2023-700152

特許第７１１７８２４号発明「モノクローナル抗体、検出方法、及び検出装置」の特許異議申立事件について、次のとおり決定する。

結 論 特許第７１１７８２４号の請求項１ないし４に係る特許を維持する。

理 由 第１ 手続の経緯 特許第７１１７８２４号（以下、「本件特許」という。）の請求項１ないし４に係る特許についての出願は、平成２８年 １月２７日に出願され、令和 ４年 ８月 ４日にその特許権の設定登録がされ、同年 ８月１５日に特許掲載公報が発行された。その後、本件特許に対し、令和 ５年 ２月１４日に特許異議申立人松井伸一（以下、「異議申立人Ａ」という。）により、令和 ５年 ２月１５日に特許異議申立人谷村典洋（以下、「異議申立人Ｂ」という。）により、それぞれ２件の特許異議の申立てがされたものである。 第２ 本件特許発明 本件特許の請求項１ないし４に係る発明（以下、「本件特許発明１」～「本件特許発明４」といい、これらを総称して、「本件特許発明」という。また、本件特許の設定登録時の明細書を「本件特許明細書」という。）は、本件特許の特許請求の範囲の請求項１ないし４に記載された事項によって特定される、以下のとおりのものである。 【請求項１】 マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のＰ３０タンパクにおける、Ｎ末端より１７７番目から２７４番目までのＣ末端側に複数回出現するアミノ酸配列に特異的に反応するが、Ｎ末端から１７６番目までには反応せず、 前記アミノ酸配列は、ＰＧＭＡＰＲＰ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｍｅｔ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ）であると共に、アミノ酸配列ＰＧＭＡＰＲには反応せず、且つ、ケラチン、フィブリノーゲンにも反応しないモノクローナル抗体。 【請求項２】 マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のＰ３０タンパクにおける、Ｎ末端より１７７番目から２７４番目までのＣ末端側に複数回出現するアミノ酸配列に特異的に反応するが、Ｎ末端から１７６番目までには反応せず、 前記アミノ酸配列は、ＰＨＰＧＭＡＰ（Ｐｒｏ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｍｅｔ－Ａｌａ－Ｐｒｏ）であると共に、アミノ酸配列ＰＧＭＡＰＲには反応せず、且つ、ケラチン、フィブリノーゲンにも反応しないモノクローナル抗体。 【請求項３】 請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体を用いて、マイコプラズマ・ジェニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）に反応性を示さず、マイコプラズマ・ニューモニエを特異的に検出する検出方法。 【請求項４】 多孔質担体と、請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体が固相化される検出区域とを有し、イムノクロマト法による免疫学的検出を行う検出装置。 第３ 異議申立理由の概要及び提出した証拠 １ 異議申立人Ａの異議申立理由の概要 異議申立人Ａが主張する異議申立理由の概要は、次のとおりのものである。 （１）申立理由Ａ１（甲第１号証に基づく拡大先願） 本件特許の請求項１、３、４に係る発明は、その出願の日前の日本語特許出願であって、その出願後に国際公開がされた甲第１号証の日本語特許出願の国際出願日における国際出願の明細書、請求の範囲又は図面に記載された発明と同一であり、しかも、この出願の発明者がその出願前の日本語特許出願に係る上記の発明をした者と同一ではなく、またこの出願の時において、その出願人が上記日本語特許出願の出願人と同一でもないので、特許法第２９条の２の規定により、特許を受けることができない（同法第１８４条の１３参照）から、上記発明に係る本件特許は、同法第１１３条第２号に該当し、取り消されるべきである。 （２）申立理由Ａ２（甲第２号証又は甲第２号証及び甲第３号証に基づく進歩性欠如） 本件特許の請求項１ないし４に係る発明は、甲第２号証（主引例）に記載された発明、又は甲第２号証（主引例）及び甲第３号証に記載された発明に基づいて、本件特許の出願日前に当業者が容易に発明をすることができたものであり、同法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないから、上記発明に係る本件特許は、同法１１３条第２号に該当し、取り消されるべきである。 ２ 異議申立人Ａが提出した証拠方法 甲第１号証：国際公開第２０１６／１２１８３１号 甲第１の２号証：ＰＣＴ／ＪＰ２０１６／０５２３８１号の優先権証明書（特願２０１５－１５２５３号の出願書類） 甲第２号証：国際公開第２０１５／２５９６８号 甲第３号証：ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＩＭＭＵＮＩＴＹ、Ｊｕｌｙ、１９９６、ｐ２５９５－２６０１ 以下、順に「甲Ａ１」、「甲Ａ１の２」、「甲Ａ２」、「甲Ａ３」という。 ３ 異議申立人Ｂの異議申立理由の概要 （１）申立理由Ｂ１（実施可能要件違反） 本件特許発明１～４に係る特許は、その発明の詳細な説明が、特許法第３６条第４項第１号に規定する要件を満たしていない特許出願に対してされたものであるから、同法第１１３条第４号に該当し、取り消されるべきである。 ４ 異議申立人Ｂが提出した証拠方法 甲第１号証：令和３年（行ケ）第１００９４号 審決取消請求事件の判決文 甲第２号証の１：不服２０１８－１４４０７の審判請求書の請求の理由を記載した手続補正書 甲第２号証の２：不服２０１８－１４４０７の前置報告書 以下、順に「甲Ｂ１」、「甲Ｂ２の１」、「甲Ｂ２の２」という。 第４ 当審の判断 当審は、異議申立人Ａ及び異議申立人Ｂが主張する上記の申立理由は、いずれも理由がなく、ほかに各特許を取り消すべき理由も発見できないから、本件特許発明１～４に係る特許は、いずれも取り消すべきものではなく、維持すべきものと判断する。 １ 申立理由Ａ１（拡大先願）について （１） 甲Ａ１の記載事項 甲Ａ１の記載事項は以下に示すとおりである。なお、下線部は当審による。 ア 「［請求の範囲］ ［請求項１］マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体を用いる免疫測定法からなり、前記抗体が配列番号３乃至５の何れか１つのアミノ酸配列に位置するＰ３０タンパク質のエピトープに対する抗体であるマイコプラズマ・ニューモニエの検出法。 ［請求項２］前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の検出法。 ・・・ ［請求項１１］マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体を少なくとも備えており、前記抗体が配列番号３乃至５の何れか１つのアミノ酸配列に位置するＰ３０タンパク質のエピトープに対する抗体であるマイコプラズマ・ニューモニエの免疫学的測定キット。 ・・・ ［請求項１８］配列番号３乃至５の何れか１つのアミノ酸配列に位置するＰ３０タンパク質のエピトープを認識する抗体。 ［請求項１９］前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１８に記載の抗体。」 イ 「［００２６］ Ｐ３０タンパク質は分子量３０ＫＤａのタンパク質であり、Ｐ１タンパク質と同様に接着と病原性に関係する接着タンパク質の１つである。マイコプラズマ・ニューモニエの菌体においては、接着器官の先端部の細胞表面に局在しており、細胞膜内に埋没しているＮ末端領域と細胞膜外に存在するＣ末端領域を持つ膜貫通型タンパク質である。また、Ｃ末端領域にはプロリンを多く含むアミノ酸配列が存在し、前記配列の繰り返し構造が存在する。一般的にプロリンを多く含むアミノ酸配列からなる領域は、立体的な高次構造をとることが知られており、抗体の反応するエピトープとなる可能性が高いことが知られている。 本発明で使用する抗体は、配列番号１に示されるＰ３０タンパク質の全アミノ酸のうち、配列番号３乃至５の何れか１つのアミノ酸配列に位置するエピトープに対する抗体である。またこれらの抗体は他のマイコプラズマ属と反応せず、マイコプラズマ・ニューモニエのみに反応し、特異性に優れるものである。配列番号３乃至５のアミノ酸配列はＰ３０タンパク質のエピトープを含む領域である。したがって、本発明で使用する抗体は配列番号３乃至５のアミノ酸配列の何れか１つに含まれる１２～１５アミノ酸残基からなるＰ３０タンパク質の断片と抗原抗体反応する抗体と言い換えることができる。」 ウ 「［００４７］（実施例１：組換えＰ３０タンパク質の発現と精製） マイコプラズマ・ニューモニエＭ１２９株のＰ３０タンパク質のアミノ酸配列をＤＤＢＪ（国立遺伝学研究所データベース）より入手した。前記Ｐ３０タンパク質のアミノ酸配列から、膜貫通ドメインを除いた細胞外領域である配列番号２に示すアミノ酸配列（ＡＡ７４－２７４）を特定し、対応する遺伝子配列を合成した。Ｈｉｓ－ｔａｇ発現用ベクターであるｐＥＴ３０２／ＮＴ－Ｈｉｓを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した後、脱リン酸化処理としてアルカリフォスファターゼにより処理し、前記遺伝子配列と混合し、ＤＡＮＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ．２（タカラバイオ）を用いてライゲーション反応をおこなった。目的遺伝子を組み込んだ組換えＰ３０プラスミドを組換え蛋白発現用宿主Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ社の製品）に導入した。導入菌をＬＢ寒天平板培地で培養し、得られたコロニーをＬＢ液体培地で培養した。さらに１ｍＭＩＰＴＧ（タカラバイオ社の製品）を添加して組換えＰ３０タンパク質の発現を誘導した後、Ｅ．ｃｏｌｉを回収した。回収した菌を可溶化バッファー［０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（Ｓｉｇｍａ社の製品）、１０ｍＭＩｍｉｄａｚｏｌｅ、２０ｍＭＰｈｏｓｐｈａｔｅおよび０．５ＭＮａＣｌ（ｐＨ７．４）（Ａｍｅｒｓｈａｍ社の製品）］に再浮遊し、超音波処理により可溶化した後、組換えＰ３０タンパク質をＨｉｓｔｒａｐＫｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社の製品）を用いて精製した。この精製タンパク質をリン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳと称する）に対して透析し、目的の組換えＰ３０タンパク質とした。 ［００４８］（実施例２：組換えＰ３０タンパク質に対するモノクローナル抗体の作出） 実施例１で得られた組換えＰ３０タンパク質を免疫用抗原として、組換えＰ３０タンパク質に対するモノクローナル抗体（以下、抗Ｐ３０抗体と称する）を作出した。モノクローナル抗体の作出は常法に従っておこなった。１００μｇの組換えＰ３０タンパク質と等量のＡｄｕｖａｎｔＣｏｍｐｌｅｔｅＦｒｅｕｎｄ（Ｄｉｆｃｏ社の製品）を混合して、マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、５週齢、日本ＳＬＣ）に３回免疫し、その脾臓細胞を細胞融合に用いた。細胞融合には、マウスの骨髄腫細胞であるＳｐ２／０－Ａｇ１４細胞（Ｓｈｕｌｍａｎら、１９７８）を用いた。細胞の培養には、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ社の製品）にＬ－グルタミン０．３ｍｇ／ｍｌ、ペニシリンＧカリウム１００単位／ｍｌ、硫酸ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、Ｇｅｎｔａｃｉｎ４０μｇ／ｍｌを添加し（以下、ＤＭＥＭと称する）、これに牛胎児血清（ＪＲＨ社の製品）を１０％となるように加えた培養液を用いた。細胞融合は、免疫マウスの脾臓細胞とＳｐ２／０－Ａｇ１４細胞を混合し、そこにＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ社の製品）を添加することにより行った。融合細胞はＨＡＴ－ＤＭＥＭ［０．１ｍＭＳｏｄｉｕｍＨｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ、０．４μＭＡｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎおよび０．０１６ｍＭＴｈｙｍｉｄｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ社の製品）を含む血清加ＤＭＥＭ］で培養し、酵素結合抗体法（ＥＬＩＳＡ）により培養上清中の抗体産生を確認した。抗体産生陽性の細胞をＨＴ－ＤＭＥＭ［０．１ｍＭＳｏｄｉｕｍＨｙｐｏｘａｎｔｉｎｅおよび０．１６ｍＭＴｈｍｉｄｉｎｅを含む血清加ＤＭＥＭ］で培養し、さらに血清加ＤＭＥＭで培養を続けた。 ［００４９］（実施例３：モノクローナル抗体の調製） クローニングした細胞は、２，６，１０，１４－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ（Ｓｉｇｍａ社の製品）を接種しておいたマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、リタイア、日本ＳＬＣ）に腹腔内接種し、腹水を採取した。この腹水をプロテインＧカラムに供し、モノクローナル抗体を精製した。作出したモノクローナル抗体のアイソタイプは、ＭｏｕｓｅＭｏｎｏｌｏｃｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙＩｓｏｔｙｐｉｎｇＲｅａｇｅｎｔｓ（Ｓｉｇｍａ社の製品）を用いて同定した。 最終的にＰ３０タンパク質に対するモノクローナル抗体産生細胞が６クローン得られた。」 エ 「［００５２］（実施例４：抗Ｐ３０抗体のエピトープ解析） 配列番号１のマイコプラズマ・ニューモニエ由来のＰ３０タンパク質のアミノ酸配列より、Ｎ末端側に存在するプロリンを多く含む領域からエピトープとなり得る可能性のあるアミノ酸配列を選択し、配列番号３乃至５のアミノ酸配列からなるポリペプチドを合成した。合成したポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端から１７８－１８９番目のＧＭＡＰＲＰＧＭＰＰＨＰ（配列番号３）、１９０－２０１番目のＧＭＡＰＲＰＧＦＰＰＱＰ（配列番号４）および、２５０－２６２番目のＧＭＡＰＲＰＧＭＱＰＰＲＰ（配列番号５）であった。なお、配列番号３に示す配列は、Ｎ末端から２０２－２１３番目および２２６－２３７番目において同様の配列が存在し、また配列番号４に示す配列は２１４－２２５番目および２３８－２４９番目において同様の配列が存在する。すなわち、配列番号３および４のアミノ酸配列はＰ３０タンパク質内に複数存在し、繰り返し構造を有している。 前記配列番号３乃至５に示すアミノ酸配列からなるペプチドを、９６穴マイクロプレートに添加し固相化した。対照として、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）精製菌体、実施例１にて調製した精製Ｐ３０タンパク質、Ｐ３０タンパク質のＮ末端側から１０１－１２５番目のＫＲＫＥＫＲＬＬＥＥＫＥＲＱＥＱＬＯＲＩＳ（配列番号６）、１２６－１４５番目のＡＱＱＥＥＱＱＡＬＥＱＱＡＡＡＥＡＨＡＥ（配列番号７）からなるポリぺプチド、および参考例１にて調製したマイコプラズマ・ニューモニエのＰ１タンパク質を固相化し、前記と同様に実施例３にて作出したモノクローナル抗体の反応性を確認した。 ペプチドを所定濃度にて固相化したマイクロプレートに、実施例３にて作製したモノクローナル抗体を添加し、室温にて１時間反応させた。次にウェル内の溶液を吸引除去し、洗浄後、ビオチン標識抗マウス抗体を反応させた。１時間の反応の後、ウェル内の溶液を吸引除去し洗浄した後、アビジン標識ホースラディッシュペルオキシダーゼを添加し反応させた。その後、発色基質として３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）溶液を添加し反応させ、２規定の硫酸により反応を停止させた。マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｒａｄ社の製品）にて主波長４５０ｎｍにて吸光度を測定した。結果を表１に示す。」 オ 表１ 「 ［図：0001399400000001.jpg］ 」 カ 「［００５３］ 上記結果より、モノクローナル抗体ＢＬＭＰ００１は、配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチドに最も強い反応を示した。また類似配列である配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドに対しても反応を示した。 モノクローナル抗体ＢＬＭＰ００２は配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチドに対し強い反応を示し、モノクローナル抗体ＢＬＭＰ００３は配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドに強い反応を示した。モノクローナル抗体ＢＬＭＰ００１と同様に、類似するアミノ酸配列からなる他のポリペプチドに対しても反応性を示した。 モノクローナル抗体ＢＬＭＰ００４は、配列番号３、配列番号４および配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチド全てに対し反応を示した。それぞれのアミノ酸配列における共通する配列を認識するモノクローナル抗体であることが推測される。 モノクローナル抗体ＢＬＭＰ００１、ＢＬＭＰ００２及びＢＬＭＰ００３はＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ精製菌体および精製Ｐ３０タンパク質に対し高い反応を示し、対照とした精製Ｐ１タンパク質に対し反応性を示さなかった。 よって、モノクローナル抗体ＢＬＭＰ００１はＰ３０タンパク質における配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識し、モノクローナル抗体ＢＬＭＰ００２は配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識し、モノクローナル抗体ＢＬＭＰ００３は配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識する抗体であることが確認された。 ［００５４］（実施例５：抗Ｐ３０抗体を用いたイムノクロマトグラフィー法テストストリップの作製） （１）抗Ｐ３０抗体の調製 実施例３で得られたモノクローナル抗体ＢＬＭＰ００１産生細胞およびモノクローナル抗体ＢＬＭＰ００４産生細胞をマウス腹腔に接種し得られた腹水それぞれを、さらに常法によりプロテインＧを用いたＩｇＧ精製を行い、抗Ｐ３０抗体とした。 ［００５５］（２）白金－金コロイド粒子溶液の調製 使用するガラス器具の全てを王水で洗浄した。３９０ｍｌの超純水をフラスコに入れて沸騰させ、この沸騰水に塩化金酸水溶液（水溶液１リットル当たり金として１ｇ、片山化学工業株式会社製）３０ｍｌを加え、その後、１重量％クエン酸ナトリウム水溶液６０ｍｌを加え、６分４５秒後に、塩化白金酸水溶液（水溶液１リットル当たり白金として１ｇ、和光純薬工業株式会社製）３０ｍｌを加えた。塩化白金酸水溶液添加から５分後に１重量％クエン酸ナトリウム水溶液６０ｍｌを加え、４時間、還流を行い、白金－金コロイド懸濁液を得た。 ［００５６］（３）白金－金コロイド標識抗Ｐ３０抗体溶液の調製 白金－金コロイド標識する抗Ｐ３０抗体として、上記（１）で得られたモノクローナル抗体ＢＬＭＰ００１を用い、下記の手順で白金－金コロイド標識を行った。 抗Ｐ３０抗体の蛋白換算重量１μｇ（以下、抗体の蛋白換算重量を示すとき、単に、その精製蛋白質の重量分析による重量数値で示す）と上記（２）の白金－金コロイド溶液１ｍｌとを混合し、室温で２分間静置してこの抗体のことごとくを白金－金コロイド粒子表面に結合させた後、白金－金コロイド溶液における最終濃度が１％となるように１０％ウシ血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」と記す）水溶液を加え、この白金－金コロイド粒子の残余の表面をことごとくこのＢＳＡでブロックして、白金－金コロイド標識抗Ｐ３０抗体（以下、「白金－金コロイド標識抗体」と記す）溶液を調製した。この溶液を遠心分離（５６００×Ｇ、３０分間）して白金－金コロイド標識抗体を沈殿せしめ、上清液を除いて白金－金コロイド標識抗体を得た。この白金－金コロイド標識抗体を１０％サッカロース・１％ＢＳＡ・０．５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００を含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁して白金－金コロイド標識抗体溶液を得た。 ［００５７］（４）マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質検出用イムノクロマトグラフィー法テストストリップの作製 （４－１）マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位 幅５ｍｍ、長さ３６ｍｍの細長い帯状のニトロセルロース膜をクロマトグラフ媒体のクロマト展開用膜担体３として用意した。抗Ｐ３０抗体１．０ｍｇ／ｍｌが含有されてなる溶液０．５μｌを、このクロマト展開用膜担体３におけるクロマト展開開始点側の末端から７．５ｍｍの位置にライン状に塗布して、これを室温で乾燥し、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質と白金－金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位３１とした。この塗布用抗Ｐ３０抗体として、上記（１）で得られたモノクローナル抗体ＢＬＭＰ００４を用いた。 （４－２）白金－金コロイド標識抗体含浸部材 5mm×15mmの帯状のガラス繊維不織布に、白金－金コロイド標識抗体溶液37.5μlを含浸せしめ、これを室温で乾燥させて白金－金コロイド標識抗体含浸部材2とした。 （４－３）イムノクロマトグラフィー法テストストリップの作製 上記クロマト展開用膜担体3、上記標識抗体含浸部材2の他に、試料添加用部材5として綿布と、吸収用部材4として濾紙を用意した。そして、これらの部材を用いて、図1と同様のイムノクロマトグラフィー法テストストリップを作製した。 ［００５８］（５）試験 マイコプラズマ・ニューモニエのＭ１２９株およびＦＨ株の培養菌液を検体抽出液で希釈して、所定濃度に調製し、被検試料とした。そして、被検試料１００μ１を用いて上記（４）で得られたテストストリップの試料添加用部材５にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で１５分放置後、上記捕捉部位３１で捕捉されたＰ３０タンパク質と白金－金コロイド標識抗体との複合体の捕捉量を肉眼で観察した。捕捉量は、その量に比例して増減する黒色の呈色度合いを肉眼で－（着色なし）、±（微弱な着色）、＋（明確な着色）、＋＋（顕著な着色）、＋＋＋（極めて顕著な着色）の５段階に区分して判定した。 その結果を表２に示す。表２から明らかなように、マイコプラズマ・ニューモニエの２株に対し高い反応性を示し、陰性対照であるマイコプラズマ・ジェニタリウムに対しては適用した濃度全てにおいて陰性を示した。２種の抗Ｐ３０抗体を使用したイムノクロマトグラフィー測定法により、高感度かつ高精度にマイコプラズマ・ニューモニエを検出できることがわかった。」 キ 表２ 「 ［図：0001399400000002.jpg］ 」 （２） 甲Ａ３の記載事項 甲Ａ３の記載事項は以下に示すとおりである。原文は英文であるから、申立人より提示された抄訳を参考に当審による翻訳文で示す。なお、下線部は当審による。 ア （タイトル） 「マイコプラズマ・ニューモニエ Ｐ３０アドヘシンの生体機能ドメインについて」 イ （要約） 「Ｐ３０アドヘシン欠損タンパク質プロファイルを示す自然発生的な血液吸着陰性（ＨＡ－）クラスＩＩマイコプラズマ・ニューモニエ変異体のＰ３０アドヘシン遺伝子が解析された。Ｐ３０欠損変異体の１つのサブクラスは、ｐ３０構造遺伝子全体を変化なく持っていた（予測分子量が２９，７４３Ｄａである２７５アミノ酸をコードする８２５ヌクレオチド［Ｓ．Ｆ．Ｄａｌｌｏ，Ａ．Ｃｈ．Ｆ．Ｄａｌｌｏ，Ａ．Ｃｈａｖｏｙａ，ａｎｄ Ｊ．Ｂ．Ｂａｓｅｍａｎ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：４１６３－４１６５、１９９０］）。しかし、２つ目の変異体サブクラスは、２５ｋＤａペプチド（計算された分子量が２４，８２３Ｄａである２２７アミノ酸をコードする６８１ヌクレオチド）の発現をもたらすｐ３０での欠損を含んでいた。 この切断されたＰ２５ペプチドは、Ｃ末端の１３個のプロリンリッチ繰り返しアミノ酸配列のうち８個を欠く。Ｃ末端に位置するプロリンリッチ繰り返しアミノ酸配列に対する抗体を用いてマイコプラズマ・ニューモニエの全細胞の放射性免疫沈降法を実施したところ、その表面への接近が示された。 一方、繰り返し配列の上流に位置するＮ末端アミノ酸配列に対して作成した抗体は、無傷のマイコプラズマに結合しなかった。Ｐ３０アドへシンと真核生物の構造タンパク質が示すアミノ酸配列の相同性は、Ｐ３０アドヘシンとフィブリノーゲン、ケラチン、ミオシンとの間に共通する交差反応エピトープによって裏付けられている。これらのデータは、細胞接着におけるＰ３０タンパク質の重要性を補強し、また、マイコプラズマ・ニューモニエを介した病態に関連する感染後の自己免疫の分子基盤を提供する。」 ウ （第２５９６頁左欄第２７～４３行） 「抗体試薬。 アドヘシンＰ３０のプロリンリッチなＣ末端繰り返し領域由来の２つの合成ペプチド（アミノ酸ＰＧＭＡＰＲＰＧＭＰＰＨ［リピートＡおよびＢ］およびＰＧＭＡＰＲＰＧＦＰＰＣＡ［リピートＡおよびＣ］、すなわち、アミノ酸１７１～２６９番目［１０］）およびこれらの繰り返し配列から上流の１つのペプチド（ＲＬＬＥＥＫＥＲＱＥＱＬＡＥＱ［アミノ酸１０６～１２０番目］）をペニンシュラ・ラボラトリー社（Ｂｅｌｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．）から購入し、ピアス社（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）から供給された方法によりキーホールリンペットヘモシアニンにカップリングした。真核生物の構造タンパク質およびヒトフィブリノーゲンに対するヤギ抗体はシグマ社から購入した。マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０アドヘシンに反応するＭＡｂｓは、以前に記述した（３１）。ウサギ単特異的抗体試薬は、Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＴｅｘａｓＨｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙで作成した。この場合、２．５－ｋｇの雄ニュージーランド白ウサギに、０．５ｍｇのキーホールリンペットヘモシアニンが融合したＰ３０合成ペプチドまたはキーホールリンペットヘモシアニン無関係ペプチドをフロイント不完全アジュバントで乳化したものを免疫した。２４日目、４３日目、５９日目に、フロイント不完全アジュバントに乳化した結合ペプチドをそれぞれ３００ｍｇ、４００ｍｇ、３．５ｍｇのブースターとしてウサギに投与した。すべての免疫療法は、複数の部位に皮下投与された。」 エ （図５Ａ） 「 ［図：0001399400000003.jpg］ 」 オ （第２５９８頁左欄図５（Ａ）、（Ｂ）説明文） 「図５（Ａ）は、マイコプラズマ・ニューモニエの野生型Ｐ３０アドヘシンおよび変異型Ｐ２５関連ペプチドを模式的に示したものである。繰り返しドメインは、大文字Ａ（アミノ酸ＰＧＭＡＰＲ）、Ｂ（ＰＧＭＰＰＨ）、及びＣ（ＰＧＦＰＰＱ）によって示される。ドメインＡとＢ、ドメインＡとＣから合成されたペプチドは、ウサギの単特異的抗体試薬の作製に使用された（材料と方法参照）。アスタリスクは、抗血清が作製された、非繰り返しでプロリンに富まない上流配列（アミノ酸１０６～１２０番目［ＲＬＬＥＥＫＥＲＱＥＱＬＡＥＱ］）を示している。（Ｂ）活性なＰ３０アドヘシンおよびそのＨｏｐｐ及びＷｏｏｄｓ（１７）の方法によって特定された不活性な短縮２５ｋＤａ相当品（Ｐ２５）の推定アミノ酸配列の疎水性プロット。横座標は、正の数がタンパク質の親水性ドメインを表し、負の数が疎水性ドメインを示す。縦座標の値はアミノ酸残基である。」 カ （第２５９８頁左欄第７行～第１０行） 「しかしながら、繰り返し構造Ａ（ＰＧＭＡＰＲ）は、野生型では７回存在し、変異型７は３回のみ存在した。繰り返し構造Ｂ（ＰＧＭＰＰＨ）及びＣ（ＰＧＦＰＰＱ）は、野生型では３回存在し、変異型７は１回のみ存在した。」 キ （第２５９８頁左欄第１５行～右欄第８行） 「Ｐ３０プロリンリッチ繰り返しドメインの表面局在化 全細胞マイコプラズマ放射性免疫沈降法は、プロリンリッチＡ－Ｂ繰り返し領域とＡ－Ｃ繰り返し領域、および上流の非プロリンリッチ親水性領域に対して生成された抗体で実施された（図５Ａ）。図６Ｂに示すように、プロリンリッチなＡ－Ｂ領域に対して反応する抗体は、野生型マイコプラズマ・ニューモニエの３０ｋＤタンパク質、変異型７の２５ｋＤタンパク質を沈殿させたが、変異型１５のペプチドを沈殿させなかった。このパターンは、Ａ－Ｃリピート領域に対して作成した抗体を用いた場合にも見られた（データは示さず）。上流の非プロリンリッチ領域および出血前コントロール血清に対して作製した抗体は、野生型または変異型マイコプラズマのいずれからも表面アクセス可能なエピトープを検出しなかった（図６Ａ）。放射性免疫沈降法解析（図６）と一致して、非プロリンリッチな親水性領域（アミノ酸１０６から１２０）は、２つの膜貫通ドメイン（アミノ酸７２から９７および１２２から１５０）の間に位置し、細胞質内を向いていることが示唆された。」 ク （第２５９８頁右欄第９行～第３３行） 「Ｐ３０アドヘシンと哺乳類タンパク質の間で共有する交差反応性のエピトープ Ｐ３０アドヘシンの多くの領域は、真核生物の構造プロテインと重要なアミノ酸相同性を示す（２、７、１０）。例えば、図５Ａ、Ｂに示すＡ－Ｂ－Ｃのプロリンリッチな表面露出繰り返しドメインと上流の表面接近型高親水性領域は、ケラチン、ミオシン、フィブリン－ゲンと４２～５６％のアミノ酸の配列同一性を示している。材料と方法に記載されているように、これらのＰ３０領域に対するウサギの単特異的抗体を作製し（図５Ａ）、これらの抗体をプールしてヒトケラチン、ミオシン、フィブリノーゲンとインキュベートした。図７は、これらのＰ３０エピトープとヒト構造タンパク質との間で観察された免疫学的交差反応性を示している。個別に見ると、Ａ－Ｂプロリンリッチリピートに対する抗体は、ヒトのケラチン、ミオシン、フィブリノーゲンと強く反応し、Ａ－Ｃプロリンリッチ領域に対する抗体はフィブリノーゲンと強く反応し、上流の非繰り返し非プロリンリッチ領域に対する抗体はケラチン、ミオシン、アクチン、トロポニンと強く反応した（データは示さず）。また、ヒトフィブリノーゲンに対して作製したヤギ抗体は、野生型Ｐ３０アドヘシンおよび変異型７のＰ２５切断ペプチドと交差反応したが、変異型３のペプチドとは反応しなかった（図８）。さらに、マイコプラズマ・ニューモニエによる呼吸器感染症が確認された患者の代表的な血清は、ヒト構造タンパク質に対する抗体価の上昇を示した（４１；未発表データ）。」 ケ （図６） 「 ［図：0001399400000004.jpg］ 」 コ （第２５９８頁右欄図６説明文） 「図６ 野生型および変異型マイコプラズマ・ニューモニエの全細胞ＲＩＰを、図５Ａの凡例に記載された合成ペプチドに対して上昇させたウサギ抗Ｐ３０単特異的抗体で行った。（Ａ）上流の非プロリンリッチなＮ末端配列に対して反応する抗体によるイムノブロット。（Ｂ）Ａ－Ｂプロリンリッチなカルボキシ末端反復領域に対する抗体でイムノブロットした。Ａ－Ｃ領域に対する抗血清を用いた場合、パネルＢと同じ結果が得られた。Ｐｂは出血前血清、Ｉｍは免疫血清。左の数字は分子サイズ（キロダルトン）である。アスタリスクはマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０（３０－ｋＤａ）アドへシンの位置を示している。」 サ （第２６００頁左欄第４３行～第５４行） 「最近、我々は、感染後の自己免疫が、マイコプラズマのアドへシンと真核生物のマトリックス成分との間に存在する分子模倣から生じる可能性があるといったメカニズムについて述べた（７，８，４１）。これらの観察と一致するように、我々はＰ３０アドへジンの特定のドメインに対して作成した単特異的抗体が、ヒトフィブリノーゲン、ケラチン、ミオシンと交差反応することを示した（図７）。さらに、この共通の免疫反応性を示す証拠として抗フィブリノーゲン抗体を用いると、野生型Ｐ３０アドヘシンおよび変異型Ｐ２５ペプチドに結合した（図８）。これらの結果は、自己免疫疾患とマイコプラズマ感染症との臨床的関連性を補強するものである（７－９，４１）。」 （３） 甲Ａ１先願発明の認定 上記（１）エの記載事項には、配列番号１のマイコプラズマ・ニューモニエ由来のＰ３０タンパク質のアミノ酸配列より、Ｎ末端側に存在するプロリンを多く含む領域からエピトープとなり得る可能性のあるアミノ酸配列を選択し、配列番号３乃至５のアミノ酸配列からなるポリペプチドを合成したこと、合成したポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端から１７８－１８９番目のＧＭＡＰＲＰＧＭＰＰＨＰ（配列番号３）、１９０－２０１番目のＧＭＡＰＲＰＧＦＰＰＱＰ（配列番号４）および、２５０－２６２番目のＧＭＡＰＲＰＧＭＱＰＰＲＰ（配列番号５）であったこと、配列番号３に示す配列は、Ｎ末端から２０２－２１３番目および２２６－２３７番目において同様の配列が存在し、また配列番号４に示す配列は２１４－２２５番目および２３８－２４９番目において同様の配列が存在すること、記載事項１（１）カには、モノクローナル抗体ＢＬＭＰ００４は、配列番号３、配列番号４および配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチド全てに対し特異的に反応を示したことが記載されているといえる。 そして、上記（１）エ及びカの記載事項は、甲Ａ１の２にも存在し、優先権主張の効果を受けることができるから、先の出願（特願２０１５－１５２５３号）に係る以下の発明が記載されているものと認められる（以下、「甲Ａ１先願発明」という。） 「マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質の配列番号３（ＧＭＡＰＲＰＧＭＰＰＨＰ；１７８－１８９番目、２０２－２１３番目および２２６－２３７番目）、配列番号４（ＧＭＡＰＲＰＧＦＰＰＱＰ；１９０－２０１番目、２１４－２２５番目および２３８－２４９番目）及び配列番号５（ＧＭＡＰＲＰＧＭＱＰＰＲＰ；２５０－２６２番目）のアミノ酸配列に特異的に反応するモノクローナル抗体ＢＬＭＰ４。」 （４） 本件特許発明１と甲Ａ１先願発明との対比 上記（１）エの記載事項のとおり、甲Ａ１には、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５が、それぞれＰ３０タンパク質のＮ末端から、１７８－１８９番目、１９０－２０１番目、及び２５０－２６２番目のアミノ酸配列を含むことが記載され、また、「配列番号３に示す配列は、Ｎ末端から２０２－２１３番目および２２６－２３７番目において同様の配列が存在し、また配列番号４に示す配列は２１４－２２５番目および２３８－２４９番目において同様の配列が存在する」ことが記載されていることから、甲Ａ１先願発明は、「Ｐ３０タンパクにおける、Ｎ末端より１７７番目から２７４番目までのＣ末端側に複数回出願するアミノ酸配列に特異的に反応する」ものであるといえる。 また、上記（１）エ、（１）オの記載事項のとおり、甲Ａ１には、Ｐ３０タンパク質のＮ末端側から１７８－１８９番目、１９０－２０１番目、及び２５０－２６２番目のアミノ酸配列に特異的に反応するモノクローナル抗体が、Ｐ３０タンパク質のＮ末端側から１０１－１２５番目のアミノ酸配列番号及び１２６－１４５番目のアミノ酸配列に対して極めて低い反応性を示していることが記載されていること、及びＰ３０タンパク質のＮ末端から１７７番目までに、配列番号３～５の配列が存在しないことを考慮すれば、甲Ａ１先願発明は、「Ｐ３０タンパク」の「Ｎ末端から１７６番目までには反応」しない蓋然性が高いものと認められる。 そうすると、本件特許発明１と甲Ａ１先願発明は、 「マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のＰ３０タンパクにおける、Ｎ末端より１７７番目から２７４番目までのＣ末端側に複数回出現するアミノ酸配列に特異的に反応するが、Ｎ末端から１７６番目までには反応しないモノクローナル抗体。」であるという点で一致し、以下の点で相違していると認められる。 （相違点１） 本件特許発明１は、「モノクローナル抗体が特異的に反応するアミノ酸配列がＰＧＭＡＰＲＰ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｍｅｔ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ）であると共に、アミノ酸配列ＰＧＭＡＰＲには反応」しないのに対し、 甲Ａ１先願発明は、モノクローナル抗体が特異的に反応するアミノ酸配列が配列番号３（ＧＭＡＰＲＰＧＭＰＰＨＰ）、配列番号４（ＧＭＡＰＲＰＧＦＰＰＱＰ）、及び配列番号５（ＧＭＡＰＲＰＧＭＱＰＰＲＰ）である点 （相違点２） 本件特許発明１は、モノクローナル抗体が「ケラチン、フィブリノーゲンにも反応しない」のに対し、 甲Ａ１先願発明は、そのようなことが明らかではない点 （５） 相違点１～２の判断 ＜相違点１について＞ 甲Ａ１先願発明の「モノクローナル抗体」は、配列番号３（ＧＭＡＰＲＰＧＭＰＰＨＰ）、配列番号４（ＧＭＡＰＲＰＧＦＰＰＱＰ）及び配列番号５（ＧＭＡＰＲＰＧＭＱＰＰＲＰ）のアミノ酸配列に特異的に反応することから、その共通配列のうちの多くを占める「ＧＭＡＰＲＰ」をもエピトープとし、特異的に反応する蓋然性が高く、また、これと共通のアミノ酸配列を有する本件特許発明１の「ＰＧＭＡＰＲＰ」についても反応する蓋然性が高いといえる。 他方、甲Ａ１には、甲Ａ１先願発明の「モノクローナル抗体」が「アミノ酸配列ＰＧＭＡＰＲ」に反応しないことについて具体的に記載はないものの、上述の同様の理由により、甲Ａ１先願発明の「モノクローナル抗体」は、本件特許発明１の「ＰＧＭＡＰＲ」をもエピトープとし、反応する蓋然性が高いといえる。（下線部は当審による。） したがって、共通するアミノ酸配列を有するという観点からすると、甲Ａ１先願発明が「アミノ酸配列ＰＧＭＡＰＲには反応」しないと認定することはできない。 なお、異議申立人Ａは、異議申立書等において、甲Ａ１先願発明の「モノクローナル抗体」が「アミノ酸配列ＰＧＭＡＰＲには反応」しないことを裏付ける証拠を提出していない。 ＜相違点２について＞ 甲Ａ１には、配列番号３～５のアミノ酸配列に特異的に反応するモノクローナル抗体が「ケラチン、フィブリノーゲンにも反応しない」ことについて何ら記載されていない。 他方で、上記の（２）クのとおり、甲Ａ３には、「Ａ－Ｂプロリンリッチリピートに対する抗体は、ヒトのケラチン、ミオシン、フィブリノーゲンと強く反応し、Ａ－Ｃプロリンリッチ領域に対する抗体はフィブリノーゲンと強く反応し、上流の非繰り返し非プロリンリッチ領域に対する抗体はケラチン、ミオシン、アクチン、トロポニンと強く反応した（データは示さず）。また、ヒトフィブリノーゲンに対して作製したヤギ抗体は、野生型Ｐ３０アドヘシンおよび変異型７のＰ２５切断ペプチドと交差反応したが、変異型３のペプチドとは反応しなかった（図８）」と記載されており、Ｐ３０タンパクのＮ末端から１７７番目以降のＣ末端側のアミノ酸配列に特徴的な繰り返し配列に対して結合する単特異的抗体がケラチン、ミオシン、フィブリノーゲンと免疫的な交差反応性を示す事実があることから、甲Ａ１のＰ３０タンパク質のＮ末端から１７８番目以降の繰り返し配列に特異的に反応するモノクローナル抗体は「ケラチン、フィブリノーゲンにも反応しない」と認定することはできない。 なお、異議申立人Ａは、甲Ａ３で用いられている抗体は、Ｐ３０タンパク質のＣ末端プロリンリッチ領域のアミノ酸配列をキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に連結してウサギに免疫することにより得られた単特異的抗体試薬であって、抗血清又はポリクローナル抗体と同視されるものであり、ハイブリドーマを取得して得られるモノクローナル抗体ではないので、Ｐ３０タンパク質に対するモノクローナル抗体がケラチン、フィブリノーゲン、ミオシンなどの構造タンパクと交差反応することを開示するものではないとし、Ｐ３０と相同性の低いケラチン、フィブリノーゲンと反応しないことは当業者に自明である旨、主張している。 しかしながら、上記の１（２）クのとおり、甲Ａ３には、「例えば、図５Ａ及びＢに図示されたＡ－Ｂ－Ｃプロリンリッチ表面露出リピートドメイン及び上流の表面不達高親水性領域はケラチン、ミオシン及びフィブリノーゲンと４２～５６％の配列同一性を示す。・・・個別的に言えば、Ａ－Ｂプロリンリッチリピートに対して生成した抗体はヒトケラチン、ミオシン及びフィブリノーゲンと強く反応し、Ａ－Ｃプロリンリッチ領域に対する抗体はケラチン、ミオシン、アクチン及びトロポニンと強く反応した」こことが記載され、このことはＰ３０タンパク質のＣ末端側のプロリンリッチ領域に対する単特異的抗体は、Ａ－Ｂ－Ｃプロリンリッチ表面露出リピートドメインがケラチン、ミオシン及びフィブリノーゲンと４２～５６％の配列同一性しか有していないにも関わらず、これらのタンパク質と強く反応する事実を示すものである。 そして、ポリクローナル抗体と、モノクローナル抗体との間で事情を異にすると認められる特段の根拠が示されていないことからすると、甲第３号証において、モノクローナル抗体での具体例がないことをもって、「Ｐ３０タンパク質に対するモノクローナル抗体がケラチン、フィブリノーゲン、ミオシンなどの構造タンパクと交差反応することを開示するものではない」と結論付けることはできない。 したがって、Ｐ３０タンパクのＣ末端側のプロリンリッチ領域を標的とする抗体がケラチン、フィブリノーゲン、ミオシンなどの構造タンパクと交差反応性を示す事実がある以上、甲Ａ１先願発明の「モノクローナル抗体」が「ケラチン、フィブリノーゲンにも反応しない」とはいえない。 よって、相違点１ないし２は実質的な相違点であり、本件特許発明１は、甲Ａ１先願発明と同一又は実質同一であるとは認められない。 （６） 小括 以上より、本件特許発明１は、甲Ａ１先願発明と同一又は実質同一であるとは認められない。 また、本件特許発明３ないし４は、いずれも、本件特許発明１を直接又は間接的に引用するものであり、相違点１ないし２の点で甲Ａ１先願発明と相違するから、本件特許発明３ないし４もまた、甲Ａ１先願発明と同一であるとも、実質的に同一であるともいえない。 したがって、本件特許発明１、３、４は、特許法第２９条の２の規定により、特許を受けることができないものであるとはいえないから、上記発明に係る特許は、申立理由Ａ１によって取り消すことはできない。 ２ 申立理由Ａ２（進歩性）について （１） 甲Ａ２の記載事項 甲Ａ２の記載事項は以下に示すとおりである。なお、下線部は当審による。 ア 「［請求の範囲］ ［請求項１］マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体を用いることを特徴とするマイコプラズマ・ニューモニエの免疫学的検出法。 ［請求項２］前記抗体が、配列番号２のアミノ酸配列の領域に存在するＰ３０タンパク質のエピトープを認識する抗体である、請求項１に記載の検出法。 ［請求項３］前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１又は２に記載の検出法。 ・・・ ［請求項１４］マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体を少なくとも備えてなるマイコプラズマ・ニューモニエの免疫学的測定キット。 ・・・ ［請求項２２］マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質を認識する抗体。 ［請求項２３］前記抗体が、配列番号２のアミノ酸配列の領域に存在するＰ３０タンパク質のエピトープを認識する抗体である、請求項２２に記載の抗体。 ［請求項２４］前記抗体がモノクローナル抗体である請求項２２又は２３に記載の抗体。」 イ 「［００２６］ Ｐ３０タンパク質は分子量３０ＫＤａのタンパク質であり、Ｐ１タンパク質と同様に接着と病原性に関係する接着タンパク質の１つである。マイコプラズマ・ニューモニエの菌体においては、接着器官の先端部の細胞表面に局在しており、細胞膜内に埋没しているＮ末端と細胞膜外に存在するＣ末端を持つ膜貫通型タンパク質である。また、Ｃ末端側にはプロリンを多く含むアミノ酸配列が存在し、前記プロリンを多く含むアミノ酸配列の繰り返し構造が存在する。一般的にプロリンを含むアミノ酸配列からなる領域は、立体的な高次構造をとることが知られており、抗体の反応するエピトープとなり得ることが知られている。 したがって、本発明で使用する抗体は、Ｐ３０タンパク質の細胞外領域における、プロリンを多く含むアミノ酸配列の繰り返し構造からなる部分を認識する抗体である可能性が高い。また配列番号２のアミノ酸配列は、前記細胞外領域を構成するアミノ酸配列であり、前記プロリンを多く含むアミノ酸配列の繰り返し構造を含む領域を含み、Ｐ３０タンパク質におけるエピトープを含むと考えられる領域である。 ［００２７］ かくして、本発明の他の局面によれば、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質を認識する抗体が提供される。さらには、配列番号２のアミノ酸配列の領域に存在するＰ３０タンパク質のエピトープを認識する抗体が提供される。」 ウ 「［００４６］（実施例１：組換えＰ３０タンパク質の発現と精製） マイコプラズマ・ニューモニエ Ｍ１２９株のＰ３０タンパク質のアミノ酸配列をＤＤＢＪ（国立遺伝学研究所データベース）より入手した。前記Ｐ３０タンパク質のアミノ酸配列から、膜貫通ドメインを除いた細胞外領域である配列番号２に示すアミノ酸配列（ＡＡ７４－２７４）を特定し、対応する遺伝子配列を合成した。Ｈｉｓ－ｔａｇ発現用ベクターであるｐＥＴ３０２／ＮＴ－Ｈｉｓを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した後、脱リン酸化処理としてアルカリフォスファターゼにより処理し、前記遺伝子配列と混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いてライゲーション反応をおこなった。目的遺伝子を組み込んだ組換えＰ３０プラスミドを組換え蛋白発現用宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に導入した。導入菌をＬＢ寒天平板培地で培養し、得られたコロニーをＬＢ液体培地で培養した。さらに１ｍＭ ＩＰＴＧ（タカラバイオ）を添加して組換えＰ３０タンパク質の発現を誘導した後、Ｅ．ｃｏｌｉ回収した。回収した菌を可溶化バッファー［０．５％Ｔｒｉｒｏｎ Ｘ－１００（ｓｉｇｍａ）、１０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、２０ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅおよび０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）］に再浮遊し、超音波処理により可溶化した後、組換えＰ３０タンパク質をＨｉｓ ｔｒａｐ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて精製した。この精製タンパク質をリン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳと称する）に対して透析し、目的の組換えＰ３０タンパク質とした。」 エ 「［００４７］（実施例２：組換えＰ３０タンパク質に対するモノクローナル抗体の作出） 実施例１で得られた組換えＰ３０タンパク質を免疫用抗原として、組換えＰ３０タンパク質に対するモノクローナル抗体（以下、抗Ｐ３０抗体と称する）を作出した。モノクローナル抗体の作出は常法に従っておこなった。１００μｇの組換えＰ３０タンパク質と等量のＡｄｕｖａｎｔ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ（Ｄｉｆｃｏ）を混合して、マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、５週齢、日本ＳＬＣ）に３回免疫し、その脾臓細胞を細胞融合に用いた。細胞融合には、マウスの骨髄腫細胞であるＳｐ２／０－Ａｇ１４細胞（Ｓｈｕｌｍａｎら、１９７８）を用いた。細胞の培養には、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）にＬ－グルタミン ０．３ｍｇ／ｍｌ、ペニシリンＧカリウム １００単位／ｍｌ、硫酸ストレプトマイシン １００μg／ｍｌ、Ｇｅｎｔａｃｉｎ ４０μｇ／ｍｌを添加し（ＤＭＥＭ）、これに牛胎児血清（ＪＲＨ）を１０％となるように加えた培養液を用いた。細胞融合は、免疫マウスの脾臓細胞とＳｐ２／０－Ａｇ１４細胞を混合し、そこにＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ）を添加することにより行った。融合細胞はＨＡＴ－ＤＭＥＭ［０．１ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｈｙｐｏｘａｎｔｉｎｅ、０．４μＭ Ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎおよび０．０１６ｍＭ Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ）を含む血清加ＤＭＥＭ］で培養し、酵素結合抗体法（ＥＬＩＳＡ）により培養上清中の抗体産生を確認した。抗体産生陽性の細胞をＨＴ－ＤＭＥＭ［０．１ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｈｙｐｏｘａｎｔｉｎｅおよび０．１６ｍＭ Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅを含む血清加ＤＭＥＭ］で培養し、さらに血清加ＤＭＥＭで培養を続けた。」 オ 「［００４８］（実施例３：モノクローナル抗体の調製） クローニングした細胞は、２，６，１０，１４－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ（Ｓｉｇｍａ）を接種しておいたマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、リタイア、日本ＳＬＣ）に腹腔内接種し、腹水を採取した。この腹水をプロテインＧカラムに供し、モノクローナル抗体を精製した。作出したモノクローナル抗体のアイソタイプは、Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｓｉｇｍａ）を用いて同定した。 最終的にＰ３０タンパク質に対するモノクローナル抗体産生細胞が５クローン得られた。これらのモノクローナル抗体のイムノグロブリンアイソタイプは全てＩｇＧ１であった。」 カ 「［００５２］（実施例４：抗Ｐ３０抗体と抗Ｐ１抗体の反応性の比較検討） 実施例３により得られた抗Ｐ３０抗体及び比較例２で得られた抗Ｐ１抗体の反応性を確認した。参考例１にて調製したマイコプラズマ・ニューモニエＭ１２９株及びＦＨ株、マイコプラズマ・ジェニタリウムの菌液を所定濃度にて固相化したマイクロプレートに、実施例２及び比較例２にて作製した各抗体を添加し、室温にて１時間反応させた。次にウェル内の溶液を吸引除去し、洗浄後、ビオチン標識抗マウス抗体を反応させた。１時間の反応の後、ウェル内の溶液を吸引除去し洗浄した後、アビジン標識ホースラディッシュペルオキシダーゼを添加し反応させた。その後、発色基質として３，３‘，５，５’－テトラメチルベンジン（ＴＭＢＺ）溶液を添加し反応させ、２規定の硫酸により反応を停止させた。マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｒａｄ）にて主波長４５０ｎｍにて測定した。結果を表１から表３に示す。」 キ 表１～３ 「 ［図：0001399400000005.jpg］ ［図：0001399400000006.jpg］ ［図：0001399400000007.jpg］ 」 ク 「［００５６］表１から明らかなように、実施例２にて作製された抗Ｐ３０抗体は、マイコプラズマ・ニューモニエのＭ１２９株およびＦＨ株のいずれにも高い反応性を示し、陰性対照のマイコプラズマ・ジェニタリウムに対しては交差反応しないことを確認した。 また表２および表３から明らかなように、比較例２にて作製した抗Ｐ１抗体は、マイコプラズマ・ニューモニエのＭ１２９株とＦＨ株に対し、いずれか一方に反応性が偏る抗体であることが示された。反応性の偏りはＰ１遺伝子型によるものであり、Ｐ１遺伝子型によるＰ１タンパク質のアミノ酸配列の相違がモノクローナル抗体の反応性に表れている可能性が高い。また陰性対照としたマイコプラズマ・ジェニタリウムに対する若干の交差反応性を認めた。 したがって、Ｐ３０タンパク質はマイコプラズマ・ニューモニエにおいて共通して保存されており、かつ、特異的なタンパク質であることが示され、さらにＰ３０タンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体を取得した。 ［００５７］（実施例５：抗Ｐ３０抗体を用いたイムノクロマトグラフィーテストストリップの作製） （１）抗Ｐ３０抗体の調製 実施例３で得られたハイブリドーマＢＬＡ－００１およびＢＬＡ－００２をマウス腹腔に接種し得られた腹水それぞれを、さらに常法によりプロテインＧを用いたＩｇＧ精製を行い、抗Ｐ３０抗体とした。 ［００５８］（２）白金－金コロイド粒子溶液の調製 使用するガラス器具の全てを王水で洗浄した。３９０ｍｌの超純水をフラスコに入れて沸騰させ、この沸騰水に塩化金酸水溶液（水溶液１リットル当たり金として１ｇ、片山科学工業株式会社製）３０ｍｌを加え、その後、１重量％クエン酸ナトリウム水溶液６０ｍｌを加え、６分４５秒後に、塩化白金酸水溶液（水溶液１リットル当たり白金として１ｇ、和光純薬工業株式会社製）３０ｍｌを加えた。塩化白金酸水溶液添加から５分後に１重量％クエン酸ナトリウム水溶液６０ｍｌを加え、４時間、還流を行い、白金－金コロイド懸濁液を得た。 ［００５９］（３）白金－金コロイド標識抗Ｐ３０抗体溶液の調製 白金ー金コロイド標識する抗Ｐ３０抗体として、上記（１）で得られたクローンＢＬＡ－００２を用い、下記の手順で白金－金コロイド標識を行った。 抗Ｐ３０抗体の蛋白換算重量１μｇ（以下、抗体の蛋白換算重量を示すとき、単に、その精製蛋白質の重量分析による重量数値で示す）と上記（２）の白金－金コロイド溶液１ｍｌとを混合し、室温で２分間静置してこの抗体のことごとくを白金－金コロイド粒子表面に結合させた後、白金－金コロイド溶液における最終濃度が１％となるように１０％ウシ血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」と記す）水溶液を加え、この白金－金コロイド粒子の残余の表面をことごとくこのＢＳＡでブロックして、白金－金コロイド標識抗Ｐ３０抗体（以下、「白金－金コロイド標識抗体」と記す）溶液を調製した。この溶液を遠心分離（５６００×Ｇ、３０分間）して白金－金コロイド標識抗体を沈殿せしめ、上清液を除いて白金－金コロイド標識抗体を得た。この白金－金コロイド標識抗体を１０％サッカロース・１％ＢＳＡ・０．５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００を含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁して白金－金コロイド標識抗体溶液を得た。 ［００６０］（４）マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質検出イムノクロマトグラフィーテストストリップの作製 （４－１）マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質と白金―金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位 幅５ｍｍ、長さ３６ｍｍの細長い帯状のニトロセルロース膜をクロマトグラフ媒体のクロマト展開用膜担体３として用意した。抗Ｐ３０抗体１．０ｍｇ／ｍｌが含有されてなる溶液０．５μｌを、このクロマト展開用膜担体３におけるクロマト展開開始点側の末端から７．５ｍｍの位置にライン状に塗布して、これを室温で乾燥し、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質と白金ー金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位３１とした。この塗布用抗Ｐ３０抗体として、上記（１）で得られたクローンＢＬＡ－００１を用いた。 （４－２）白金－金コロイド標識抗体含浸部材 ５ｍｍ×１５ｍｍの帯状のガラス繊維不織布に、白金－金コロイド標識抗体溶液３７．５μｌを含浸せしめ、これを室温で乾燥させて白金－金コロイド標識抗体含浸部材２とした。 （４－３）イムノクロマトグラフィーテストストリップの作製 上記クロマト展開用膜担体３、上記標識抗体含浸部材２の他に、試料添加用部材５として綿布と、吸収用部材４として濾紙を用意した。そして、これらの部材を用いて、図１と同様のイムノクロマトグラフィーテストストリップを作製した。 ［００６１］（５）試験 参考例１で得られたマイコプラズマ・ニューモニエのＭ１２９株およびＦＨ株の培養菌液を検体抽出液で希釈して、所定濃度に調製し、被検試料とした。そして、被検試料１２０μｌを用いて上記（４）で得られたテストストリップの試料添加用部材５にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で１５分放置後、上記捕捉部位３１で捕捉されたＰ３０タンパク質と白金ー金コロイド標識抗体との複合体の捕捉量を肉眼で観察した。捕捉量は、その量に比例して増減する黒色の呈色度合いを肉眼で－（着色なし）、±（微弱な着色）、＋（明確な着色）、＋＋（顕著な着色）、＋＋＋（顕著な着色）の５段階に区分して判定した。 その結果を表４に示す。表４から明らかなように、２種の抗Ｐ３０抗体を使用したイムノクロマトグラフィー測定法により、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質を検出できることがわかった。またＢｌａｎｋにおける非特異的呈色も確認されなかった。」 ケ 表４ 「 ［図：0001399400000008.jpg］ 」 コ 表５ 「 ［図：0001399400000009.jpg］ 」 サ 「［００６６］ 表５から明らかなように、Ｐ３０タンパク質検出イムノクロマトグラフィーテストストリップを用いた場合、Ｍ１２９株では１×１０７ＣＦＵ／ｍｌ、ＦＨ株では１×１０６ＣＦＵ／ｍｌで顕著な呈色を示し、Ｍ１２９株では１×１０６ＣＦＵ／ｍｌ、ＦＨ株では１×１０５ＣＦＵ／ｍｌで明確な呈色を示した。 一方、Ｐ１タンパク質検出イムノクロマトグラフィーテストストリップを用いた場合には、Ｍ１２９株では１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ、ＦＨ株では１×１０７ＣＦＵ／ｍｌにて明確な呈色を示した。」 シ 「［００６７］表５の結果から明らかなように、同じ呈色強度を示した被検試料の菌濃度を比較した結果、Ｐ３０タンパク質検出イムノクロマトグラフィーテストストリップが、Ｐ１タンパク質検出イムノクロマトグラフィーテストストリップに対し、Ｍ１２９株およびＦＨ株との反応性において１００倍の検出感度差があることが示された。 以上の結果より、抗Ｐ３０抗体を用いた、Ｐ３０タンパク質検出イムノクロマトグラフィーテストストリップにより、マイコプラズマ・ニューモニエを高感度かつ特異的に検出することが可能であることが示された。」 （２） 甲Ａ２発明の認定 上記（１）ア、ウ～クの記載事項によれば、甲Ａ２には、マイコプラズマ・ニューモニエの配列番号２のアミノ酸配列の領域に存在するＰ３０タンパク質のエピトープを認識するモノクローナル抗体が記載されていると認められる。 上記（１）ウの「Ｐ３０タンパク質のアミノ酸配列から、膜貫通ドメインを除いた細胞外領域である配列番号２に示すアミノ酸配列（ＡＡ７４－２７４）」から、配列番号２で示されるアミノ酸配列は、Ｐ３０タンパク質のＮ末端から７４～２７４番目のアミノ酸配列であると認められる。 以上より、甲Ａ２には、以下の発明が記載されているものと認められる（以下、「甲Ａ２発明」という。） 「マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のＮ末端から７４～２７４番目のアミノ酸配列の領域に存在するエピトープを認識するモノクローナル抗体。」 （３） 本件特許発明１と甲Ａ２発明との対比 本件特許発明１の「アミノ酸配列に特異的に反応する」は、甲Ａ２発明の「アミノ酸配列の領域に存在するエピトープを認識する」に相当する。 したがって、本件特許発明１と甲Ａ２発明は、 「マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のＰ３０タンパクにおけるアミノ酸配列に特異的に反応するモノクローナル抗体。」であるという点で一致し、以下の点で相違していると認められる。 （相違点３） モノクローナル抗体が特異的に反応するアミノ酸配列について、 本件特許発明１は、「Ｐ３０タンパクにおける、Ｎ末端より１７７番目から２７４番目までのＣ末端側に複数回出現するアミノ酸配列」に特異的に反応し、「Ｐ３０タンパク」の「Ｎ末端から１７６番目までには反応」しないものであるのに対し、 甲Ａ２発明は、「Ｐ３０タンパク質のＮ末端から７４～２７４番目のアミノ酸配列」のいずれかに特異的に反応するものである点 （相違点４） モノクローナル抗体が特異的に反応するアミノ酸配列について、 本件特許発明１は、「ＰＧＭＡＰＲＰ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｍｅｔ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ）」に特異的に反応し、「アミノ酸配列ＰＧＭＡＰＲには反応」しないものであるのに対し、 甲Ａ２発明では、そのようなアミノ酸配列に反応しないことが明らかでない点 （相違点５） 本件特許発明１は、「ケラチン、フィブリノーゲンにも反応しない」のに対し、 甲Ａ２発明は、そのようなことが明らかではない点 （４） 相違点３～５の判断 ＜相違点３について＞ 上記（１）イのとおり、甲Ａ２には、「Ｃ末端側にはプロリンを多く含むアミノ酸配列が存在し、前記プロリンを多く含むアミノ酸配列の繰り返し構造が存在する。一般的にプロリンを含むアミノ酸配列からなる領域は、立体的な高次構造をとることが知られており、抗体の反応するエピトープとなり得る」ことが記載されている。 また、本願明細書の段落［００５８］には、Ｐ３０タンパクの全長配列が記載され、Ｐ３０タンパクは、Ｎ末端から１４９番目以降に、プロリンを多く含むアミノ酸配列の繰り返し構造を有するものである。 しかしながら、甲Ａ２発明の「モノクローナル抗体」について、甲Ａ２には、Ｐ３０タンパク質の７４～２７４番目のアミノ酸配列のうち、「Ｎ末端より１７７番目から２７４番目までのＣ末端側に複数回出現するアミノ酸配列」をエピトープとして認識し、他方、Ｐ３０タンパク質の１～２７４番目の中から、「Ｎ末端から１７６番目」をエピトープとして認識しないものを選択することを動機付ける記載はないから、これを選択することは、当業者といえども容易に想到し得ることとはいえない。 ＜相違点４について＞ 本件特許発明１は、「ＰＧＭＡＰＲＰ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｍｅｔ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ）」に特異的に反応し、「アミノ酸配列ＰＧＭＡＰＲには反応」しないものである。上記（１）イのとおり、甲Ａ２には、「Ｐ３０タンパク質の細胞外領域における、プロリンを多く含むアミノ酸配列の繰り返し構造からなる部分を認識する抗体」を用いることが記載されているにとどまり、ＰＧＭＡＰＲＰ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｍｅｔ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ）」に特異的に反応し、「アミノ酸配列ＰＧＭＡＰＲには反応」しない抗体については記載も示唆もない。また、上記（２）ウのとおり、甲Ａ３には、アドヘシンＰ３０のプロリンリッチなＣ末端繰り返し領域由来の２つの合成ペプチド（アミノ酸ＰＧＭＡＰＲＰＧＭＰＰＨ［リピートＡおよびＢ］およびＰＧＭＡＰＲＰＧＦＰＰＣＡ［リピートＡおよびＣ］）を免疫原として産生した抗体が記載されているものの、甲Ａ２発明のモノクローナル抗体について、ＰＧＭＡＰＲＰ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｍｅｔ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ）」に特異的に反応し、「アミノ酸配列ＰＧＭＡＰＲには反応」しない抗体を選択することを動機付ける記載がないから、甲Ａ２発明に甲Ａ３記載の事項を組み合わせたとしても、ＰＧＭＡＰＲＰ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｍｅｔ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ）」に特異的に反応し、「アミノ酸配列ＰＧＭＡＰＲには反応」しない抗体を選択することは、当業者であっても容易に想到し得ることとはいえない。 なお、異議申立人Ａは、「当業者であれば、配列番号２のアミノ酸配列の中でプロリンを多く含むアミノ酸配列とは、プロリンが連続して出現する部分、又は、プロリンが一つおきに出現する領域として特定することができ、・・・そのうち、ＰＰＱＰ（ＰＰＱ、ＰＱＰを含む）とＰＰＨＰ（ＰＰＨ、ＰＨＰを含む）とＰＲＰなどの配列は頻回出現していることが認められる」旨、主張している。 しかしながら、甲Ａ２の配列番号２には、異議申立人Ａが主張するように、プロリンを多く含む繰り返し配列として、ＰＰＱＰ、ＰＰＨＰ、ＰＲＰなどが複数存在するところ、そのような複数のアミノ酸配列からＰＲＰを選択し、さらに、より長いアミノ酸配列を有する「ＰＧＭＡＰＲＰ」を選択した上で、「アミノ酸配列ＰＧＭＡＰＲには反応」しない抗体を選択することは、甲Ａ２、３の記載及び本件特許の出願時の技術常識に照らしても、当業者が容易に想到しうるとはいえない。 また、異議申立人Ａは、異議申立書等において、甲Ａ２発明の「モノクローナル抗体」は、「ＰＧＭＡＰＲＰ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｍｅｔ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ）」に特異的に反応し、「アミノ酸配列ＰＧＭＡＰＲには反応」しないことを裏付ける証拠を提出していない。 ＜相違点５について＞ 甲Ａ２には、甲Ａ２発明の「モノクローナル抗体」が「ケラチン、フィブリノーゲンにも反応しない」ことについて何ら記載されていない。 他方で、上記１（５）において、相違点２について述べたのと同様に、甲Ａ３における上記１（２）クの記載事項より、甲Ａ２のＰ３０タンパク質のＮ末端から１７８番目以降の繰り返し配列に特異的に反応するモノクローナル抗体は「ケラチン、フィブリノーゲンにも反応しない」と認定することはできない。 よって、本件特許発明１は、甲Ａ２発明に基づいて、又は甲Ａ２発明及び甲Ａ３の記載事項に基づいて、当業者が容易に発明できたものとはいえない。 （５） 本件特許発明２と甲Ａ２発明との対比 本件特許発明２と甲Ａ２発明は、 「マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のＰ３０タンパクにおけるアミノ酸配列に特異的に反応するモノクローナル抗体。」であるという点で一致し、以下の点で相違していると認められる。 （相違点６） モノクローナル抗体が特異的に反応するアミノ酸配列について、 本件特許発明２は、「Ｐ３０タンパクにおける、Ｎ末端より１７７番目から２７４番目までのＣ末端側に複数回出現するアミノ酸配列」に特異的に反応し、「Ｐ３０タンパク」の「Ｎ末端から１７６番目までには反応」しないものであるのに対し、 甲Ａ２発明は、「Ｐ３０タンパク質のＮ末端から７４～２７４番目のアミノ酸配列」のいずれかに特異的に反応するものである点 （相違点７） モノクローナル抗体が特異的に反応するアミノ酸配列について、 本件特許発明２は、「ＰＨＰＧＭＡＰ（Ｐｒｏ－Ｈｉｓ―Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｍｅｔ－Ａｌａ－Ｐｒｏ）」に特異的に反応し、「アミノ酸配列ＰＧＭＡＰＲには反応」しないものであるのに対し、 甲Ａ２発明では、そのようなアミノ酸配列に反応しないことが明らかでない点 （相違点８） 本件特許発明２は、「ケラチン、フィブリノーゲンにも反応しない」のに対し、 甲Ａ２発明は、そのようなことが明らかではない点 （６） 相違点６～８の判断 ＜相違点６について＞ 相違点６は、上記（４）の相違点３と同じであり、上記（４）において相違点３について述べたとおり、当業者であっても容易に想到し得るものとはいえない。 ＜相違点７について＞ 本件特許発明２は、「ＰＨＰＧＭＡＰ（Ｐｒｏ－Ｈｉｓ―Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｍｅｔ－Ａｌａ－Ｐｒｏ）」に特異的に反応し、「アミノ酸配列ＰＧＭＡＰＲには反応」しないものである。上記記載事項２（１）イに記載されているとおり、甲Ａ２には、「Ｐ３０タンパク質の細胞外領域における、プロリンを多く含むアミノ酸配列の繰り返し構造からなる部分を認識する抗体」を用いることが記載されているにとどまり、「ＰＨＰＧＭＡＰ（Ｐｒｏ－Ｈｉｓ―Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｍｅｔ－Ａｌａ－Ｐｒｏ）」に特異的に反応し、「アミノ酸配列ＰＧＭＡＰＲには反応」しない抗体については記載も示唆もない。また、上記（５）において相違点４について述べたのと同様に、甲Ａ３の記載をみても、甲Ａ２発明のモノクローナル抗体として、「ＰＨＰＧＭＡＰ（Ｐｒｏ－Ｈｉｓ―Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｍｅｔ－Ａｌａ－Ｐｒｏ）」に特異的に反応し、「アミノ酸配列ＰＧＭＡＰＲには反応」しない抗体を選択することを動機付ける記載はないから、甲Ａ２発明に甲Ａ３記載の事項を組み合わせたとしても、「ＰＨＰＧＭＡＰ（Ｐｒｏ－Ｈｉｓ―Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｍｅｔ－Ａｌａ－Ｐｒｏ）」に特異的に反応し、「アミノ酸配列ＰＧＭＡＰＲには反応」しない抗体を選択することは、当業者であっても容易に想到し得ることとはいえない。 ＜相違点８について＞ 相違点８は、上記（４）の相違点５と同じであり、上記（４）において相違点５の判断で述べたとおり、当業者であっても容易に想到し得るものとはいえない。 よって、本件特許発明２は、甲Ａ２発明に基づいて、又は甲Ａ２発明及び甲Ａ３の記載事項に基づいて、当業者が容易に発明できたものとはいえない。 （７） 小括 以上より、本件特許発明１ないし２は、甲Ａ２発明に基づいて、又は甲Ａ２発明及び甲Ａ３の記載事項に基づいて、当業者が容易に発明できたものとはいえない。 本件特許発明３ないし４は、本件特許発明１ないし２を直接又は間接的に引用するものであり、相違点３ないし５の点で、本件特許発明１ないし２が甲Ａ２発明に基づいて、又は甲Ａ２発明及び甲Ａ３の記載事項に基づいて、当業者が容易に発明できたものとはいえないから、本件特許発明３ないし４もまた甲Ａ２発明に基づいて、又は甲Ａ２発明及び甲Ａ３の記載事項に基づいて、当業者が容易に発明できたものとはいえない。 したがって、本件特許発明１ないし４は、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであるとはいえないから、上記発明に係る特許は、申立理由Ａ２によっては取り消すことはできない。 ３ 申立理由Ｂ１（実施可能要件）について （１）本件明細書に記載された事項 本件明細書の発明の詳細な説明には、以下の事項が記載されている。なお、下線部は当審による。 本ａ． 「【発明を実施するための最良の形態】 【００４８】 （開発の経緯） まず本発明者らが本願発明の完成に達するまでの経緯を述べる。 【００４９】 モノクローナル抗体の作製は、免疫原にマイコプラズマ・ニューモニエＦＨ株菌体の可溶化物を用いて常法に従って行った。 【００５０】 すなわち、マイコプラズマ・ニューモニエＦＨ株可溶化抗原と完全フロインドアジュバンドを混合して、エマルジョンを調製し、これをマウスの腹腔内に免疫した。 【００５１】 免疫から二週間後、同じくマイコプラズマ・ニューモニエＦＨ株可溶化抗原と不完全フロインドアジュバンドを混合してエマルジョンを調製し、前記マウスの腹腔内に追加免疫を３回行った。 【００５２】 最終免疫の３日後に、マウスから脾臓を摘出し、その中に含まれる免疫細胞を取り出し、ポリエチレングリコールの存在下で、骨髄腫ミエローマ細胞と細胞融合を行い、ハイブリドーマを調製した。各ハイブリドーマから産生される培養上清中の抗体を、抗原結合プレート、及び抗マウスＰＯＤ（西洋わさびペルオキシダーゼ）標識ポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法で確認することにより抗原に反応するモノクローナル抗体生産株２３種を選別した。 【００５３】 選別されたモノクローナル抗体は、それぞれ腹水化を行った後に、プロテインＧアフィニティークロマトカラムを用いてＩｇＧとして精製し、これらを用いてイムノクロマト法 の試作を行い反応性の確認を行った。 【００５４】 すなわち、それぞれのモノクローナル抗体を１ｍｇ／ｍｌ濃度でＰＢＳ緩衝液にて調製し、ニトロセルロースメンブレン（ミリポア社：ＨＦ０１３５ハイフローメンブレン）に１．３μＬ／ｃｍをライン状に塗布して結合させた。これを十分に乾燥させたのちに約５ｍｍ幅の短冊状に裁断してテストストリップを作製した。 【００５５】 一方、それぞれのモノクローナル抗体は金コロイド粒子（平均粒径６０μｍ）に結合させることで標識物を作製した。 【００５６】 これらを組み立ててイムノクロマト法の抗原サンドイッチによる検出試薬として作製し、マイコプラズマ・ニューモニエ抗原との反応性を確認した。 【００５７】 ここで、本発明者らは、Ｐ３０タンパクに反応性を有する、特に検出感度の高い２種のモノクローナル抗体を選定し、これらをそれぞれ抗マイコプラズマ モノクローナル抗体＃００４（以下、抗体＃００４）、と抗マイコプラズマ モノクローナル抗体＃００６（以下、抗体＃００６）と名付けた。」 本ｂ． 「【実施例】 【００６８】 ＜実施例１＞ ［合成ペプチドによるイムノクロマト競合法による測定］ Ｐ３０のアミノ酸配列ＰＲＰＧＭＰＰＨＰＧＭＡＰＲＰの中から以下に示すペプチドを作製した。これらを検体として使用し、マイコプラズマ・ニューモニエ抗原を固相に用いたイムノクロマト競合法による測定を行った。 【００６９】 （合成ペプチド） ペプチド１－１：ＰＲＰＧＭＰＰＨＰＧＭＡＰＲＰ ペプチド１－２：ＰＧＭＰＰＨＰＧＭＡＰＲＰ ペプチド１－３：ＧＭＰＰＨＰＧＭＡＰＲＰ ペプチド１－４：ＭＰＰＨＰＧＭＡＰＲＰ ペプチド１－５：ＰＨＰＧＭＡＰＲＰ ペプチド１－６：ＰＧＭＡＰＲＰ ペプチド１－７：ＰＧＭＡＰＲ ペプチド１－８：ＰＧＭＡＰ ペプチド１－９：ＭＰＰＨＰＧＭ ペプチド１－１０：ＧＭＰＰＨＰＧＭＡＰ ペプチド１－１１：ＭＰＰＨＰＧＭＡＰ ペプチド１－１２：ＧＭＰＰＨＰＧＭ ペプチド１－１３：ＰＰＨＰＧＭ 【００７０】 図１を参照しながら、以下検出装置の作製方法を示す。ここで、図１（ａ）は本発明の一実施の形態における検出装置の側面図、図１（ｂ）、（ｂ’）は同検出装置の正面図である。 【００７１】 図１に示すように、この検出装置は、滴下部１１、標識区域１２、多孔質担体１３、検出区域１４、対象区域１５、吸液部１６を有する。 【００７２】 また図中、Ａは、マイコプラズマ・ニューモニエ、Ｂは、本発明のモノクローナル抗体を標識したモノクローナル抗体標識物、Ｃは複合体、Ｘは合成ペプチドである。 【００７３】 この検出装置は、イムノクロマト競合法を利用した、モノクローナル抗体標識物の、種々の合成ペプチドへの反応性を確認するための装置であるが、他の要素は、イムノクロマト競合法を利用した検出装置として、通常使用されるもので差し支えない。以下、更に詳しく説明する。 【００７４】 （標識成分の調製） Ｇ．Ｆｒｅｎｓ（Ｎａｔｕｒｅ、２４１、２０－２２、１９７３）の方法に従い金コロイド粒子を作製した。この金コロイド１０ｍＬに対し、抗体♯００４を４０μｇ室温にて混合し、金コロイド標識抗体♯００４を調製した。同様にして金コロイド標識抗体♯００６も調製した。 【００７５】 （標識区域１２の調製） 金コロイド標識抗体♯００４をＯＤ５２０ｎｍ＝１．０となるように調製し、反応確認のために対照として金コロイド標識ウサギγグロブリンをＯＤ５２０ｎｍ＝０．２となるように調製したものを混合し調製液を作製した。【００７６】 この調製液をガラス繊維パッドにテスト当たり３６μＬずつそれぞれ塗布した後、凍結乾燥させ、標識区域１２である金コロイド標識抗体♯００４＃塗布パッドを調製した。抗体♯００６についても同様に金コロイド標識抗体♯００６塗布パッドを調製した。 【００７７】 （検出区域１４の調製） マイコプラズマ・ニューモニエ ＦＨ株（ＡＴＣＣ♯１５５３１）を８．１ｘ１０8ＣＦＵ／ｍＬとなるようにＰＢＳ緩衝液で調製し、多孔質坦体１３であるニトロセルロースメンブレン（ミリポア社）の所定位置に、テスト当たり０．７３μＬでライン状に塗布し検出区域１４を形成した。 【００７８】 また、検出区域１４の下流側に、抗ウサギ抗体をテスト当たり０．７３μＬで塗布し、反応確認のための対照区域１５を形成した。乾燥作業を経て、マイコプラズマ・ニューモニエ抗原固相化メンブレン（検出区域１４の配置された多孔質担体１３）を調製した。 【００７９】 （検出装置の作製） 滴下部１１としてのＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｇｒａｄｅ６０（商標）濾紙を用い、金コロイド標識抗体♯００４塗布パッド、マイコプラズマ・ニューモニエ抗原固相化メンブレン、吸液部１６としての濾紙とをそれぞれ重ね合わせ、粘着剤付きの台紙に貼付してイムノクロマト競合法を利用した検出装置を作製した。同様に抗体♯００４の代わりに抗体♯００６を用いた検出装置も作製した。 【００８０】 （検体試料液の調製） 抽出液としてＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を用い、この抽出液にて各ペプチドをそれぞれ１．０ｍｇ／ｍＬとなるように調製し、検体試料液として用いた。対照として、抽出液のみを用いた。 【００８１】 （反応性試験） 作製した２種の検出装置に検体試料液をピペットで１００μＬ滴下した後、１５分後の検出区域１４のライン発色を確認した。ここで、マイコプラズマ・ニューモニエ抗原固相化メンブレンと、各モノクローナル抗体（抗体＃００４、抗体＃００６）は免疫反応して、金コロイドの赤紫色の発色ラインを形成するが、エピトープに対応するペプチドが存在すると競合的に阻害がかかり、発色ラインが形成されない。 【００８２】 すなわち、発色の阻害があることで、モノクローナル抗体のエピトープを含むペプチドであることが確認される。 【００８３】 （モノクローナル抗体＃００４の検討結果） 発色に阻害がかかったもの：ペプチド１－１、ペプチド１－２、ペプチド１－３、ペプチド１－４、ペプチド１－５、ペプチド１－６ 【００８４】 発色したもの：ペプチド１－７、ペプチド１－８、ペプチド１－９ 以上の結果より、モノクローナル抗体♯００４は「ＰＧＭＡＰＲＰ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｍｅｔ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ）」であることが判明した。 【００８５】 （モノクローナル抗体＃００６の検討結果） 発色に阻害がかかったもの：ペプチド１－１、ペプチド１－２、ペプチド１－３、ペプチド１－４、ペプチド１－５、ペプチド１－１０、ペプチド１－１１ 【００８６】 発色したもの：ペプチド１－６、ペプチド１－９、ペプチド１－１２、ペプチド１－１３ 【００８７】 以上の結果より、モノクローナル抗体＃００６は「ＰＨＰＧＭＡＰ（Ｐｒｏ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｍｅｔ－Ａｌａ－Ｐｒｏ）」のペプチド配列に反応性を有することが確認された。 【００８８】 さらに、抗体＃００６については、「ＰＨＰＧＭＡＰ」の２つめのアミノ酸がＲに置換された「Ｐ“Ｒ”ＰＧＭＡＰ」および６番目がＰに置換された「ＰＨＰＧＭ“Ｐ”Ｐ」にも反応性を有することが確認された。」 本ｃ． 「【０１２６】 （交差反応性試験） 非特許文献２によるとＰ３０の繰り返し配列は、構造タンパクであるケラチン、フィブリノーゲン、ミオシンなどに免疫的に強い交差反応性を示すことが記載されている。 【０１２７】 そこで、検体としてマイコプラズマ・ニューモニエの入っていない陰性測定試料と０．２μｇ／ｍＬにて添加した陽性測定試料を準備し、これにケラチン、フィブリノーゲンをそれぞれ１００μｇ／ｍＬになるように添加して反応性を確認した。 【０１２８】 【表４】 ［図：0001399400000010.jpg］ 【０１２９】 本検出系において、１００μｇ／ｍＬ濃度のケラチン、フィブリノーゲンは陰性判定であり、交差反応による偽陽性はなかった。また、本来の陽性反応を示すマイコプラズマ・ニューモニエ陽性試料（ＦＨ株）を測定し、ケラチンおよびフィブリノーゲンを添加して反応性を確認したが、陽性判定に阻害はかからず反応への影響はなかった。 【０１３０】 したがって、抗マイコプラズマ・ニューモニエ モノクローナル抗体＃００４、および＃００６は、ケラチン、フィブリノーゲンとの交差反応を示さず、陰性反応、陽性反応共に影響を受けないことが確認された。」 （２）実施可能要件の考え方 物の発明について、発明の詳細な説明の記載が実施可能要件に適合するというためには、明細書の発明の詳細な説明が、当業者が、明細書の発明の詳細な説明の記載及び出願時の技術常識に基づいて、過度の試行錯誤を要することなく、その物を作り、使用することができる程度のものであることを要する。 また、方法の発明について、発明の詳細な説明の記載が実施可能要件に適合するというためには、明細書の発明の詳細な説明が、当業者が、明細書の発明の詳細な説明の記載及び出願時の技術常識に基づいて、過度の試行錯誤を要することなく、その方法を使用できることを要する。 （３）本件特許発明１、２の実施可能要件の判断 上記本ａ．のとおり、本願明細書の段落【００４９】～【００５７】には、免疫原にマイコプラズマ・ニューモニエＦＨ株菌体の可溶化物を用いて常法に従って、モノクローナル抗体＃００４を作製したことが記載され、上記本ｂ．のとおり、実施例１では、当該モノクローナル抗体＃００４が、Ｐ３０タンパク質における「ＰＧＭＡＰＲＰ」に反応し、「ＰＧＭＡＰＲ」に反応しないことが確認され、上記本ｃ．のとおり、実施例２では、当該モノクローナル抗体＃００４がケラチン及びフィブリノーゲンとの交差反応を示さないことが確認されている。 一方で、上記本ａ．のとおり、本願明細書の段落【００４９】～【００５７】には、免疫原にマイコプラズマ・ニューモニエＦＨ株菌体の可溶化物を用いて常法に従って、モノクローナル抗体＃００６を作製したことが記載され、上記本ｂ．のとおり、実施例１では、当該モノクローナル抗体＃００６が、Ｐ３０タンパク質における「ＰＨＰＧＭＡＰ」に反応することが確認され、上記本ｃ．のとおり、実施例２では、当該モノクローナル抗体＃００６がケラチン及びフィブリノーゲンとの交差反応を示さないことが確認されている。 以上のことから、発明の詳細な説明には、本件特許発明１、２のモノクローナル抗体について、それぞれ少なくとも１種類は製造できることが記載されているといえる。 これに加えて、本件特許についての出願の審査過程において、令和 ４年 ４月２０日付けの手続補足書として、株式会社バイオマトリックス研究所により作成された、「マイコプラズマに対するモノクローナル抗体のリスト」と題する甲第２号証と、それら抗体のうち、＃００４、＃００３、＃００６、及び＃０２５についての「Ｍｙｃｏモノクローナル抗体反応性の確認」と題する甲第３号証が提出された。 （甲第２号証） ［図：0001399400000011.jpg］ （甲第３号証） ［図：0001399400000012.jpg］ 甲第２号証には、左側欄外に１～９３までの抗体番号と右側から２つ目の欄に「一次選定（２３種）として、＃００１～＃０２３までの２３種類の抗体、右側から１つ目の欄に「二次選定」として、＃００２４～＃００２９の６種類の抗体が記載されている。 これらの抗体の中で、甲第２号証の右側から４つ目の欄の標題部分を除く上から１～１６行目には、「Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ」と記載されているから、＃００１～＃０１０、＃０２４～＃０２９までの１６種類は、少なくともマイコプラズマ・ニューモニエに対する抗体であると認められる。 そして、甲第３号証によると、モノクローナル抗体＃００４、＃００３は、合成ペプチドＰＧＭＡＰＲＰと反応し、合成ペプチドＰＧＭＡＰＲと反応しないこと（合成ペプチドＰＧＭＡＰＲＰ、合成ペプチドＰＧＭＡＰＲとの＃００４、＃００３のケラチンの反応性について（一番上の表））、ケラチンにもフィブリノーゲンにも反応しないこと（＃００４、＃００３のケラチン、フィブリノーゲンとの交差反応性について（上から２番目の表））、モノクローナル抗体＃００６、＃０２５は、合成ペプチドＰＨＰＧＭＡＰと反応し、合成ペプチドＰＧＭＡＰＲと反応しないこと（合成ペプチドＰＨＰＧＭＡＰ、合成ペプチドＰＧＭＡＰＲとの＃００６、＃０２５の反応性について（上から３番目の表））、ケラチンにもフィブリノーゲンにも反応しないこと（＃００６、＃０２５のケラチン、フィブリノーゲンとの交差反応性について（上から４番目の表））が示されている。 そして、これらの記載のうち、モノクローナル抗体＃００４が合成ペプチドＰＧＭＡＰＲＰと反応し、合成ペプチドＰＧＭＡＰＲと反応せず、ケラチンにもフィブリノーゲンにも反応しないこと、モノクローナル抗体＃００６が合成ペプチドＰＨＰＧＭＡＰと反応し、合成ペプチドＰＧＭＡＰＲと反応せず、ケラチンにもフィブリノーゲンにも反応しないことは、上記本ｂ．（段落【００８１】～【００８８】、上記本ｃ．（段落【０１２６】～【０１３０】）と整合するものであり、令和 ４年 ４月２０日付けの意見書の記載を踏まえると、これら甲第２号証及び甲第３号証は、出願前に得られていたモノクローナル抗体＃００４や＃００６を含むモノクローナル抗体群の性質をマイコプラズマ・ニューモニエＦＨ株のモノクローナル抗体の開発委託先である株式会社バイオマトリックス研究所が再解析したものであると認められ、これに疑義を抱くべき格別の根拠も異議申立人Ｂからは示されていない。 そうすると、本件特許発明１に係るモノクローナル抗体は、本件明細書に記載されたモノクローナル抗体＃００４だけでなく、モノクローナル抗体＃００３についても、本件特許の出願前に取得できており、本件特許発明２に係るモノクローナル抗体は、本件明細書に記載されたモノクローナル抗体＃００６だけでなく、モノクローナル抗体＃０２５についても、本件特許の出願前に取得できていたと認められるから、当業者は過度の試行錯誤を要することなく、発明の詳細な説明に記載された方法で、本件特許発明１、２のモノクローナル抗体を作製して使用することができているというべきである。 （４）異議申立人Ｂの主張について 異議申立人Ｂは、モノクローナル抗体は偶然の産物であって再現性をもって得られるものではないことは、この分野の技術常識として認められていること、及び、本件特許の明細書の実施例では、本件特許の請求項１及び請求項２に包含されるモノクローナル抗体が各１個ずつしか得られておらず、それらを産生するハイブリドーマは寄託されておらず、さらにそれらのＣＤＲ配列も記載されていないことから、当業者が、本件特許の請求項１又は請求項２に係るモノクローナル抗体を容易に取得することはできない旨主張している。 しかしながら、上記（３）で述べたとおり、本件特許の請求項１又は請求項２に包含されるモノクローナル抗体は各１個ずつしか得られていないものではなく、たかだか１６種類のクローンの中から、各２個ずつと、極めて高確率で本件特許の請求項１又は請求項２に包含されるモノクローナル抗体を得ることができるものと認められることから、ハイブリドーマの寄託が無く、モノクローナル抗体のＣＤＲの特定が無くても、再現性をもって、本件特許の請求項１又は請求項２に包含されるモノクローナル抗体については、当業者は過度の試行錯誤を要することなく、発明の詳細な説明に記載された方法で製造できるものといえる。 よって、上記異議申立人Ｂの主張は、理由がない。 （５）本件特許発明３、４の実施可能要件の判断 本件特許発明３は、マイコプラズマ・ジェニタリウムに反応性を示さないことを更に特定したものである。モノクローナル抗体＃００４と＃００６がマイコプラズマ・ジェニタリウムに反応性を示さないことは、本件明細書の記載事項（段落【０１１７】～【０１２５】）に記載されているとおりである。 そして、上記モノクローナル抗体＃００３と＃０２５は、それぞれモノクローナル抗体＃００４と＃００６と同一の結合特性を有するのであるから、マイコプラズマ・ジェニタリウムに反応性を示さないと合理的に推認することができ、本件特許発明３のモノクローナル抗体についても、本件特許の出願前に少なくとも４種類取得できていたものと認められるから、当業者は過度の試行錯誤を要することなく、発明の詳細な説明に記載された方法で、本件特許発明３のモノクローナル抗体を用いて、マイコプラズマ・ニューモニエを特異的に検出する検出方法を使用することができているというべきである。 本件特許発明４は、モノクローナル抗体が固相化される検出区域とを有するイムノクロマト法による免疫学的検出を行う検出装置と更に特定したものであるが、上述のとおり、本件特許発明４のモノクローナル抗体は、本件特許の出願前に少なくとも４種類取得できていたものと認められるから、当業者は過度の試行錯誤を要することなく、発明の詳細な説明に記載された方法で、本件特許発明４のモノクローナル抗体が固相化される検出区域を有するイムノクロマト法による免疫学的検出を行う検出装置を作り、使用することができているというべきである。 （６）小括 本件特許発明１ないし４について、本件明細書の発明の詳細な説明の記載は実施可能要件を満たすものであるから、異議申立人Ｂの申立理由Ｂ１（実施可能要件）は、理由がない。 第５ むすび 以上のとおり、本件特許に係る特許異議申立てにおいて異議申立人Ａ及び異議申立人Ｂが主張する申立理由は、いずれも理由がないから、請求項１ないし４に係る特許は、取り消すことができない。 ほかに、請求項１ないし４に係る特許を取り消すべき理由も発見しない。 よって、結論のとおり決定する。