2025-700745

特許第７６３１３８６号発明「Ｌ－グルホシネートを作製する方法」の特許異議申立事件について、次のとおり決定する。

結 論 特許第７６３１３８６号の請求項１に係る特許を維持する。

理 由 第１ 手続の経緯及び証拠方法 １ 手続の経緯 特許第７６３１３８６号（以下「本件特許」という。）の請求項１に係る特許についての出願は、平成２９年２月２８日（優先権主張 ２０１６年３月２日、２０１６年５月１６日、及び２０１６年１０月２６日 いずれも（ＵＳ）米国）を国際出願日とする特願２０１８－５４５８７１号の一部を令和３年２月２日に新たな特許出願（特願２０２１－１５２００号）とし、さらにその一部を令和５年１月２４日に新たな特許出願（特願２０２３－８４３９号）としたものであって、令和７年２月７日に特許権の設定登録がされたものである（特許掲載公報の発行日は、令和７年２月１８日である。）。 その後、本件特許の請求項１に係る特許に対して、令和７年７月１８日に特許異議申立人である白井 雅恵（以下、単に「申立人」という。）から特許異議申立書（以下、単に「申立書」という。）が提出され、特許異議の申立てがなされた。 第２ 本件発明 請求項１に係る発明（以下、「本件発明」という。）は、特許請求の範囲の請求項１に記載された、以下の事項によって特定されるとおりのものである。 「【請求項１】 Ｌ－グルホシネートを作製する方法であって、Ｄ－グルホシネートを、通気しながらＤ－アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）酵素と反応させて、ＰＰＯ（２－オキソ－４－（ヒドロキシ（メチル）ホスフィノイル）酪酸）を形成する工程、及びアンモニアを使用して、Ｌ－アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＬＡＡＤ）酵素によって、ＰＰＯをＬ－グルホシネートにアミノ化する工程を含み、前記方法がｅｘ ｖｉｖｏで行われる、前記方法。」 第３ 特許異議申立ての理由概要と証拠方法 １ 特許異議申立ての理由概要 申立人が申し立てた取消理由の概要は次のとおりである。 （１） 申立理由１（明確性要件違反；特許法第３６条第６項第２号） 請求項１中、「アンモニアを使用して、Ｌ－アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＬＡＡＤ）酵素によって、ＰＰＯをＬ－グルホシネートにアミノ化する工程を含み」との記載の「アンモニアを使用して」および「Ｌ－アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＬＡＡＤ）酵素によって」は使用方法を理解することができず不明確である。 （２） 申立理由２（補正要件違反；特許法第１７条の２第３項） 請求項１中、「アンモニアを使用して」との記載は令和６年７月９日付け手続補正書による補正によって追加されており、当該記載に関する補正の根拠が出願明細書に存在しない。 （３） 申立理由３（実施可能要件違反；特許法第３６条第４項第１号） 本件特許の明細書は本件発明を当業者が容易に実施可能なように記載されているとはいえず、本件特許明細書は、特許法第３６条第４項第１号の要件を満たしていない。 （４） 申立理由４（サポート要件違反；特許法第３６条第６項第１号） 本件発明は、特許明細書に実質的に開示された発明とはいえず、本件特許の請求項１は、特許法第３６条第６項第１号の要件を満たしていない。 （５） 申立理由５（進歩性；特許法第２９条第２項） 本件発明は、甲第７～１３号証に記載の発明に基づき、当業者が容易に発明することができたものであり、特許法第２９条第２項の規定に違反して特許されたものである。 （６） 申立理由６（進歩性；特許法第２９条第２項） 本件発明は、甲第１４号証に記載の発明に基づき、当業者が容易に発明することができたものであり、特許法第２９条第２項の規定に違反して特許されたものである。 ２ 証拠方法 申立人は、証拠方法として以下に挙げる甲第１号証～甲第１４号証を提出した。 （１）甲第１号証：特許７６３１３８６号公報（本件特許の特許掲載公報） （２）甲第２号証：特開２０２３－６１９５４号公報（特願２０２３－８４３９号の出願公開） （３）甲第３号証：特願２０２３－８４３９号における令和６年１０月９日付手続補正書 （４）甲第４号証：満倉浩一ら，生物工学会誌，2024，第102巻，第6号，pp.278-283 （４の２）甲第４号証の２：日本生物工学会ウェブサイト，２０２５年９月５日（印刷日），https://www.sbj.or.jp/sbj/sbj_vol102_no06.html （５）甲第５号証：Simon, R.C. et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2012, 51, pp.6713-6716 （５の２）甲第５号証の２：Wiley Online Library, ２０２５年９月５日（印刷日）, https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.201202375 （６）甲第６号証：特表２０２２－５３３４４４号公報 （７）甲第７号証：Hawkes, T. et al., Plant Biotechnology Journal, 2011, 9, pp.301-314 （７の２）甲第７号証の２：Wiley Online Library, ２０２５年９月５日（印刷日）, https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1467-7652.2010.00549.x （８）甲第８号証：農薬評価書 グルホシネ-ト（第４版、令和４年３月、食品安全委員会） （９）甲第９号証：Fang, J.M. et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1995, pp.967-978 （９の２）甲第９号証の２：J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1995, No.8の表紙 （１０）甲第１０号証：Gruber C.C. et al., Adv. Synth. Catal., 2006, 348, pp.1789-1805 （１０の２）甲第１０号証の２：Wiley Online Library, ２０２５年９月５日（印刷日）, https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adsc.200606158 （１１）甲第１１号証：Nakajima, N. et al., J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1990, pp.947-948 （１１の２）甲第１１号証の２：PUBLISHING, ２０２５年９月５日（印刷日）, https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/1990/c3/c399000fx049 （１２）甲第１２号証：国際公開第２００７／０１５５１１号 （１３）甲第１３号証：Wakayama, M. et al., Analytical Biochemistry, 1997, 250, pp.252-253 （１３の２）甲第１３号証の２：SCIENCE DIRECT, ２０２５年９月５日（印刷日）, https://www.sciencedirect.com/journal/analytical-biochemistry/vol/250/issue/2 （１４）甲第１４号証：特表２０１９－５０９７３４号公報 （特願２０１８－５４５８７１号の国内公表） 第４ 当審の判断 当審は、申立人が主張する上記の申立理由は、以下で示すようにいずれも理由がなく、ほかに取り消すべき理由も発見できないから、本件特許の請求項１に係る特許は、いずれも取り消すべきものではなく、維持すべきものと判断する。 １ 甲各号証の記載事項 第３の「２ 証拠方法」で挙げた、甲各号証の記載事項は以下のとおりである。英文で記載された甲号証に関しては、図表と当該図表中にある説明部分以外は訳文を示す。下線は当審で付した。 なお、甲第２～３号証は、それぞれ本件特許の出願公開及び審査時の手続補正書に関するものであり、甲第１４号証は本件特許の出願の原々出願の国内公表であって、申立理由１～６に関する当審の判断においては本件特許の特許掲載公報である甲第１号証の摘示で足りるので、記載事項の摘示を省略する。 また、甲第４号証の２、甲第５号証の２、甲第７号証の２、甲第９号証の２、甲第１０号証の２、甲第１１号証の２、及び甲第１３号証の２は、それぞれ、甲第４号証、甲第５号証、甲第７号証、甲第９号証、甲第１０号証、甲第１１号証、及び甲第１３号証の作成年月日を示すために提出されたものであり、申立理由１～６に関する当審の判断に直接的影響を及ぼすものではないため、記載事項の摘示を省略する。 （１） 甲第１号証 ア 段落０００４ 「【発明が解決しようとする課題】 【０００４】 したがって、活性Ｌ－グルホシネート形態のみ、または、主に活性Ｌ－グルホシネート形態が生産されるような方法が必要とされている。これまで、純粋なＬ－グルホシネート、または、Ｌ－グルホシネートに富んだＤおよびＬ－グルホシネートの混合物を生成する、費用対効果の高い方法は利用できなかった。本明細書では、Ｌ－グルホシネートの生産に関する新たな費用対効果の高い方法を記載する。」 イ 段落０００６ 「【０００６】 ＤＡＡＯ酵素は、反応を促進するために、活性を約３μｍｏｌ／分＊ｍｇまたはそれを超える増加された活性を有さなくてはならない。ＤＡＡＯ酵素は、当該技術分野で利用可能であり、プロセスを促進するのに必要な必須増加活性を有するように修飾されたり、変異を有することができる。……それぞれの場合において、酵素は、約３μｍｏｌ／分＊ｍｇに等しいか、もしくはそれを超える、約４μｍｏｌ／分＊ｍｇを超える、またはそれよりも高い活性を有する必要がある。野生型酵素は、酵素が上記のような活性レベルを有する限りは、本発明の方法において使用することができる。」 ウ 段落００２０～００２１ 「【００２０】 Ｉ．合成方法 Ｄ－グルホシネートの、Ｌ－グルホシネートへの変換方法が提供される。本明細書中に記載する方法は、低コストのＤおよびＬ－グルホシネートのラセミ混合物の原料を、Ｌ－グルホシネートに富んだより価値のある生成物に変換する手段を提供する。変換方法は、２工程を含み、それらは、１つまたは複数の別々の容器で行うことができる。第１工程は、Ｄ－グルホシネート（ＤおよびＬ－グルホシネートのラセミ混合物中に存在し得る）の、ＰＰＯ（２－オキソ－４－（ヒドロキシ（メチル）ホスフィノイル）酪酸）への酸化的脱アミノ化である。この工程は、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）酵素、Ｄ－アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＤＡＡＤ）酵素、または化学変換によって、触媒反応を進めることができる。第２の工程は、１つまたは複数のアミン供与体由来のアミン基を使用した、ＰＰＯの、Ｌ－グルホシネートへの特異的アミノ化である。かかるアミン供与体は、グルタメート、Ｌ－グルタメート、リジン、アラニン、イソプロピルアミン、ｓｅｃ－ブチルアミン、フェニルエチルアミン等から選択することができる。この工程は、トランスアミナーゼ（ＴＡ）酵素、Ｌ－アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＬＡＡＤ）酵素、または化学変換によって、触媒反応を進めることができる。本明細書中に記載する方法を使用して、実質的に精製されたＬ－グルホシネートの組成物を得ることができる。 【００２１】 図１に、Ｄ－グルホシネートをＬ－グルホシネートへ変換する例を記載している。上述するように、その方法は、２工程のプロセスを含む。図のように、第１工程は、Ｄ－グルホシネートの、ＰＰＯへの酸化的脱アミノ化であり、第２工程は、ＰＰＯの、Ｌ－グルホシネートへのアミノ化である。」 エ 段落００４３ 「【００４３】 本明細書に記載する方法の第２の工程は、トランスアミナーゼ（ＴＡ）酵素、Ｌ－アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＬＡＡＤ）酵素を使用するか、または化学的変換によるＰＰＯの、Ｌ－グルホシネートへの変換を含む。一実施形態では、その方法は、ＴＡによって触媒される反応である。ＰＰＯを基質として受容するのに必要とされる立体特異性を有するＴＡは、下記化学量論を用いて、ＰＰＯの、Ｌ－グルホシネートへのアミノ化を触媒する： ＰＰＯ＋アミン供与体 ⇒ Ｌ－グルホシネート＋ケト酸。」 オ 段落００５１ 「【００５１】 ＰＰＯの、Ｌ－グルホシネートへの変換を触媒するために使用される他の酵素として、ＰＰＯを基質として受容するＬＡＡＤ酵素またはイミン還元酵素が挙げられる。かかるＬＡＡＤ酵素は、下記化学量論を使用する： ＮＨ３＋還元受容体＋ＰＰＯ ⇒ Ｌ－グルホシネート＋Ｈ２Ｏ＋受容体。」 カ 実施例４～５（段落０１５４～０１５６） 「【０１５４】 実施例４：トランスアミナーゼ活性の実証 非限定的な例において、トランスアミノ化アッセイに関するＰＰＯの供給源は、ＤＡＡＯによってＰＰＯに変換されたＤ－グルホシネートまたはラセミＤ／Ｌ－グルホシネートであり得る。第１の工程では、３９ｍＭラセミＤ／Ｌ－グルホシネートを、０．５ｍｇ／ｍｌの精製した、Ｆ５８Ｋ、Ｍ２１３ＳであるＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓのＤＡＡＯおよび１０μｇ／ｍＬのカタラーゼとともに、５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ８の緩衝液中で、３０℃で２０時間インキュベートした。これにより、Ｄ－グルホシネートの大部分はＰＰＯに変換された。続いて、精製したＥ． ｃｏｌｉ ｇａｂＴを２０μｇ／ｍＬで添加して、Ｌ－グルタメートをアミン供与体として、５０ｍＭで添加した。適切な時点で試料を１０分間沸騰し、続く等量のアセトニトリルによる沈殿によって停止させた。個々の化学種は、Ｃｈｉｒｏｂｉｏｔｉｃ Ｔ２カラムを用いたＨＰＬＣで分解され、真正標準物質との比較によって定量化された。 【０１５５】 ＤＡＡＯの変異体およびトランスアミナーゼの組合せは、Ｄ－グルホシネートに対するＬ－グルホシネートに関して０％（すなわち、Ｄ－グルホシネートおよびＬ－グルホシネートの表現は等しい）で出発した鏡像異性体富化を、９２％の鏡像異性体富化に改善した。これらの結果により、Ｅ． ｃｏｌｉ ｇａｂＴがトランスアミナーゼ活性を有することが実証され、このアッセイを使用して、任意数の野生型および／または潜在的変異型トランスアミナーゼの活性を決定することができる。 【０１５６】 実施例５：単一器中でのラセミＤ／Ｌ－グルホシネートの脱ラセミ化 反応は、実施例４と同様に設定した。系（５．４５ｍＬ、３０℃）は、ｐＨ７．３のリン酸緩衝液にて実行した。ｐＨ８．０での５０ｍＭリン酸緩衝液は、アミノ酸添加を緩衝するには不十分であること、およびこの系におけるアミノ酸添加後の未調節ｐＨは、ｐＨ６．４であることが観察された。ｐＨは、容量５．４５ｍＬになるように１Ｍの塩基の塩Ｋ２ＨＰＯ４を使用して調節されていたため、添加による実際の初期基質濃度は２７５ｍＭになることを意味していた。反応の開始時に基本的に同時に下記試薬を添加した：Ｄ，Ｌ－グルホシネート２７１ｍｇ、グルタメート４２０ｍｇ、ＡＣ２６３ ＤＡＡＯ １５ｍｇ、カタラーゼ ５０μｇ、およびＥ． ｃｏｌｉ ｇａｂＴトランスアミナーゼ１．０ｍｇ。図２は、全ての試薬を添加すると、ほんのわずかのＰＰＯの蓄積を伴って、Ｄ－ＰＰＴ（Ｄ－グルホシネート）の量は、減少したことを示している。この結果は、ＲｇＤＡＡＯ／ＥｃｇａｂＴ酵素対によるＤ／Ｌ－グルホシネートの、Ｌ－グルホシネートへの効率的な脱ラセミ化を示している。」 キ 実施例６（段落０１５７～０１６５） 「【０１５７】 実施例６：ＤＡＡＯ酵素の改善の実証 上記で概略が述べられているタンパク質の変異誘発戦略を使用して、改良した変異体ＤＡＡＯ酵素を同定した。酵素は、以下に記載する手順に従ってアッセイされた。 【０１５８】 ストック溶液：…… 【０１５９】 反応ミックス：…… 【０１６０】 プロトコール：…… 【０１６１】 …… 【０１６２】 酵素動態を上記のように測定して、ミカエリスメンテングラフ上にプロットして、ＶｍａｘおよびＫＭを算出するのに使用した。変異体Ａｃ３０２（５４Ｖ、５８Ｑ、２１３Ｓ）に関して、Ｖｍａｘは、４．２μｍｏｌ／分＊ｍｇであった。 【０１６３】 上記のように多くの変異体ＤＡＡＯ酵素に関してこの分析を完了させたが、但し、混合物Ｃのストックは、ＤＡＡＯの０．２ｍｇ／ｍＬ溶液であり、ＤＡＡＯのこの最終反応濃度は、５０μｇ／ｍＬであった。 【０１６４】 表１で以下に示すように、変異体ＤＡＡＯ酵素は、幅広い活性を示した： 【０１６５】 【表１】 ［図：0001431158000001.jpg］ 」 ク 図１ 「【図１】 ［図：0001431158000002.jpg］ 」 （２） 甲第４号証 ア ２７９ページ右欄１１～２０行 「たとえば、ω－ＴＡによる１，５－ジケトンの位置・エナンチオ選択的モノアミノ化では，キラルアミノケトンが生成したのち，自発的環化によりキラル環状イミンを生成する（図４Ａ）。さらに，アラニンデヒドロゲナーゼ（ＡｌａＤＨ）とギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）を用いてアラニン再生系を構築することで，キラル環状イミンの効率的な合成にも成功している．続いて，Ｐｄ／Ｃを用いた環状イミンの水素化により２，６－二置換ピペリジンがジアステレオ選択的（＞９９％ｄｅ）に合成された１３）。」 イ 図４（２８０ページ） 「 ［図：0001431158000003.jpg］ 」 （３） 甲第５号証 ア ６７１３ページ左欄２１～２４行 「したがって、我々は２，６－ジケトン１をモデル基質として選択し、ω－トランスアミナーゼ（ω－ＴＡ；スキーム１）を用いた不斉位置選択的アミノ化の可能性を調べた。［９， １０］」 イ ６７１３ページ左欄２５～２７行 「最初に、基質濃度５０ｍｍでのジケトン１ａの変換について、さまざまな（Ｓ）－および （Ｒ）－立体選択的ω－トランスアミナーゼで試験した（表１）。」 ウ 表１（６７１３ページ） 「 ［図：0001431158000004.jpg］ 」 エ スキーム１（６７１３ページ右欄） 「 ［図：0001431158000005.jpg］ 」 オ ６７１３ページ右欄下から７行～下から３行 「アミンドナーとしてアラニンを用いると副生成物としてピルビン酸が生成し、これはアラニンデヒドロゲナーゼ（ＡｌａＤＨ）のシステムを用いて除去され、アラニンにリサイクルされた。全ての場合において、このシステムに対して完全な変換が達成された。」 （４） 甲第６号証 ア 実施例２（段落００８８～００９４） 「（実施例２）突然変異体酵素の比酵素活性の検出 【００８８】 基質溶液の調製：…… 【００８９】 酵素活性の検出方法：…… 【００９０】 単位酵素活性の定義：…… 特定の反応条件（３０℃）下で、１分間あたり１μｍｏｌのＮＡＤＰＨが減少するのに必要な酵素量。 【００９１】 比酵素活性とは、酵素タンパク質１ｍｇあたりに含まれる活性の単位であり、計算式：酵素活性／タンパク質含有量、単位はＵ／ｍｇ又はＵ／ｇである。結果は表４に示される。 【００９２】 ＣＮ１０８５８８０４５Ａからわかるように、野生型ＬｓＧｌｕＤＨ－ＷＴ（ＷＰ＿０１２２９３８１２．１）の酵素活性は単一部位突然変異体の酵素活性よりも遥かに低く、当業者は、野生型ＬｓＧｌｕＤＨ－ＷＴ（ＷＰ＿０１２２９３８１２．１）の比酵素活性も突然変異体よりも遥かに低いと結論づけることができるので、本発明では野生型ＬｓＧｌｕＤＨ－ＷＴ（ＷＰ＿０１２２９３８１２．１）に対して検出しなかった。 【００９３】 【表４】 ［図：0001431158000006.jpg］ 【００９４】 以下の実施例で使用されるＬ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼ粗酵素液の調製方法はいずれも上記の方法を採用する。」 （５） 甲第７号証 ア 要約（３０１ページ） 「除草剤グルホシネート（２－アミノ－４－（メチルホスフィニル）－ブタン酸）の不活性なＤ－エナンチオマーを、葯内で植物毒性のあるＬ－エナンチオマーに変換する化学的雄性不稔システムについて述べる。ＰＡＴ（Ｌ－グルホシネートＮ－アセチルトランスフェラーゼ）遺伝子を発現する大腸菌株を用いた発酵と、未反応のＤ－エナンチオマーをイオン交換法で培養液から精製することにより、ラセミ体から９８％を超えるエナンチオマー過剰率で高純度のＤ－グルホシネートを単離した。Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ由来のｄ－アミノ酸酸化酵素（ＤＡＡＯ）（ＥＣ １．４．３．３）の改変型（Ｆ５８Ｋ、Ｍ２１３Ｓ）を設計し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を行った結果、Ｄ－グルホシネートを効率的にその２－オキソ誘導体（２－オキソ－４－（メチルホスフィニル）－ブタン酸）に酸化することが明らかになった。タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）植物は、ＴＡＰ１タペートム特異的プロモーターの制御下でこの改変型酸化酵素を発現するように形質転換された。得られたトランスジェニック系統の多くは、７５ｇ／ｈａまたは２００ｇ／ｈａのＤ－グルホシネートを葉面散布した直後から２週間以上完全な雄性不稔性を示したが、明らかな植物毒性症状や雌性生殖能力の測定可能な低下は見られなかった。同様に、同じコンストラクトに加え、プラストシアニンプロモーターから発現したＰＡＴ遺伝子を含む植物は、ラセミ体グルホシネートの葉面散布後に雄の稔性が大幅に低下したが、雌の稔性は低下しなかった。したがって、精製されたｄ－グルホシネートまたは市販の除草剤の葉面散布と、改変型ＤＡＡＯの葯発現を組み合わせることで、実用的なＦ１雑種種子生産に必要な特性を備えた、費用対効果の高い条件付き化学的雄性不稔システムを提供できることが期待される。」 イ ３０２ページ右欄１６～２３行 「この酵素は、Ｄ－グルホシネートを２－オキソ－４－（メチルホスフィニル）－ブタン酸に効率的に酸化するように特別に設計された、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｔ）由来のＤ－アミノ酸酸化酵素（ＤＡＡＯ）の改変型（ＤＭＲｔＤＡＡＯ）である（図１）。この２－オキソ誘導体は、植物体内で内因性Ｌ－グルタミン酸トランスアミナーゼの活性を介して、迅速かつほぼ定量的にＬ－グルホシネートへ変換されるため、植物毒として作用する（Ｌｅａ ｅｔ ａｌ．， １９８４； Ｄｒｏｇｅ－Ｌａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。」 ウ 図１（３０３ページ左欄） 「 ［図：0001431158000007.jpg］ 」 エ ３０３ページ左欄１１行～右欄１０行 「この戦略を、Ｄ－アミノ酸を基質とし、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで発現した野生型ＲｔＤＡＡＯ酵素と改変ＲｔＤＡＡＯ酵素とを比較することによって検討した（表１）。野生型酵素はＤ－グルホシネートに対して検出可能な活性を示さず、アスパルテートに対しても、Ｄ－グルタミン酸に対しても最小限の活性しか示さなかったのに対し、いくつかの改変ＲｔＤＡＡＯはこれらの酸性基質の一部またはすべてに対して高レベルの活性を示した。位置２１３にメチオニンの代わりにセリンを有し、位置５８にヒスチジンまたは好ましくはリジンのいずれかを有する変異体（表１）は、Ｄ－グルホシネートを効率的に酸化した。さまざまな濃度のＤ－グルホシネートによる検定から、ＲｔＤＡＡＯのＦ５８Ｋ、Ｍ２１３Ｓ二重突然変異体（ＤＭＲｔＤＡＡＯ）のＫｍ値とＶｍａｘ値は、それぞれ１２ ｍＭおよび３．７μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇであることが示された。野生型およびＤＭＲｔＤＡＡＯの抽出物は、２５℃にて２４時間インキュベーションした後にも、それぞれ初期活性の７５％および４６％を保持しており、酵素の安定性に対する悪影響はわずかであると思われた。」 オ 表１（３０３ページ右欄） 「 ［図：0001431158000008.jpg］ 」 （６） 甲第８号証 ア 審議の経緯（ｉｉページ１～７行） 「＜審議の経緯＞ －第１版関係－ １９８４年６月１４日 初回農薬登録（グルホシネート） …… ２００７年６月２１日 農林水産省から厚生労働省へ農薬登録申請に係る連絡及び基準値設定依頼［新規（グルホシネートＰ）：かんきつ、なす、トマト等］」 イ ｖｉｉページ２～４行 「アミノ酸系除草剤である「グルホシネート」には光学異性体（Ｌ体及びＤ体）が存在し、ラセミ体であるグルホシネートと活性本体であるＬ体を選択的に含有するグルホシネートＰがある。」 ウ １－１１ページ「２．有効成分の一般名」、「６．構造式」 「 ［図：0001431158000009.jpg］ ［図：0001431158000010.jpg］ 」 エ ２－９ページ「２．有効成分の一般名」、「６．構造式」、「７．開発の経緯」 「 ［図：0001431158000011.jpg］ ［図：0001431158000012.jpg］ ７．開発の経緯 グルホシネートＰナトリウム塩は、明治製菓株式会社によって開発されたアミノ酸系除草剤である。グルタミン合成酵素阻害によりアンモニアが蓄積し、植物の生理機能を阻害して殺草活性を示すと考えられている。先に国内で登録されたグルホシネートが、光学異性体（Ｌ体及びＤ体）のラセミ体であるのに対して、グルホシネートＰナトリウム塩は活性本体であるＬ体を選択的に製造したものである。グルホシネートＰナトリウム塩は、我が国で２０１１年に農薬登録された。 第４版では、農薬取締法に基づく農薬登録申請（適用拡大：さとうきび）がなされている。」 （７） 甲第９号証 ア ９７３ページ右欄３２行～９７４ページ左欄４行 「図５は、ニコチンアミド依存性の別の酵素反応を示しており、Ｌ－グルタミン酸脱水素酵素を触媒とする還元アミノ化反応により、対応するケト酸からＬ－ホスフィノトリエンを合成する。Ｌ－ホスフィノトリエンは天然抗生物質ビラホスの有効成分である。ビラホスはグルタミン酸合成酵素を阻害し、除草剤として広く使用されている。この合成法はいくつか報告されている。ここで述べる還元アミノ化法は、高いエナンチオマー純度の生成物を与え、大規模プロセスにも適用可能であると考えられる。しかしながら、変換率は比較的低い。 イ 図５（９７４ページ） 「 ［図：0001431158000013.jpg］ 」 ウ ９７５ページ左欄１９行～右欄６行 「Ｌ－ホスフィノトリシンの合成 ４－（ヒドロキシメチルホスフィノイル）－２－オキソブタン酸は、以前に示されたようにメチルジクロロホスフィンから合成され、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（５０ｍｇ）およびグルコースデヒドロゲナーゼ（１０ｍｇ）を、グルコース（１７３ｍｇ）、塩化ナトリウム（０．３８ｇ）、ジチオトレイトール（１５ｍｇ）、塩化アンモニウム（０．５３３ｇ）、ＮＡＤ（１０ｍｇ）および４－（ヒドロキシメチルホスフィノイル）－２－オキソブタン酸（１５０ｍｇ）を含むリン酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ ７．５、５０ｍｍｏｌ ｄｍ－３；５０ｃｍ３）に添加した。反応混合物を室温で撹拌し、１ｍｏ１ ｄｍ－３水酸化アンモニウムを周期的に添加してｐＨを一定に維持した。さらに生成物が生成しないこと（６日間）によって反応が完了したとき、溶液を８０℃で１５分間加熱し、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、デカントした。上清を濃塩酸でｐＨ ２に酸性化し、そして４℃に一晩冷却した。得られた沈殿物を濾取し、エタノール－水から再結晶して、光学回転の比較によって測定したＬ－ホスフィノトリシン塩酸塩（４．５ｍｇ、２５％）、融点１９２－１９６℃； ［α］Ｄ１９ ＋２４．８５（ｃ ２，１ｍｏｌ ｄｍ－３ ＨＣｌ） ｛ｌｉｔ．、６５・６６ ｍｐ １９４－１９６℃および［α］Ｄ１９ ＋２１．４（ｃ １．４、１ｍｏｌ ｄｍ－３ ＨＣｌ）、８９．２％エナンチオマー過剰｝、６５・６６＞９９％エナンチオマー過剰を得た。１Ｈ ＮＭＲデータは以前に報告されたものと同じであった。」 （８） 甲第１０号証 ア １８０２ページ左欄８～１２行 「関連するアプローチにおいて、ｄ－アミノ酸オキシダーゼ、カタラーゼ、ロイシンデヒドロゲナーゼ、およびホルメートデヒドロゲナーゼからなるマルチ酵素システム（スキーム１８）を使用してｄｌ－メチオニンは効率的に脱ラセミ化されてｌ－エナンチオマーが得られる。」 イ スキーム１８（１８０２ページ左欄） 「 ［図：0001431158000014.jpg］ 」 （９） 甲第１１号証 ア スキーム１（９４７ページ左欄） 「 ［図：0001431158000015.jpg］ 」 イ 図１（９４７ページ右欄） 「 ［図：0001431158000016.jpg］ 」 ウ ９４８ページ左欄３～２８行 「著者らは、Ｄ－メチオニンが以下の条件下で最も効率的にＬ－エナンチオマーに変換されることを見出した。反応混合物は、ＤＬ－メチオニン（１００μｍｏｌ）、ＮＡＤＨ （１μｍｏｌ）、塩化アンモニウム（２５μｍｏｌ）、ギ酸ナトリウム（５００μｍｏｌ）、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ８．５、１００μｍｏｌ）、Ｓｉｇｍａから入手したＤ－アミノ酸オキシダーゼ（５ユニット）、Ｓｉｇｍａから入手したカタラーゼ（２ユニット）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ ＡＮ ２８－４由来のロイシンデヒドロゲナーゼ（１０ユニット）、およびＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ由来のギ酸デヒドロゲナーゼ（２ユニット）を最終容量１ｍｌ中に含んでいた（図１）。反応の最適温度は約３７℃であり、最適ｐＨは８．０～８．５であった。１０時間インキュベートした後、ＨＣＩを最終濃度１．０Ｍになるまで反応混合物に添加した。溶液をＤｏｗｅｘ ５０（Ｈ＋）カラム（１×１０ｃｍ）に適用し、Ｌ－メチオニンを１Ｍ ＮＨ４ＯＨで溶離した。Ｌ－メチオニンを含有する画分をプールし、少量まで濃縮し、次いで減圧下で蒸発乾固した。残渣を少量の熱８０％エタノールに溶解し、Ｌ－メチオニンを４℃で結晶化させた。 ダイセルクラウンパックカラム（０．４ ｉ．ｄ．×５０ｃｍ）を有するエナンチオ選択的ＨＰＬＣは、Ｄ－メチオニンが完全にＬ－エナンチオマー（＞９９％エナンチオマー過剰、ｅ．ｅ．）に変換されることを示した。Ｌ‐メチオニンの収率は、使用したＤＬ‐メチオニンに基づいて＞９５％であった。メチオニンのＤ－エナンチオマーは、エナンチオ選択的リガンド交換クロマトグラフィーまたはＤ－アミノ酸オキシダーゼ法によって検出されなかった。」 エ ９４８ページ右欄１～４行 「また、０．１Ｍ ＤＬ－アラニンをＬ‐エナンチオマー（＞９５％収率；１０時間で＞９９％収率）に変換し、０．１Ｍ ＤＬ－ロイシンをＬ‐エナンチオマー（９５％収率；２時間で９９％収率）に変換した。」 （１０） 甲第１２号証 ア 実施例１０（［０１６７］～［０１７４］） 「（実施例１０）形質転換体を利用したＬ－アミノ酸の合成 実施例６で得たＤ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１（ｐＣＤＡ００３）（ＦＥＲＭ ＢＰ－１０６３９）、およびＪＭ１０９（ｐＣＤＡ００３）（ＦＥＲＭ ＢＰ－１０６３８）を各培養液から遠心分離により集菌し、それぞれ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して超音波により菌体を破砕後、遠心分離し、上清を粗酵素液として回収した。また、後述する方法で得たギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体を培養液から遠心分離により集菌し、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して超音波により菌体を破砕後、遠心分離し、上清を粗酵素液として回収した。また、後述する方法で得たフェニルアラニン脱水素酵素活性を有する形質転換体、およびロイシン脱水素酵素活性を有する形質転換体を各培養液から遠心分離により集菌し、それぞれ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して超音波により菌体を破砕後、遠心分離し、上清を粗酵素液として回収した。それらの粗酵素液を、ＤＬ－フェニルアラニン、ＤＬ－４－フルオロ－フェニルアラニン、β－クロロ－ＤＬ－アラニン、ＤＬ－ノルバリン、またはＤＬ－ロイシンのそれぞれに作用させて、立体反転反応により対応するＬ－アミノ酸を合成した。 ギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体の培養液は次のようにして得た。ギ酸脱水素活性を有する形質転換体であるエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１（ｐＦＴ００２）（ＦＥＲＭ ＢＰ－７６７３）を、試験管内で滅菌した１０ｍｌの培地（トリプトン１６ｇ、イーストエキス１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、水１ｌ、滅菌前ｐＨ７）に接種して、３０℃で２４時間振とう培養した。また、後述する参考例１に示す方法で育種したフェニルアラニン脱水素酵素活性を有する形質転換体、および後述する参考例２に示す方法で育種したロイシン脱水素酵素活性を有する形質転換体の培養液のそれぞれは次のようにして得た。フェニルアラニン脱水素酵素活性を有する形質転換体およびロイシン脱水素酵素活性を有する形質転換体のそれぞれを、試験管内で滅菌した１０ｍｌの培地（トリプトン１６ｇ、イーストエキス１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、水１ｌ、滅菌前ｐＨ７）に接種して、３０℃で２４時間振とう培養した。 （１０－１）ＤＬ－フェニルアラニンからＬ－フェニルアラニンの合成 前記のＤ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１（ｐＣＤＡ００３）（ＦＥＲＭ ＢＰ－１０６３９）の培養液１０ｍｌ分、前記のフェニルアラニン脱水素酵素活性形質転換体の培養液１０ｍｌ分、前記のギ酸脱水素酵素活性形質転換体培養液１０ｍｌ分の各菌体を、遠心分離により集菌し、それぞれ１ｍｌの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離し、上清を粗酵素液として回収した。得られた粗酵素液をそれぞれ５０μｌ、ＤＬ－フェニルアラニン１０ｍｇ、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）２μｌ、ＮＡＤ＋０．１８ｍｇ、ギ酸アンモニウム７．０ｍｇ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．８５ｍｌを使用して、３０℃で１３時間反応した。反応液をＨＣｌＯ４水溶液（ｐＨ１．５）で５０倍希釈して、遠心上清をＨＰＬＣで分析し、アミノ酸を定量した。ＨＰＬＣ分析によるアミノ酸の定量は実施例７と同条件で実施した。その結果、対ラセミ体アミノ酸９５．６ｍｏｌ％の反応収率で、光学純度１００％ｅｅのＬ－フェニルアラニンが得られた。 （１０－２）ＤＬ－フェニルアラニンからＬ－フェニルアラニンの合成 前記のＤ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（ｐＣＤＡ００３）（ＦＥＲＭ ＢＰ－１０６３８）の培養液１０ｍｌ分、前記のフェニルアラニン脱水素酵素活性形質転換体の培養液１０ｍｌ分、前記のギ酸脱水素酵素活性形質転換体培養液１０ｍｌ分の各菌体を、遠心分離により集菌し、それぞれ１ｍｌの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離し、上清を粗酵素液として回収した。得られた粗酵素液をそれぞれ５０μｌ、ＤＬ－フェニルアラニン１０ｍｇ、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）２μｌ、ＮＡＤ＋０．１８ｍｇ、ギ酸アンモニウム７．０ｍｇ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．８５ｍｌを使用して、３０℃で１９時間反応した。反応液をＨＣｌＯ４水溶液（ｐＨ１．５）で１００倍希釈して、遠心上清をＨＰＬＣで分析し、アミノ酸を定量した。ＨＰＬＣ分析によるアミノ酸の定量は実施例７と同条件で実施した。その結果、対ラセミ体アミノ酸９５ｍｏｌ％の反応収率で、光学純度１００％ｅｅのＬ－フェニルアラニンが得られた。 （１０－３）ＤＬ－４－フルオロ－フェニルアラニンからＬ－４－フルオロ－フェニルアラニンの合成 上記実施例（１０－２）と同様に調製した各形質転換体の粗酵素液をそれぞれ５０μｌ、ＤＬ－４－フルオロ－フェニルアラニン１０ｍｇ、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）２μｌ、ＮＡＤ＋０．１８ｍｇ、ギ酸アンモニウム７．０ｍｇ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．８５ｍｌを使用して、３０℃で１９時間反応した。反応液をＨＣｌＯ４水溶液（ｐＨ１．５）で１００倍希釈して、遠心上清をＨＰＬＣで分析し、アミノ酸を定量した。ＨＰＬＣ分析は実施例（９－３）と同条件で実施した。その結果、対ラセミ体アミノ酸１０３ｍｏｌ％の反応収率で、光学純度１００％ｅｅのＬ－４－フルオロ－フェニルアラニンが得られた。 （１０－４）ＤＬ－ノルバリンからＬ－ノルバリンの合成 前記のＤ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（ｐＣＤＡ００３）（ＦＥＲＭ ＢＰ－１０６３８）の培養液１０ｍｌ分、前記のロイシン脱水素酵素活性形質転換体の培養液１０ｍｌ分、前記のギ酸脱水素酵素活性形質転換体培養液１０ｍｌ分の各菌体を、遠心分離により集菌し、それぞれ１ｍｌの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離し、上清を粗酵素液として回収した。得られたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（ｐＣＤＡ００３）（ＦＥＲＭ ＢＰ－１０６３８）の粗酵素液１００μｌ、ロイシン脱水素酵素活性形質転換体およびギ酸脱水素酵素活性形質転換体の各粗酵素液をそれぞれ５０μｌ、ＤＬ－ノルバリン５０ｍｇ、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）１０μｌ、ＮＡＤ＋０．８９ｍｇ、ギ酸アンモニウム１６．１ｍｇ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．８ｍｌを使用して、３０℃で３時間反応した。反応液を２ｍＭ ＣｕＳＯ４水溶液／メタノール＝１９／１で１００倍希釈して、遠心上清をＨＰＬＣで分析し、アミノ酸を定量した。ＨＰＬＣ分析は実施例（９－４）と同条件で実施した。その結果、対ラセミ体アミノ酸９５．６ｍｏｌ％の反応収率で、光学純度１００％ｅｅのＬ－ノルバリンが得られた。 （１０－５）ＤＬ－ロイシンからＬ－ロイシンの合成 上記１０－４と同様に調製したエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（ｐＣＤＡ００３）（ＦＥＲＭ ＢＰ－１０６３８）の粗酵素液３０μｌ、ロイシン脱水素酵素活性形質転換体の粗酵素液２５μｌ、およびギ酸脱水素酵素活性形質転換体の粗酵素液１００μｌ、ＤＬ－ロイシン５０ｍｇ、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）１０μｌ、ＮＡＤ＋０．８９ｍｇ、ギ酸アンモニウム１６．１ｍｇ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．８ｍｌを使用して、３０℃で６時間反応した。反応液をＭｉｌｌｉＱ水にて５０倍希釈後、１ＮＨＣｌにて反応を停止し、遠心上清をＨＰＬＣで分析し、アミノ酸を定量した。 ＨＰＬＣ分析は次に示す条件で実施した。カラム：ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＡ－５０００（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、住化分析センター社製）、溶離液：２ｍＭ ＣｕＳＯ４水溶液／２－プロパノ－ル＝１９／１、流速：０．９ｍｌ／ｍｉｎ．、カラム温度：３０℃、検出：２５４ｎｍ。その結果、対ラセミ体アミノ酸１０３．１ｍｏｌ％の反応収率で、光学純度１００％ｅｅのＬ－ロイシンが得られた。」 イ 比較例１（［０１９４］～［０１９６］） 「（比較例１）Ｄ－アミノ酸オキシダーゼの活性を有する形質転換体と、ロイシン脱水素酵素及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体とを利用したＬ－ノルバリンの合成 実施例６で得られた、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１（ｐＣＤＡ００３）（ＦＥＲＭ ＢＰ－１０６３９）を、滅菌した培地Ａに植菌後、３７℃で３０時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、脱イオン水にて菌体濃度が培養液の１０倍になるように懸濁した。懸濁液の一部を超音波処理にかけることにより菌体を破砕して、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼを含む粗酵素液を得た。また、後述する参考例４に示す方法で育種したロイシン脱水素酵素活性及びギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１（ｐＦＴＬＢ）を、滅菌した培地Ａに植菌後、３３℃で４８時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、脱イオン水にて菌体濃度が培養液の１０倍になるように懸濁した。懸濁液の一部を超音波により菌体を破砕して、ロイシン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素を含む粗酵素液を得た。 ラセミ体ノルバリン５０ｍｇに、上記エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１（ｐＣＤＡ００３）の菌体懸濁液を実施例１３の場合と同量、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１（ｐＦＴＬＢ）を実施例１３の場合と同量、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）１μｌ、ＮＡＤ０．３０ｍｇ、及びギ酸アンモニウム１６ｍｇを添加し、さらに５Ｍアンモニア水溶液を用いてｐＨを８．０に調整した後、脱イオン水を添加して１ｍｌになるよう反応液を調製した。この反応液を試験管に入れて３０℃にて振とうし、２Ｎ硫酸にて８．０にコントロールしながら９時間反応した。生成したＬ－ノルバリンの収率及び光学純度を実施例３と同様の方法にて分析した結果、ラセミ体に対し７８．３％の反応収率で、光学純度４７．９％ｅｅのＬ－ノルバリンが得られた。 また、各形質転換体の菌体懸濁液の代わりに粗酵素液を同量使用して同様の反応を行なった場合は、ラセミ体に対し７９．５％の反応収率で、光学純度１００％ｅｅのＬ－ノルバリンが得られた。この結果から、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼの活性を有する形質転換体と、ロイシン脱水素酵素及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体とを利用したＬ－ノルバリンの製造においては、未破砕の菌体を使用すると反応性が低下することが示された。」 （１１） 甲第１３号証 ア ２５２ページ左欄下から４行～最下行 「……Ｄ－Ａｓｐオキシダーゼ（Ｄ－ＡＯ）……マレイン酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）又はグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧｌＤＨ）……」 イ ２５２ページ右欄１０行～下から６行 「Ｄ－ＡＯとＭＤＨまたはＧｌＤＨのカップリングのためのアッセイシステムは以下の反応工程に基づく。 ［図：0001431158000017.jpg］ アッセイは以下のように行った。１００ｍｍｏｌのＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ ７．５）、０．１単位のＭＤＨ、２８単位のカタラーゼ、および１．０ｍｌの最終容量のＤ－ＡＯを含むＤ－Ａｓｐ測定用標準アッセイ混合物を、３０℃で５分間プレインキュベートした。適切な量のＤ－Ａｓｐ（最終濃度０～６０μＭ）を添加することにより酵素反応を開始した。１００μｍｏｌのＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ ７．５）、０．１μｍｏｌのＮＡＤＨ、０．５μｍｏｌのＡＤＰ、０．１μｍｏｌのＥＤＴＡ、２５μｍｏｌの塩化アンモニウム、２．５単位のＧｌＤＨ、２８単位のカタラーゼ、および０．１単位のＤ－ＡＯを含むＤ－Ｇｌｕ測定用標準アッセイ混合物を、１．０ｍｌの最終容量にて３０℃で５分間プレインキュベートした。適切な量のＤ－Ｇｌｕ（最終濃度０～６０μＭ）を添加することにより酵素反応を開始した。Ｄ－Ａｓｐ－またはＤ－Ｇｌｕをブランク用の水に置き換えた。両アッセイにおいて、１ｍｌの石英キュベットおよび１．０ｃｍの光路を使用し、温度計付きＨｉｔａｃｈｉ Ｕ－３０００分光光度計で３４０ｎｍのブランクに対して吸光度の変化を追跡した。」 ２ 申立理由１（明確性要件違反）についての判断 （１） 申立人の主張 申立人は、以下のとおり、本件発明の「アンモニアを使用して」との記載は、どのようにアンモニアを使用するのかが明確ではなく、その意味するところが不明確であると主張する。 ア 請求項１の「アンモニアを使用して、Ｌ－アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＬＡＡＤ）酵素によって、ＰＰＯをＬ－グルホシネートにアミノ化する工程を含み」との記載に関し、ＰＰＯをＬ－グルホシネートにアミノ化する工程での酵素反応の基質は、特許明細書ではアミン供与体と表記されており、アンモニアをアミン供与体として使用することについて特許明細書は何らの記載も含まない。アンモニアをアミン供与体として使用するとの記載がされていないことから、本件特許請求項１の「Ｌ－アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＬＡＡＤ）酵素によって」との記載は、「ＰＰＯをＬ－グルホシネートにアミノ化する」ことに直接関与するとは解されない。 イ 本件特許明細書の段落００５１には、 「ＰＰＯの、Ｌ－グルホシネートへの変換を触媒するために使用される他の酵素として、ＰＰＯを基質として受容するＬＡＡＤ酵素またはイミン還元酵素が挙げられる。かかるＬＡＡＤ酵素は、下記化学量論を使用する： ＮＨ３＋還元受容体＋ＰＰＯ ⇒ Ｌ－グルホシネート＋Ｈ２Ｏ＋受容体。」 と記載されているが、これはＬＡＡＤ酵素を使用する場合の化学量論を説明するものに過ぎず、ＮＨ３を実際に基質として使用することを意味するものではない。実際、実施例で示される酵素を用いたアミノ化反応では、ＮＨ３を基質（アミン供与体）として使用する例は記載されていない。 ウ 本件特許明細書では、アンモニアの使用に関して、Ｌ－グルホシネートの精製においてＬ－グルホシネートの不溶性塩を形成する際に塩基として使用すること（段落００６８）や、化学的還元的アミノ化によりケト基をアミン基へ変換する際にアミンとして使用すること（段落００４３）が記載されているが、これらの工程が請求項１に記載の工程に包含されているかは明らかではない。 （２） 判断 請求項１の「アンモニアを使用して、Ｌ－アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＬＡＡＤ）酵素によって、ＰＰＯをＬ－グルホシネートにアミノ化する工程を含み」との記載からみて、その意味するところは、「ＰＰＯをＬ－グルホシネートにアミノ化する工程」において、「Ｌ－アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＬＡＡＤ）酵素によって」アミノ化すること、及び、「アンモニアを使用」することを意図したものであるといえる。 この点に関し本件特許明細書をみると、段落００５１には「ＰＰＯの、Ｌ－グルホシネートへの変換を触媒するために使用される他の酵素として、ＰＰＯを基質として受容するＬＡＡＤ酵素」を用いる場合に関して、「ＮＨ３＋還元受容体＋ＰＰＯ ⇒ Ｌ－グルホシネート＋Ｈ２Ｏ＋受容体」という式が記載されており（第４の「１ 甲各号証の記載事項」（１）オ）、「ＮＨ３」がアンモニアの分子式であることは当業者に周知の事項である。そうすると、段落００５１の記載は、「ＰＰＯの、Ｌ－グルホシネートへの変換を触媒するために」「ＰＰＯを基質として受容するＬＡＡＤ酵素」を使用する際、アンモニアを使用してＰＰＯをＬ－グルホシネートへ変換すること、その際のアンモニアとＰＰＯ、及びＬ－グルホシネートが化学量論的に等量であることが記載されたものといえ、請求項１に関する上記理解と合致したものである。 一方、本件特許明細書において、「Ｌ－アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＬＡＡＤ）酵素」を用いたアミノ化で使用される「アミン供与体」として、段落００２０及び段落００４３に記載があり、段落００２０では一般的な「１つまたは複数のアミン供与体由来のアミン基を使用した、ＰＰＯの、Ｌ－グルホシネートへの特異的アミノ化」という記載とともに、アミン供与体について「グルタメート、Ｌ－グルタメート、リジン、アラニン、イソプロピルアミン、ｓｅｃ－ブチルアミン、フェニルエチルアミン等から選択することができる。」との記載があること、段落００４３では「ＰＰＯ＋アミン供与体 ⇒ Ｌ－グルホシネート＋ケト酸」という式中の記載があり（第４の「１ 甲各号証の記載事項」（１）ウ、エ）、アンモニアという化合物名やＮＨ３という分子式は記載されていない。しかし、上記記載のうち段落００２０で列挙されたアミン供与体は、「……等から選択することができる。」と記載されているように、アミン供与体の一部が例示的に列挙されたものであって、アンモニアがアミン供与体として使用できないことを示すものではなく、その他の記載もアミン供与体を特定の化合物に限定したり、特定の化合物を対象外とすることが明示されたものではない。 また、Ｌ－グルホシネートの精製工程や還元的アミノ化によるケト基のアミン基へ変換時に使用されるアンモニアは、Ｌ－アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＬＡＡＤ）酵素によるアミノ化とは異なる工程であることが明らかである。 よって、上記ア～ウの主張はいずれも理由がない。 （３）小括 以上のとおりであるから、申立人が主張する申立理由１（明確性要件違反）は、理由がない。 ３ 申立理由２（補正要件違反）についての判断 （１） 申立人の主張 申立人は、以下のとおり、請求項１において「Ｌ－アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＬＡＡＤ）酵素によって、ＰＰＯをＬ－グルホシネートにアミノ化する工程」において「アンモニアを使用」することは、出願時の明細書に補正の根拠がないので、該補正は新規事項を追加する補正に該当すると主張する。 ア 本件特許明細書の段落００２０には、「第２の工程は、１つまたは複数のアミン供与体由来のアミン基を使用した、ＰＰＯの、Ｌ－グルホシネートへの特異的アミノ化である。かかるアミン供与体は、グルタメート、Ｌ－グルタメート、リジン、アラニン、イソプロピルアミン、ｓｅｃ－ブチルアミン、フェニルエチルアミン等から選択することができる。この工程は、トランスアミナーゼ（ＴＡ）酵素、Ｌ－アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＬＡＡＤ）酵素、または化学変換によって、触媒反応を進めることができる。」と記載され、また、段落００５１にはＬＡＡＤ酵素の化学量論に関して説明をする記載があり、そこでＬＡＡＤ酵素によるアミノ化反応が、ＮＨ３、還元受容体、およびＰＰＯを１分子ずつ消費して、Ｌ－グルホシネート、Ｈ２Ｏ、および受容体を一分子ずつ生成する反応に相当することが説明されるが、これらの記載はＬＡＡＤ酵素の基質（アミン供与体）としてアンモニアを使用することについて記載するものではなく、ＬＡＡＤ酵素による反応の化学量論について説明がされているに過ぎない。 イ 酵素反応の技術分野では、例えば、２つの酵素を組み合わせて所望の生成物を得る製造方法が知られており、例えば甲第４号証、甲第５号証には、ω－トランスアミナーゼ（ω－ＴＡ）とアラニンデヒドロゲナーゼ（ＡｌａＤＨ）を組み合わせることにより、全体の化学量論として系中のＮＨ３を１分子消費して、アミンを一分子得られる反応について、ＡｌａＤＨはアミノ化反応を直接的には触媒せず、アンモニアもアミノ化反応の直接的な基質としては使用されていないものが記載されている。 ウ 本件特許明細書には、段落０１０９に、１つまたは複数のアミン供与体由来のアミン基を使用して、トランスアミナーゼ（ＴＡ）酵素によって、ＰＰＯをＬ－グルホシネートにアミノ化する工程について記載されているが、酵素反応の基質としてアンモニアを使用することについて一般的記載も実施例も特許明細書には含まれていない。 エ なお、例えばＬ－アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＬＡＡＤ）酵素がアミン供与体として明細書に特定された化合物以外の化合物を基質としうるとの公知情報は、補正の根拠とはなり得えない。 （２） 判断 本件特許明細書をみると、段落００５１には「ＰＰＯの、Ｌ－グルホシネートへの変換を触媒するために使用される他の酵素として、ＰＰＯを基質として受容するＬＡＡＤ酵素」を用いる場合に関して、「ＮＨ３＋還元受容体＋ＰＰＯ ⇒ Ｌ－グルホシネート＋Ｈ２Ｏ＋受容体」という式が記載されており（第４の「１ 甲各号証の記載事項」（１）オ）、これは本件特許出願当初の明細書においても同様の記載がある（甲第２号証の段落００５１）。そして、「ＮＨ３」がアンモニアの分子式であることは当業者に周知の事項である。 そうすると、段落００５１の記載は、「ＰＰＯの、Ｌ－グルホシネートへの変換を触媒するために」「ＰＰＯを基質として受容するＬＡＡＤ酵素」を使用する際、アンモニアを使用してＰＰＯをＬ－グルホシネートへ変換すること、その際のアンモニアとＰＰＯ、及びＬ－グルホシネートが化学量論的に等量であることが記載されたものといえ、「Ｌ－アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＬＡＡＤ）酵素によって、ＰＰＯをＬ－グルホシネートにアミノ化する工程」において「アンモニアを使用」することは本件特許の出願当初明細書に記載された事項といえる。 一方、申立人は甲第４号証や甲第５号証の記載を挙げ、アンモニアがアミノ化反応の直接的な基質としては使用されていないものが記載されている旨を主張するが、これらの文献に記載された反応式は本件特許明細書の段落００４３や００５１とは記載様式が異なるとともに、これらの文献で使用されている酵素はアミノ基の転移酵素であるトランスアミナーゼであり、Ｌ－アミノ酸の脱水素酵素であるＬＡＡＤとは反応様式が異なる。そうすると、甲第４号証や甲第５号証の記載を踏まえても、本件特許明細書段落００５１の「ＮＨ３」がアンモニアではないことや、アンモニアではあるが酵素反応に関与しないことが明らかであったとはいえない。 よって、上記ア～エの主張はいずれも理由がない。 （３）小括 以上のとおりであるから、申立人が主張する申立理由２（補正要件違反）は、理由がない。 ４ 申立理由３（実施可能要件）についての判断 （１） 申立人の主張 申立人は、以下のとおり、本件特許明細書は本件発明を当業者が容易に実施可能なように記載されているとはいえず、本件特許明細書は、特許法第３６条第４項第１号の要件を満たしていないと主張する。 ア 「アンモニアを使用して、Ｌ－アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＬＡＡＤ）酵素によって、ＰＰＯをＬ－グルホシネートにアミノ化する工程」について （ア） 本件特許の請求項１には「アンモニアを使用して、Ｌ－アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＬＡＡＤ）酵素によって、ＰＰＯをＬ－グルホシネートにアミノ化する工程を含み」との記載があり、「アンモニアを使用して」と具体的に記載される一方、本件特許明細書には、ＬＡＡＤによって、ＰＰＯをＬ－グルホシネートにアミノ化する工程について、具体的な試験結果は示されていない。また、実施例にはアミン供与体としてＬ－グルタメート、イソプロピルアミン、又はリシンを使用し、トランスアミナーゼを用いてＰＰＯをＬ－グルホシネートにアミノ化する工程が試験結果とともに記載されているが、請求項１に記載のアミノ化工程とは使用される酵素も基質も異なり、当業者であってもアンモニアを使用してＬＡＡＤによる酵素反応で所望のアミンを製造できるかどうかは理解することができない。 （イ） 甲第６号証で、野生型のＬｓＧｌｕＤＨがＰＰＯをＬーグルホシネートに変換する反応には使用できず、何らかの変異を含む酵素のみが利用可能であったことが記載されているように、ＬＡＡＤの全てが本件発明に利用できるわけではなく、本件発明を実施する当業者は変異の導入の検討や個々の酵素について利用可能であるかどうかの検討を行う必要があるから、当業者は過度の試行錯誤を強いられることなく本件発明を実施することができないことは明らかである。 イ 「Ｄ－グルホシネートを、通気しながらＤ－アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）酵素と反応させて、ＰＰＯ（２－オキソ－４－（ヒドロキシ（メチル）ホスフィノイル）酪酸）を形成する工程」について （ア） 「Ｄ－グルホシネートを、通気しながらＤ－アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）酵素と反応させて、ＰＰＯ（２－オキソ－４－（ヒドロキシ（メチル）ホスフィノイル）酪酸）を形成する工程」の「Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）酵素」は全てのＤＡＡＯを包含する。一方、本件特許明細書の段落０００６には「ＤＡＡＯ酵素は、反応を促進するために、活性を約３μｍｏｌ／分＊ｍｇまたはそれを超える増加された活性を有さなくてはならない。」と記載されるとともに、実施例をみると上記活性を満たさないＤＡＡＯが含まれ、甲第７号証でも本件発明の反応には使用できないと理解されるＤＡＡＯが記載されている。「Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）酵素」のうち、本件発明に使用可能なＤＡＡＯ酵素を判断することは当業者といえども不可能であり、またＤＡＡＯ変異体を作成して実験などにより活性を確認する作業は、当業者に過度の負担を強いるものである。 （２） 判断 酵素を用いた反応において、反応に使用される成分、基質や使用される酵素の反応内容が明確である場合には、当業者であれば技術常識を踏まえて進行する反応を理解できる。また、酵素の分野において、例えば、強い活性を有する酵素に多数の変異を加えたことで活性が極めて小さくなる場合や、野生型の活性が弱い場合でも変異を加えることで活性が増強される場合、同じ種類の酵素であっても由来となる微生物種が異なると活性が大きく異なる場合があることは当業者に広く知られており、酵素の由来や変異の有無、程度により酵素活性が変化を受けることは当業者に周知の事項である。さらに、酵素を用いた反応において、反応が進むためには酵素が有する活性が一定程度以上あることが求められることも当業者において周知の事項である。 本件発明では、特定の酵素を用いた特定の反応方法において、使用される酵素や試薬、基質が示されている。そうすると、酵素が有すべき活性の程度が示されておらず、任意の酵素活性である場合が包含されるよう記載されていたとしても、あらゆる酵素が条件を満足することまでが求められるわけではなく、当該反応を進めることができると当業者が理解できる程度の活性を有する酵素が本件特許明細書に開示されていたり、出願時の技術常識に基づき同程度の活性を有する酵素が当業者に知られたものであれば、発明の詳細な説明の記載に基づき本件発明を実施することができたものといえる。これを本件発明についてみると、以下のとおりであり、出願時の技術常識と発明の詳細な説明の記載に基づき本件発明を実施することができたものといえる。 （ａ）本件特許明細書には「アンモニアを使用して、Ｌ－アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＬＡＡＤ）酵素によって、ＰＰＯをＬ－グルホシネートにアミノ化する工程」で使用される酵素、試薬、基質は特定されており、当該反応に関する試験結果は記載されていないものの、Ｄ－アミノ酸のアミノ基をカルボニル基に変換した化合物にアンモニアを有する条件下でＬＡＡＤを作用させてＬ－アミノ酸とするという反応は、甲第１０号証～甲第１３号証に記載されるように、本件特許の出願時点における当業者の技術常識といえる。そうすると、上記技術常識を踏まえれば、本件特許明細書で「アンモニアを使用して、Ｌ－アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＬＡＡＤ）酵素によって、ＰＰＯをＬ－グルホシネートにアミノ化する工程」の試験結果が記載されていないとしても、請求項１の記載に基づいて、当業者であれば当該反応を実施できるというべきである。 （ｂ）「Ｄ－グルホシネートを、通気しながらＤ－アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）酵素と反応させて、ＰＰＯ（２－オキソ－４－（ヒドロキシ（メチル）ホスフィノイル）酪酸）を形成する工程」で使用される酵素、試薬、基質は特定されており、また、本件特許明細書では酵素が有すべき活性の下限が目安として示されるとともに、実施例ではＤ－グルホシネートを、通気しながらＤＡＡＯと反応させて、ＰＰＯが得られたことが示されている。そうすると、反応を進行させることができない程度に酵素活性が弱いＤＡＡＯが存在したとしても、その他に反応を進行させることのできるＤＡＡＯが存在することは本件特許明細書に記載されているから、当業者であれば当該反応を実施できるというべきである。 よって、上記ア、イの主張はいずれも理由がない。 （３）小括 以上のとおりであるから、申立人が主張する申立理由３（実施可能要件違反）は、理由がない。 ５ 申立理由４（サポート要件）についての判断 （１） 申立人の主張 申立人は、以下のとおり、本件発明は、特許明細書に実質的に開示された発明とはいえず、本件特許の請求項１は、特許法第３６条第６項第１号の要件を満たしていないと主張する。 ア 申立理由３のアで記載したとおり、本件特許の請求項１には「アンモニアを使用して、Ｌ－アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＬＡＡＤ）酵素によって、ＰＰＯをＬ－グルホシネートにアミノ化する工程を含み」と記載される一方、本件特許明細書をみても、当該工程でトランスアミナーゼを用いた場合のみであって、ＬＡＡＤによって、ＰＰＯをＬ－グルホシネートにアミノ化することに関する具体的な試験結果は示されていない。また、ＬＡＡＤの全てが本件発明に利用できるわけではない。そうすると、本件特許明細書をみた当業者であってもアンモニアを使用してＬＡＡＤによる酵素反応でＰＰＯをＬ－グルホシネートにアミノ化できるかどうかは理解することができず、本件特許明細書の記載を本件発明の範囲にまで拡張または一般化することはできない。 イ 申立理由３のイで記載したとおり、「Ｄ－グルホシネートを、通気しながらＤ－アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）酵素と反応させて、ＰＰＯ（２－オキソ－４－（ヒドロキシ（メチル）ホスフィノイル）酪酸）を形成する工程」の「Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）酵素」は全てのＤＡＡＯを包含する一方、本件特許明細書の段落０００６の記載も踏まえると、発明の実施に利用可能であるのは特定の条件を満たすＤＡＡＯ酵素であることが明記されたものといえる。そうすると、本件特許の請求項１の「Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）酵素」との記載は発明の実施に使用できないＤＡＡＯを含むことが明らかであり、本件特許明細書の記載を本件発明の範囲まで拡張または一般化することはできない。 （２） 判断 酵素を用いた反応及び酵素の分野における技術常識、並びに本件特許明細書の記載は、いずれも４（２）で検討したとおりである。これらの点を踏まえると、本件特許発明の「Ｄ－グルホシネートを、通気しながらＤ－アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）酵素と反応させて、ＰＰＯ（２－オキソ－４－（ヒドロキシ（メチル）ホスフィノイル）酪酸）を形成する工程」、及び「アンモニアを使用して、Ｌ－アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＬＡＡＤ）酵素によって、ＰＰＯをＬ－グルホシネートにアミノ化する工程」は、いずれも出願時の技術常識と発明の詳細な説明の記載に基づき本件発明を実施することができたものといえ、本件特許明細書の記載を本件発明の範囲にまで拡張または一般化することができたものといえる。 よって、上記ア、イの主張はいずれも理由がない。 （３）小括 以上のとおりであるから、申立人が主張する申立理由４（サポート要件違反）は、理由がない。 ６ 申立理由５（進歩性）についての判断 （１） 申立人の主張 申立人は、以下のとおり、本件発明は、甲第７～１３号証に記載の発明に基づき、当業者が容易に発明することができたものであり、特許法第２９条第２項の規定に違反して特許されたものであると主張する。 ア 本件発明の製造方法に関して、Ｄ－グルホシネートおよび生成物のＬ－グルホシネートは、アミノ酸としての化学構造を有する周知の化合物であること、グルホシネートのＬ体とＤ体のラセミ混合物であるグルホシネートは除草剤として登録されていること、ラセミ混合物のＬ－体が活性本体であり、Ｌ－体を選択的に製造して農薬登録されたグルホシネートＰナトリウム塩が販売されていることは、甲第８号証にあるように当業者に周知の事項である。 また、Ｄ―アミノ酸を対応するＬ－アミノ酸に変換する手法は広く行われている技術であり、ＤＡＡＯによりＤ－アミノ酸のアミノ基をオキソ基（Ｏ＝）に酸化してα－ケトカルボン酸に変換し、その後ＬＡＡＤによりアミノ基に変換してＬ－アミノ酸を得る手法も、甲第１０号証～甲第１３号証にも記載されるように周知の技術である。 イ 甲第９号証には、ＰＰＯを化学合成により製造し、ＬＡＡＤを使用してＰＰＯのアミノ化反応によるＬ－グルホシネートの製造方法が記載されている（９７５頁左欄～右欄、およびＦｉｇ５）。また、甲第７号証には、Ｄ－グルホシネートに高い活性を示すＤＡＡＯが記載される（３０３頁左欄下から８行～右欄１０行、Ｔａｂｌｅ１）とともに、Ｔａｂｌｅ１に示される２箇所に変異を有するＲｔＤＡＡＯ（Ｆ５８Ｋ／Ｍ２１３Ｓ）はＤ－グルホシネートに極めて高い活性を示すことが開示されている。 ウ 当業者であれば、ア、イで挙げた点を踏まえ、甲９号証では化学合成により製造しているＰＰＯを、ＤＡＡＯを用いてＤ－アミノ酸を対応するα－ケトカルボン酸に変換することは周知であるとともに、甲第７号証に記載されたＤ－グルホシネートに高い活性を示すＤＡＡＯであるＲｔＤＡＡＯ（Ｆ５８Ｋ／Ｍ２１３Ｓ）を使用することが公知の事項であるから、工業的に生産されているＤＬ－アミノ酸のラセミ混合物であるＤＬ－グルホシネートを基質として、ＲｔＤＡＡＯ（Ｆ５８Ｋ／Ｍ２１３Ｓ）を使用してＰＰＯを合成し、それをＬＡＡＤによる反応に付すことに容易に想到することができたといえる。 そして、本件特許明細書では、本件発明に係る方法を用いた実施例が記載されておらず、申立理由３、４で主張したように、明らかに実施不能な発明を含んでいることから、本件発明について顕著な効果を参酌する余地はない。 （２） 判断 ア 甲第９号証記載の発明 甲第９号証には、メチルジクロロホスフィンから４－（ヒドロキシメチルホスフィノイル）－２－オキソブタン酸が合成されること、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（５０ｍｇ）およびグルコースデヒドロゲナーゼ（１０ｍｇ）を、グルコース（１７３ｍｇ）、塩化ナトリウム（０．３８ｇ）、ジチオトレイトール（１５ｍｇ）、塩化アンモニウム（０．５３３ｇ）、ＮＡＤ（１０ｍｇ）および４－（ヒドロキシメチルホスフィノイル）－２－オキソブタン酸（１５０ｍｇ）を含むリン酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．５、５０ｍｍｏｌ ｄｍ－３；５０ｃｍ３）に添加した。反応混合物を室温で撹拌し、１ｍｏｌ ｄｍ－３水酸化アンモニウムを周期的に添加してｐＨを一定に維持した。さらに生成物が生成しないこと（６日間）によって反応が完了したとき、溶液を８０℃で１５分間加熱し、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、デカントした。上清を濃塩酸でｐＨ ２に酸性化し、そして４℃に一晩冷却した。得られた沈殿物を濾取し、エタノール－水から再結晶して、光学回転の比較によって測定したＬ－ホスフィノトリシン塩酸塩（４．５ｍｇ、２５％）、融点１９２－１９６℃； ［α］Ｄ１９ ＋２４．８５（ｃ ２，１ｍｏｌ ｄｍ－３ＨＣｌ） ｛ｌｉｔ．、ｍｐ １９４－１９６℃および［α］Ｄ１９ ＋２１．４（ｃ １．４、１ｍｏｌ ｄｍ－３ＨＣｌ）、８９．２％エナンチオマー過剰｝、＞９９％エナンチオマー過剰を得たことが記載されている（第４の「１ 甲各号証の記載事項」（７）ア～ウ）。 そうすると、甲第９号証には、以下の発明が記載されていると認められる（以下、「引用発明」という。） 「メチルジクロロホスフィンから４－（ヒドロキシメチルホスフィノイル）－２－オキソブタン酸が合成され、グルタミン酸デヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼを、塩化アンモニウムおよび４－（ヒドロキシメチルホスフィノイル）－２－オキソブタン酸を含むリン酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．５、５０ｍｍｏｌ ｄｍ－３；５０ｃｍ３）に添加して、反応混合物を室温で撹拌し、１ｍｏｌ ｄｍ－３水酸化アンモニウムを周期的に添加してｐＨを一定に維持して反応させ、反応後に加熱、遠心分離、デカントし、上清を濃塩酸で酸性化し、冷却、沈殿し、沈殿物を再結晶してＬ－ホスフィノトリシン塩酸塩を得る方法。」 イ 本件発明と引用発明との対比 本件発明と引用発明とを対比する。 引用発明の「４－（ヒドロキシメチルホスフィノイル）－２－オキソブタン酸」、「グルタミン酸デヒドロゲナーゼ」、及び「ホスフィノトリシン」は、それぞれ、本件発明の「ＰＰＯ（２－オキソ－４－（ヒドロキシ（メチル）ホスフィノイル）酪酸）」、「Ｌ－アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＬＡＡＤ）酵素」、及び「グルホシネート」に相当する。また、引用発明での反応に用いられた緩衝液のｐＨは７．５であり、これに１ｍｏ１ ｄｍ－３水酸化アンモニウムを周期的に添加してｐＨを一定に維持して反応を進めていたこと、アンモニアは易水溶性であって、水溶液はアルカリ性を示す物質であるから、引用発明の「水酸化アンモニウム」はアンモニアの水溶液であり、本件発明の「アンモニア」に相当する。さらに、本件特許明細書の段落００６８では「精製は、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、酢酸等を含む適切な酸の添加によるＬ－グルホシネートの不溶性塩の形成によって成されてもよい。」と記載されているから、引用発明の「Ｌ－ホスフィノトリシン塩酸塩」はＬ－グルホシネートが塩酸塩の形態で精製されたものであり、本件発明の「Ｌ－グルホシネート」に相当する。そして、引用発明で記載された反応はいずれも生体外で行われたものであるから、引用発明は「ｅｘ ｖｉｖｏで行われ」たものである。 そうすると、本件発明と引用発明とは 「Ｌ－グルホシネートを作製する方法であって、ＰＰＯ（２－オキソ－４－（ヒドロキシ（メチル）ホスフィノイル）酪酸）を形成する工程、及びアンモニアを使用して、Ｌ－アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＬＡＡＤ）酵素によって、ＰＰＯをＬ－グルホシネートにアミノ化する工程を含み、前記方法がｅｘ ｖｉｖｏで行われる、前記方法。」 である点で一致し、以下の点で相違する。 （相違点） 本件発明では「ＰＰＯ（２－オキソ－４－（ヒドロキシ（メチル）ホスフィノイル）酪酸）を形成する工程」が「Ｄ－グルホシネートを、通気しながらＤ－アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）酵素と反応させ」る工程であるのに対し、引用発明では「メチルジクロロホスフィンから４－（ヒドロキシメチルホスフィノイル）－２－オキソブタン酸が合成され」る工程である点 ウ 相違点についての判断 甲第８号証には、Ｄ－グルホシネートおよび生成物のＬ－グルホシネートは、アミノ酸としての化学構造を有する周知の化合物であること、グルホシネートのＬ体とＤ体のラセミ混合物であるグルホシネートは除草剤として登録されていること、及び、ラセミ混合物のＬ－体が活性本体であり、Ｌ－体を選択的に製造して農薬登録されたグルホシネートＰナトリウム塩が登録されていることが記載されており（第４の「１ 甲各号証の記載事項」（６）ア～エ）、甲第８号証が既承認農薬の評価に関する文献であることを踏まえると、上記事項は当業者に周知のものといえる。しかし、甲第８号証に記載されているのはグルホシネートのＬ体とＤ体のラセミ混合物や活性本体であるＬ体という化合物や当該化合物を含む組成物、農薬に関する内容であって、具体的なＬ体の選択的製造方法が記載されているわけではない。そうすると、甲第８号証をみても、グルホシネートのＬ－体を選択的に製造する際、「Ｄ－グルホシネートを、通気しながらＤ－アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）酵素と反応させ」るという工程は記載されたものと解することはできない。 一方、甲第１０号証～甲第１３号証には、ＤＡＡＯによりＤ－アミノ酸のアミノ基をオキソ基（Ｏ＝）に酸化してα－ケトカルボン酸に変換し、その後ＬＡＡＤによりアミノ基に変換してＬ－アミノ酸を得る手法が記載されており（第４の「１ 甲各号証の記載事項」（８）～（１１））、当業者に周知の技術といえる。しかし、上記反応でＤ－アミノ酸としてＤ－グルホシネートを用いることは甲第１０号証～甲第１３号証のいずれにも記載がなく、また、反応を「通気しながら」行うこともこれらの文献に記載されていない。 さらに、甲第７号証には「Ｄ－グルホシネートを２－オキソ－４－（メチルホスフィニル）－ブタン酸に効率的に酸化するように特別に設計された、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｔ）由来のＤ－アミノ酸酸化酵素（ＤＡＡＯ）の改変型（ＤＭＲｔＤＡＡＯ）」が記載されている（第４の「１ 甲各号証の記載事項」（５）ア～オ）。しかし、これは植物体の葯内でＬ－グルタミン酸トランスアミナーゼが作用して、ＰＰＯに相当する「２－オキソ－４－（メチルホスフィニル）－ブタン酸」がＬ体グルホシネートへと変換される、という知見をもとに、葯内にＤＡＡＯを発現する遺伝子組換え植物を作製し、植物体葉面にＤ－グルホシネートを散布した場合に「２－オキソ－４－（メチルホスフィニル）－ブタン酸」を経てＬ体へ変換されるようにすることで、植物体に稔性低下をもたらすことを目的としてなされたものであり、野生型や改変ＲｔＤＡＡＯの酵素活性は検討されているものの、これらはＤＡＡＯに関する遺伝子組換え体を作製するための候補を検討するためになされた試験であって、ｅｘ ｖｉｖｏ条件下でＤ－グルホシネートをＰＰＯに変換するために行われたものではない。 そうすると、甲第９号証及び甲第７号証に記載された事項、並びに、甲第８号証及び甲第１０号証～甲第１３号証に記載された技術常識を踏まえても、引用発明で「メチルジクロロホスフィンから４－（ヒドロキシメチルホスフィノイル）－２－オキソブタン酸が合成」している工程について、原料をＤ－グルホシネートにし、これを通気しながらＤＡＡＯと反応させてＰＰＯを得るようにすることが当業者にとり容易であると解することはできない。 よって、上記ア～ウの主張はいずれも理由がない。 また、甲第７号証、甲第８号証、甲第１０号証～甲第１３号証の記載は上で検討したとおりであるから、これらのいずれかに基づいて引用発明を認定した場合でも、甲第９号証に基づき引用発明を認定した上の場合と同様に、本件発明に容易に想到することができたと解することはできない。 （３）小括 以上のとおりであるから、申立人が主張する申立理由５（進歩性）は、理由がない。 ７ 申立理由６（進歩性）についての判断 （１） 申立人の主張 申立人は、以下のとおり、本件発明は、甲第１４号証に記載の発明に基づき、当業者が容易に発明することができたものであり、特許法第２９条第２項の規定に違反して特許されたものであると主張する。 ア 申立理由２に関して記載したように、本件特許は補正により追加された新規事項を含むので、本願は分割出願の要件を満たさない。したがって、本件特許の出願日は原出願日に遡及せず、実際の出願日である令和５年１月２４日となる。 イ 甲第１４号証は上記出願日前に公開された文献であり、請求項１において追加された新規事項である、「アンモニアを使用して、Ｌ－アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＬＡＡＤ）酵素をよって」との記載以外は甲第１４号証に開示されている。アンモニアおよびＬ－アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＬＡＡＤ）酵素は周知の事項であるので、当業者であれば甲第１４号証の記載に基づいて本件発明を容易に想到する。また本件特許明細書には本件発明について何らの実施例も開示されていないので、本件発明が顕著な効果を有するとも認定できない。 以上の理由により本件発明は、特許法第２９条第２項の要件を満たさない。 （２） 判断 申立理由２については上記「３ 申立理由２（補正要件違反）についての判断」で検討したとおりであって、本件特許は補正により追加された新規事項を含まず、原々出願の出願当初の明細書等との関係においても新規事項を含むものではないから、本件特許出願は分割出願の要件を満足するものといえる。そして、甲第１４号証は本件特許出願の原々出願にあたる特願２０１８－５４５８７１号の国内公表であるところ、分割出願の要件を満足する本件特許の出願日は特願２０１８－５４５８７１号の出願日と同日であるから、本件発明が甲第１４号証に基づき進歩性を有しないと解することのできる事情は存在しない。 よって、上記ア、イの主張はいずれも理由がない。 （３）小括 以上のとおりであるから、申立人が主張する申立理由６（進歩性）は、理由がない。 第５ むすび 以上のとおりであるから、特許異議申立書に記載した特許異議の申立ての理由によっては、本件特許の請求項１に係る特許を取り消すことはできない。 また、他に本件特許の請求項１に係る特許を取り消すべき理由を発見しない。 よって、結論のとおり決定する。