７Ａ、Ｄ１４３Ｒ））を用いて、反応溶液中のイオン強度を変えながら、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでＤＮＡポリメラーゼ（ＰｆｕＰｏｌＢ）によるＤＮＡ鎖合成の促進作用を比較した。高次構造形成により特定の部位で停止する傾向のある鋳型ＤＮＡを用いて、ＰＣＮＡによるＤＮＡ鎖合成促進活性を調べてみたところ、０～８０ｍＭ塩化ナトリウムの範囲では環状構造の安定性が低い変異型ＰｆｕＰＣＮＡ（Ｄ１４３Ａ／Ｄ１４７Ａ、Ｄ１４３Ｒ）がより強い促進活性を示し、」（第１０６１頁左欄第２１行～第３２行）

（甲３－９）「ＰＣＮＡをＰＣＲにうまく利用するためには、セルフローディング／アンローディングが素早く起こるような環状構造の安定性を有するＰＣＮＡの変異体を利用すればいいのではないかと筆者らは考えた。すなわち環状構造をより不安定化させた変異体ＰｆｕＰＣＮＡの中には、それ自身でＤＮＡへの解離と再結合を繰り返すことができる適度な安定性を有するものがあるのではないかと考え、実験してみた。」（第１０６１頁右欄第２４行～第３１行）

（甲３－１０）「ＰＣＲをモデルとして、ＰｆｕＰＣＮＡを加えない時には全く増幅産物が検出されない条件下でＰｆｕＰＣＮＡの促進効果を見た。ＰｆｕＰＣＮＡは前述のＤＮＡ鎖伸長活性を比較した時と同様に、野生型ＰｆｕＰＣＮＡと３種類の変異型ＰｆｕＰＣＮＡを用いて比較した。その結果は、低塩濃度におけるＤＮＡ鎖伸長活性測定の時と同様に、環状構造が不安定化した変異型ＰｆｕＰＣＮＡ（Ｄ１４３Ａ／Ｄ１４７Ａ、Ｄ１４３Ｒ）を用いた時に、顕著に目的の増幅産物が検出された。」（第１０６２頁左欄第１行～第９行）

（甲３－１１）「

」（第１０６２頁、図６）

４．甲第４号証：国際公開第２００７／００４６５４号

（甲４－１）「［１］ＰＣＮＡの単量体であって、

単量体のＮ末端側領域と他の単量体のＣ末端側領域とが界面となって多量体を形成した場合に、各単量体の界面領域で単量体相互の分子間相互作用を形成する部位のアミノ酸残基が、電荷的に反発しあうアミノ酸残基で構成され、かつ、

単量体のまま又は多量体を形成して、ＤＮＡ複製を促進する活性を備える、変異型ＰＣＮＡ単量体。

［２］前記ＰＣＮＡ単量体が、配列番号２又は３２に記載のアミノ酸配列の場合における第８２番目、第８４番目、第１０９番目、第１３９番目、第１４３番目および第１４７番目からなる群より選ばれる少なくとも１つの位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に換えたアミノ酸配列を有し、

下記（ｉ）群から選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基と、下記（ｉｉ）群から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基とが電荷的に反発しあうアミノ酸残基により構成される、請求項１に記載の変異型ＰＣＮＡ単量体。

（ｉ）第８２番目、第８４番目および第１０９番目のアミノ酸残基群

（ｉｉ）第１３９番目、第１４３番目および第１４７番目のアミノ酸残基群

・・・・・・・・・

［５］前記（ｉ）群から選ばれる少なくとも１つ以上アミノ酸と（ｉｉ）群から選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸とが、双方とも酸性アミノ酸、または双方とも塩基性アミノ酸である、請求項２から４のいずれか１項に記載の変異型ＰＣＮＡ単量体。

［６］配列番号２又は３２に記載のアミノ酸配列において、第１４３番目のアミノ酸残基をアルギニンに換えた配列を有する、請求項２から５のいずれか１項に記載の変異型ＰＣＮＡ単量体。」（請求項１、２、５、６）

（甲４－２）「その結果、一方の単量体のＮ末端側領域と他の単量体のＣ末端側領域とが界面となって多量体を形成した場合に、界面領域において単量体相互の分子間相互作用を形成する部位のアミノ酸残基が、他方の単量体の界面領域内のアミノ酸残基と相互に電荷的反発を生じるアミノ酸残基で構成されるように調製することにより、ＲＦＣの有無にほとんど依存せず、伸長性、忠実性のバランス良くＤＮＡの伸長反応を促進し得る作用を備えたＰＣＮＡが得られるという知見を得、本発明を完成させるに至った。」（［００２１］）

（甲４－３）「本発明は、ＤＮＡ複製反応をより促進し得るように、ＰＣＮＡ単量体の界面領域のアミノ酸配列を特定したものである。本発明のＰＣＮＡは、菌主の異なる多数のＤＮＡポリメラーゼにも適用性があり、汎用性が高い。また、本発明のＰＣＮＡは、ＲＦＣを併用しない場合でも優れたＤＮＡ伸長促進活性を発揮する点において、従来に比し極めて特異な性能を発揮し得るものである。」（［００２３］）

（甲４－４）「図２に、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ　ＰＣＮＡの分子間相互作用のモデル図を示す。図２では、配列番号２に記載のアミノ酸配列（野生型Ｐｆｕ－ＰＣＮＡのアミノ酸配列）を有するＰＣＮＡについて説明する。一方の単量体１０ａのＮ末端側領域内に含まれるアミノ酸残基と、他方の単量体１０ｃのＣ末端側領域内とに含まれるアミノ酸残基とが分子間対を形成する。図２に示すように、配列番号２に記載のアミノ酸配列における、１３９番目、第１４３番目および第１４７番目のアミノ酸残基群と、第８２番目、第８４番目、第１０９番目のアミノ酸残基群とが、相互に影響しあうネットワークを形成すると考えられる。」（［００３０］）

（甲４－５）「

」（図２）

（甲４－６）「本発明のＤＮＡ複製方法は、ＰＣＮＡ単量体および／または前記単量体で構成された多量体およびＤＮＡポリメラーゼの存在下でＤＮＡの合成反応を行うことを特徴とする。ＤＮＡの合成方法としては、ＰＣＲ、プライマーエクステンション、ニックトランスレーション、逆転写酵素によるＦｉｒｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ合成、などが挙げられる。」（［００５５］）

（甲４－７）「本発明のＰＣＮＡは、様々なＤＮＡポリメラーゼと相性がよく、汎用性が高い。ＤＮＡポリメラーゼは、通常、伸長性または忠実性のいずれか一方に優れ、一長一短があるのが一般的である。しかし、本発明のＰＣＮＡと組み合わせることにより、忠実性を低下させずに、伸長性を向上し得るため、ＤＮＡポリメラーゼの短所を補強しつつＤＮＡ複製活性が増強され得る。本発明のＤＮＡ複製方法において用いるＤＮＡポリメラーゼとして好ましくは、例えば、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）、ＴａＫａＲａ　ＥＸ　Ｔａｑ（タカラバイオ社）、Ｖｅｎｔ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＷ　ＥＮＧＬＡＮＤ　Ｂｉｏ　Ｌａｂｓ社）、Ｄｅｅｐ　ＶｅｎｔＲ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社）、Ｐｆｕ　Ｔｕｒｂｏ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ストラタジーン社）、ＫＯＤ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）、およびＰｗｏ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ロッシュ・ダイアグノスティックス社）など、現在主要に用いられているＤＮＡポリメラーゼのほとんどに適用し得る。また、本発明のＰＣＮＡは特に伸長性向上に有効であり、忠実性には優れるが、伸長性に劣るタイプのα型ポリメラーゼとの組み合わせにおいて特に有用である。

本発明のＤＮＡ複製方法においては，本発明のＰＣＮＡがＲＦＣを必要としないことから，反応系にＲＦＣを添加しなくてよい。」（［００５７］～［００５８］）

（甲４－８）「

」（［００８８］、表２）

（甲４－９）「

」（［０２８８］、表１８）

５．甲第５号証：生物工学（２０１２）Ｖｏｌ．９０，Ｎｏ．１０，ｐ．６４９－６５３

（甲５－１）「超好熱アーキア由来の酵素は、真核生物の複製酵素と共にファミリーＢ（前述のＰｏｌα様酵素）に属する。」（第６５１頁左欄第１７行～第１９行）

６．甲第６号証：Ａｎａｌ．Ｓｃｉ．（２００９）Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．１２，ｐ．１４８７－１４８９

（甲６－１）「鋳型としてヒト毛根を直接使用する、単純で、労力のいらない、安価かつ迅速なＳＮＰジェノタイピング法を開発した。該シングルチューブ・ジェノタイピング法は、毛根（ＤＮＡ単離なしに）およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）酵素キットＫＯＤ　ＦＸを用いてＡＤＨ１Ｂ及びＡＬＤＨ２多型を首尾よく、かつ、確実にジェノタイプするのに使用された。」（要約、第１行～第４行）

（甲６－２）「ＰＣＲ増幅酵素キットＫＯＤ　ＦＸは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来の新規なＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ　ＫＯＤ１に基づいており、生物試料中に存在する阻害物質を効果的に中和する。さらに、該システムは、紙上で乾燥させた全血からのＤＮＡを抽出することなく、試料の再現可能なハイスループット直接ＰＣＲ増幅に寄与する。」（第１４８７頁左欄第２６行～第３２行）

７．甲第７号証：ＵＰＬＯＡＤ（２００８）Ｖｏｌ．９２，ｐ．１５－１６

（甲７－１）「ＫＯＤ　ＦＸを用いた植物ライセートからの直接ＰＣＲ」（第１５頁、表題）

（甲７－２）「『ＫＯＤ　ＦＸ』は、様々な優れた特性を有するＰＣＲ酵素『ＫＯＤ　ＦＸ』をベースに開発された高性能ＰＣＲ試薬です。・・・・・・本酵素では、クルードなサンプルを鋳型に用いた場合においても、高いＰＣＲ成功率を示し、確実な結果を期待することができます。」（第１５頁、「はじめに」第１行～第３行）

８．甲第８号証：ＫＯＤ　ＦＸ　実験例集（２００９）表紙、ｐ．１～１４、巻末頁

（甲８－１）「高成功率ＰＣＲ酵素　ＫＯＤ　ＦＸ　実験例集」（表紙、表題）

（甲８－２）「応用編　クルードサンプルのＰＣＲ

実験例１　全血サンプルの増幅例（血液を直接サンプルとして使用）」（第５頁、第１行～第２行）

（甲８－３）「結果

結果のように、ＫＯＤ　ＦＸを使用した場合のみ、異なる血液量でもすべてはっきりとした増幅ができます。さらに、ＫＯＤ　ＦＸを使用すると最大８．５ｋｂの目的断片の増幅ができます。」（第５頁、第２２行～第２４行）

上記記載事項（甲１－１）～（甲１－６）又は上記記載事項（甲２－１）～（甲２－７）から、甲第１号証又は甲第２号証には、「動植物組織から選択されるクルードサンプルを核酸増幅反応液に添加し、該サンプル中の標的核酸を増幅する方法であって、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌から単離されるα型ＤＮＡポリメラーゼと、改変型伸長因子を反応液中に含んでいる核酸増幅法。」の発明が記載されていると認められる。

第５　当審の判断

１．本件特許発明１について

甲第１号証又は甲第２号証に記載された発明の「クルードサンプル」は、本件特許発明１の「精製工程を経ていない」「生体試料」に相当し、また、甲第１号証又は甲第２号証に記載された発明の「サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌から単離されるα型ＤＮＡポリメラーゼ」が、ファミリーＢに属することは技術常識である（例えば、甲第５号証の上記記載事項（甲５－１））から、本件特許発明１と甲第１号証又は甲第２号証に記載された発明とを対比すると、両者は、「精製工程を経ていない、動植物組織、体液、排泄物、細胞、細菌、及びウイルスからなる群から選択される生体試料を核酸増幅反応液に添加し、該生体試料中の標的核酸を増幅する方法であって、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属またはサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌から単離されるファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを反応液中に含んでいることを特徴とする核酸増幅法。」に係る発明である点で一致し、以下の点で相違する。

（相違点）本件特許発明１は、「配列番号２１または配列番号２２で示されるアミノ酸配列において、下記（ａ）および（ｂ）で示される群の位置に存在するアミノ酸残基のうち少なくとも一つの改変を有し、かつ、増幅増強活性を示すポリペプチドからなるＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ　Ｃｅｌｌ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ）

（ａ）８２、８４および１０９番目のアミノ酸残基群

（ｂ）１３９、１４３および１４７番目のアミノ酸残基群」を反応液中に含んでいるのに対し、甲第１号証又は甲第２号証に記載された発明は、「改変型伸長因子」を含んでいる点。

相違点について検討する。

甲第３号証、甲第４号証には、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属またはサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌由来のＰＣＮＡのアミノ酸配列において、１４３番目、１４７番目、８２番目及び１０９番目のアミノ酸残基のうち少なくとも一つの改変を有し、かつ、増幅増強活性を示すポリペプチドからなるＰＣＮＡ変異体が記載されており、また、該ＰＣＮＡ変異体を、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属またはサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌由来のファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼと組み合わせて核酸増幅に用いることが記載されていると認められる（上記記載事項（甲３－１）～（甲３－６）、上記記載事項（甲４－１）～（甲４－７））が、甲第３号証、甲第４号証には、該ＰＣＮＡ変異体を、精製工程を経ていない、動植物組織等の生体試料から核酸を増幅する際に使用することなどは記載も示唆もされておらず、精製工程を経ていないクルードな生体試料という過酷な条件で使用し得るとは当業者は解することができない。

異議申立人は、甲第１号証、甲第２号証の図（上記記載事項（甲１－４）、（甲１－６）、（甲２－４）、（甲２－６））が、甲第３号証の図（上記記載事項（甲３－３）、（甲３－１１））と類似していることに基づき、甲第３号証、甲第４号証のＰＣＮＡ変異体を甲第１号証、甲第２号証の「改変型伸長因子」の代わりに用いることができる旨主張する。

しかしながら、いずれの甲号証にも、「改変型伸長因子」がＰＣＮＡの改変型であることを示す記載はなく、また、図が似ているというだけで、甲第１号証、甲第２号証に記載されている「改変型伸長因子」の代わりに、甲第３号証、甲第４号証に記載されているＰＣＮＡ変異体を用いることの動機付けになるものとはいえない。

加えて、甲第１号証、甲第２号証には、「改変型伸長因子」が、どのような改変を有する伸長因子であるのか何ら具体的に記載されておらず、甲第３号証、甲第４号証には、改変型伸長因子とＰＣＮＡ変異体が対応することの記載も示唆もなく、また、上述のとおり、ＰＣＮＡ変異体を、精製工程を経ていない、動植物組織等の生体試料から核酸を増幅する際に使用することの記載も示唆もないから、甲第３号証、甲第４号証に記載された事項が、甲第１号証、甲第２号証に記載されている「改変型伸長因子」の代わりに、甲第３号証、甲第４号証に記載されているＰＣＮＡ変異体を用いることの動機付けになるものとはいえない。

また、甲第６～８号証に記載されているように、精製工程を経ていない生体試料から核酸を増幅する際に、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌由来のファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを使用することが本願優先日前周知技術であったとしても、甲第３号証、甲第４号証に記載のＰＣＮＡ変異体がクルードな生体試料で核酸増幅に使用し得ると当業者が理解し得なければ、甲第１号証、甲第２号証に記載されている「改変型伸長因子」の代わりに、甲第３号証、甲第４号証に記載されているＰＣＮＡ変異体を用いることの動機付けになるものとはいえない。

よって、甲第３～４号証に記載された事項及び甲第５～８号証に記載されている周知技術を参照しても、甲第１号証又は甲第２号証に記載された発明において、「改変型伸長因子」の代わりに、「配列番号２１または配列番号２２で示されるアミノ酸配列において、（ａ）８２、８４および１０９番目のアミノ酸残基群および（ｂ）１３９、１４３および１４７番目のアミノ酸残基群で示される群の位置に存在するアミノ酸残基のうち少なくとも一つの改変を有し、かつ、増幅増強活性を示すポリペプチドからなるＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ　Ｃｅｌｌ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ）」を用いることは、当業者が容易に想到し得ることとはいえない。

そして、本件特許発明１は、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属またはサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌から単離されるファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼと、特定のアミノ酸残基に改変を有するＰＣＮＡを用いることにより、精製工程を経ていない、動植物組織等の生体試料から核酸増幅することができるという効果を奏するのに対し、甲第１号証には、クルードサンプルについて、「ＰＣＲ阻害物質を吸収する成分＆増幅増強成分のバッファー系への添加で対応力アップ！」（上記記載事項（甲１－１））と記載されているように、Ｔｋｓ　ＧｆｌｅｘＴＭ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにおいて、クルードサンプルを鋳型とした場合でも高効率なＰＣＲが可能となったのは、「ＰＣＲ阻害物質を吸収する成分」や「増幅増強成分」をバッファー系へ添加したことによる効果であると認められるから、本件特許発明１の効果は、甲第１号証又は甲第２号証の記載から当業者が予測し得ないものである。

したがって、本件特許発明１は、甲第１号証又は甲第２号証に記載された発明及び甲第３～４号証に記載された事項並びに甲第５～８号証に記載されている周知技術に基いて、当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえない。

２．本件特許発明２～５について

本件特許発明２～５は、本件特許発明１に更なる限定を加えた発明であるから、上記１．で述べたように、本件特許発明１が、甲第１号証又は甲第２号証に記載された発明及び甲第３～４号証に記載された事項並びに甲第５～８号証に記載されている周知技術に基いて、当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえない以上、本件特許発明２～５も、甲第１号証又は甲第２号証に記載された発明及び甲第３～４号証に記載された事項並びに甲第５～８号証に記載されている周知技術に基いて、当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえない。

第６　むすび

以上のとおりであるから、特許異議申立の理由によっては、本件特許発明１～５に係る特許を取り消すことはできない。また、他に本件特許発明１～５に係る特許を取り消すべき理由を発見しない。

よって、結論のとおり決定する。