2021-701032

第２ 訂正の適否

１ 訂正の内容

令和４年６月３日付けの訂正請求書の訂正請求（以下、「本件訂正請求」という。）による訂正の内容は、次のとおりである。

（１）訂正事項１－１

特許請求の範囲の請求項１の工程（ａ）に、「細胞」と記載されているのを「細胞（但し、受精卵を除く）」に訂正する。

（２）訂正事項１－２

特許請求の範囲の請求項１の「２種以上の選択マーカー用ドナーＤＮＡ、」という記載の後に、「ここで、前記ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子は、薬剤耐性遺伝子であり、かつ、２種以上の選択マーカー用ドナーＤＮＡがそれぞれ、前記上流ホモロジーアームと前記下流ホモロジーアームの間に、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子とネガティブ選択用のマーカー遺伝子と標的配列とを有し、」を追加する。

特許請求の範囲の請求項１に、「を含む、」と記載されているのを、

「（ｃ）前記工程（ｂ）の後、下記（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を選択された細胞に導入して前記２以上のアレルに組換え用ドナーＤＮＡを導入する工程と、

（ｉｉｉ）前記標的配列を標的とし、当該標的配列を切断することができる配列特異的核酸切断分子、又は前記配列特異的核酸切断分子をコードするポリヌクレオチドを含むゲノム改変システム、

（ｉｖ）所望の塩基配列を含む組換え用ドナーＤＮＡであって、前記標的領域の上流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する上流ホモロジーアームと、前記標的領域の下流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する下流ホモロジーアームを有する、組換え用ドナーＤＮＡ、

（ｄ）前記工程（ｃ）の後、前記ネガティブ選択用のマーカー遺伝子を発現しない細胞を選択する工程（ネガティブ選択のための工程）と、

を含み、」に訂正する。

（３）訂正事項１－３

特許請求の範囲の請求項１の「方法。」という記載の前に、「標的領域が１０ｋｂｐ以上の長さを有する、」を追加する。

（４）訂正事項１－４

特許請求の範囲の請求項１に、「選択マーカー遺伝子の塩基配列」と記載されているのを「ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子の塩基配列」に訂正し、「前記選択マーカー遺伝子」と記載されているのを、「前記ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子」に訂正し、「導入された当該区別可能に異なる選択マーカー遺伝子」と記載されているのを「導入された当該区別可能に異なるポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子」に訂正する。

（５）訂正事項２－１

特許請求の範囲の請求項２の工程（ａ）に、「細胞」と記載されているのを「細胞（但し、受精卵を除く）」に訂正する。

（６）訂正事項２－２

特許請求の範囲の請求項２の「２種以上の選択マーカー用ドナーＤＮＡ、」という記載の後に、「ここで、前記ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子は、薬剤耐性遺伝子であり、かつ、２種以上の選択マーカー用ドナーＤＮＡがそれぞれ、前記上流ホモロジーアームと前記下流ホモロジーアームの間に、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子とネガティブ選択用のマーカー遺伝子と標的配列とを有し、」を追加する。

特許請求の範囲の請求項２に、「を含む、」と記載されているのを、

「（ｃ）前記工程（ｂ）の後、下記（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を選択された細胞に導入して前記２以上のアレルに組換え用ドナーＤＮＡを導入する工程と、

（ｉｉｉ）前記標的配列を標的とし、当該標的配列を切断することができる配列特異的核酸切断分子、又は前記配列特異的核酸切断分子をコードするポリヌクレオチドを含むゲノム改変システム、

（ｉｖ）所望の塩基配列を含む組換え用ドナーＤＮＡであって、前記標的領域の上流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する上流ホモロジーアームと、前記標的領域の下流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する下流ホモロジーアームを有する、組換え用ドナーＤＮＡ、

（ｄ）前記工程（ｃ）の後、前記ネガティブ選択用のマーカー遺伝子を発現しない細胞を選択する工程（ネガティブ選択のための工程）と、

を含み、」に訂正する。

（７）訂正事項２－３

特許請求の範囲の請求項２の「方法。」という記載の前に、「標的領域が１０ｋｂｐ以上の長さを有する、」を追加する。

（８）訂正事項２－４

特許請求の範囲の請求項２に、「選択マーカー遺伝子の塩基配列」と記載されているのを「ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子の塩基配列」に訂正し、「相互に区別可能に異なる選択マーカー遺伝子」と記載されているのを「相互に区別可能に異なるポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子」に訂正し、「前記選択マーカー遺伝子」と記載されているのを、「前記ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子」に訂正し、「導入された当該区別可能に異なる選択マーカー遺伝子」と記載されているのを「導入された当該区別可能に異なるポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子」に訂正する。

（９）訂正事項３

特許請求の範囲の請求項３に、「５ｋｂｐ以上」と記載されているのを「１０ｋｂｐ以上４０ｋｂｐ以下」に訂正する。

（１０）訂正事項４

特許請求の範囲の請求項４に、「８ｋｂｐ以上」と記載されているのを「１０ｋｂｐ以上２０ｋｂｐ以下」に訂正する。

（１１）訂正事項５

特許請求の範囲の請求項５に、

「２種以上の選択マーカー用ドナーＤＮＡがそれぞれ、前記上流ホモロジーアームと前記下流ホモロジーアームの間に、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子とネガティブ選択用のマーカー遺伝子と標的配列とを有し、ここで、当該選択マーカー遺伝子がポジティブ選択用にもネガティブ選択用にも用いられる場合には、別のネガティブ選択用の選択マーカー遺伝子を有していなくてよく、

（ｃ）前記工程（ｂ）の後、下記（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を選択された細胞に導入して前記２以上のアレルに組換え用ドナーＤＮＡを導入する工程と、 （ｉｉｉ）前記標的配列を標的とし、当該標的配列を切断することができる配列特異的核酸切断分子、又は前記配列特異的核酸切断分子をコードするポリヌクレオチドを含むゲノム改変システム、

（ｉｖ）所望の塩基配列を含む組換え用ドナーＤＮＡであって、前記標的領域の上流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する上流ホモロジーアームと、前記標的領域の下流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する下流ホモロジーアームを有する、組換え用ドナーＤＮＡ、

（ｄ）前記工程（ｃ）の後、前記ネガティブ選択用のマーカー遺伝子を発現しない細胞を選択する工程（ネガティブ選択のための工程）と、

をさらに含む、」と記載されているのを削除する。

特許請求の範囲の請求項５の「請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。」という記載の前に、「前記上流ホモロジーアームおよび前記下流ホモロジーアームがそれぞれ、５００ｂｐ～３，０００ｂｐである、」を追加する。

（１２）訂正事項６

特許請求の範囲の請求項６に、

「２種以上の選択マーカー用ドナーＤＮＡがそれぞれ、前記上流ホモロジーアームと前記下流ホモロジーアームの間に、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子とネガティブ選択用のマーカー遺伝子と標的配列とを有し、ここで、当該選択マーカー遺伝子がポジティブ選択用にもネガティブ選択用にも用いられる場合には、別のネガティブ選択用の選択マーカー遺伝子を有していなくてよく、

（ｃ）前記工程（ｂ）の後、下記（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を選択された細胞に導入して前記２以上のアレルに組換え用ドナーＤＮＡを導入する工程と、

（ｉｉｉ）前記標的配列を標的とし、当該標的配列を切断することができる配列特異的核酸切断分子、又は前記配列特異的核酸切断分子をコードするポリヌクレオチドを含むゲノム改変システム、

（ｉｖ）所望の塩基配列を含む組換え用ドナーＤＮＡであって、前記標的領域の上流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する上流ホモロジーアームと、前記標的領域の下流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する下流ホモロジーアームを有する、組換え用ドナーＤＮＡ、

（ｄ）前記工程（ｃ）の後、前記ネガティブ選択用のマーカー遺伝子を発現しない細胞を選択する工程（ネガティブ選択のための工程）と、

をさらに含む、」と記載されているのを削除する。

特許請求の範囲の請求項６の「請求項３に記載の方法。」という記載の前に、「前記上流ホモロジーアームおよび前記下流ホモロジーアームがそれぞれ、５００ｂｐ～３，０００ｂｐである、」を追加する。

（１３）訂正事項７

特許請求の範囲の請求項７に、

「２種以上の選択マーカー用ドナーＤＮＡがそれぞれ、前記上流ホモロジーアームと前記下流ホモロジーアームの間に、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子とネガティブ選択用のマーカー遺伝子と標的配列とを有し、ここで、当該選択マーカー遺伝子がポジティブ選択用にもネガティブ選択用にも用いられる場合には、別のネガティブ選択用の選択マーカー遺伝子を有していなくてよく、

（ｃ）前記工程（ｂ）の後、下記（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を選択された細胞に導入して前記２以上のアレルに組換え用ドナーＤＮＡを導入する工程と、

（ｉｉｉ）前記標的配列を標的とし、当該標的配列を切断することができる配列特異的核酸切断分子、又は前記配列特異的核酸切断分子をコードするポリヌクレオチドを含むゲノム改変システム、

（ｉｖ）所望の塩基配列を含む組換え用ドナーＤＮＡであって、前記標的領域の上流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する上流ホモロジーアームと、前記標的領域の下流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する下流ホモロジーアームを有する、組換え用ドナーＤＮＡ、

（ｄ）前記工程（ｃ）の後、前記ネガティブ選択用のマーカー遺伝子を発現しない細胞を選択する工程（ネガティブ選択のための工程）と、

をさらに含む、」と記載されているのを削除する。

特許請求の範囲の請求項７の「請求項４に記載の方法。」という記載の前に、「前記上流ホモロジーアームおよび前記下流ホモロジーアームがそれぞれ、５００ｂｐ～３，０００ｂｐである、」を追加する。

（１４）訂正事項８

特許請求の範囲の請求項８に、「請求項５～７」と記載されているのを、「請求項１～７」に訂正する。

（１５）訂正事項９

特許請求の範囲の請求項９に、「請求項６または７」と記載されているのを、「請求項３または４」に訂正する。

（１６）訂正事項１０

特許請求の範囲の請求項１０に、「請求項７」と記載されているのを、「請求項４」に訂正する。

（１７）訂正事項１１－１

特許請求の範囲の請求項１２に、「選択マーカー遺伝子の塩基配列」と記載されているのを「ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子の塩基配列」に訂正し、「相互に区別可能に異なる選択マーカー遺伝子」と記載されているのを「相互に区別可能に異なるポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子」に訂正し、「前記選択マーカー遺伝子」と記載されているのを、「前記ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子」に訂正する。

（１８）訂正事項１１－２

特許請求の範囲の請求項１２の「ＤＮＡ。」という記載の「ＤＮＡ」と「。」との間に、「、 ここで、選択マーカー遺伝子は、薬剤耐性遺伝子であり、かつ、２種以上の選択マーカー用ドナーＤＮＡがそれぞれ、前記上流ホモロジーアームと前記下流ホモロジーアームの間に、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子とネガティブ選択用のマーカー遺伝子と標的配列とを有する」を追加する。

（１９）訂正事項１２

特許請求の範囲の請求項１３に、「５ｋｂｐ以上」と記載されているのを「１０ｋｂｐ以上４０ｋｂｐ以下」に訂正する。

（２０）訂正事項１３

特許請求の範囲の請求項１４に、「８ｋｂｐ以上」と記載されているのを「１０ｋｂｐ以上２０ｋｂｐ以下」に訂正する。

（２１）訂正事項１４

特許請求の範囲の請求項２０に、「請求項５」と記載されているのを、「請求項１～４のいずれか一項」に訂正する。

（２２）訂正事項１５

特許請求の範囲の請求項２１に、「請求項６または７」と記載されているのを、「請求項３または４」に訂正する。

（２３）訂正事項１６

特許請求の範囲の請求項２４に、「請求項５」と記載されているのを、「請求項１～４のいずれか一項」に訂正する。

（２４）訂正事項１７

特許請求の範囲の請求項２５に、「請求項６または７」と記載されているのを、「請求項３または４」に訂正する。

（２５）訂正事項１８

特許請求の範囲の請求項２７に、「請求項６または７」と記載されているのを、「請求項３または４」に訂正する。

２ 一群の請求項について

訂正前の請求項３～２８は、訂正前の請求項１、２を直接的又は間接的に引用するものであって、訂正事項１－１～１－４、２－１～２－４によって記載が訂正される請求項１、２に連動して訂正されるものであるから、訂正前の請求項１～２８は、特許法第１２０条の５第４項に規定する一群の請求項である。

したがって、本件訂正請求による訂正は、特許法第１２０条の５第４項に規定する一群の請求項について請求されたものである。

３ 訂正の目的の適否、特許請求の範囲の実質上の拡張又は変更の存否、新規事項追加の有無、独立特許要件

（１）訂正事項１－１について

ア 訂正の目的の適否

訂正事項１－１は、「除くクレーム」に該当するものであるから、特許法第１２０条の５第２項ただし書第１号に規定する特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。

イ 特許請求の範囲の実質上の拡張又は変更の存否

訂正事項１－１は、「除くクレーム」に該当するものであり、カテゴリーや対象、目的を変更するものではないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではなく、特許法第１２０条の５第９項で準用する第１２６条第６項の規定に適合するものである。

ウ 新規事項追加の有無

訂正事項１－１は、「除くクレーム」に該当するものであるから、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第１２０条の５第９項で準用する第１２６条第５項の規定に適合するものである。

エ 独立特許要件

本件においては、すべての請求項について特許異議申立てがされているので、訂正事項１－１に関して、特許法第１２０条の５第９項で読み替えて準用する第１２６条第７項の独立特許要件は適用されない。

（２）訂正事項１－２について

ア 訂正の目的の適否

訂正事項１－２は、訂正前の請求項１に、「ここで、前記ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子は、薬剤耐性遺伝子であり、かつ、２種以上の選択マーカー用ドナーＤＮＡがそれぞれ、前記上流ホモロジーアームと前記下流ホモロジーアームの間に、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子とネガティブ選択用のマーカー遺伝子と標的配列とを有し、」、「（ｃ）前記工程（ｂ）の後、下記（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を選択された細胞に導入して前記２以上のアレルに組換え用ドナーＤＮＡを導入する工程と、 （ｉｉｉ）前記標的配列を標的とし、当該標的配列を切断することができる配列特異的核酸切断分子、又は前記配列特異的核酸切断分子をコードするポリヌクレオチドを含むゲノム改変システム、 （ｉｖ）所望の塩基配列を含む組換え用ドナーＤＮＡであって、前記標的領域の上流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する上流ホモロジーアームと、前記標的領域の下流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する下流ホモロジーアームを有する、組換え用ドナーＤＮＡ、 （ｄ）前記工程（ｃ）の後、前記ネガティブ選択用のマーカー遺伝子を発現しない細胞を選択する工程（ネガティブ選択のための工程）と、」を追加するものであり、発明特定事項の直列的付加に該当するものであるから、特許法第１２０条の５第２項ただし書第１号に規定する特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。

イ 特許請求の範囲の実質上の拡張又は変更の存否

訂正事項１－２は、発明特定事項の直列的付加に該当するものであり、カテゴリーや対象、目的を変更するものではないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではなく、特許法第１２０条の５第９項で準用する第１２６条第６項の規定に適合するものである。

ウ 新規事項追加の有無

願書に添付した特許請求の範囲の請求項５には、「２種以上の選択マーカー用ドナーＤＮＡがそれぞれ、前記上流ホモロジーアームと前記下流ホモロジーアームの間に、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子とネガティブ選択用のマーカー遺伝子と標的配列とを有」すること、「（ｃ）前記工程（ｂ）の後、下記（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を選択された細胞に導入して前記２以上のアレルに組換え用ドナーＤＮＡを導入する工程と、 （ｉｉｉ）前記標的配列を標的とし、当該標的配列を切断することができる配列特異的核酸切断分子、又は前記配列特異的核酸切断分子をコードするポリヌクレオチドを含むゲノム改変システム、 （ｉｖ）所望の塩基配列を含む組換え用ドナーＤＮＡであって、前記標的領域の上流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する上流ホモロジーアームと、前記標的領域の下流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する下流ホモロジーアームを有する、組換え用ドナーＤＮＡ、 （ｄ）前記工程（ｃ）の後、前記ネガティブ選択用のマーカー遺伝子を発現しない細胞を選択する工程（ネガティブ選択のための工程）と、」を含むことが記載されており、また、願書に添付した明細書の段落【００４８】には、「ポジティブ選択マーカー遺伝子としては、例えば、薬剤耐性遺伝子、・・・・・・等が挙げられる。」と記載されているから、訂正事項１－２は、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第１２０条の５第９項で準用する第１２６条第５項の規定に適合するものである。

エ 独立特許要件

本件においては、すべての請求項について特許異議申立てがされているので、訂正事項１－２に関して、特許法第１２０条の５第９項で読み替えて準用する第１２６条第７項の独立特許要件は適用されない。

（３）訂正事項１－３について

ア 訂正の目的の適否

訂正事項１－３は、訂正前の請求項１に、「標的領域が１０ｋｂｐ以上の長さを有する、」を追加するものであり、発明特定事項の直列的付加に該当するものであるから、特許法第１２０条の５第２項ただし書第１号に規定する特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。

イ 特許請求の範囲の実質上の拡張又は変更の存否

訂正事項１－３は、発明特定事項の直列的付加に該当するものであり、カテゴリーや対象、目的を変更するものではないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではなく、特許法第１２０条の５第９項で準用する第１２６条第６項の規定に適合するものである。

ウ 新規事項追加の有無

願書に添付した明細書の段落【００３５】には、「ゲノム改変の対象となる標的領域は、１以上のアレルを有するゲノム上の任意の領域とすることができる。標的領域のサイズは、特に限定されない。本実施形態のゲノム改変方法では、従来よりも大きなサイズの領域を改変することができる。標的領域は、例えば、１０ｋｂｐ以上であってもよい。標的領域は、例えば、１００ｂｐ以上、２００ｂｐ以上、４００ｂｐ以上、８００ｂｐ以上、１ｋｂｐ以上、２ｋｂｐ以上、３ｋｂｐ以上、４ｋｂｐ以上、５ｋｂｐ以上、８ｋｂｐ以上、１０ｋｂｐ以上、２０ｋｂｐ以上、４０ｋｂｐ以上、８０ｋｂｐ以上、１００ｋｂｐ以上、又は２００ｋｂｐ以上であってもよい。」と記載されているから、訂正事項１－３は、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第１２０条の５第９項で準用する第１２６条第５項の規定に適合するものである。

エ 独立特許要件

本件においては、すべての請求項について特許異議申立てがされているので、訂正事項１－３に関して、特許法第１２０条の５第９項で読み替えて準用する第１２６条第７項の独立特許要件は適用されない。

（４）訂正事項１－４について

ア 訂正の目的の適否

訂正事項１－４は、訂正前の請求項１に、「選択マーカー遺伝子の塩基配列」と記載されているのを「ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子の塩基配列」に限定し、「前記選択マーカー遺伝子」と記載されているのを、「前記ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子」に限定し、「導入された当該区別可能に異なる選択マーカー遺伝子」と記載されているのを「導入された当該区別可能に異なるポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子」に限定するものであるから、特許法第１２０条の５第２項ただし書第１号に規定する特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。

イ 特許請求の範囲の実質上の拡張又は変更の存否

訂正事項１－４は、「選択マーカー遺伝子の塩基配列」と記載されているのを「ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子の塩基配列」に限定し、「前記選択マーカー遺伝子」と記載されているのを、「前記ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子」に限定し、「導入された当該区別可能に異なる選択マーカー遺伝子」と記載されているのを「導入された当該区別可能に異なるポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子」に限定するものであり、カテゴリーや対象、目的を変更するものではないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではなく、特許法第１２０条の５第９項で準用する第１２６条第６項の規定に適合するものである。

ウ 新規事項追加の有無

願書に添付した特許請求の範囲の請求項５には、「ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子」と記載されているから、訂正事項１－４は、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第１２０条の５第９項で準用する第１２６条第５項の規定に適合するものである。

エ 独立特許要件

本件においては、すべての請求項について特許異議申立てがされているので、訂正事項１－４に関して、特許法第１２０条の５第９項で読み替えて準用する第１２６条第７項の独立特許要件は適用されない。

（５）訂正事項２－１について

ア 訂正の目的の適否

訂正事項２－１は、「除くクレーム」に該当するものであるから、特許法第１２０条の５第２項ただし書第１号に規定する特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。

イ 特許請求の範囲の実質上の拡張又は変更の存否

訂正事項２－１は、「除くクレーム」に該当するものであり、カテゴリーや対象、目的を変更するものではないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではなく、特許法第１２０条の５第９項で準用する第１２６条第６項の規定に適合するものである。

ウ 新規事項追加の有無

訂正事項２－１は、「除くクレーム」に該当するものであるから、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第１２０条の５第９項で準用する第１２６条第５項の規定に適合するものである。

エ 独立特許要件

本件においては、すべての請求項について特許異議申立てがされているので、訂正事項２－１に関して、特許法第１２０条の５第９項で読み替えて準用する第１２６条第７項の独立特許要件は適用されない。

（６）訂正事項２－２について

ア 訂正の目的の適否

訂正事項２－２は、訂正前の請求項２に、「ここで、前記ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子は、薬剤耐性遺伝子であり、かつ、２種以上の選択マーカー用ドナーＤＮＡがそれぞれ、前記上流ホモロジーアームと前記下流ホモロジーアームの間に、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子とネガティブ選択用のマーカー遺伝子と標的配列とを有し、」、「（ｃ）前記工程（ｂ）の後、下記（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を選択された細胞に導入して前記２以上のアレルに組換え用ドナーＤＮＡを導入する工程と、 （ｉｉｉ）前記標的配列を標的とし、当該標的配列を切断することができる配列特異的核酸切断分子、又は前記配列特異的核酸切断分子をコードするポリヌクレオチドを含むゲノム改変システム、 （ｉｖ）所望の塩基配列を含む組換え用ドナーＤＮＡであって、前記標的領域の上流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する上流ホモロジーアームと、前記標的領域の下流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する下流ホモロジーアームを有する、組換え用ドナーＤＮＡ、 （ｄ）前記工程（ｃ）の後、前記ネガティブ選択用のマーカー遺伝子を発現しない細胞を選択する工程（ネガティブ選択のための工程）と、」を追加するものであり、発明特定事項の直列的付加に該当するものであるから、特許法第１２０条の５第２項ただし書第１号に規定する特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。

イ 特許請求の範囲の実質上の拡張又は変更の存否

訂正事項２－２は、発明特定事項の直列的付加に該当するものであり、カテゴリーや対象、目的を変更するものではないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではなく、特許法第１２０条の５第９項で準用する第１２６条第６項の規定に適合するものである。

ウ 新規事項追加の有無

願書に添付した特許請求の範囲の請求項５には、「２種以上の選択マーカー用ドナーＤＮＡがそれぞれ、前記上流ホモロジーアームと前記下流ホモロジーアームの間に、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子とネガティブ選択用のマーカー遺伝子と標的配列とを有」すること、「（ｃ）前記工程（ｂ）の後、下記（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を選択された細胞に導入して前記２以上のアレルに組換え用ドナーＤＮＡを導入する工程と、 （ｉｉｉ）前記標的配列を標的とし、当該標的配列を切断することができる配列特異的核酸切断分子、又は前記配列特異的核酸切断分子をコードするポリヌクレオチドを含むゲノム改変システム、 （ｉｖ）所望の塩基配列を含む組換え用ドナーＤＮＡであって、前記標的領域の上流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する上流ホモロジーアームと、前記標的領域の下流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する下流ホモロジーアームを有する、組換え用ドナーＤＮＡ、 （ｄ）前記工程（ｃ）の後、前記ネガティブ選択用のマーカー遺伝子を発現しない細胞を選択する工程（ネガティブ選択のための工程）と、」を含むことが記載されており、また、願書に添付した明細書の段落【００４８】には、「ポジティブ選択マーカー遺伝子としては、例えば、薬剤耐性遺伝子、・・・・・・等が挙げられる。」と記載されているから、訂正事項２－２は、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第１２０条の５第９項で準用する第１２６条第５項の規定に適合するものである。

エ 独立特許要件

本件においては、すべての請求項について特許異議申立てがされているので、訂正事項２－２に関して、特許法第１２０条の５第９項で読み替えて準用する第１２６条第７項の独立特許要件は適用されない。

（７）訂正事項２－３について

ア 訂正の目的の適否

訂正事項２－３は、訂正前の請求項２に、「標的領域が１０ｋｂｐ以上の長さを有する、」を追加するものであり、発明特定事項の直列的付加に該当するものであるから、特許法第１２０条の５第２項ただし書第１号に規定する特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。

イ 特許請求の範囲の実質上の拡張又は変更の存否

訂正事項２－３は、発明特定事項の直列的付加に該当するものであり、カテゴリーや対象、目的を変更するものではないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではなく、特許法第１２０条の５第９項で準用する第１２６条第６項の規定に適合するものである。

ウ 新規事項追加の有無

願書に添付した明細書の段落【００３５】には、「ゲノム改変の対象となる標的領域は、１以上のアレルを有するゲノム上の任意の領域とすることができる。標的領域のサイズは、特に限定されない。本実施形態のゲノム改変方法では、従来よりも大きなサイズの領域を改変することができる。標的領域は、例えば、１０ｋｂｐ以上であってもよい。標的領域は、例えば、１００ｂｐ以上、２００ｂｐ以上、４００ｂｐ以上、８００ｂｐ以上、１ｋｂｐ以上、２ｋｂｐ以上、３ｋｂｐ以上、４ｋｂｐ以上、５ｋｂｐ以上、８ｋｂｐ以上、１０ｋｂｐ以上、２０ｋｂｐ以上、４０ｋｂｐ以上、８０ｋｂｐ以上、１００ｋｂｐ以上、又は２００ｋｂｐ以上であってもよい。」と記載されているから、訂正事項２－３は、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第１２０条の５第９項で準用する第１２６条第５項の規定に適合するものである。

エ 独立特許要件

本件においては、すべての請求項について特許異議申立てがされているので、訂正事項２－３に関して、特許法第１２０条の５第９項で読み替えて準用する第１２６条第７項の独立特許要件は適用されない。

（８）訂正事項２－４について

ア 訂正の目的の適否

訂正事項２－４は、訂正前の請求項２に、「選択マーカー遺伝子の塩基配列」と記載されているのを「ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子の塩基配列」に限定し、「相互に区別可能に異なる選択マーカー遺伝子」と記載されているのを「相互に区別可能に異なるポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子」に限定し、「前記選択マーカー遺伝子」と記載されているのを、「前記ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子」に限定し、「導入された当該区別可能に異なる選択マーカー遺伝子」と記載されているのを「導入された当該区別可能に異なるポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子」に限定するものであるから、特許法第１２０条の５第２項ただし書第１号に規定する特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。

イ 特許請求の範囲の実質上の拡張又は変更の存否

訂正事項２－４は、「選択マーカー遺伝子の塩基配列」と記載されているのを「ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子の塩基配列」に限定し、「相互に区別可能に異なる選択マーカー遺伝子」と記載されているのを「相互に区別可能に異なるポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子」に限定し、「前記選択マーカー遺伝子」と記載されているのを、「前記ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子」に限定し、「導入された当該区別可能に異なる選択マーカー遺伝子」と記載されているのを「導入された当該区別可能に異なるポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子」に限定するものであり、カテゴリーや対象、目的を変更するものではないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではなく、特許法第１２０条の５第９項で準用する第１２６条第６項の規定に適合するものである。

ウ 新規事項追加の有無

願書に添付した特許請求の範囲の請求項５には、「ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子」と記載されているから、訂正事項２－４は、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第１２０条の５第９項で準用する第１２６条第５項の規定に適合するものである。

エ 独立特許要件

本件においては、すべての請求項について特許異議申立てがされているので、訂正事項２－４に関して、特許法第１２０条の５第９項で読み替えて準用する第１２６条第７項の独立特許要件は適用されない。

（９）訂正事項３について

ア 訂正の目的の適否

訂正事項３は、訂正前の請求項３に、「標的領域が５ｋｂｐ以上の長さを有する」と記載されているのを、「標的領域が１０ｋｂｐ以上４０ｋｂｐ以下の長さを有する」に限定するものであるから、特許法第１２０条の５第２項ただし書第１号に規定する特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。

イ 特許請求の範囲の実質上の拡張又は変更の存否

訂正事項３は、「標的領域が５ｋｂｐ以上の長さを有する」と記載されているのを、「標的領域が１０ｋｂｐ以上４０ｋｂｐ以下の長さを有する」に限定するものであり、カテゴリーや対象、目的を変更するものではないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではなく、特許法第１２０条の５第９項で準用する第１２６条第６項の規定に適合するものである。

ウ 新規事項追加の有無

願書に添付した明細書の段落【００３５】には、「ゲノム改変の対象となる標的領域は、１以上のアレルを有するゲノム上の任意の領域とすることができる。標的領域のサイズは、特に限定されない。本実施形態のゲノム改変方法では、従来よりも大きなサイズの領域を改変することができる。標的領域は、例えば、１０ｋｂｐ以上であってもよい。標的領域は、例えば、１００ｂｐ以上、２００ｂｐ以上、４００ｂｐ以上、８００ｂｐ以上、１ｋｂｐ以上、２ｋｂｐ以上、３ｋｂｐ以上、４ｋｂｐ以上、５ｋｂｐ以上、８ｋｂｐ以上、１０ｋｂｐ以上、２０ｋｂｐ以上、４０ｋｂｐ以上、８０ｋｂｐ以上、１００ｋｂｐ以上、又は２００ｋｂｐ以上であってもよい。」と記載されているから、訂正事項３は、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第１２０条の５第９項で準用する第１２６条第５項の規定に適合するものである。

エ 独立特許要件

本件においては、すべての請求項について特許異議申立てがされているので、訂正事項３に関して、特許法第１２０条の５第９項で読み替えて準用する第１２６条第７項の独立特許要件は適用されない。

（１０）訂正事項４について

ア 訂正の目的の適否

訂正事項４は、訂正前の請求項４に、「標的領域が８ｋｂｐ以上の長さを有する」と記載されているのを、「標的領域が１０ｋｂｐ以上２０ｋｂｐ以下の長さを有する」に限定するものであるから、特許法第１２０条の５第２項ただし書第１号に規定する特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。

イ 特許請求の範囲の実質上の拡張又は変更の存否

訂正事項４は、「標的領域が８ｋｂｐ以上の長さを有する」と記載されているのを、「標的領域が１０ｋｂｐ以上２０ｋｂｐ以下の長さを有する」に限定するものであり、カテゴリーや対象、目的を変更するものではないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではなく、特許法第１２０条の５第９項で準用する第１２６条第６項の規定に適合するものである。

ウ 新規事項追加の有無

願書に添付した明細書の段落【００３５】には、「ゲノム改変の対象となる標的領域は、１以上のアレルを有するゲノム上の任意の領域とすることができる。標的領域のサイズは、特に限定されない。本実施形態のゲノム改変方法では、従来よりも大きなサイズの領域を改変することができる。標的領域は、例えば、１０ｋｂｐ以上であってもよい。標的領域は、例えば、１００ｂｐ以上、２００ｂｐ以上、４００ｂｐ以上、８００ｂｐ以上、１ｋｂｐ以上、２ｋｂｐ以上、３ｋｂｐ以上、４ｋｂｐ以上、５ｋｂｐ以上、８ｋｂｐ以上、１０ｋｂｐ以上、２０ｋｂｐ以上、４０ｋｂｐ以上、８０ｋｂｐ以上、１００ｋｂｐ以上、又は２００ｋｂｐ以上であってもよい。」と記載されているから、訂正事項４は、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第１２０条の５第９項で準用する第１２６条第５項の規定に適合するものである。

エ 独立特許要件

本件においては、すべての請求項について特許異議申立てがされているので、訂正事項４に関して、特許法第１２０条の５第９項で読み替えて準用する第１２６条第７項の独立特許要件は適用されない。

（１１）訂正事項５について

ア 訂正の目的の適否

訂正事項５の前段は、訂正前の請求項１、２に、訂正前の請求項５に記載されていた発明特定事項を追加したことに伴い、訂正後の請求項１、２の記載との整合性を図るために、訂正前の請求項５に、「２種以上の選択マーカー用ドナーＤＮＡがそれぞれ、前記上流ホモロジーアームと前記下流ホモロジーアームの間に、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子とネガティブ選択用のマーカー遺伝子と標的配列とを有し、ここで、当該選択マーカー遺伝子がポジティブ選択用にもネガティブ選択用にも用いられる場合には、別のネガティブ選択用の選択マーカー遺伝子を有していなくてよく、 （ｃ）前記工程（ｂ）の後、下記（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を選択された細胞に導入して前記２以上のアレルに組換え用ドナーＤＮＡを導入する工程と、 （ｉｉｉ）前記標的配列を標的とし、当該標的配列を切断することができる配列特異的核酸切断分子、又は前記配列特異的核酸切断分子をコードするポリヌクレオチドを含むゲノム改変システム、 （ｉｖ）所望の塩基配列を含む組換え用ドナーＤＮＡであって、前記標的領域の上流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する上流ホモロジーアームと、前記標的領域の下流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する下流ホモロジーアームを有する、組換え用ドナーＤＮＡ、 （ｄ）前記工程（ｃ）の後、前記ネガティブ選択用のマーカー遺伝子を発現しない細胞を選択する工程（ネガティブ選択のための工程）と、 をさらに含む、」と記載されているのを削除することにより明瞭でない記載を明瞭にするために訂正するものであるから、特許法第１２０条の５第２項ただし書第３号に規定する明瞭でない記載の釈明を目的とするものである。

訂正事項５の後段は、訂正前の請求項５に、「前記上流ホモロジーアームおよび前記下流ホモロジーアームがそれぞれ、５００ｂｐ～３，０００ｂｐである、」を追加するものであり、発明特定事項の直列的付加に該当するものであるから、特許法第１２０条の５第２項ただし書第１号に規定する特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。

イ 特許請求の範囲の実質上の拡張又は変更の存否

訂正事項５の前段は、訂正後の請求項１、２の記載との整合性を図るために、「２種以上の選択マーカー用ドナーＤＮＡがそれぞれ、前記上流ホモロジーアームと前記下流ホモロジーアームの間に、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子とネガティブ選択用のマーカー遺伝子と標的配列とを有し、ここで、当該選択マーカー遺伝子がポジティブ選択用にもネガティブ選択用にも用いられる場合には、別のネガティブ選択用の選択マーカー遺伝子を有していなくてよく、 （ｃ）前記工程（ｂ）の後、下記（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を選択された細胞に導入して前記２以上のアレルに組換え用ドナーＤＮＡを導入する工程と、 （ｉｉｉ）前記標的配列を標的とし、当該標的配列を切断することができる配列特異的核酸切断分子、又は前記配列特異的核酸切断分子をコードするポリヌクレオチドを含むゲノム改変システム、 （ｉｖ）所望の塩基配列を含む組換え用ドナーＤＮＡであって、前記標的領域の上流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する上流ホモロジーアームと、前記標的領域の下流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する下流ホモロジーアームを有する、組換え用ドナーＤＮＡ、 （ｄ）前記工程（ｃ）の後、前記ネガティブ選択用のマーカー遺伝子を発現しない細胞を選択する工程（ネガティブ選択のための工程）と、 をさらに含む、」を削除することにより明瞭でない記載を明瞭にするものであり、カテゴリーや対象、目的を変更するものではないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものには該当せず、特許法第１２０条の５第９項で準用する特許法第１２６条第６項に適合するものである。

訂正事項５の後段は、発明特定事項の直列的付加に該当するものであり、カテゴリーや対象、目的を変更するものではないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではなく、特許法第１２０条の５第９項で準用する第１２６条第６項の規定に適合するものである。

ウ 新規事項追加の有無

訂正事項５の前段は、明瞭でない記載を明瞭にするものであるから、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第１２０条の５第９項で準用する特許法第１２６条第５項に適合するものである。

願書に添付した明細書の段落【００１７】には、「ドナーＤＮＡは、上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームとの間に、所望の塩基配列を含むことができる。各ホモロジーアームの長さは、３００ｂｐ以上が好ましく、通常５００～３０００ｂｐ程度である。」と記載されているから、訂正事項５の後段は、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第１２０条の５第９項で準用する第１２６条第５項の規定に適合するものである。

エ 独立特許要件

本件においては、すべての請求項について特許異議申立てがされているので、訂正事項５に関して、特許法第１２０条の５第９項で読み替えて準用する第１２６条第７項の独立特許要件は適用されない。

（１２）訂正事項６について

ア 訂正の目的の適否

訂正事項６の前段は、訂正前の請求項１、２に、訂正前の請求項６に記載されていた発明特定事項を追加したことに伴い、訂正後の請求項１、２の記載との整合性を図るために、訂正前の請求項６に、「２種以上の選択マーカー用ドナーＤＮＡがそれぞれ、前記上流ホモロジーアームと前記下流ホモロジーアームの間に、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子とネガティブ選択用のマーカー遺伝子と標的配列とを有し、ここで、当該選択マーカー遺伝子がポジティブ選択用にもネガティブ選択用にも用いられる場合には、別のネガティブ選択用の選択マーカー遺伝子を有していなくてよく、 （ｃ）前記工程（ｂ）の後、下記（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を選択された細胞に導入して前記２以上のアレルに組換え用ドナーＤＮＡを導入する工程と、 （ｉｉｉ）前記標的配列を標的とし、当該標的配列を切断することができる配列特異的核酸切断分子、又は前記配列特異的核酸切断分子をコードするポリヌクレオチドを含むゲノム改変システム、 （ｉｖ）所望の塩基配列を含む組換え用ドナーＤＮＡであって、前記標的領域の上流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する上流ホモロジーアームと、前記標的領域の下流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する下流ホモロジーアームを有する、組換え用ドナーＤＮＡ、 （ｄ）前記工程（ｃ）の後、前記ネガティブ選択用のマーカー遺伝子を発現しない細胞を選択する工程（ネガティブ選択のための工程）と、 をさらに含む、」と記載されているのを削除することにより明瞭でない記載を明瞭にするために訂正するものであるから、特許法第１２０条の５第２項ただし書第３号に規定する明瞭でない記載の釈明を目的とするものである。

訂正事項６の後段は、訂正前の請求項６に、「前記上流ホモロジーアームおよび前記下流ホモロジーアームがそれぞれ、５００ｂｐ～３，０００ｂｐである、」を追加するものであり、発明特定事項の直列的付加に該当するものであるから、特許法第１２０条の５第２項ただし書第１号に規定する特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。

イ 特許請求の範囲の実質上の拡張又は変更の存否

訂正事項６の前段は、訂正後の請求項１、２の記載との整合性を図るために、「２種以上の選択マーカー用ドナーＤＮＡがそれぞれ、前記上流ホモロジーアームと前記下流ホモロジーアームの間に、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子とネガティブ選択用のマーカー遺伝子と標的配列とを有し、ここで、当該選択マーカー遺伝子がポジティブ選択用にもネガティブ選択用にも用いられる場合には、別のネガティブ選択用の選択マーカー遺伝子を有していなくてよく、 （ｃ）前記工程（ｂ）の後、下記（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を選択された細胞に導入して前記２以上のアレルに組換え用ドナーＤＮＡを導入する工程と、 （ｉｉｉ）前記標的配列を標的とし、当該標的配列を切断することができる配列特異的核酸切断分子、又は前記配列特異的核酸切断分子をコードするポリヌクレオチドを含むゲノム改変システム、 （ｉｖ）所望の塩基配列を含む組換え用ドナーＤＮＡであって、前記標的領域の上流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する上流ホモロジーアームと、前記標的領域の下流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する下流ホモロジーアームを有する、組換え用ドナーＤＮＡ、 （ｄ）前記工程（ｃ）の後、前記ネガティブ選択用のマーカー遺伝子を発現しない細胞を選択する工程（ネガティブ選択のための工程）と、 をさらに含む、」を削除することにより明瞭でない記載を明瞭にするものであり、カテゴリーや対象、目的を変更するものではないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものには該当せず、特許法第１２０条の５第９項で準用する特許法第１２６条第６項に適合するものである。

訂正事項６の後段は、発明特定事項の直列的付加に該当するものであり、カテゴリーや対象、目的を変更するものではないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではなく、特許法第１２０条の５第９項で準用する第１２６条第６項の規定に適合するものである。

ウ 新規事項追加の有無

訂正事項６の前段は、明瞭でない記載を明瞭にするものであるから、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第１２０条の５第９項で準用する特許法第１２６条第５項に適合するものである。

願書に添付した明細書の段落【００１７】には、「ドナーＤＮＡは、上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームとの間に、所望の塩基配列を含むことができる。各ホモロジーアームの長さは、３００ｂｐ以上が好ましく、通常５００～３０００ｂｐ程度である。」と記載されているから、訂正事項６の後段は、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第１２０条の５第９項で準用する第１２６条第５項の規定に適合するものである。

エ 独立特許要件

本件においては、すべての請求項について特許異議申立てがされているので、訂正事項６に関して、特許法第１２０条の５第９項で読み替えて準用する第１２６条第７項の独立特許要件は適用されない。

（１３）訂正事項７について

ア 訂正の目的の適否

訂正事項７の前段は、訂正前の請求項１、２に、訂正前の請求項７に記載されていた発明特定事項を追加したことに伴い、訂正後の請求項１、２の記載との整合性を図るために、訂正前の請求項７に、「２種以上の選択マーカー用ドナーＤＮＡがそれぞれ、前記上流ホモロジーアームと前記下流ホモロジーアームの間に、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子とネガティブ選択用のマーカー遺伝子と標的配列とを有し、ここで、当該選択マーカー遺伝子がポジティブ選択用にもネガティブ選択用にも用いられる場合には、別のネガティブ選択用の選択マーカー遺伝子を有していなくてよく、 （ｃ）前記工程（ｂ）の後、下記（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を選択された細胞に導入して前記２以上のアレルに組換え用ドナーＤＮＡを導入する工程と、 （ｉｉｉ）前記標的配列を標的とし、当該標的配列を切断することができる配列特異的核酸切断分子、又は前記配列特異的核酸切断分子をコードするポリヌクレオチドを含むゲノム改変システム、 （ｉｖ）所望の塩基配列を含む組換え用ドナーＤＮＡであって、前記標的領域の上流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する上流ホモロジーアームと、前記標的領域の下流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する下流ホモロジーアームを有する、組換え用ドナーＤＮＡ、 （ｄ）前記工程（ｃ）の後、前記ネガティブ選択用のマーカー遺伝子を発現しない細胞を選択する工程（ネガティブ選択のための工程）と、 をさらに含む、」と記載されているのを削除することにより明瞭でない記載を明瞭にするために訂正するものであるから、特許法第１２０条の５第２項ただし書第３号に規定する明瞭でない記載の釈明を目的とするものである。

訂正事項７の後段は、訂正前の請求項７に、「前記上流ホモロジーアームおよび前記下流ホモロジーアームがそれぞれ、５００ｂｐ～３，０００ｂｐである、」を追加するものであり、発明特定事項の直列的付加に該当するものであるから、特許法第１２０条の５第２項ただし書第１号に規定する特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。

イ 特許請求の範囲の実質上の拡張又は変更の存否

訂正事項７の前段は、訂正後の請求項１、２の記載との整合性を図るために、「２種以上の選択マーカー用ドナーＤＮＡがそれぞれ、前記上流ホモロジーアームと前記下流ホモロジーアームの間に、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子とネガティブ選択用のマーカー遺伝子と標的配列とを有し、ここで、当該選択マーカー遺伝子がポジティブ選択用にもネガティブ選択用にも用いられる場合には、別のネガティブ選択用の選択マーカー遺伝子を有していなくてよく、 （ｃ）前記工程（ｂ）の後、下記（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を選択された細胞に導入して前記２以上のアレルに組換え用ドナーＤＮＡを導入する工程と、 （ｉｉｉ）前記標的配列を標的とし、当該標的配列を切断することができる配列特異的核酸切断分子、又は前記配列特異的核酸切断分子をコードするポリヌクレオチドを含むゲノム改変システム、 （ｉｖ）所望の塩基配列を含む組換え用ドナーＤＮＡであって、前記標的領域の上流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する上流ホモロジーアームと、前記標的領域の下流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する下流ホモロジーアームを有する、組換え用ドナーＤＮＡ、 （ｄ）前記工程（ｃ）の後、前記ネガティブ選択用のマーカー遺伝子を発現しない細胞を選択する工程（ネガティブ選択のための工程）と、 をさらに含む、」を削除することにより明瞭でない記載を明瞭にするものであり、カテゴリーや対象、目的を変更するものではないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものには該当せず、特許法第１２０条の５第９項で準用する特許法第１２６条第６項に適合するものである。

訂正事項７の後段は、発明特定事項の直列的付加に該当するものであり、カテゴリーや対象、目的を変更するものではないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではなく、特許法第１２０条の５第９項で準用する第１２６条第６項の規定に適合するものである。

ウ 新規事項追加の有無

訂正事項７の前段は、明瞭でない記載を明瞭にするものであるから、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第１２０条の５第９項で準用する特許法第１２６条第５項に適合するものである。

願書に添付した明細書の段落【００１７】には、「ドナーＤＮＡは、上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームとの間に、所望の塩基配列を含むことができる。各ホモロジーアームの長さは、３００ｂｐ以上が好ましく、通常５００～３０００ｂｐ程度である。」と記載されているから、訂正事項７の後段は、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第１２０条の５第９項で準用する第１２６条第５項の規定に適合するものである。

エ 独立特許要件

本件においては、すべての請求項について特許異議申立てがされているので、訂正事項７に関して、特許法第１２０条の５第９項で読み替えて準用する第１２６条第７項の独立特許要件は適用されない。

（１４）訂正事項８について

ア 訂正の目的の適否

訂正事項８は、訂正前の請求項８に「請求項５～７のいずれか一項に記載の方法」と記載されていたが、訂正前の請求項５に記載されていた発明特定事項の削除に伴い、訂正後の請求項１～７の記載との整合性を図るために、訂正前の請求項８に「請求項５～７のいずれか一項に記載の方法」と記載されているのを、「請求項１～７のいずれか一項に記載の方法」に訂正することにより、訂正前の請求項５に記載されていた発明特定事項の削除に伴い生じる明瞭でない記載を明瞭にするために訂正するものであるから、特許法第１２０条の５第２項ただし書第３号に規定する明瞭でない記載の釈明を目的とするものである。

イ 特許請求の範囲の実質上の拡張又は変更の存否

訂正事項８は、訂正前の請求項５に記載されていた発明特定事項の削除に伴い生じる明瞭でない記載を明瞭にするものであり、カテゴリーや対象、目的を変更するものではないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものには該当せず、特許法第１２０条の５第９項で準用する特許法第１２６条第６項の規定に適合するものである。

ウ 新規事項追加の有無

訂正事項８は、訂正前の請求項５に記載されていた発明特定事項の削除に伴い生じる明瞭でない記載を明瞭にするものであるから、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第１２０条の５第９項で準用する特許法第１２６条第５項の規定に適合するものである。

エ 独立特許要件

本件においては、すべての請求項について特許異議申立てがされているので、訂正事項８に関して、特許法第１２０条の５第９項で読み替えて準用する第１２６条第７項の独立特許要件は適用されない。

（１５）訂正事項９について

ア 訂正の目的の適否

訂正事項９は、訂正前の請求項９に「請求項６または７に記載の方法」と記載されていたが、訂正前の請求項６または７に記載されていた発明特定事項の削除に伴い、訂正後の請求項３または４の記載との整合性を図るために、訂正前の請求項９に「請求項６または７に記載の方法」と記載されているのを、「請求項３または４に記載の方法」に訂正することにより、訂正前の請求項６または７に記載されていた発明特定事項の削除に伴い生じる明瞭でない記載を明瞭にするために訂正するものであるから、特許法第１２０条の５第２項ただし書第３号に規定する明瞭でない記載の釈明を目的とするものである。

イ 特許請求の範囲の実質上の拡張又は変更の存否

訂正事項９は、訂正前の請求項６または７に記載されていた発明特定事項の削除に伴い生じる明瞭でない記載を明瞭にするものであり、カテゴリーや対象、目的を変更するものではないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものには該当せず、特許法第１２０条の５第９項で準用する特許法第１２６条第６項の規定に適合するものである。

ウ 新規事項追加の有無

訂正事項９は、訂正前の請求項６または７に記載されていた発明特定事項の削除に伴い生じる明瞭でない記載を明瞭にするものであるから、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第１２０条の５第９項で準用する特許法第１２６条第５項の規定に適合するものである。

エ 独立特許要件

本件においては、すべての請求項について特許異議申立てがされているので、訂正事項９に関して、特許法第１２０条の５第９項で読み替えて準用する第１２６条第７項の独立特許要件は適用されない。

（１６）訂正事項１０について

ア 訂正の目的の適否

訂正事項１０は、訂正前の請求項１０に「請求項７に記載の方法」と記載されていたが、訂正前の請求項７に記載されていた発明特定事項の削除に伴い、訂正後の請求項４の記載との整合性を図るために、訂正前の請求項１０に「請求項７に記載の方法」と記載されているのを、「請求項４に記載の方法」に訂正することにより、訂正前の請求項７に記載されていた発明特定事項の削除に伴い生じる明瞭でない記載を明瞭にするために訂正するものであるから、特許法第１２０条の５第２項ただし書第３号に規定する明瞭でない記載の釈明を目的とするものである。

イ 特許請求の範囲の実質上の拡張又は変更の存否

訂正事項１０は、訂正前の請求項７に記載されていた発明特定事項の削除に伴い生じる明瞭でない記載を明瞭にするものであり、カテゴリーや対象、目的を変更するものではないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものには該当せず、特許法第１２０条の５第９項で準用する特許法第１２６条第６項の規定に適合するものである。

ウ 新規事項追加の有無

訂正事項１０は、訂正前の請求項７に記載されていた発明特定事項の削除に伴い生じる明瞭でない記載を明瞭にするものであるから、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第１２０条の５第９項で準用する特許法第１２６条第５項の規定に適合するものである。

エ 独立特許要件

本件においては、すべての請求項について特許異議申立てがされているので、訂正事項１０に関して、特許法第１２０条の５第９項で読み替えて準用する第１２６条第７項の独立特許要件は適用されない。

（１７）訂正事項１１－１について

ア 訂正の目的の適否

訂正事項１１－１は、訂正前の請求項１２に、「選択マーカー遺伝子の塩基配列」と記載されているのを「ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子の塩基配列」に限定し、「相互に区別可能に異なる選択マーカー遺伝子」と記載されているのを「相互に区別可能に異なるポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子」に限定し、「前記選択マーカー遺伝子」と記載されているのを、「前記ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子」に限定するものであるから、特許法第１２０条の５第２項ただし書第１号に規定する特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。

イ 特許請求の範囲の実質上の拡張又は変更の存否

訂正事項１１－１は、「選択マーカー遺伝子の塩基配列」と記載されているのを「ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子の塩基配列」に限定し、「相互に区別可能に異なる選択マーカー遺伝子」と記載されているのを「相互に区別可能に異なるポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子」に限定し、「前記選択マーカー遺伝子」と記載されているのを、「前記ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子」に限定するものであり、カテゴリーや対象、目的を変更するものではないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではなく、特許法第１２０条の５第９項で準用する第１２６条第６項の規定に適合するものである。

ウ 新規事項追加の有無

願書に添付した特許請求の範囲の請求項５には、「ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子」と記載されているから、訂正事項１１－１は、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第１２０条の５第９項で準用する第１２６条第５項の規定に適合するものである。

エ 独立特許要件

本件においては、すべての請求項について特許異議申立てがされているので、訂正事項１１－１に関して、特許法第１２０条の５第９項で読み替えて準用する第１２６条第７項の独立特許要件は適用されない。

（１８）訂正事項１１－２について

ア 訂正の目的の適否

訂正事項１１－２は、訂正前の請求項１２に、「、 ここで、選択マーカー遺伝子は、薬剤耐性遺伝子であり、かつ、２種以上の選択マーカー用ドナーＤＮＡがそれぞれ、前記上流ホモロジーアームと前記下流ホモロジーアームの間に、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子とネガティブ選択用のマーカー遺伝子と標的配列とを有する」を追加するものであり、発明特定事項の直列的付加に該当するものであるから、特許法第１２０条の５第２項ただし書第１号に規定する特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。

イ 特許請求の範囲の実質上の拡張又は変更の存否

訂正事項１１－２は、発明特定事項の直列的付加に該当するものであり、カテゴリーや対象、目的を変更するものではないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではなく、特許法第１２０条の５第９項で準用する第１２６条第６項の規定に適合するものである。

ウ 新規事項追加の有無

願書に添付した特許請求の範囲の請求項５には、「２種以上の選択マーカー用ドナーＤＮＡがそれぞれ、前記上流ホモロジーアームと前記下流ホモロジーアームの間に、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子とネガティブ選択用のマーカー遺伝子と標的配列とを有」することが記載されており、また、願書に添付した明細書の段落【００４８】には、「ポジティブ選択マーカー遺伝子としては、例えば、薬剤耐性遺伝子、・・・・・・等が挙げられる。」と記載されているから、訂正事項１１－２は、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第１２０条の５第９項で準用する第１２６条第５項の規定に適合するものである。

エ 独立特許要件

本件においては、すべての請求項について特許異議申立てがされているので、訂正事項１１－２に関して、特許法第１２０条の５第９項で読み替えて準用する第１２６条第７項の独立特許要件は適用されない。

（１９）訂正事項１２について

ア 訂正の目的の適否

訂正事項１２は、訂正前の請求項１３に、「標的領域が５ｋｂｐ以上の長さを有する」と記載されているのを、「標的領域が１０ｋｂｐ以上４０ｋｂｐ以下の長さを有する」に限定するものであるから、特許法第１２０条の５第２項ただし書第１号に規定する特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。

イ 特許請求の範囲の実質上の拡張又は変更の存否

訂正事項１２は、「標的領域が５ｋｂｐ以上の長さを有する」と記載されているのを、「標的領域が１０ｋｂｐ以上４０ｋｂｐ以下の長さを有する」に限定するものであり、カテゴリーや対象、目的を変更するものではないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではなく、特許法第１２０条の５第９項で準用する第１２６条第６項の規定に適合するものである。

ウ 新規事項追加の有無

願書に添付した明細書の段落【００３５】には、「ゲノム改変の対象となる標的領域は、１以上のアレルを有するゲノム上の任意の領域とすることができる。標的領域のサイズは、特に限定されない。本実施形態のゲノム改変方法では、従来よりも大きなサイズの領域を改変することができる。標的領域は、例えば、１０ｋｂｐ以上であってもよい。標的領域は、例えば、１００ｂｐ以上、２００ｂｐ以上、４００ｂｐ以上、８００ｂｐ以上、１ｋｂｐ以上、２ｋｂｐ以上、３ｋｂｐ以上、４ｋｂｐ以上、５ｋｂｐ以上、８ｋｂｐ以上、１０ｋｂｐ以上、２０ｋｂｐ以上、４０ｋｂｐ以上、８０ｋｂｐ以上、１００ｋｂｐ以上、又は２００ｋｂｐ以上であってもよい。」と記載されているから、訂正事項１２は、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第１２０条の５第９項で準用する第１２６条第５項の規定に適合するものである。

エ 独立特許要件

本件においては、すべての請求項について特許異議申立てがされているので、訂正事項１２に関して、特許法第１２０条の５第９項で読み替えて準用する第１２６条第７項の独立特許要件は適用されない。

（２０）訂正事項１３について

ア 訂正の目的の適否

訂正事項１３は、訂正前の請求項１４に、「標的領域が８ｋｂｐ以上の長さを有する」と記載されているのを、「標的領域が１０ｋｂｐ以上２０ｋｂｐ以下の長さを有する」に限定するものであるから、特許法第１２０条の５第２項ただし書第１号に規定する特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。

イ 特許請求の範囲の実質上の拡張又は変更の存否

訂正事項１３は、「標的領域が８ｋｂｐ以上の長さを有する」と記載されているのを、「標的領域が１０ｋｂｐ以上２０ｋｂｐ以下の長さを有する」に限定するものであり、カテゴリーや対象、目的を変更するものではないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではなく、特許法第１２０条の５第９項で準用する第１２６条第６項の規定に適合するものである。

ウ 新規事項追加の有無

願書に添付した明細書の段落【００３５】には、「ゲノム改変の対象となる標的領域は、１以上のアレルを有するゲノム上の任意の領域とすることができる。標的領域のサイズは、特に限定されない。本実施形態のゲノム改変方法では、従来よりも大きなサイズの領域を改変することができる。標的領域は、例えば、１０ｋｂｐ以上であってもよい。標的領域は、例えば、１００ｂｐ以上、２００ｂｐ以上、４００ｂｐ以上、８００ｂｐ以上、１ｋｂｐ以上、２ｋｂｐ以上、３ｋｂｐ以上、４ｋｂｐ以上、５ｋｂｐ以上、８ｋｂｐ以上、１０ｋｂｐ以上、２０ｋｂｐ以上、４０ｋｂｐ以上、８０ｋｂｐ以上、１００ｋｂｐ以上、又は２００ｋｂｐ以上であってもよい。」と記載されているから、訂正事項１３は、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第１２０条の５第９項で準用する第１２６条第５項の規定に適合するものである。

エ 独立特許要件

本件においては、すべての請求項について特許異議申立てがされているので、訂正事項１３に関して、特許法第１２０条の５第９項で読み替えて準用する第１２６条第７項の独立特許要件は適用されない。

（２１）訂正事項１４について

ア 訂正の目的の適否

訂正事項１４は、訂正前の請求項２０に「請求項５に記載の方法」と記載されていたが、訂正前の請求項５に記載されていた発明特定事項の削除に伴い、訂正後の請求項１～４の記載との整合性を図るために、訂正前の請求項２０に「請求項５に記載の方法」と記載されているのを、「請求項１～４のいずれか一項に記載の方法」に訂正することにより、訂正前の請求項５に記載されていた発明特定事項の削除に伴い生じる明瞭でない記載を明瞭にするために訂正するものであるから、特許法第１２０条の５第２項ただし書第３号に規定する明瞭でない記載の釈明を目的とするものである。

イ 特許請求の範囲の実質上の拡張又は変更の存否

訂正事項１４は、訂正前の請求項５に記載されていた発明特定事項の削除に伴い生じる明瞭でない記載を明瞭にするものであり、カテゴリーや対象、目的を変更するものではないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものには該当せず、特許法第１２０条の５第９項で準用する特許法第１２６条第６項の規定に適合するものである。

ウ 新規事項追加の有無

訂正事項１４は、訂正前の請求項５に記載されていた発明特定事項の削除に伴い生じる明瞭でない記載を明瞭にするものであるから、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第１２０条の５第９項で準用する特許法第１２６条第５項の規定に適合するものである。

エ 独立特許要件

本件においては、すべての請求項について特許異議申立てがされているので、訂正事項１４に関して、特許法第１２０条の５第９項で読み替えて準用する第１２６条第７項の独立特許要件は適用されない。

（２２）訂正事項１５について

ア 訂正の目的の適否

訂正事項１５は、訂正前の請求項２１に「請求項６または７に記載の方法」と記載されていたが、訂正前の請求項６または７に記載されていた発明特定事項の削除に伴い、訂正後の請求項３または４の記載との整合性を図るために、訂正前の請求項２１に「請求項６または７に記載の方法」と記載されているのを、「請求項３または４に記載の方法」に訂正することにより、訂正前の請求項６または７に記載されていた発明特定事項の削除に伴い生じる明瞭でない記載を明瞭にするために訂正するものであるから、特許法第１２０条の５第２項ただし書第３号に規定する明瞭でない記載の釈明を目的とするものである。

イ 特許請求の範囲の実質上の拡張又は変更の存否

訂正事項１５は、訂正前の請求項６または７に記載されていた発明特定事項の削除に伴い生じる明瞭でない記載を明瞭にするものであり、カテゴリーや対象、目的を変更するものではないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものには該当せず、特許法第１２０条の５第９項で準用する特許法第１２６条第６項の規定に適合するものである。

ウ 新規事項追加の有無

訂正事項１５は、訂正前の請求項６または７に記載されていた発明特定事項の削除に伴い生じる明瞭でない記載を明瞭にするものであるから、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第１２０条の５第９項で準用する特許法第１２６条第５項の規定に適合するものである。

エ 独立特許要件

本件においては、すべての請求項について特許異議申立てがされているので、訂正事項１５に関して、特許法第１２０条の５第９項で読み替えて準用する第１２６条第７項の独立特許要件は適用されない。

（２３）訂正事項１６について

ア 訂正の目的の適否

訂正事項１６は、訂正前の請求項２４に「請求項５に記載の方法」と記載されていたが、訂正前の請求項５に記載されていた発明特定事項の削除に伴い、訂正後の請求項１～４の記載との整合性を図るために、訂正前の請求項２４に「請求項５に記載の方法」と記載されているのを、「請求項１～４のいずれか一項に記載の方法」に訂正することにより、訂正前の請求項５に記載されていた発明特定事項の削除に伴い生じる明瞭でない記載を明瞭にするために訂正するものであるから、特許法第１２０条の５第２項ただし書第３号に規定する明瞭でない記載の釈明を目的とするものである。

イ 特許請求の範囲の実質上の拡張又は変更の存否

訂正事項１６は、訂正前の請求項５に記載されていた発明特定事項の削除に伴い生じる明瞭でない記載を明瞭にするものであり、カテゴリーや対象、目的を変更するものではないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものには該当せず、特許法第１２０条の５第９項で準用する特許法第１２６条第６項の規定に適合するものである。

ウ 新規事項追加の有無

訂正事項１６は、訂正前の請求項５に記載されていた発明特定事項の削除に伴い生じる明瞭でない記載を明瞭にするものであるから、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第１２０条の５第９項で準用する特許法第１２６条第５項の規定に適合するものである。

エ 独立特許要件

本件においては、すべての請求項について特許異議申立てがされているので、訂正事項１６に関して、特許法第１２０条の５第９項で読み替えて準用する第１２６条第７項の独立特許要件は適用されない。

（２４）訂正事項１７について

ア 訂正の目的の適否

訂正事項１７は、訂正前の請求項２５に「請求項６または７に記載の方法」と記載されていたが、訂正前の請求項６または７に記載されていた発明特定事項の削除に伴い、訂正後の請求項３または４の記載との整合性を図るために、訂正前の請求項２５に「請求項６または７に記載の方法」と記載されているのを、「請求項３または４に記載の方法」に訂正することにより、訂正前の請求項６または７に記載されていた発明特定事項の削除に伴い生じる明瞭でない記載を明瞭にするために訂正するものであるから、特許法第１２０条の５第２項ただし書第３号に規定する明瞭でない記載の釈明を目的とするものである。

イ 特許請求の範囲の実質上の拡張又は変更の存否

訂正事項１７は、訂正前の請求項６または７に記載されていた発明特定事項の削除に伴い生じる明瞭でない記載を明瞭にするものであり、カテゴリーや対象、目的を変更するものではないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものには該当せず、特許法第１２０条の５第９項で準用する特許法第１２６条第６項の規定に適合するものである。

ウ 新規事項追加の有無

訂正事項１７は、訂正前の請求項６または７に記載されていた発明特定事項の削除に伴い生じる明瞭でない記載を明瞭にするものであるから、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第１２０条の５第９項で準用する特許法第１２６条第５項の規定に適合するものである。

エ 独立特許要件

本件においては、すべての請求項について特許異議申立てがされているので、訂正事項１７に関して、特許法第１２０条の５第９項で読み替えて準用する第１２６条第７項の独立特許要件は適用されない。

（２５）訂正事項１８について

ア 訂正の目的の適否

訂正事項１８は、訂正前の請求項２７に「請求項６または７に記載の方法」と記載されていたが、訂正前の請求項６または７に記載されていた発明特定事項の削除に伴い、訂正後の請求項３または４の記載との整合性を図るために、訂正前の請求項２７に「請求項６または７に記載の方法」と記載されているのを、「請求項３または４に記載の方法」に訂正することにより、訂正前の請求項６または７に記載されていた発明特定事項の削除に伴い生じる明瞭でない記載を明瞭にするために訂正するものであるから、特許法第１２０条の５第２項ただし書第３号に規定する明瞭でない記載の釈明を目的とするものである。

イ 特許請求の範囲の実質上の拡張又は変更の存否

訂正事項１８は、訂正前の請求項６または７に記載されていた発明特定事項の削除に伴い生じる明瞭でない記載を明瞭にするものであり、カテゴリーや対象、目的を変更するものではないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものには該当せず、特許法第１２０条の５第９項で準用する特許法第１２６条第６項の規定に適合するものである。

ウ 新規事項追加の有無

訂正事項１８は、訂正前の請求項６または７に記載されていた発明特定事項の削除に伴い生じる明瞭でない記載を明瞭にするものであるから、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許法第１２０条の５第９項で準用する特許法第１２６条第５項の規定に適合するものである。

エ 独立特許要件

本件においては、すべての請求項について特許異議申立てがされているので、訂正事項１８に関して、特許法第１２０条の５第９項で読み替えて準用する第１２６条第７項の独立特許要件は適用されない。

４ まとめ

以上のとおりであるから、本件訂正請求による訂正は、特許法第１２０条の５第２項ただし書第１号及び第３号に掲げる事項を目的とするものであり、かつ、同条第９項において準用する同法第１２６条第５項及び第６項の規定に適合するので、訂正後の請求項〔１～２８〕について訂正することを認める。

第３ 訂正後の本件発明

上記第２のとおり、本件訂正は認容されるので、本件訂正請求により訂正された請求項１～２８に係る発明（以下、「本件発明１～２８」という。）は、令和４年６月３日付けの訂正請求書に添付された訂正特許請求の範囲の請求項１～２８に記載された次の事項により特定されるとおりのものである。下線は訂正箇所を示すものである。

「【請求項１】染色体ゲノムの２つ以上のアレルが改変された単離された細胞を作製する方法であって、

（ａ）下記（ｉ）及び（ｉｉ）を、２つ以上のアレルを含む単離された細胞（但し、受精卵を除く）に導入して、前記２つ以上のアレルそれぞれに選択マーカー遺伝子を導入する工程と、

（ｉ）前記染色体ゲノムの２つ以上のアレル中の標的領域を標的とし、当該標的領域を切断することができる配列特異的核酸切断分子、又は前記配列特異的核酸切断分子をコードするポリヌクレオチドを含むゲノム改変システム、

（ｉｉ）２種以上の選択マーカー用ドナーＤＮＡであって、それぞれが前記標的領域の上流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する上流ホモロジーアームと、前記標的領域の下流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する下流ホモロジーアームとを有し、かつ、上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームの間に、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子の塩基配列を含み、前記２種以上の選択マーカー用ドナーＤＮＡは、相互に区別可能に異なる選択マーカー遺伝子をそれぞれ有し、前記ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子は、選択マーカー用ドナーＤＮＡの種類毎に固有であり、前記選択マーカー用ドナーＤＮＡの種類数は、ゲノム改変の対象とする前記アレルの数と同数以上である、２種以上の選択マーカー用ドナーＤＮＡ、ここで、前記ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子は、薬剤耐性遺伝子であり、かつ、２種以上の選択マーカー用ドナーＤＮＡがそれぞれ、前記上流ホモロジーアームと前記下流ホモロジーアームの間に、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子とネガティブ選択用のマーカー遺伝子と標的配列とを有し、

続きを表示（全55行）

（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記２以上のアレルに対して異なる種類の選択マーカー用ドナーＤＮＡがそれぞれ相同組み換えすることによって、当該２以上のアレルにそれぞれ区別可能に異なる固有の選択マーカー遺伝子が導入され、導入された当該区別可能に異なるポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子のすべてを発現する単離された細胞を選択する工程（ポジティブ選択のための工程）と、

（ｃ）前記工程（ｂ）の後、下記（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を選択された細胞に導入して前記２以上のアレルに組換え用ドナーＤＮＡを導入する工程と、

（ｉｉｉ）前記標的配列を標的とし、当該標的配列を切断することができる配列特異的核酸切断分子、又は前記配列特異的核酸切断分子をコードするポリヌクレオチドを含むゲノム改変システム、

（ｉｖ）所望の塩基配列を含む組換え用ドナーＤＮＡであって、前記標的領域の上流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する上流ホモロジーアームと、前記標的領域の下流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する下流ホモロジーアームを有する、組換え用ドナーＤＮＡ、

（ｄ）前記工程（ｃ）の後、前記ネガティブ選択用のマーカー遺伝子を発現しない細胞を選択する工程（ネガティブ選択のための工程）と、

を含み、

標的領域が１０ｋｂｐ以上の長さを有する、

方法。

【請求項２】染色体ゲノムの２つ以上のアレルを改変する方法であって、

（ａ）下記（ｉ）及び（ｉｉ）を、２つ以上のアレルを含む単離された細胞（但し、受精卵を除く）に導入して、前記２つ以上のアレルそれぞれに選択マーカー遺伝子を導入する工程と、

（ｉ）前記染色体ゲノムの２つ以上のアレル中の標的領域を標的とし、当該標的領域を切断することができる配列特異的核酸切断分子、又は前記配列特異的核酸切断分子をコードするポリヌクレオチドを含むゲノム改変システム、

（ｉｉ）２種以上の選択マーカー用ドナーＤＮＡであって、それぞれが前記標的領域の上流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する上流ホモロジーアームと、前記標的領域の下流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する下流ホモロジーアームとを有し、かつ、上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームの間に、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子の塩基配列を含み、前記２種以上の選択マーカー用ドナーＤＮＡは、相互に区別可能に異なるポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子をそれぞれ有し、前記ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子は、選択マーカー用ドナーＤＮＡの種類毎に固有であり、前記選択マーカー用ドナーＤＮＡの種類数は、ゲノム改変の対象とする前記アレルの数と同数以上である、２種以上の選択マーカー用ドナーＤＮＡ、ここで、前記ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子は、薬剤耐性遺伝子であり、かつ、２種以上の選択マーカー用ドナーＤＮＡがそれぞれ、前記上流ホモロジーアームと前記下流ホモロジーアームの間に、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子とネガティブ選択用のマーカー遺伝子と標的配列とを有し、

（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記２以上のアレルに対して異なる種類の選択マーカー用ドナーＤＮＡがそれぞれ相同組み換えすることによって、当該２以上のアレルにそれぞれ区別可能に異なる固有の選択マーカー遺伝子が導入され、導入された当該区別可能に異なるポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子のすべてを発現する単離された細胞を選択する工程（ポジティブ選択のための工程）と、

（ｃ）前記工程（ｂ）の後、下記（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を選択された細胞に導入して前記２以上のアレルに組換え用ドナーＤＮＡを導入する工程と、

（ｉｉｉ）前記標的配列を標的とし、当該標的配列を切断することができる配列特異的核酸切断分子、又は前記配列特異的核酸切断分子をコードするポリヌクレオチドを含むゲノム改変システム、

（ｉｖ）所望の塩基配列を含む組換え用ドナーＤＮＡであって、前記標的領域の上流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する上流ホモロジーアームと、前記標的領域の下流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する下流ホモロジーアームを有する、組換え用ドナーＤＮＡ、

（ｄ）前記工程（ｃ）の後、前記ネガティブ選択用のマーカー遺伝子を発現しない細胞を選択する工程（ネガティブ選択のための工程）と、

を含み、

標的領域が１０ｋｂｐ以上の長さを有する、

方法。

【請求項３】標的領域が１０ｋｂｐ以上４０ｋｂｐ以下の長さを有する、請求項１または２に記載の方法。

【請求項４】標的領域が１０ｋｂｐ以上２０ｋｂｐ以下の長さを有する、請求項３に記載の方法。

【請求項５】前記上流ホモロジーアームおよび前記下流ホモロジーアームがそれぞれ、５００ｂｐ～３，０００ｂｐである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項６】前記上流ホモロジーアームおよび前記下流ホモロジーアームがそれぞれ、５００ｂｐ～３，０００ｂｐである、請求項３に記載の方法。

【請求項７】前記上流ホモロジーアームおよび前記下流ホモロジーアームがそれぞれ、５００ｂｐ～３，０００ｂｐである、請求項４に記載の方法。

【請求項８】組換え用ドナーＤＮＡの上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームとの間の領域が、５ｋｂｐ以上の長さを有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項９】組換え用ドナーＤＮＡの上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームとの間の領域が、５ｋｂｐ以上の長さを有する、請求項３または４に記載の方法。

【請求項１０】組換え用ドナーＤＮＡの上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームとの間の領域が、５ｋｂｐ以上の長さを有する、請求項４に記載の方法。

【請求項１１】組換え用ドナーＤＮＡの上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームとの間の領域が、８ｋｂｐ以上の長さを有する、請求項８に記載の方法。

【請求項１２】下記（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、染色体ゲノムの２つ以上のアレルを改変するゲノム改変キットであって、請求項１または２に記載の方法に用いるためのキット。

（ｉ）前記染色体ゲノムの標的領域を標的とし、標的領域を切断することができる配列特異的核酸切断分子、又は前記配列特異的核酸切断分子をコードするポリヌクレオチドを含むゲノム改変システム、

（ｉｉ）２種以上の選択マーカー用ドナーＤＮＡであって、前記標的領域の上流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する上流ホモロジーアームと、前記標的領域の下流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する下流ホモロジーアームを有し、上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームの間に、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子の塩基配列を含み、前記２種以上の選択マーカー用ドナーＤＮＡは、相互に区別可能に異なるポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子を有し、前記ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子は、選択マーカー用ドナーＤＮＡの種類毎に固有であり、前記選択マーカー用ドナーＤＮＡの種類数は、ゲノム改変の対象とする前記アレルの数と同数以上である、２種以上の選択マーカー用ドナーＤＮＡ、

ここで、選択マーカー遺伝子は、薬剤耐性遺伝子であり、かつ、２種以上の選択マーカー用ドナーＤＮＡがそれぞれ、前記上流ホモロジーアームと前記下流ホモロジーアームの間に、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子とネガティブ選択用のマーカー遺伝子と標的配列とを有する。

【請求項１３】標的領域が１０ｋｂｐ以上４０ｋｂｐ以下の長さを有する、請求項１２に記載のキット。

【請求項１４】標的領域が１０ｋｂｐ以上２０ｋｂｐ以下の長さを有する、請求項１３に記載のキット。

【請求項１５】組換え用ドナーＤＮＡをさらに含む、請求項１２～１４のいずれか一項に記載のキットであって、

組換え用ドナーＤＮＡは、前記標的領域の上流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する上流ホモロジーアームと、前記標的領域の下流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する下流ホモロジーアームを有し、

請求項７に記載の方法に用いるための、キット。

【請求項１６】組換え用ドナーＤＮＡの上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームとの間の領域が、５ｋｂｐ以上の長さを有する、請求項１５に記載のキット。

【請求項１７】組換え用ドナーＤＮＡの上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームとの間の領域が、８ｋｂｐ以上の長さを有する、請求項１５または１６に記載のキット。

【請求項１８】標的領域が５ｋｂｐ以上の長さを有し、かつ、組換え用ドナーＤＮＡの上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームとの間の領域が、５ｋｂｐ以上の長さを有する、請求項１５または１６に記載のキット。

【請求項１９】標的領域が８ｋｂｐ以上の長さを有し、かつ、組換え用ドナーＤＮＡの上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームとの間の領域が、８ｋｂｐ以上の長さを有する、請求項１８に記載のキット。

【請求項２０】組換え用ドナーＤＮＡが、組換え用ドナーＤＮＡの上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームとの間の領域に塩基配列を有さず、改変後に得られる染色体ゲノムの前記２つ以上のアレルにおいて、標的領域の上流および下流の配列が、塩基の挿入、置換および欠失なく、シームレスに連結している、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項２１】組換え用ドナーＤＮＡが、組換え用ドナーＤＮＡの上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームとの間の領域に塩基配列を有さず、改変後に得られる染色体ゲノムの前記２つ以上のアレルにおいて、標的領域の上流および下流の配列が、塩基の挿入、置換および欠失なく、シームレスに連結している、請求項３または４に記載の方法。

【請求項２２】改変後に得られる染色体ゲノムの前記２つ以上のアレルにおいて、部位特異的組換え酵素の標的配列が存在しない、請求項３に記載の方法。

【請求項２３】改変後に得られる染色体ゲノムの前記２つ以上のアレルにおいて、部位特異的組換え酵素の標的配列が存在しない、請求項４に記載の方法。

【請求項２４】改変後に得られる染色体ゲノムの前記２つ以上のアレルにおいて、部位特異的組換え酵素の標的配列が存在しない、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項２５】改変後に得られる染色体ゲノムの前記２つ以上のアレルにおいて、部位特異的組換え酵素の標的配列が存在しない、請求項３または４に記載の方法。

【請求項２６】工程（ｂ）において、２以上のアレルが改変された細胞を選択するまでの過程では単一細胞クローニングは行われない、請求項１～１１、および２０～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項２７】組換え用ドナーＤＮＡの上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームとの間の領域が、８ｋｂｐ以上の長さを有する、請求項３または４に記載の方法。

【請求項２８】組換え用ドナーＤＮＡが、組換え用ドナーＤＮＡの上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームとの間の領域に塩基配列を有さない、請求項１５に記載のキット。」

第４ 当審が通知した取消理由の概要及び特許異議申立の理由の概要

１ 令和４年３月３１日付け取消理由通知に記載した取消理由について

訂正前の請求項１～２８に係る特許に対して、令和４年３月３１日付けで特許権者に通知した取消理由の要旨は、次のとおりである。

請求項１、２、２６に係る発明は、甲第３号証に記載された発明であって、特許法第２９条第１項第３号に該当するから、請求項１、２、２６に係る特許は、特許法第２９条第１項の規定に違反してされたものであり、また、請求項１～２８に係る発明は、甲第３号証に記載された発明及び甲第１、６～７号証、引用文献Ａ（国際公開第２０１７／０５３７２９号）に記載された事項に基いて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、請求項１～２８に係る特許は、特許法第２９条第２項の規定に違反してされたものである。

２ 特許異議申立の理由の概要及び証拠方法について

特許異議申立人が、訂正前の請求項１～２８に係る特許に対して申し立てた特許異議申立理由の概要及び証拠方法は、次のとおりである。

（１）特許法第２９条第１項第３号及び第２９条第２項（甲第１号証を主引用例とする新規性欠如及び進歩性欠如）

請求項１～２８に係る発明は、甲第１号証に記載された発明であって、特許法第２９条第１項第３号に該当するから、請求項１～２８に係る特許は、特許法第２９条第１項の規定に違反してされたものであり、また、請求項１～２８に係る発明は、甲第１号証に記載された発明及び甲第３～７号証に記載された事項に基いて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、請求項１～２８に係る特許は、特許法第２９条第２項の規定に違反してされたものである。

（２）特許法第２９条第１項第３号及び第２９条第２項（甲第３号証を主引用例とする新規性欠如及び進歩性欠如）

請求項１、２、１２、２６に係る発明は、甲第３号証に記載された発明であって、特許法第２９条第１項第３号に該当するから、請求項１、２、１２、２６に係る特許は、特許法第２９条第１項の規定に違反してされたものであり、また、請求項１～２８に係る発明は、甲第３号証に記載された発明及び甲第１、４～７号証に記載された事項に基いて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、請求項１～２８に係る特許は、特許法第２９条第２項の規定に違反してされたものである。

（３）証拠方法

ア 甲第１号証：国際公開第２０１９／０１８５３４号

イ 甲第２号証：Nat.Methods(2018)Vol.15,No.12,p.1045-1047

and Supplementary information

ウ 甲第３号証：eLife(2017)Vol.6,e27873

エ 甲第４号証：FEBS Letters(2017)Vol.591,No.6,p.903-913

オ 甲第５号証：Mol.Ther.Methods Clin.Dev.(2019)Vol.15,p.285-293

カ 甲第６号証：Sci.Rep.(2018)Vol.8,No.1,15028

キ 甲第７号証：Nat.Commun.(2016)Vol.7,10431

第５ 甲号証の記載

甲第１号証、甲第３号証には、以下の事項が記載されている（英語で記載されているので、日本語訳で摘記する。下線は合議体による。）。

１ 甲第１号証：国際公開第２０１９／０１８５３４号

（甲１－１）「１．以下の工程を含む、細胞のゲノムＤＮＡのスカーレス編集のための方法：

（ａ）（ｉ） 第１のドナーポリヌクレオチドの細胞中への導入であって、第１のドナーポリヌクレオチドが、細胞のゲノムＤＮＡにおける改変されるべき標的配列に対する意図した編集を含む配列に隣接する第１の左ホモロジーアームおよび第１の右ホモロジーアームと、少なくとも１つの選択マーカーをコードする発現カセットとを含む、導入；および

（ｉｉ） 第１のガイドＲＮＡおよびＣａｓ９の細胞中への導入であって、第１のガイドＲＮＡが、Ｃａｓ９が第１のガイドＲＮＡと第１の複合体を形成するように、細胞のゲノムＤＮＡにおける改変されるべきゲノム標的配列に対して相補的な配列を含み、該ガイドＲＮＡが、第１の複合体をゲノム標的配列に方向づけ、Ｃａｓ９が、細胞のゲノムＤＮＡにおいて二本鎖切断を作製し、第１のドナーポリヌクレオチドが、Ｃａｓ９媒介相同組換え修復（ＨＤＲ）によってゲノムＤＮＡ中に組み込まれて、遺伝子改変細胞を生成する、導入

を含む、第１のＣａｓ９媒介相同組換え修復（ＨＤＲ）段階を行う工程；

（ｂ） 少なくとも１つの選択マーカーの陽性選択に基づいて、遺伝子改変細胞を単離する工程；

（ｃ）（ｉ） 第２のドナーポリヌクレオチドの遺伝子改変細胞中への導入であって、第２のドナーポリヌクレオチドが、少なくとも１つの選択マーカーをコードする発現カセットの欠失を含む以外はＣａｓ９媒介ＨＤＲによるゲノムＤＮＡ中への第１のドナーポリヌクレオチドの組み込みによって改変されるような標的ゲノム配列に対して相補的な配列に隣接する、第２の左ホモロジーアームおよび第２の右ホモロジーアームを含む、導入；

（ｉｉ） 第２のガイドＲＮＡおよびＣａｓ９ヌクレアーゼの細胞中への導入であって、Ｃａｓ９が、第２のガイドＲＮＡと第２の複合体を形成し、該第２のガイドＲＮＡが、第２の複合体を改変標的ゲノム配列に方向づけ、Ｃａｓ９が、改変ゲノムＤＮＡにおいて二本鎖切断を作製し、かつ第２のドナーポリヌクレオチドが、Ｃａｓ９媒介ＨＤＲによってゲノムＤＮＡ中に組み込まれ、それにより、少なくとも１つの選択マーカーをコードする発現カセットをＣａｓ９媒介ＨＤＲによって改変ゲノムＤＮＡから除去する、導入

を含む、第２のＣａｓ９媒介相同組換え修復（ＨＤＲ）段階を行う工程；ならびに

（ｄ） 少なくとも１つの選択マーカーの陰性選択に基づいて、意図した編集を含む遺伝子改変細胞を単離する工程であって、該少なくとも１つの選択マーカーをコードする発現カセットが欠失している、工程。

２．前記意図した編集を含む配列が、少なくとも１つの選択マーカーをコードする発現カセット内またはその近くに位置づけられる、請求項１記載の方法。

３．前記意図した編集が、細胞のゲノムＤＮＡにおける遺伝子中に変異を導入する、請求項１記載の方法。

４．前記変異が、挿入、欠失、および置換からなる群より選択される、請求項３記載の方法。

５．前記意図した編集が、細胞のゲノムＤＮＡにおける遺伝子から変異を除去する、請求項１記載の方法。

６．前記意図した編集が、細胞のゲノムＤＮＡにおける遺伝子の不活性化を結果としてもたらす、請求項１記載の方法。

７．一方のアレルが、ゲノムＤＮＡにおいて改変される、請求項１記載の方法。

８．両方のアレルが、ゲノムＤＮＡにおいて改変される、請求項１記載の方法。

９．前記少なくとも１つの選択マーカーが、蛍光マーカーである、請求項１記載の方法。

１０．前記遺伝子改変細胞が、単一アレル編集を含むかまたは両アレル編集を含むかを決定するために、蛍光強度を測定する工程をさらに含む、請求項９記載の方法。

１１．前記細胞が、真核生物、原核生物、または古細菌生物由来である、請求項１記載の方法。

１２．前記細胞が哺乳動物である、請求項１１記載の方法。

１３．前記細胞がヒトである、請求項１２記載の方法。

１４．前記細胞が細胞株由来である、請求項１記載の方法。

１５．前記細胞が不死化細胞である、請求項１記載の方法。

１６．前記細胞ががん性である、請求項１記載の方法。

１７．前記細胞がインビトロまたはインビボである、請求項１記載の方法。

１８．前記細胞が、Ｋ５６２細胞、胚性幹細胞、および人工多能性幹細胞からなる群より選択される、請求項１記載の方法。

１９．前記少なくとも１つの選択マーカーが、細胞表面マーカー、薬物耐性遺伝子、レポーター遺伝子、および自殺遺伝子からなる群より選択される、請求項１記載の方法。

２０．前記細胞表面マーカーが、切断型ＣＤ８、ＮＧＦＲ、切断型ＣＤ１９（ｔＣＤ１９）、ＣＣＲ５、およびＡＢＯ抗原からなる群より選択される、請求項１９記載の方法。

２１．前記細胞表面マーカーが、細胞機能にとって不可欠ではない、請求項１９記載の方法。

２２．第１のＨＤＲ段階から生成された遺伝子改変細胞が、選択マーカーに特異的に結合する結合物質を用いた陽性選択によって単離される、請求項１９記載の方法。

２３．前記結合物質が、選択マーカーに特異的に結合する抗体、抗体模倣物、またはアプタマーを含む、請求項２２記載の方法。

２４．前記抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ナノボディ、抗体の組換え断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、およびｓｃＦｖ断片からなる群より選択される、請求項２３記載の方法。

２５．前記抗体が、抗ｔＣＤ１９抗体、抗ＣＤ８抗体、および抗ＮＧＦＲ抗体からなる群より選択される、請求項２２記載の方法。

２６．前記結合物質が、固体支持体上に固定化される、請求項２２記載の方法。

２７．前記固体支持体が、磁性ビーズ、非磁性ビーズ、スライド、ゲル、膜、またはマイクロタイタープレートウェルである、請求項２６記載の方法。

２８．前記少なくとも１つの選択マーカーをコードする発現カセットが、ＵｂＣプロモーター、ｍＣｈｅｒｒｙをコードするポリヌクレオチド、Ｔ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチド、切断型ＣＤ１９（ｔＣＤ１９）をコードするポリヌクレオチド、およびポリアデニル化配列を含む、請求項１記載の方法。

２９．第１のドナーポリヌクレオチド、第２のドナーポリヌクレオチド、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡ、またはＣａｓ９のうちの１つまたは複数が、ベクターによって提供される、請求項１記載の方法。

３０．前記ベクターが、プラスミドまたはウイルスベクターである、請求項１記載の方法。

３１．第１のドナーポリヌクレオチド、第１のガイドＲＮＡ、およびＣａｓ９が、単一のベクターまたは複数のベクターによって提供される、請求項２９記載の方法。

３２．第２のドナーポリヌクレオチド、第２のガイドＲＮＡ、およびＣａｓ９が、単一のベクターまたは複数のベクターによって提供される、請求項２９記載の方法。

３３．第１のドナーポリヌクレオチドが、ランダムに組み込まれるかまたはエピソーム性である選択マーカーの発現を阻害する短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする少なくとも１つの発現カセットをさらに含む、請求項１記載の方法。

３４．第１のドナーポリヌクレオチドが、ｓｈＲＮＡをコードする発現カセットのペアを含み、該ペアの第１の発現カセットが、第１の左ホモロジーアームの５’に位置し、かつ該ペアの第２の発現カセットが、第１の右ホモロジーアームの３’に位置する、請求項３３記載の方法。

３５．前記ｓｈＲＮＡが、ゲノム中にランダムに組み込まれている選択マーカーを発現するクローンの選択を低減させる、請求項３３記載の方法。

３６．前記二本鎖切断が、非遺伝子破壊性二本鎖切断である、請求項１記載の方法。

３７．前記二本鎖切断が、前記少なくとも１つの選択マーカーの発現に影響を及ぼさない、請求項１記載の方法。

３８．以下を含む、スカーレスゲノム編集システム：

（ａ） 細胞のゲノムＤＮＡにおける改変されるべき標的配列に対する意図した編集を含む配列に隣接する第１の左ホモロジーアームおよび第１の右ホモロジーアームと、少なくとも１つの選択マーカーをコードする発現カセットとを含む、第１のドナーポリヌクレオチド；

（ｂ） 少なくとも１つの選択マーカーをコードする発現カセットの欠失を含む以外は第１のドナーポリヌクレオチドの配列に対して相補的な配列に隣接する、第２の左ホモロジーアームおよび第２の右ホモロジーアームを含む、第２のドナーポリヌクレオチド；

（ｃ） Ｃａｓ９ヌクレアーゼ；

（ｄ） Ｃａｓ９ヌクレアーゼと複合体を形成し、該複合体を標的配列に方向づけることができる、第１のガイドＲＮＡ；ならびに

（ｅ） Ｃａｓ９ヌクレアーゼと複合体を形成し、該複合体を、Ｃａｓ９媒介相同組換え修復（ＨＤＲ）によるゲノムＤＮＡ中への第１のドナーポリヌクレオチドの組み込みによって改変されるような標的ゲノム配列に方向づけることができる、第２のガイドＲＮＡ。

３９．前記少なくとも１つの選択マーカーをコードする発現カセットが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、第１のドナーポリヌクレオチドを、少なくとも１つの選択マーカーの発現に適している条件下で、前記Ｃａｓ９媒介ＨＤＲによって標的配列で細胞のゲノムＤＮＡ中に組み込むことができ、かつ、Ｃａｓ９媒介ＨＤＲによって標的部位で細胞のゲノムＤＮＡ中に組み込まれた第１のドナーポリヌクレオチドを有する細胞を、発現カセットによってコードされる該少なくとも１つの選択マーカーの陽性選択により、特定することができる、請求項３８記載のスカーレスゲノム編集システム。

４０．第２のドナーポリヌクレオチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むポリヌクレオチドを含み、第２のドナーポリヌクレオチドを、少なくとも１つの選択マーカーをコードする発現カセットを除去するために、Ｃａｓ９媒介ＨＤＲによって標的部位で細胞の改変ゲノムＤＮＡ中に組み込むことができる、請求項３８記載のスカーレスゲノム編集システム。

４１．第１のドナーポリヌクレオチド、第２のドナーポリヌクレオチド、第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡ、またはＣａｓ９のうちの１つまたは複数が、ベクターによって提供される、請求項３８記載のスカーレスゲノム編集システム。

４２．前記ベクターが、プラスミドまたはウイルスベクターである、請求項３８記載のスカーレスゲノム編集システム。

４３．第１のドナーポリヌクレオチド、第１のガイドＲＮＡ、およびＣａｓ９が、単一のベクターまたは複数のベクターによって提供される、請求項３８記載のスカーレスゲノム編集システム。

４４．第２のドナーポリヌクレオチド、第２のガイドＲＮＡ、およびＣａｓ９が、単一のベクターまたは複数のベクターによって提供される、請求項３８記載のスカーレスゲノム編集システム。

４５．第１のドナーポリヌクレオチドが、ランダムに組み込まれるかまたはエピソーム性である選択マーカーの発現を阻害する短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする少なくとも１つの発現カセットをさらに含む、請求項３８記載のスカーレスゲノム編集システム。

４６．第１のドナーポリヌクレオチドが、ｓｈＲＮＡをコードする発現カセットのペアを含み、該ペアの第１の発現カセットが、第１の左ホモロジーアームの５’に位置し、かつ該ペアの第２の発現カセットが、第１の右ホモロジーアームの３’に位置する、請求項３８記載のスカーレスゲノム編集システム。

４７．請求項３８記載のスカーレスゲノム編集システムを含む、宿主細胞。

４８．請求項３８記載のスカーレスゲノム編集システム、およびゲノムＤＮＡのスカーレス編集を行うための説明書を含む、キット。

４９．請求項４７記載の宿主細胞を含む、キット。」（特許請求の範囲）

（甲１－２）「技術分野

本発明は、概して、ゲノム工学およびスカーレスゲノム編集の分野に属する。特に、本発明は、細胞を遺伝子改変して望まれない配列を除去するための、相同組換え修復（ＨＤＲ）を利用したスカーレスゲノム編集の方法に関する。」（第１頁第５行～第９行）

（甲１－３）「概要

本発明は、スカーレスゲノム編集のための方法に関する。特に、本方法は、細胞を遺伝子改変し、望まれない配列を除去するための、ＨＤＲ段階を用いることによるスカーレスゲノム改変を提供する。本方法は、ゲノム中にサイレンス変異、選択マーカー配列、または他の付加的な望ましくない配列を残さずに、ゲノムにおける任意の位置に変異、欠失、または挿入を導入することを含むゲノム編集のために使用され得る。」（第４頁第８行～第１４行）

（甲１－４）「１つのアレルまたは２つのアレルのいずれかが、ゲノムＤＮＡにおいて改変されてもよい。ある特定の態様において、少なくとも１つの選択マーカーは、蛍光マーカーであり、遺伝子改変細胞が単一アレル編集を含むかまたは両アレル編集を含むかを決定するために、蛍光強度を測定することができる。」（第５頁第２０行～第２３行）

（甲１－５）「ある特定の態様において、少なくとも１つの選択マーカーは、細胞表面マーカー、薬物耐性遺伝子、レポーター遺伝子、および自殺遺伝子からなる群より選択される。別の態様において、細胞表面マーカーは、切断型ＣＤ８、ＮＧＦＲ、切断型ＣＤ１９（ｔＣＤ１９）、ＣＣＲ５、およびＡＢＯ抗原からなる群より選択される。」（第６頁第１０行～第１４行）

（甲１－６）「図１３Ａ～Ｄは、種々のパターンのスカーレス編集のためのドナーＤＮＡ設計を示す。本発明者らは、ＨＲベースの編集を、適切なマーカー選択と組み合わせた場合は、ｈＰＳＣ中で、ＴＢＸ１編集においては３ ｋｂよりも長くを組み込み、および欠失させるため、ならびにＢ２Ｍ編集においては約３ ｋｂ～１ ｋｂの配列を改変するために利用可能であることを実証した。それらを組み合わせることは、以下のようなスカーレス編集の追加的な適用を理論的に可能にする：（図１３Ａ）多能性幹細胞における分化の最適化または薬物スクリーニングに有用であるはずであるレポーター遺伝子の導入などのための大きな挿入。（図１３Ｂ）疾患モデルまたはノックアウト動物を作製するための大きな欠失。（図１３Ｃ）ヒト化モデルを含むノックイン動物を作製するための大きな置換。（図１３Ｄ）意図した変異部位の近くに、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼを含む部位特異的ヌクレアーゼ（ＳＳＮ）の良好な標的部位がない場合における編集。この技法を用いて、編集部位に対するほぼすべての限定が排除されるはずである。」（第１２頁第２６行～第１３頁第４行）

（甲１－７）「本発明は、細胞を遺伝子改変し、望まれない配列を除去するために２段階ＨＤＲ修復を用いる、スカーレスゲノム編集の方法の開発に基づく。本方法は、ゲノム中にサイレント変異、選択マーカー配列、または他の付加的な望ましくない配列を残さずに、ゲノムにおける任意の位置に変異、欠失、または挿入を導入するために、ゲノム編集において使用され得る。さらに、編集部位の選択に対してほぼ制限がない。本方法は、小さな編集だけではなく、数千の塩基の大きな編集のためにも使用され得る。このゲノム編集法の大きな利点は、種々の種類の細胞におけるその極度に高い効率および柔軟性を含む。本発明者らは、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞のゲノム編集のための本方法の使用の実証に成功している（実施例１）。本方法の高い効率により、所望のクローンを、典型的には、１０個よりも多くのコロニーをスクリーニングする必要なく特定することが可能である。加えて、本方法は、複数の遺伝子編集を可能にするように容易に適合可能である（実施例１を参照されたい）。」（第２９頁第１０行～第２２行）

（甲１－８）「Ａ．２段階ＨＤＲ修復によるスカーレスゲノム編集

上記で説明されるように、本発明の方法は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを用いたスカーレスゲノム編集を達成するために、２つのＨＤＲ修復段階を利用する。第１のＨＤＲ段階において、ゲノムに対する意図した編集を含む配列を含有するドナーポリヌクレオチドが、細胞において標的ゲノム配列を改変するために用いられ、該ドナーポリヌクレオチドは、部位特異的相同組換えによって標的遺伝子座でゲノム中に組み込まれる。ドナーポリヌクレオチドは、標的遺伝子を修復する、改変する、置き換える、欠失させる、減衰させる、または不活性化する目的で、例えば、ゲノム中に意図した編集を導入するために使用され得る。ドナーポリヌクレオチドに選択マーカー発現カセットが含まれることにより、第１のＨＤＲ段階によって生成される遺伝子改変細胞を、陽性選択によって単離することが可能である。第２のＨＤＲ段階において、第２のドナーポリヌクレオチドが、第１のＨＤＲ段階において生成された遺伝子改変細胞から選択マーカー発現カセットを欠失させるために用いられる。第２のドナーポリヌクレオチドは、選択マーカー発現カセットの欠失を含む以外は第１のＨＤＲ段階におけるゲノムＤＮＡ中への第１のドナーポリヌクレオチドの組み込みによって改変されるような標的ゲノム配列に対して相補的な配列を含む。それ故、標的ゲノム遺伝子座での第２のドナーポリヌクレオチドの組み込みは、発現カセットを除去する。選択マーカーカセットが除去されている遺伝子改変細胞は、陰性選択に基づいて単離することができる。」（第２９頁第２７行～第３０頁第１３行）

（甲１－９）「本明細書に記載されるようなゲノム編集は、細胞のゲノムＤＮＡにおいて改変されている１つのアレルまたは２つのアレルのいずれかを結果としてもたらし得る。ある特定の態様において、陽性選択のために用いられる選択マーカーのうちの少なくとも１つは、蛍光マーカーであり、遺伝子改変細胞が単一アレル編集を含むかまたは両アレル編集を含むかを決定するために、蛍光強度を測定することができる。

蛍光ｍＣｈｅｒｒｙマーカーおよび切断型ＣＤ１９（ｔＣＤ１９）細胞表面マーカーをコードする例示的な発現カセットを、実施例１に示す。選択マーカー発現カセットは、ｍＣｈｅｒｒｙをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたＵｂＣプロモーター、Ｔ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチド、切断型ＣＤ１９（ｔＣＤ１９）をコードするポリヌクレオチド、およびポリアデニル化配列を含む。

ある特定の態様において、陰性選択マーカーが、選択マーカー発現カセットを有さない（すなわち、陽性選択マーカーをコードする配列が欠失している）細胞を特定するために用いられる。例えば、第２のＨＤＲ段階後の細胞の陰性選択を容易にするための選択マーカー発現カセットにおける陰性選択マーカーとして、自殺マーカーが含まれてもよい。自殺遺伝子は、遺伝子改変細胞においてアポトーシスを誘導すること、または非毒性薬物を毒性化合物に変換することによって、細胞を選択的に死滅させるために使用され得る。例には、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、細胞内抗体、テロメラーゼ、カスパーゼ、およびＤＮアーゼをコードする自殺遺伝子が含まれる。ある特定の態様において、自殺遺伝子は、１つまたは複数の他の選択マーカー、例えば、細胞の陽性選択における使用のための上記のものと組み合わせて用いられる。自殺遺伝子は、スカーレス編集を達成するために第２のＨＤＲ段階において除去されてよい。あるいは、自殺遺伝子は、その破壊を意のままに可能にすることによってその安全性を改善するため、第２のＨＤＲ段階後に遺伝子改変細胞において保持されてもよい。例えば、参照により本明細書に組み入れられるＪｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５：２５４、Ｍｉｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ． ５：５１－５８、Ｇｒｅｃｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ６：９５を参照されたい。

あるいはまたは加えて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、遺伝子アレイ、シークエンシング、またはハイブリダイゼーション技法（例えば、サザンブロット）などの従来の方法を用いて、第２のＨＤＲ段階後の遺伝子改変細胞における選択マーカー配列および他の望ましくない配列の非存在について、細胞を試験することができる。」（第３２頁第２３行～第３３頁第２１行）

（甲１－１０）「いくつかの例において、細胞の集団は、遺伝子改変細胞を残りの集団から分離することによって、遺伝子改変を含むものが濃縮されてもよい。遺伝子改変細胞の分離は、典型的には、標的遺伝子座で意図した編集と同時に組み込まれた選択可能マーカーの発現に依拠する。第１のＨＤＲ段階後に、例えば、遺伝子改変を含む濃縮された細胞の集団を作製するように、細胞を集団から単離するために、陽性選択が行われる。第２のＨＤＲ段階後に、例えば選択マーカー発現カセット由来の望まれない配列を依然として含有する細胞を除去するために、陰性選択が行われる。」（第３６頁第２３行～第３１行）

（甲１－１１）「Ｃ．キット

第１および第２のＨＤＲ段階のためのドナーＤＮＡおよびガイドＲＮＡ、ならびにＣａｓ９を含む上記の試薬は、本明細書に記載されるようなスカーレスゲノム改変のための適している説明書および他の必要な試薬と共に、キットにおいて提供することができる。キットはまた、ゲノム改変のための細胞、細胞の陽性選択および陰性選択のための結合物質、およびトランスフェクション剤も含有し得る。キットは標準的に、別々の容器に、ドナーＤＮＡ、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓ９、および必要とされる他の試薬を含有する。本明細書に記載されるようなゲノム編集を実施するための説明書（例えば、書面、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ、Ｂｌｕ－ｒａｙ、フラッシュドライブ、デジタルダウンロードなど）が通常、キットに含まれる。キットはまた、用いられる特定のアッセイに応じて、他のパッケージングされた試薬および材料（すなわち、洗浄緩衝液など）も含有することができる。本明細書に記載されるような細胞のゲノム編集は、これらのキットを用いて実施することができる。」（第５１頁第７行～第１９行）

（甲１－１２）「実施例１

ヒト多能性幹細胞における高効率スカーレスゲノム編集

本発明者らの方法において、本発明者らは、単一ヌクレオチド変化またはより大きなＤＮＡ断片（レポーター遺伝子など）の挿入のいずれかを作製しながらＩＮＤＥＬを作製することなく、いずれか一方または両方のアレル上のスカーレス編集を可能にする２段階ＨＲアプローチを、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の両方において４つの遺伝子に適用した。

以前のスカーレス編集法の限界を打破するために、本発明者らは、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡシステムを用いた２段階ＨＲ戦略と、磁性ビーズを用いた陽性－陰性選択との組み合わせを使用した（図１Ａ～１Ｃ）。概念実証として、本発明者らは、ディジョージ症候群としても公知の２２ｑ１１．２欠失症候群を引き起こす、ｃＤＮＡのヌクレオチド９２８位でのＴＢＸ１内の点変異（ｃ．９２８ Ｇ＞Ａ）をヒトＥＳＣにおいて導入した（Ｙａｇｉ ｅｔ ａｌ． Ｌａｎｃｅｔ ３６２，１３６６－１３７３（２００３））。ＴＢＸ１ ｃ．９２８ Ｇの１ｋｂ以内にはＴＴＡＡ部位がないため、この遺伝子座の編集は、ｐｉｇｇｙＢａｃシステムを用いて可能ではない。本発明者らの方法のために、本発明者らは、ｈＥＳＣに、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９（Ｃａｓ９）およびＴＢＸ１ ｃ．９２８ Ｇ近くを標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を同時発現するプラスミドをトランスフェクトした（図６Ａ）。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡプラスミドに加えて、本発明者らはまた、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体によって導入されるＤＳＢの後に、修復鋳型として用いられるドナーＤＮＡを保有するプラスミドもトランスフェクトした。ドナー鋳型はまた、左ホモロジーアームと右ホモロジーアームとの間でマーカーとして働くようにヒトＵｂＣプロモーターの制御下でｍＣｈｅｒｒｙおよび切断型ＣＤ１９（ｔＣＤ１９）を発現する、２シストロン性カセットも含有する（図１Ｂ）。ｍＣｈｅｒｒｙおよびｔＣＤ１９はエピソーム性に発現されるため、トランスフェクション後６日以内に２．１％まで低減する、ｍＣｈｅｒｒｙの一過性発現が観察される（図２Ａ）。したがって、トランスフェクション後６日目に、本発明者らは、磁性ビーズとコンジュゲートされた抗ＣＤ１９を用いた磁気補助細胞分離（ＭＡＣＳ）選択によって、ｔＣＤ１９陽性細胞を精製した（図２Ｂ）。細胞を次いで、単一細胞クローニングのために低密度（１００細胞／ｃｍ２）でプレーティングした。培養においてさらに８日後に、明るいかまたは薄暗いｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を有するコロニーが観察された（図２Ｃ）。これらの蛍光細胞におけるＴＢＸ１の遺伝子型判定により、明るいｍＣｈｅｒｒｙ発現を有する１１クローンのうち９個が、意図したＴＢＸ１部位中に両アレル編集を所有することが明らかになった（図２Ｄ）。本発明者らはまた、薄暗いｍＣｈｅｒｒｙ発現を有する３クローンも採取し、そのうちのすべては、意図した遺伝子座での本発明者らのマーカーの単一アレル挿入を示した。さらなる確認のために、本発明者らは、ＵｂＣプロモーターのｄｄＰＣＲ定量によって、ゲノムに挿入されたターゲティングベクターのコピー数を検証した。明るいコロニーはすべて、４コピーのＵｂＣプロモーターを含有していた（ユビキチン遺伝子座での内在性の２コピーのＵｂＣプロモーター＋本発明者らの標的化遺伝子座での外来性の２コピーに由来する、図２Ｅ）。これは、１１クローンのうち９個が、ランダムな組み込みを伴わずに正確に標的化されたことを示す。本発明者らの仮説に沿って、薄暗いコロニーはすべて、内在性の２コピー＋ＴＢＸ１内の単一アレル編集事象からの１つに由来する、３コピーのＵｂＣプロモーターを含有していた。

第１ラウンドのＭＡＣＳ選択の後に、スカーレス両アレル編集および単一アレル編集を有する細胞を生じる本発明者らの方法の能力を実証するために、本発明者らは、両アレル性に編集されたクローン２番および単一アレル性に編集されたクローン１３番において第２ラウンドのＨＲを行った。これは、挿入されたマーカーのみを標的とするカスタムｇＲＮＡと共にＣａｓ９を発現するプラスミドをトランスフェクトすることによって、以前のように行った（ガイド２、図６Ａ）。ガイド２は、生物情報学解析に基づいて高い特異性を有するように設計され、マーカー遺伝子とホモロジーアームとの間の接合部のみを標的とし、したがって、ヒトゲノムにおける内在性標的部位を有さない。本発明者らは、スカーレスのマーカーを含まない編集事象を生じるであろう、ホモロジーアームと共にＴＢＸ１ ｃ．Ｇ９２８ Ｇ＞Ａ変異を含有するドナー鋳型を保有するプラスミドを、同時にトランスフェクトした（図１Ｂ）。この第２の編集を所有する細胞を、トランスフェクション後７日目にＭＡＣＳ陰性選択によって精製した。陰性選択を用いて、本発明者らは、９８％よりも多くがｔＣＤ１９陰性細胞の集団を増大させる（図２Ｆ）。本発明者らは次いで、ｔＣＤ１９陰性集団からの単一細胞クローニングを用いて、両アレル編集事象を経験したマーカーを含まない細胞を特定した。クローンの解析により、クローン２番に由来する７個の別個のクローン由来の７個のＴＢＸ１ ｃ．Ｇ９２８ Ｇ＞Ａ両アレル編集系統、およびクローン１３番に由来する１６クローン由来の１２個の単一アレル編集系統が示された（図２Ｇ、２Ｈ）。クローン１３番に由来する１６クローンすべてで、単一アレル編集事象を伴う第２ラウンドのＨＲを始めたが、その後、１６クローンのうちの４個は、ＷＴアレルのみを所有した。本発明者らは、単一アレル編集事象のこの喪失は、第２のＣａｓ９媒介ＤＳＢの後の（姉妹染色分体ではない）ＷＴホモログ染色体を用いたＨＲ事象のせいであったと仮説を立てた。この考えを支持して、非編集細胞の混入には由来し得ない、第２ラウンドのＨＲ後にホモ接合性１塩基挿入を有する単一のクローンが見出された（図７）。加えて、ＷＴおよびＴＢＸ１ ｃ．９２８ Ｇ＞Ａドナーの混合物を用いたクローン２番における第２ラウンドのＨＲは、ＷＴ、ヘテロ接合性、およびホモ接合性の変異体を生じた（図２Ｇ）。このため、同質遺伝子バックグラウンドにおけるＷＴ、ヘテロ接合性、およびホモ接合性のスカーレスクローンを、ちょうど同腹比較などの疾患のモデリングが遺伝子改変動物で行われる場合の、適切な比較のために容易に取得することができる。第２ラウンドのＨＲおよびその後の陰性選択の後に、本発明者らは、編集された幹細胞が多能性マーカーを保持することを確認した（図８）。

本発明者らは次に、ＲＵＮＸ１遺伝子の終止コドンの直前での、２Ａ自己切断性ペプチド配列の後に続くｍＯｒａｎｇｅ遺伝子の組み込みによってＲＵＮＸ１レポーターｉＰＳ細胞株を作製するために、同じアプローチを適用した。この編集の目標は、ＲＵＮＸ１＋造血幹および前駆細胞への方向づけられた分化の画像解析を可能にするため、ならびにＰＳＣのＲＵＮＸ１＋細胞への分化を増強する培養条件／小分子をスクリーニングするためおよびＣＲＩＳＰＲまたはｓｈＲＮＡベースの遺伝子スクリーニングのために、同質遺伝子スカーレスＲＵＮＸ１レポーターを作製することである（図３Ａ）。ＲＵＮＸ１遺伝子はＰＳＣにおいて発現しないため、従来の編集法によって編集された系統を取得することは容易ではなく、マーカー選択が使用されない限り、通常何百ものコロニーを採取して解析しなければならない。第１ラウンドの編集を通して、本発明者らは、図６Ｂおよび７に図示されるＣａｓ９／ｇＲＮＡおよびドナープラスミドを用いて、ＲＵＮＸ１終止コドンの５’側にｍＣｈｅｒｒｙ－ｔＣＤ１９発現カセットを挿入した。ｔＣＤ１９陽性細胞のＭＡＣＳ濃縮および単一細胞培養の後、本発明者らは８個の明るいクローンを採取した。ＰＣＲベースの遺伝子型判定により、クローン２番および８番において、マーカーが標的化遺伝子座で両アレル性に挿入されたことが示され（図３Ｂ）、ｄｄＰＣＲベースのコピー数解析により、これらのクローンが４コピーのＵｂＣプロモーターを有することが示される。次いで、本発明者らは、クローン２番を、図３Ａに図示されるようなＣａｓ９／ｇＲＮＡおよびドナーベクターを用いた第２ラウンドの編集に供した。その後、ｔＣＤ１９陰性細胞をＭＡＣＳ分離によって濃縮し、次いで、単一細胞クローニングにより、ＲＵＮＸ１の終止コドンの直前に２Ａ－ｍＯｒａｎｇｅを両アレル性に有する所望の系統がもたらされた（クローン１、３、５、６、および７番、図３Ｃ）。このように、本発明者らは、内在性ＲＵＮＸ１遺伝子を破壊することなくＲＵＮＸ１のためのレポーターを導入した、ＰＳＣ系統を作製した。組み込まれたｍＯｒａｎｇｅがＲＵＮＸ１のためのレポーターとして働くかどうかを確認するために、本発明者らは、このｉＰＳ細胞株を造血幹前駆細胞（ＨＳＰＣ）への分化に供した（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １２，１１４－１２６（２０１３））。放射線照射Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞との共培養の１３日後に、ｍＯｒａｎｇｅ陽性ＨＳＰＣ様細胞が検出された（図３Ｄ）。ＦＡＣＳ解析により、主としてＨＳＰＣを含有する、ＣＤ３４が陽性、かつＣＤ４５が中間陽性である集団は、未分化のまたは他の細胞型を含有する他の集団よりも多くの明るいｍＯｒａｎｇｅを発現することが示される（図３Ｅ）。これらの結果は、ｍＯｒａｎｇｅレポーター細胞が、その分化能力を保持し、系列分化を調節する非細胞表面転写因子であるＲＵＮＸ１の発現について正確に報告することを実証する。本発明者らはまた、同じ編集戦略によってＲＵＮＸ１－ＧＦＩ１二重レポーター系統を作製するために、このＲＵＮＸ１－ｍＯｒａｎｇｅ系統を用いてＧＦＩ１遺伝子座でのさらなる編集も実施した（図９）。

ＲＵＮＸ１およびＧＦＩ１両方のレポーター組み込みにおいて、第１の編集段階でのランダムな組み込みを伴わない両アレルターゲティング頻度は、クローンの３０％未満で起こった。ランダムな組み込みを伴うクローンの大部分はプラスミドバックボーン由来の配列を有していたため（図１０）、本発明者らは、プラスミドバックボーンにおける陰性選択特性の導入は、第１ラウンドの編集におけるランダムな組み込みを伴う細胞の濃縮を効果的に低減させるという仮説を立てた。薬物選択を用いる必要によって限定される、広く用いられているチミジンキナーゼ選択法を用いる代わりに、本発明者らは、ｓｈＲＮＡベースの対抗選択に基づく新規の陰性選択法を開発した。このシステムにおいて、ｓｈＲＮＡカセットは、両方のホモロジーアームに隣接し、陽性マーカー選択遺伝子を抑制するように設計されている。ｓｈＲＮＡが（エピソーム性発現またはランダムな組み込みのいずれかから）発現される限り、マーカー遺伝子は抑制され、細胞は陽性として記録されないことになる。ひとたびエピソーム性発現が失われると、マーカー遺伝子抑制は緩和され、カセットが標的化様式のみで組み込まれている陽性マーカークローンを、容易に特定することができる。本発明者らは、このシステムを、ＥＳ Ｈ９系統におけるＢ２Ｍ遺伝子座の、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ａ＊２４融合タンパク質を作製するためにＢ２Ｍ終止コドンの５’側にリンカーを伴ってＨＬＡ－Ａ＊２４ ｃＤＮＡを組み込むように設計されたドナーベクターでの編集に適用した。図４Ｂに示されるように、ｓｈＧＦＰ発現カセット（各々０．３ ｋｂ）を、第１のドナーベクターにおける左ホモロジーアームおよび右ホモロジーアーム両方の外側に導入し、選択マーカーを、ｍＣｈｅｒｒｙおよびｔＣＤ１９からＧＦＰおよびｔＣＤ８に変更した。結果として、５個の明るいクローンから、ランダムな組み込みを伴わない４個の両アレル性にマーカーが組み込まれたクローンが取得され（図４Ｂ）、他方、ｓｈＲＮＡ選択システムを伴わずにドナーベクターを用いた６個の明るいクローンからは、１個の両アレル性に標的化されたクローンのみが取得され（図４Ａ）、これは、ｓｈＲＮＡベースの対抗選択特性が、第１ラウンドの編集からの陽性選択におけるランダムな組み込みを伴う細胞の混入を効果的に低減したことを示した。本発明者らは、薬物選択を用いる必要なくそのようなクローンを特定することができ、したがってこれは、システムをより容易に、かつ残ったクローンに対する毒性をより少なくした。

加えて、本発明者らは、新規ＥｃｏＲＩ部位を生成する、ＡＴＧから上流３１４番目および３１５番目の変異（ＧＧ＞ＡＡ）の導入が、ヒトＵｂＣプロモーター活性に影響を及ぼさないことを見出した。この特性により、ｄｄＰＣＲなどの定量的ＰＣＲ戦略を用いる必要なく正規のＰＣＲによって、選択マーカーを駆動する新たな外来性ＵｂＣプロモーターのコピー数解析を行うことが可能になる（図１１）。次いで、本発明者らは、陰性選択と組み合わせた第２ラウンドの編集によって、８個の濃縮されたクローンから８個の正確に編集されたクローンを取得したことを確認し（図４Ｃ）、所望のＨＬＡ発現プロファイル（内在性ＨＬＡのノックアウトおよびＨＬＡ－Ａ＊２４の発現）が、編集された細胞において観察された（図４Ｄ）。本発明者らはまた、高密度ＳＮＰアレイ解析によって、すべての編集実験における元の系統、第１ラウンドおよび／または第２ラウンドの編集産物の間でゲノムのコピー数変動（ＣＮＶ）を比較した。２段階編集プロセスによって引き起こされた実質的な染色体変化（欠失または増倍）はなかったが、第２ラウンドの編集後のＴＢＸ１系統のうちの１つにおける「コピー中立性のヘテロ接合性喪失（ＬＯＨ）」および１つの各標的化遺伝子座でＲＵＮＸ１マーカーが組み込まれた系統が見出され、これは、これらの変化がｇＲＮＡ／Ｃａｓ９駆動二本鎖切断によって引き起こされたことを示唆した。しかし、２段階編集プロセス後の大部分の系統は、そのような変化を有さなかった。これらの変化がｇＲＮＡ／Ｃａｓ９切断によって誘導されたと仮定すると、そのような変化は、操作されたヌクレアーゼを用いた他の編集戦略を用いても起こる可能性が高い。多くの場合にゲノム完全性を調べるために行われるＧバンド解析は、コピー中立性ＬＯＨを検出することができず、したがって、高密度ＳＮＰアレイ解析を用いなかった以前の研究においては見落とされていた可能性がある。オンターゲット部位の周りの高密度ＳＮＰアレイを用いたＣＮＶ解析が、ゲノム編集細胞を用いる機能解析または臨床細胞療法の場合に特に推奨される。

これらの結果は、方法が、精密なかつスカーレスの様式で単一ヌクレオチド変化または大きなＤＮＡ断片のいずれかを導入するために用いられ得ることを実証する。他の方法とは対照的に、本発明者らの方法は、スカーレスゲノム編集において３種類の重要な利点をもたらす。第１に、本発明者らの方法は、（ＴＢＸ１編集において示されるように）同じクローンから十分に一致した同質遺伝子対照（ＷＴ）、ホモ接合性、およびヘテロ接合性の系統を生成する。編集プロセスは、ｈＰＳＣの表現型を変化させる可能性がある長期培養を必要とするため、元の系統と編集された系統との間の表現型の比較は、その獲得された変化のために誤解を招く場合がある。本発明者らの戦略は、同じクローンから同じ段階において様々な遺伝子型（ＷＴ、ヘテロ接合性、ホモ接合性）を生じることが容易であるように、第２の編集段階において極度に高いターゲティング効率を利用し、したがって、長期の培養によって誘導される変動性を低減させる。第２に、本発明者らの方法は、ｈＰＳＣにおいて発現されない遺伝子中へを含み、ｓｓＯＤＮ法を用いて組み込むことが可能ではない挿入物サイズである、より大きな導入遺伝子のスカーレス様式での導入を可能にする。他の方法が、例えば、レポーター遺伝子の組み込みを達成しているが、ｈＰＳＣにおいて発現される遺伝子中へだけである。ＲＵＮＸ１およびＧＦＩ１での本発明者らの編集は、ｈＰＳＣにおいて発現されない遺伝子でのスカーレスのマーカー組み込みの例である。第３に、本発明者らの方法は、切断から編集までの距離が長い遺伝子座で効率的に働き、これは、他の方法を用いて以前に達成されていなかった特性であった。例えば、Ｂ２Ｍ遺伝子座について、本発明者らは、６３塩基対の切断から編集までの距離で、本発明者らのマーカーの８０％の標的化された組み込みを達成した。切断から編集までの距離のこの延長は、ｈＰＳＣにおいて達成され得るスカーレス編集の範囲を有意に増大させる（図１２）。マーカー選択およびその後のマーカー除去を用いることは、第１および第２両方の編集段階の効率を増加させ、したがって、他の方法を用いて必要である数百の代わりに、５～１０クローンのみを解析することが必要であるシステムを作製した（表２）（上記のＰａｑｕｅｔ ｅｔ ａｌ．；Ｍｉｙａｏｋａ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １１，２９１－３（２０１４））。本発明者らは、加えて、蛍光マーカータンパク質に対するｓｈＲＮＡカセットを含めることによって、第１段階の編集プロセスの効率を改善し、それによって、ランダムな組み込みを伴うクローンが採取されることを低減させ、または排除すらした。第２ラウンドの編集について、濃縮されたマーカー細胞におけるターゲティング頻度は１００％であることができ、かつ常に１００％に近く、したがって、何百ものクローンの骨の折れるかつ面倒なスクリーニングおよび解析を排除する。この高い頻度は、以前にＣｒｅ－ｌｏｘＰベースの２段階編集でも用いられた（Ｘｉ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ． １６，１－１７（２０１５））、蛍光マーカーを用いることによって達成されるが、本発明者らの新規２段階法が現在まで失敗例なく働くことを可能にしている。加えて、陰性選択は、標的化された組み込みおよびランダムな組み込みの両方を伴う細胞を特定する陽性選択とは異なり、第１の段階で標的化細胞のみを濃縮するため、第２の編集段階での１００％ターゲティング頻度に寄与する。この合理化されたプロセスは、６～８週間でヘテロ接合性クローンおよびホモ接合性クローンの特定を結果としてもたらし、ヒトＰＳＣにおいて発現されない遺伝子座で達成され、したがって、高速かつ効率的であるために発現される標的部位を必要としないことを実証した。この高い効率は、代替法で必要とされる大きな労働力を要するコロニー採取、遺伝子型判定、およびシーケンシングの必要を排除する。要約すると、本発明者らの方法は、スカーレスゲノム編集を有するヒト多能性細胞を生じ、したがって疾患モデルおよび発生モデル、薬物スクリーニングツール、ならびに治療薬として幹細胞技術を進歩させる際の複数の障害に対処する。」（第５４頁第１７行～第６０頁第１８行）

（甲１－１３）「

［図：0001398220000001.jpg］

」（図２Ｃ）

（甲１－１４）「

［図：0001398220000002.jpg］

」（図２Ｄ）

２ 甲第３号証：eLife(2017)Vol.6,e27873

（甲３－１）「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びＡＡＶ６を使用したヒト造血幹細胞・前駆細胞の多重化遺伝子操作」（表題）

（甲３－２）「要約 遺伝子の正確かつ効率的な操作は、ヒト造血を管理する分子機構の理解ならびに血液及び免疫系の疾患の新規治療の開発に重要である。現在の方法は、細胞の混合集団中で容易にトラッキングすることができる複雑な遺伝子型の正確な操作を可能にするものではない。我々は、ｒＡＡＶ６ドナー送達とリボ核タンパク質（ＲＮＰ）として送達されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系とを組み合わせることによる、ヒト造血幹細胞・前駆細胞並びに初代ヒトＴ細胞における多重相同組み換え（ＨＲ）の方法について説明する。さらに、レポーター遺伝子の使用により、ＨＲにより改変された複数のアレルまたは部位を有する細胞のＦＡＣＳ精製及びトラッキングが可能になる。我々は、この方法がヒト造血遺伝子機能及びネットワークの研究だけでなく複雑な合成生物学の実施を含む広範な応用が可能であり、遺伝子工学的に作製された幹細胞ベースの画期的な治療の開発につながるであろうと考えている。」（要約）

（甲３－３）「ここに、我々は、ヒトＨＳＰＣとＴ細胞におけるＨＲを利用したゲノム編集法を報告する。本法では、前述の欠点が改善されており、複数の遺伝子座すべてが遺伝子ノックアウト又は遺伝子置換されたＨＳＰＣ又はＴ細胞を作り出して濃縮することが可能である。この方法によって造血及び免疫系疾患病態形成時の機能的な遺伝子ネットワークを明らかにすることが可能になり、本法と合成生物学の概念を組み合わせることで幹細胞ベースの新規治療法を生み出すことができると考えられる。」（第２頁下から第１７行～第１２行）

（甲３－４）「ＨＳＰＣにおける両アレル標的組み込み

この方法が、完全な機能的遺伝子ノックアウトに必要な両アレル遺伝子破壊を有するＨＳＰＣを濃縮するために使用し得るかどうかを決定するために、我々は、ＡＳＸＬ１遺伝子を標的化し、同時にＧＦＰ及びＢＦＰをコードするｒＡＡＶ６ドナーを提供した。エレクトロポレーション及び形質導入の４日後、ＡＡＶのみのサンプルの０．２％と比較して、細胞の１０．４％がＧＦＰ高及びＢＦＰ高について二重陽性であった（図２ａ）。同様に、種々の色の組合せを有する２つのｒＡＡＶ６ドナーを用いて３つの他の遺伝子（ＲＵＮＸ１、ＨＢＢ及びＣＣＲ５）を標的化する場合、二重陽性集団が見られた（図２－捕捉図１及び捕捉ファイル１ｃ）。エレクトロポレーションの４日後に選別された二重陽性細胞は、培養中で２週間超、９４％が二重陽性のままであった（図２ｂ）。単一細胞由来のメチルセルロースクローン由来のｇＤＮＡ上の「インアウトＰＣＲ」により、一方の導入遺伝子の１つのアレルへのオンターゲット組込み及び他方の導入遺伝子の第２のアレルへのオンターゲット組込みが確認された（図２ｃ）。我々は、次いで両アレル標的化アプローチを、他の血液細胞種へと拡張し、それによりＣＣＲ５標的化Ｃａｓ９ ＲＮＰによるエレクトロポレーション及びそれに次ぐＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙ ＣＣＲ５ ｒＡＡＶ６ドナーの形質導入後、ＧＦＰ高／ｍＣｈｅｒｒｙ高二重陽性細胞集団が観察され、これはＣＣＲ５遺伝子における両アレル組込みを示している（図２ｄ）。Ｔ細胞において、毒性と両アレル標的化は有意に相関していなかった（図２－補足図２）。全体として、これらの結果は両アレル相同組み換えを行った初代ヒトＨＳＰＣ及びＴ細胞を濃縮するための、ｒＡＡＶ６、Ｃａｓ９ ＲＮＰ及びＦＡＣＳの使用の有用性を示しており、これらは血液学的及び免疫学的な疾患を研究するため、または両方のアレルにおける遺伝子改変若しくは遺伝子ノックアウトを必要とするＨＳＰＣ若しくはＴ細胞治療を作製するために応用し得る。」（第３頁下から第８行～第５頁第２行）

（甲３－５）「

［図：0001398220000003.jpg］

図２．両アレルゲノム編集ＣＤ３４＋ヒト造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）の特定及び濃縮。（ａ）左、ＡＳＸＬ１の各アレルへの組込みのためのＧＦＰ及びＢＦＰをコードするｒＡＡＶ６ドナーを用いたＡＳＸＬ１についての両アレル標的化戦略を示す模式図。ＳＦＦＶプロモーターはレポーター発現を誘導する。中央、エレクトロポレーションの４日後の「ＡＡＶのみ」サンプルからのＦＡＣＳプロットを示し、これは、ＣＲＩＳＰＲ系を用いない細胞における低いエピソームレポーター発現（ＧＦＰ及びＢＦＰ）を示す。右、Ｃａｓ９ ＲＮＰ及び２つのｒＡＡＶ６ドナーの両方で処理したＣＤ３４＋ＨＳＰＣのＦＡＣＳプロットであり、ＡＳＸＬ１両アレル標的化を行ったＢＦＰ高／ＧＦＰ高二重陽性細胞の作製を強調している。（ｂ）ＨＳＰＣは、ＨＢＢの両方のアレル（ＧＦＰ及びｔｄＴｏｍａｔｏ ｒＡＡＶ６ドナーを用いたＣａｓ９ ＲＮＰ）において標的化されており、エレクトロポレーションの４日後に二重陽性細胞を選別し、１６日間、レポーター発現を解析しながら培養した。Ｓ．Ｅ．Ｍを表すエラーバーは存在するが、可視化できないほど小さい（Ｎ＝３の異なるＨＳＰＣドナー）。（ｃ）（ｅ）ＨＢＢアレルのそれぞれへの組込みを確認した後の、６つのメチルセルロース由来のクローンのＰＣＲ遺伝子決定を示すゲル画像。（ｄ）ヒト初代Ｔ細胞を３日間ＣＤ３／ＣＤ２８刺激した後、ＣＣＲ５標的化Ｃａｓ９ ＲＮＰを用いてエレクトロポレーションした後、それぞれＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙをコードする、２つのＣＣＲ５特異的なｒＡＡＶ６ドナーを用いて形質導入した。ＦＡＣＳプロットは、エレクトロポレーションの４日後におけるＧＦＰ高／ｍＣｈｅｒｒｙ高両アレル標的化頻度を示す。」（図２）

（甲３－６）「ＨＳＰＣにおける多重化相同組み換え

次いで、我々は、二遺伝子及び両アレル標的化アプローチを、ＡＳＸＬ１の両方のアレル（ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙ）並びにＲＵＮＸ１ｃの両方のアレル（ＢＦＰ及びＥ２－Ｃｒｉｍｓｏｎ）を同時に標的化する（四重アレル）ために組み合わせることができるかどうかを試験した（模式図については、図４－補足図１ａを参照のこと）。両方の遺伝子を標的とするＣａｓ９ ＲＮＰの送達、及び、それに次ぐ４つのｒＡＡＶ６ドナーの形質導入により、１．１％のＧＦＰ高／ｍＣｈｅｒｒｙ高／ＢＦＰ高／Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎｙ高四重陽性細胞が生じた（図４ａ及び図４－補足図１ｂ～ｃ）。ＨＢＢ及びＲＵＮＸ１ｃの４つのアレルの組合せすべてを標的化した場合、同様の四重陽性集団が明らかに見られた（図４－補足図１ｅ～ｈ及び補足ファイル１ｅ）。骨髄及び赤血球コロニーの混合が、ＡＡＶのみの対照と同等の頻度及び比率で形成された（図４ｂ）。コロニーの遺伝子型決定により、クローンの７８％における両方の部位での両方のアレルにおけるオンターゲット組込みが明らかになった（７３クローンを解析）（図４ｃ）。個々のコロニーのフローサイトメトリー解析により、高いレベルの４つのレポーター（ＢＦＰ／ＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ／Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎｙ）すべての発現が確認された（図４－補足図１ｄ）。合成生物学的な目的のために使用し得る、この濃縮した集団における遺伝子的な変化の総数は６であり：２つの内在性遺伝子の不活性化（各遺伝子の両方の）に加えて４つの異なる導入遺伝子の付加（我々の実験では異なる蛍光タンパク質をコードする４つの遺伝子で表される）である。したがって、この方法論は機能を喪失するためには両方のコピーが破壊されることが必要な遺伝子、例えば腫瘍抑制遺伝子の相互作用を研究するために使用し得る。

ＨＳＰＣにおける多遺伝子ＨＲにより、ヒト造血間の機能的な遺伝子ネットワークの特性決定が可能になるであろう（Ｂｙｓｔｒｙｋｈら、２００５）。我々の方法論は、ＨＳＰＣにおいて、２つの超える遺伝子において同時にＨＲを多重化し得ることを実証するために、我々は、ＨＢＢ、ＣＣＲ５及びＩＬ２ＲＧを標的化するＲＮＰを用いてＨＳＰＣをエレクトロポレーションした後、遺伝子特異的ｒＡＡＶ６ドナーを用いてそれらを形質導入した（ＨＢＢ－ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＣＣＲ５－ｔＮＧＦＲ、ＩＬ２ＲＧ－ＧＦＰ）（模式図については、図４－補足図２ａを参照のこと）。エレクトロポレーションの４日後において、ＨＳＰＣの４．１％が三重陽性であった（図４ｄ及び図４－補足図２ｂ）。この集団由来の骨髄及び赤血球コロニー由来のｇＤＮＡ上の「インアウトＰＣＲ」により、７８％（２７クローンを解析）が、３部位すべてにおいて組込みイベントを有していることが示され、これは、各標的化部位における少なくとも単一アレルの組込みを示している（図４ｅ）。さらなる解析により、三遺伝子組込みを有するこれらのクローンの８５％が、両アレル組込み又はほとんどが破壊的である非組込みアレル上のＩＮＤＥＬのいずれかにより、すべてのアレル上で改変されていることが示された（補足ファイル１ｄ）。これらのデータにより、方法論が多重化ＨＲを有するＨＳＰＣについて効率的に濃縮することができることが確認されている。３つの遺伝子（ＲＵＮＸ１／ＨＢＢ／ＡＳＸＬ１）の他の組合せの標的化は、２．９％の三重陽性細胞を示し（図４－補足図２ｃ～ｅ）、合わせると、三遺伝子標的化実験により、平均４．５％の三重陽性細胞が、最大１４％の頻度で得られた（Ｎ＝５）（補足ファイル１ｅ）。多重化ＨＲが、ＨＳＰＣにおいて、細胞老化又は一遺伝子又は二遺伝子標的化よりも多くの細胞死を引き起こすかどうかを試験するために、標的化の３日後における細胞死及びアポトーシス比率及び標的化の１０日後（選別の７日後に相当）までの増殖を評価した。改変及び非改変細胞を比較して同等の増殖速度（データは示さない）、及び１つの遺伝子の場合と比較して３つの遺伝子を標的化した場合のごくわずかの統計学的に有意ではない細胞生存率の低下（ｐ＝０．３３３）を観察した（図４－補足図３）。最終的に、我々は、四遺伝子ＨＲ（ＨＢＢ、ＣＣＲ５、ＡＳＸＬ１、ＲＵＮＸ１）についてＨＳＰＣを標的化し、培養中で４日後に、細胞の１％が４つのレポーターすべてについてレポーター高陽性であることを見出した（図４ｆ）。レポーター遺伝子の他の組合せを用いて同一の４つの遺伝子を標的化することにより、全細胞集団において０．４１％及び０．７８％の四遺伝子標的化頻度が生じた（補足ファイル１ｅ）。衝撃的なことに、三遺伝子ＨＲを有するＨＳＰＣの４１～７１％が四遺伝子ＨＲを起こしており、このことは、多重化ＮＨＥＪについての近年の知見とは対照的に、異なる遺伝子におけるＨＲイベントは互いに独立したものではない可能性を示している（Ｈｕｌｔｑｕｉｓｔら、２０１６）。ｒＡＡＶベクターは、ＮＨＥＪを介してＤＳＢにおいて捕捉することができるため（Ｍｉｌｌｅｒら、２００４）、標的化試験に非相同ｒＡＡＶドナーを含めることによって、捕捉イベントの頻度を検出することを目的とする実験を行った。我々は、レポーター高細胞の８９～９８％がオンターゲット相同組み換えによるものであることを見出し、このことによりＡＡＶ捕捉の比率が比較的低いことが確認された（図４－補足図４）。」（第７頁下から第２０行～第９頁第２９行）

（甲３－７）「

［図：0001398220000004.jpg］

図４．ＣＤ３４＋ヒト造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）における多重化相同組み換え。（ａ）ＨＳＰＣをＡＳＸＬ１及びＲＵＮＸ１を標的化するＣａｓ９ ＲＮＰによりエレクトロポレーションした後、ＡＳＸＬ１についての２つのドナー（ｍＣｈｅｒｒｙ及びＧＦＰ）及びＲＵＮＸ１についての２つのドナー（Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎｙ及びＢＦＰ）によりｒＡＡＶ６形質導入した。四重アレル標的化したＨＳＰＣを、ｍＣｈｅｒｒｙ高／ＧＦＰ高／ＢＦＰ高／Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎｙ高として特定した（Ｎ＝３、補足ファイル１ｅを参照のこと）。（ｂ）（（ａ）と同様に）ＲＵＮＸ１及びＡＳＸＬ１についての両方のアレルにおいて改変された細胞をメチルセルロースアッセイに供し（３つ組）、選別の１４日後に、形態に基づいてＢＦＵ－Ｅ、ＣＦＵ－Ｍ、ＣＦＵ－ＧＭ又はＣＦＵ－ＧＥＭＭとスコア付けした。（ｃ）ＰＣＲをコロニー由来のｇＤＮＡ上で行い、両方の遺伝子における標的化組込みを検出した。７３の個々のコロニーを解析した。三重アレル組み込みしたコロニーについての色識別は次のとおりである。灰色：ＲＵＮＸ１両アレル／ＡＳＸＬ１単一アレル；白色：ＲＵＮＸ１単一アレル／ＡＳＸＬ１両アレル。（ｄ）ＨＳＰＣの三遺伝子標的化のために、細胞をＩＬ２ＲＧ、ＨＢＢ及びＣＣＲ５を標的化するＲＮＰエレクトロポレーションした後、３つの遺伝子のそれぞれに相同の３つのｒＡＡＶドナーの形質導入を行った（ＩＬ２ＲＧ－ＧＦＰ、ＨＢＢ－ｔｄＴｏｍａｔｏ及びＣＣＲ５－ｔＮＧＦＲ）。三遺伝子標的化細胞を、３つのレポーターすべてについてレポーター高として特定した（Ｎ＝３、補足ファイル１ｅを参照のこと）。（ｅ）（ｄ）における三重陽性細胞からのメチルセルロースクローンを遺伝子型決定ＰＣＲに供し、ゲル画像は、９／１１のコロニーにおける３つの遺伝子すべてにおいて標的化組み込みしたコロニーを示す（ＧＦＰはコロニー６においてかすかなバンドを示していることに留意されたい）。（ｆ）左、４つの異なる遺伝子（ＨＢＢ、ＲＵＮＸ１、ＡＳＸＬ１及びＣＣＲ５）を同時に標的化する（四遺伝子）戦略を示す模式図。４つの異なる遺伝子を、４つの異なるＣａｓ９ ＲＮＰによるエレクトロポレーション、それに次ぐ、異なるレポーターによりそれぞれ遺伝子を標的化する４つの異なるｒＡＡＶ６ドナーによる形質導入により標的化する。右、上述の４つの遺伝子における四遺伝子標的化は、４つのレポーターすべてについてレポーター高として特定した（Ｎ＝３、補足ファイル１ｅを参照のこと）。」（図４）

第６ 当審の判断

１ 令和４年３月３１日付け取消理由通知に記載した取消理由について

（１）特許法第２９条第１項第３号及び第２９条第２項（甲第３号証を主引用例とする新規性欠如及び進歩性欠如）

ア 本件発明１について

上記記載事項（甲３－５）の図２ａ中の「ＬＨＡ」、「ＲＨＡ」は、それぞれ、「左ホモロジーアーム」、「右ホモロジーアーム」を表し、「ＧＦＰ」、「ＢＦＰ」は、それぞれ、「ＧＦＰ遺伝子」、「ＢＦＰ遺伝子」を表す。また、上記記載事項（甲３－５）の図２ａ中の「ｃｈｒ．２０」は、「第２０番染色体」を表す。

上記記載事項（甲３－１）～（甲３－５）から、甲第３号証には、

「染色体ゲノムの２つのアレルが改変された単離されたヒト造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）を作製する方法であって、

Ｃａｓ９ ＲＮＰと、左ホモロジーアーム、ＧＦＰ遺伝子及び右ホモロジーアームを含むドナーＤＮＡ、左ホモロジーアーム、ＢＦＰ遺伝子及び右ホモロジーアームを含むドナーＤＮＡを、２つのアレルを含む単離された細胞に導入して、前記２つのアレルそれぞれにＧＦＰ遺伝子、ＢＦＰ遺伝子を導入した後、

前記２つのアレルに対して、左ホモロジーアーム、ＧＦＰ遺伝子及び右ホモロジーアームを含むドナーＤＮＡ、左ホモロジーアーム、ＢＦＰ遺伝子及び右ホモロジーアームを含むドナーＤＮＡがそれぞれ相同組み換えすることによって、当該２つのアレルにそれぞれＧＦＰ遺伝子、ＢＦＰ遺伝子が導入され、導入されたＧＦＰ遺伝子、ＢＦＰ遺伝子のすべてを発現する単離された細胞を選択する、方法。」の発明が記載されていると認められる。

甲第３号証に記載された発明の「Ｃａｓ９ ＲＮＰ」は、本件発明１の「前記染色体ゲノムの２つ以上のアレル中の標的領域を標的とし、当該標的領域を切断することができる配列特異的核酸切断分子を含むゲノム改変システム」に相当し、甲第３号証に記載された発明の「左ホモロジーアーム、ＧＦＰ遺伝子及び右ホモロジーアームを含ドナーＤＮＡ」及び「左ホモロジーアーム、ＢＦＰ遺伝子及び右ホモロジーアームを含むドナーＤＮＡ」は、本件発明１の「標的領域の上流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する上流ホモロジーアームと、前記標的領域の下流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する下流ホモロジーアームとを有し、かつ、上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームの間に、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子の塩基配列を含む選択マーカー用ドナーＤＮＡ」に相当する。

また、甲第３号証に記載された発明のＧＦＰ遺伝子、ＢＦＰ遺伝子は、相互に区別可能に異なるポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子であり、甲第３号証に記載された発明のドナーＤＮＡの種類数は、ゲノム改変の対象とするアレルの数と同数以上である。

そして、甲第３号証に記載された発明の「ヒト造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）」は、受精卵でない細胞であることは明らかである。

そうすると、本件発明１と甲第３号証に記載された発明とを対比すると、

両者は、

「染色体ゲノムの２つ以上のアレルが改変された単離された細胞を作製する方法であって、

（ａ）下記（ｉ）及び（ｉｉ）を、２つ以上のアレルを含む単離された細胞（但し、受精卵を除く）に導入して、前記２つ以上のアレルそれぞれに選択マーカー遺伝子を導入する工程と、

（ｉ）前記染色体ゲノムの２つ以上のアレル中の標的領域を標的とし、当該標的領域を切断することができる配列特異的核酸切断分子を含むゲノム改変システム、

（ｉｉ）２種以上の選択マーカー用ドナーＤＮＡであって、それぞれが前記標的領域の上流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する上流ホモロジーアームと、前記標的領域の下流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する下流ホモロジーアームとを有し、かつ、上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームの間に、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子の塩基配列を含み、前記２種以上の選択マーカー用ドナーＤＮＡは、相互に区別可能に異なる選択マーカー遺伝子をそれぞれ有し、前記ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子は、選択マーカー用ドナーＤＮＡの種類毎に固有であり、前記選択マーカー用ドナーＤＮＡの種類数は、ゲノム改変の対象とする前記アレルの数と同数以上である、２種以上の選択マーカー用ドナーＤＮＡ、

（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記２以上のアレルに対して異なる種類の選択マーカー用ドナーＤＮＡがそれぞれ相同組み換えすることによって、当該２以上のアレルにそれぞれ区別可能に異なる固有の選択マーカー遺伝子が導入され、導入された当該区別可能に異なるポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子のすべてを発現する単離された細胞を選択する工程（ポジティブ選択のための工程）と、

を含む、方法。」に係る発明である点で一致し、以下の点で相違する。

（相違点１）本件発明１は、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子は、薬剤耐性遺伝子であり、かつ、２種以上の選択マーカー用ドナーＤＮＡがそれぞれ、前記上流ホモロジーアームと前記下流ホモロジーアームの間に、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子とネガティブ選択用のマーカー遺伝子と標的配列とを有し、（ｃ）前記工程（ｂ）の後、下記（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を選択された細胞に導入して前記２以上のアレルに組換え用ドナーＤＮＡを導入する工程と、（ｉｉｉ）前記標的配列を標的とし、当該標的配列を切断することができる配列特異的核酸切断分子、又は前記配列特異的核酸切断分子をコードするポリヌクレオチドを含むゲノム改変システム、（ｉｖ）所望の塩基配列を含む組換え用ドナーＤＮＡであって、前記標的領域の上流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する上流ホモロジーアームと、前記標的領域の下流側の塩基配列と相同組換え可能な塩基配列を有する下流ホモロジーアームを有する、組換え用ドナーＤＮＡ、（ｄ）前記工程（ｃ）の後、前記ネガティブ選択用のマーカー遺伝子を発現しない細胞を選択する工程（ネガティブ選択のための工程）と、を含むのに対し、甲第３号証に記載された発明は、そのような特定はされていない点。

（相違点２）本件発明１は、標的領域が１０ｋｂｐ以上の長さを有するのに対し、甲第３号証に記載された発明は、そのような特定はされていない点。

相違点１について検討する。

甲第１号証には、選択マーカー遺伝子として、薬剤耐性遺伝子を用いることが記載されている（上記記載事項（甲１－５））が、選択マーカー遺伝子として、相互に区別可能に異なるポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子を用いることは、何ら記載されておらず、また、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子に加えて、ネガティブ選択用のマーカー遺伝子を用い、選択マーカー用ドナーＤＮＡとして、上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームの間に、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子とネガティブ選択用のマーカー遺伝子とを有するものを用い、ネガティブ選択用のマーカー遺伝子を発現しない細胞を選択することは何ら記載されていないから、甲第１号証の記載が、甲第３号証に記載された発明において、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子として、薬剤耐性遺伝子を用い、選択マーカー用ドナーＤＮＡとして、上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームの間に、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子とネガティブ選択用のマーカー遺伝子とを有するものを用い、前記工程（ｃ）の後にネガティブ選択用のマーカー遺伝子を発現しない細胞を選択する工程を採用することの動機付けになるとはいえない。また、甲第４～７号証及び引用文献Ａが、甲第３号証に記載された発明において、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子として、薬剤耐性遺伝子を用い、選択マーカー用ドナーＤＮＡとして、上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームの間に、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子とネガティブ選択用のマーカー遺伝子とを有するものを用い、前記工程（ｃ）の後にネガティブ選択用のマーカー遺伝子を発現しない細胞を選択する工程を採用することの動機付けになるとはいえない。

よって、甲第１、４～７号証及び引用文献Ａの記載から、甲第３号証に記載された発明において、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子として、薬剤耐性遺伝子を用い、選択マーカー用ドナーＤＮＡとして、上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームの間に、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子とネガティブ選択用のマーカー遺伝子とを有するものを用い、前記工程（ｃ）の後にネガティブ選択用のマーカー遺伝子を発現しない細胞を選択する工程を採用することは、当業者が容易に想到し得ることとはいえない。

したがって、本件発明１は、相違点２について検討するまでもなく、甲第３号証に記載された発明とはいえないし、また、甲第３号証に記載された発明及び甲第１、４～７号証、引用文献Ａに記載された事項に基いて当業者が容易に発明をすることができたものとはいえない。

イ 本件発明２について

本件発明２は、本件発明１の発明特定事項と同様の発明特定事項を含むものであり、上記相違点１、２で甲第３号証に記載された発明と相違するから、本件発明１と同様の理由により、甲第３号証に記載された発明とはいえないし、また、甲第３号証に記載された発明及び甲第１、４～７号証、引用文献Ａに記載された事項に基いて当業者が容易に発明をすることができたものとはいえない。

ウ 本件発明３～２８について

本件発明３～２８は、本件発明１、２を直接的又は間接的に引用するものであるから、本件発明１、２と同様の理由により、甲第３号証に記載された発明とはいえないし、また、甲第３号証に記載された発明及び甲第１、４～７号証、引用文献Ａに記載された事項に基いて当業者が容易に発明をすることができたものとはいえない。

（２）特許異議申立人の意見について

特許異議申立人は、令和４年１１月１７日付け意見書において、本件訂正発明は、選択マーカー遺伝子として、薬剤耐性遺伝子を用いることが記載されている（上記記載事項（甲１－５））から、甲第１号証に記載された発明であり、依然として新規性を有しない旨主張している。

しかしながら、特許異議申立人も、特許異議申立書において、「甲第１号証には、２つ以上のアレルそれぞれに導入される選択マーカー遺伝子が、相互に区別可能に異なることが明記されていない」と述べているように、甲第１号証には、選択マーカー遺伝子として、相互に区別可能に異なるポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子を用いることは、何ら記載されておらず、また、甲第１号証に具体的に記載されている蛍光マーカーを用いた方法は、蛍光強度の強さの差異で選択する方法であるから、甲第１号証に薬剤耐性遺伝子を用いることが例示されている（上記記載事項（甲１－５））としても、本件訂正発明が甲第１号証に記載されているとはいえず、特許異議申立人の上記主張は採用できない。

また、特許異議申立人は、同意見書において、ネガティブ選択工程は甲第１号証に記載されているから、甲第３号証に記載されたポジティブ選択工程を含む方法の発明において、甲第１号証に記載されたネガティブ選択工程を組み合わせることは、当業者が容易に想到し得ることである旨主張している。

しかしながら、甲第１号証には、「ドナーポリヌクレオチドに選択マーカー発現カセットが含まれることにより、第１のＨＤＲ段階によって生成される遺伝子改変細胞を、陽性選択によって単離することが可能である。第２のＨＤＲ段階において、第２のドナーポリヌクレオチドが、第１のＨＤＲ段階において生成された遺伝子改変細胞から選択マーカー発現カセットを欠失させるために用いられる。第２のドナーポリヌクレオチドは、選択マーカー発現カセットの欠失を含む以外は第１のＨＤＲ段階におけるゲノムＤＮＡ中への第１のドナーポリヌクレオチドの組み込みによって改変されるような標的ゲノム配列に対して相補的な配列を含む。それ故、標的ゲノム遺伝子座での第２のドナーポリヌクレオチドの組み込みは、発現カセットを除去する。選択マーカーカセットが除去されている遺伝子改変細胞は、陰性選択に基づいて単離することができる。」と記載されている（上記記載事項（甲１－８））ものの、上記記載は、選択マーカーとして、１種類の選択マーカーを用いて、陽性選択及び陰性選択を行うことを教示しているだけで、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子に加えて、ネガティブ選択用のマーカー遺伝子を用い、選択マーカー用ドナーＤＮＡとして、上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームの間に、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子とネガティブ選択用のマーカー遺伝子とを有するものを用い、ネガティブ選択用のマーカー遺伝子を発現しない細胞を選択することは、甲第１号証には何ら記載されていないから、特許異議申立人の上記主張は採用できない。

２ 取消理由通知書で採用しなかった申立理由について

（１）特許法第２９条第１項第３号及び第２９条第２項（甲第１号証を主引用例とする新規性欠如及び進歩性欠如）

甲第１号証には、選択マーカー遺伝子として、相互に区別可能に異なるポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子を用いることは記載も示唆もされていないから、本件発明１～２８は、甲第１号証に記載された発明とはいえない。

また、上記１（２）で述べたように、甲第１号証の記載事項（甲１－８）の記載は、選択マーカーとして、１種類の選択マーカーを用いて、陽性選択及び陰性選択を行うことを教示しているだけで、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子に加えて、ネガティブ選択用のマーカー遺伝子を用い、選択マーカー用ドナーＤＮＡとして、上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームの間に、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子とネガティブ選択用のマーカー遺伝子とを有するものを用い、ネガティブ選択用のマーカー遺伝子を発現しない細胞を選択することは記載も示唆もされていない。また、甲第３～７号証にも、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子に加えて、ネガティブ選択用のマーカー遺伝子を用い、選択マーカー用ドナーＤＮＡとして、上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームの間に、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子とネガティブ選択用のマーカー遺伝子とを有するものを用い、ネガティブ選択用のマーカー遺伝子を発現しない細胞を選択することは記載も示唆もされていない。

よって、甲第３～７号証の記載から、甲第１号証に記載された発明において、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子として、薬剤耐性遺伝子を用い、選択マーカー用ドナーＤＮＡとして、上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームの間に、ポジティブ選択用の選択マーカー遺伝子とネガティブ選択用のマーカー遺伝子とを有するものを用い、前記工程（ｃ）の後にネガティブ選択用のマーカー遺伝子を発現しない細胞を選択する工程を採用することは、当業者が容易に想到し得ることとはいえない。

したがって、本件発明１～２８は、甲第１号証に記載された発明とはいえないし、また、甲第１号証に記載された発明及び甲第３～７号証に記載された事項に基いて当業者が容易に発明をすることができたものとはいえない。

第７ むすび

以上のとおりであるから、本件請求項１～２８に係る特許は、取消理由通知に記載した取消理由及び特許異議申立の理由によっては、取り消すことはできない。また、他に本件請求項１～２８に係る特許を取り消すべき理由を発見しない。

よって、結論のとおり決定する。