2023-007641

第２ 本願発明

本願の請求項１～２６に係る発明は、令和５年５月１０日付け手続補正書の特許請求の範囲１～２６に記載された事項により特定されるものであるところ、そのうち請求項１に係る発明（以下、「本願発明」という。）は、以下のとおりである。

「【請求項１】

２つまたは６つの二価結合単位を含む多量体結合分子であって、各結合単位が、抗原結合ドメインと各々会合している２つの重鎖定常領域を含み、前記結合分子の少なくとも１つの抗原結合ドメインが、以下を含むＣＤ２０抗原結合ドメインである、前記多量体結合分子：

（ａ） ６つの免疫グロブリン相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３であって、ここでＨＣＤＲ１が配列番号：３９のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２が配列番号：４０のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３が配列番号：４１のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１が配列番号：４３のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２が配列番号：４４のアミノ酸配列を含み；およびＬＣＤＲ３が配列番号：４５のアミノ酸配列を含む、前記６つの免疫グロブリン相補性決定領域、または

（ｂ） 抗体重鎖可変領域（ＶＨ）および抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）であって、ここでＶＨが配列番号：３８のアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号：４２のアミノ酸配列を含む、前記抗体重鎖可変領域（ＶＨ）および前記抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）。」

第３ 原査定の拒絶理由

本願発明に対する原査定の拒絶の理由１（Ｂ）の概要は、以下のとおりである。

（理由１（Ｂ））本願発明は、本願優先日前に頒布された下記引用文献に記載された発明と、本願優先日前に抗体に関する技術分野において広く行われていた事項に基いて、本願出願前にその発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。

（引用文献）特表２００８－５４１７５８号公報

上記理由１（Ｂ）について、以下で検討する。

第４ 当審の判断

１ 引用文献の記載

引用文献には、以下の事項が記載されている。

なお、下線は当審で付した（以下同様。）。

（１） 特許請求の範囲

「【請求項１】

ＣＤ２０に結合し、且つＧＹＳＦＴＳＹＷＩＧ（配列番号２０１）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）を含む標的結合剤。

【請求項２】

ＣＤ２０に結合し、且つＫＩＳＮＲＦＳ（配列番号２０２）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）を含む標的結合剤。

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……

【請求項１６】

前記標的結合剤は、モノクローナル抗体１．５．３（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ－７３３０）である、請求項１～８のいずれか一項に記載の標的結合剤。

……

【請求項２０】

前記標的結合剤は、配列番号３０の配列を有する重鎖ポリペプチドを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の標的結合剤。

【請求項２１】

前記標的結合剤は、配列番号３２の配列を有する軽鎖ポリペプチドを含む、請求項２０に記載の標的結合剤。」

（２） 段落０００８

「【０００８】

発明の概要

本発明の実施形態は、ＣＤ２０に特異的に結合すると共に、ＣＤ２０を発現する細胞の成長を阻害する標的結合剤に関する。これを達成することができるメカニズムは、限定されないが、ＣＤ２０を発現する細胞のアポトーシスを誘起するステップ、ＣＤ２０を発現する細胞における抗体依存細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）を誘起するステップ、またはＣＤ２０を発現する細胞における補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を誘起するステップのいずれかを含むことができ、これにより、ＣＤ２０＋リンパ腫細胞、ＣＤ２０＋白血病細胞および通常のＢ細胞を含むＣＤ２０陽性Ｂ細胞を根絶する。」

（３） 段落０１２６～０１２８

「【０１２６】

抗体配列

本発明の実施形態は、以下の表１に列挙された特定の抗ＣＤ２０抗体を含む。この表は、対応する重鎖および軽鎖遺伝子の可変領域の配列番号と共に、各抗ＣＤ２０抗体の識別番号を報告する。

……

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【０１２８】

【表１－１】

［図：0001424964000001.jpg］

……

【表１－２】

……

［図：0001424964000002.jpg］

……」

（４） 段落０１３０

「【０１３０】

所望の場合には、例えば異なるアイソタイプの生物学的特性を生かすために、抗ＣＤ２０抗体のアイソタイプは転換されることができる。例えば、いくつかの状況において、ＣＤ２０に対する治療的抗体としての抗体の生成に関連して、抗体は、補体に結合し、および補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）に関与することができることが望ましい場合がある。限定されないが、以下の：マウスＩｇＭ、マウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ、マウスＩｇＧ３、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＡ、ヒトＩｇＧ１、およびヒトＩｇＧ３を含む、同じことができる多数の抗体のアイソタイプがある。他の実施形態において、ＣＤ２０に対する治療的抗体としての抗体の生成に関連して、抗体は、Ｆｃ受容体をエフェクター細胞に結合することができ、抗体依存傷害作用（ＡＤＣＣ）に関与することが望ましい場合がある。限定されないが、以下の：マウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ、マウスＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ１、およびヒトＩｇＧ３を含む、同じことができる多数の抗体のアイソタイプがある。生成される抗体は、初めからアイソタイプを具える必要はなく、むしろ、生成された抗体はいずれかのアイソタイプを具えることができ、および抗体はその後、技術分野において周知である従来の技術用いてアイソタイプ転換されることができることが認識されるであろう。このような技術は、とりわけ、直接的組み換え型技術（例えば、米国特許第４，８１６，３９７号明細書を参照のこと）、細胞－細胞融合技術（例えば、米国特許第５，９１６，７７１号明細書および米国特許第６，２０７，４１８号明細書を参照のこと）の使用を含む。」

（５） 配列表「配列番号３０」

「<210> 30

<211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiens

続きを表示（全21行）

<400> 30

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Pro Ser Tyr Gly Ser Gly Ser Pro Asn Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 」

（６） 配列表「配列番号３２」

「<210> 32

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens

続きを表示（全19行）

<400> 32

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Ala

85 90 95

Thr Gln Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110 」

２ 周知例の記載

（１） 周知例１の記載

本願優先日前に日本国内又は外国において頒布された刊行物である国際公開第２０１３／１２００１２号（以下、「周知例１」という。）には、以下の事項が記載されている。

ア 請求の範囲

「１．配列番号７８～９９のいずれか１つに示す配列を有する相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）を含む重鎖を含む、ＣＤＩＭに結合する単離された抗原結合タンパク質。

２．配列番号１０４又は１０５のいずれか１つに示す配列を有する相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）を含む軽鎖を更に含む、請求項１に記載の抗体。

……

４．配列番号１～２２のいずれか１つに示すフレームワーク１（ＦＲ１）を含む重鎖を更に含む、請求項１、請求項２、又は請求項３に記載の単離された抗原結合タンパク質。

続きを表示（全13行）

５．（ａ）配列番号７６に示す配列を有するＣＤＲＨ１、及び配列番号７７に示す配列を有するＣＤＲＨ２を含む重鎖、及び、

（ｂ）配列番号１００又は１０２に示す配列を有するＣＤＲＬ１、及び配列番号１０１又は１０３に示す配列を有するＣＤＲＬ２を含む軽鎖、

を更に含む、請求項１、請求項２、請求項３、又は請求項４に記載の単離された抗原結合タンパク質。

……

２０．モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、又はこれらの抗体断片である、請求項１～請求項１９のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

……

２４．ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、及びＩｇＥからなる群より選択される、請求項２０に記載の単離された抗原結合タンパク質。

２５．ＩｇＭである、請求項２４に記載の単離された抗原結合タンパク質。

……」

イ 実施例１～３

「［０００９９］

実施例１ 代表的なＣＤＩＭ結合タンパク質の作成及び配列測定

［０００１００］

プラスミドＤＮＡの構築。

続きを表示（全23行）

５’末端及び３’末端それぞれにＸｂａＩ－Ｋｐｎ１部位を有するＨシリーズμ鎖構築物重鎖可変領域（Ｈ１～Ｈ２２と命名）を、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔにより全て合成した。全てのＨシリーズμ鎖構築物を、各重鎖可変領域をＸｂａＩ－Ｋｐｎ１断片として単離し、そしてμ定常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｍｕ ｒｅｇｉｏｎ）を範囲に含むＫｐｎ１－ＢａｍＨＩ断片を用いて３部ライゲーション（ｔｈｒｅｅ ｐａｒｔ ｌｉｇａｔｉｏｎ）でこれら断片を、ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化した発現ベクターＡＢ１１と共に連結することにより組み立てた。ライゲーションしたプラスミドをコンピテント・バクテリアにトランスフォームした。得られたクローン化プラスミドを直接配列決定法により確認した。ＣＨＯ－Ｓ細胞にトランスフェクションするためのＤＮＡが適切な量得られるように、Ｑｉａｇｅｎを用いてプラスミドミディプレップを作成した。

［０００１０１］

軽鎖プラスミドも同様に構築した。λインサートを３部ラゲーションでクローン化した；λ可変領域をＸｂａＩ－ＥｃｏＲＩ断片として設計し、これをＥｃｏＲＩ－ＢａｍＨＩλ定常領域断片と混合し、そしてＸｂａＩ部位とＢａｍＨＩ部位の間でＡＢ２ベクターにライゲーションした。Ｌ２κインサートをＸｂａＩ－ＢａｍＨＩ断片として単離し、そしてＡＢ２－κベクターにライゲーションした。

［０００１０２］

Ｈ１～Ｈ２２／Ｌ２プラスミドＤＮＡによるＣＨＯ－Ｓ細胞のトランスフェクション。

重鎖及び軽鎖に対応するＤＮＡを、ＰＥＩ技法を用いて同時トランスフェクション用として調製した（等しい量のＬ２及びＨ１～２２）。トランスフェクションで用いられるＣＨＯ－Ｓ細胞（１Ｅ８個の対数増殖段階）をＲＰＭＩ１６４０培地中で増殖させた。ＤＮＡ：ＰＥＩを１：２で混合し、そしてこのＤＮＡ：ＰＥＩ混合物を、０．５×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、及びＨＴを補充したＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ中のＣＨＯ－Ｓ細胞に添加した。シェイカーフラスコ中、オーバーナイトでインキュベーションした後、培地を０．５×Ｐ／Ｓ、Ｇｌｕを含むＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯに置換した。トランスフェクション後の７日目に、細胞の遠心分離により細胞培養物上清（１００ｍｌ）を採取した。これらＩｇＭ例について特徴付けを行うために、１５ｍｌの細胞培養上清をＣｅｎｔｒｉｃｏｎで１０倍に濃縮した。

［０００１０３］

２２個の異なる重鎖可変領域のアミノ酸配列を図１Ａ～Ｄに示す。２つの異なる軽鎖可変領域のアミノ酸配列を図１Ｅに示す。重鎖及び軽鎖の定常領域のアミノ酸配列を図１Ｆに示す。κ又はλ定常領域のいずれも利用可能と理解される。識別及び単離されたＣＤＩＭ結合タンパク質、ＩＧＭ１～ＩＧＭ４４を代表するアミノ酸配列を図２Ａ～２Ｖに示す。Ｈ１～Ｈ２２のＣＤＲ３配列を図３に示す。

［０００１０４］

４４個の開示するＣＤＩＭ結合タンパク質をコードするのに利用可能なポリヌクレオチド配列の例を、図４Ａ～Ｌに示す。遺伝子コードの縮重に起因して、全く同一のアミノ酸配列をコードするのにその他の配列も利用可能であることが理解される。抗体の重鎖可変領域の様々な相補性決定領域（ＣＤＲＨ）及びフレームワーク（ＦＲ）領域について、その配列を、フレームワーク１（ＦＲ１）、相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）、フレームワーク２（ＦＲ２）、相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）、フレームワーク３（ＦＲ３）及び相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）を含め決定した。

［０００１０５］

実施例２ ＣＤＩＭ結合タンパク質の作成

［０００１０６］

本実施例は、いくつかの開示する結合タンパク質の作成方法について記載する。配列は重鎖及び軽鎖可変領域変異体から構成された（κ及びλ定常領域の両方がコードされた）。重鎖及び軽鎖変異体の特定の組み合わせを、ＣＨＯ細胞、すなわちＤＧ４４ＣＨＯ細胞にトランスフェクションし、一時的トランスフェクションを実施した。１０～１００μｇ／ｍｌの発現レベルが、初回トランスフェクションから得られた。ＩｇＭ抗体を、アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、ゲル電気泳動による評価を行い、そして細胞結合、細胞毒性分析、及びＥＬＩＳＡ試験により、複数の生体分子に対する結合について生物活性を試験した。機能分析から得られた結果を、第一選択候補の指針として用いた。選択したら、第一候補を、ＣＨＯ細胞に安定的にトランスフェクションし、２０プレート（約２０００ウェル）にサブ－クローン化し、そして最高レベルの分泌についてＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。トップ５０のクローンをＴ７５フラスコで増殖させ、その後ベスト２４のクローンをシェイカーフラスコに移した。これら２４クローンに由来するＩｇＭを精製、定量し、そしてトップ６のクローン（ＩｇＭ抗体分泌レベルにより選択した）を、高レベルで分泌する細胞株の増殖を促進するために、メトトレキサート（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ）中での更なる選択条件下で増殖させた。

［０００１０７］

実施例３ 非還元式ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いたＩｇＭ発現評価

……

［０００１１１］

図５は、コロイダルブルー染色プロトコール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に基づき染色したＳＤＳゲルを示し、１，０４８ｋＤに明瞭なバンドを認め、これはＩｇＭ五量体を表し、また１，２３６ｋＤにも明瞭なバンドを認め、これはＩｇＭ六量体を表す。図で認識可能なように、ＩｇＭの例について六量体形成と比較すると、五量体形成の方（実線矢印）が支配的である。同様に、単離されたヒトＩｇＭ２１６も、５量体型（点線矢印）の方が支配的であるが、但しこのＩｇＭフォーマットに含まれるλ軽鎖はより短いことに起因して低めの分子量として認められる。」

ウ 図５

「

［図：0001424964000003.jpg］

（題目部分の訳文は以下のとおり。

「非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ：パネルＡはＩＧＭ２３～ＩＧＭ２９を示し、パネルＢはＩＧＭ３１～ＩＧＭ４３を示す」）」

（２） 周知例２

本願優先日前に日本国内又は外国において頒布された刊行物である国際公開第２００５／００５６３６号（以下、「周知例２」という。）には、以下の事項が記載されている。

ア 請求の範囲

「１．１００ｍｇ／Ｌ以上のＩｇＭを産生できる形質転換細胞。

……

８．ＣＨＯ細胞株である請求項７に記載の形質転換細胞。

……

続きを表示（全12行）

２４．請求項１～請求項８、並びに請求項１４～請求項２３のいずれかに記載の細胞を培養し、ＩｇＭを採取する工程を含むＩｇＭを製造する方法。

２５．請求項１～請求項８、並びに請求項１４～請求項２３のいずれかに記載の細胞培養物の培養上清からＩｇＭを精製する工程を含む、実質的に純粋なＩｇＭを製造する方法。

２６．請求項２４に記載の方法により得られるＩｇＭ。

２７．請求項２５に記載の方法により得られる実質的に純粋なＩｇＭ。

２８．ヒト抗体、マウス抗体、ヒトキメラ抗体またはヒト化抗体である請求項２６または請求項２７に記載のＩｇＭ。

２９．実質的に純粋な５量体あるいは６量体である請求項２６～請求項２８のいずれかに記載のＩｇＭ。

３０．ＣＨＯ細胞が付加する糖鎖を有する実質的に純粋な５量体または６量体ＩｇＭ。

……」

イ １２ページ１６～２４行

「次にＨ鎖またはＬ鎖の遺伝子について述べる。一般にイムノグロブリンの遺伝子の取得においては、その可変領域をを含む領域をコードする塩基配列が重要である。イムノグロブリンの定常領域の構造は保存されている。そのため、いったんクローニングされれば、可変領域を組み換えることによって、目的とする抗原結合活性を有するイムノグロブリンを再構成できると考えられている。したがって、通常は、可変領域やＣＤＲの遺伝子を取得し、先にクローニングされた定常領域やフレームワークに移植することによって、イムノグロブリン全体をコードする塩基配列が構築される。ＩｇＭを構成するμ鎖のＨ鎖あるいはＬ鎖の定常領域の構造は既に明らかにされている。」

ウ 実施例２～３

「〔実施例２〕ガングリオシドＧＭ２に対する組換え型ヒト抗体Ｌ５５の作製

２．１ 抗ガングリオシドＧＭ２ヒト抗体Ｈ鎖遺伝子の構築

ガングリオシドＧＭ２に結合するヒト抗体（以下、Ｌ５５と表記する）のＨ鎖をコードする遺伝子は、Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルスで形質転換されたヒトＢ細胞（以下、Ｌ５５発現Ｂ細胞と表記する）より抽出したＴｏｔａｌ ＲＮＡを用いて、ＲＴ－ＰＣＲ法によって増幅した。Ｌ５５のＨ鎖可変領域遺伝子の塩基配列については、Ｎｉｓｈｉｎａｋａらにより報告されている（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９８；４８：７３－７５）。

……

続きを表示（全25行）

増幅した遺伝子断片は、制限酵素ＸｈｏＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＳａｌＩ（宝酒造社製）で消化した後に、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、ｐＵＣＡＧの制限酵素ＸｈｏＩ部位に連結し、クローニングした。完成したプラスミドをｐＵＣＡＧ／Ｌ５５Ｈと命名した。本プラスミドに含まれるＬ５５Ｈ鎖の塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号：１９および配列番号：２０に示す。

２．２ 抗ガングリオシドＧＭ２ヒト抗体Ｌ鎖遺伝子の構築

Ｌ５５のＬ鎖をコードする遺伝子はＬ５５発現Ｂ細胞より抽出したＴｏｔａｌ ＲＮＡを用いて、ＲＴ－ＰＣＲ法によって増幅した。Ｌ５５のＬ鎖可変領域遺伝子の塩基配列については、Ｎｉｓｈｉｎａｋａらにより報告されている（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９８；４８：７３－７５）。

……

増幅した遺伝子断片は、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）で消化した後に、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、ｐＣＸＮＤ３の制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ切断部位に連結し、クローニングした。完成したプラスミドをｐＣＸＮＤ３／Ｌ５５Ｌと命名した。本プラスミドに含まれるＬ５５Ｌ鎖の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号：２１および配列番号：２２に示す。

２．３ 抗ガングリオシドＧＭ２ヒト抗体の発現ベクターの構築

Ｌ５５発現ベクターを作製するために、ｐＵＣＡＧ／Ｌ５５Ｈを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）で消化して得られる約４．０ｋｂｐの断片をｐＣＸＮＤ３／Ｌ５５Ｌの制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に連結し、クローニングした。完成したプラスミドをｐＣＸＮＤ３／Ｌ５５ＩｇＭと命名した。本プラスミドは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子、Ｌ５５遺伝子を発現する。

２．４ 動物細胞を用いた抗ガングリオシドＧＭ２ヒト抗体の発現

ＣＨＯ細胞（ＤＧ４４株）を用いた安定発現細胞株の作製は次のようにして行った。Ｇｅｎｅ ＰｕｌｓｅｒＩＩ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いたエレクトロポレーション法により遺伝子導入した。

Ｊ鎖を発現しない細胞株の遺伝子導入について以下に述べる。Ｌ５５発現ベクターｐＣＸＮＤ３／Ｌ５５ＩｇＭ（２５μｇ）とＰＢＳに懸濁したＣＨＯ細胞（１×１０７細胞／ｍｌ）の０．７５ｍｌを混合したものを氷上で１０分間冷却し、キュベットに移した後に１．５ｋＶ、２５μＦＤの容量にてパルスを与えた。

……

同様の培地で５０倍希釈溶液を作製し、９６ウェル培養用プレートに１００μｌ／ウェルで分注した。ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）で２４時間培養後、０．５ｍｇ／ｍＬ濃度のＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）および０．６ｍｇ／ｍＬ濃度のＺｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加して２週間培養した。Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、Ｚｅｏｃｉｎ耐性を示す形質転換細胞のコロニーが観察されたウェルの培養上清中のＩｇＭ量について実施例１．６に示す濃度定量法で測定した。Ｌ５５高発現細胞株を順次拡大培養し、Ｌ５５安定発現細胞株ＬＪ０５、ＬＪ２３、ＬＪ３２、ＬＪ４９、およびＬＪ６１を得た。

各種Ｌ５５安定発現細胞株を７５ｃｍ２培養フラスコ内で初発細胞密度２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬで培養し、培養上清中のＩｇＭ濃度を実施例１．６で示した方法で測定した。結果を表２に示す。ＩｇＭ産生量は培養３日目で７～７０ｍｇ／Ｌ、培養７日目で５０～１５０ｍｇ／Ｌであり、単一細胞が産生する能力を示す産生能は５～４０ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙであった。

実施例１．６で示した組換え型Ｌ６１２産生細胞株と同等またはそれ以上の産生量が得られた。この結果より、ＣＨＯ細胞において高い産生量の組換え型ＩｇＭ発現細胞株が安定的に作製できることが明らかになった。

〔実施例３〕

３．１ 組換え型Ｌ６１２（実施例１）および組換え型Ｌ５５（実施例２）の多量体形成の解析

組換え型Ｌ６１２（実施例１）および組換え型Ｌ５５の多量体の解析は、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて行なった。非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用の電気泳動ゲルは、以下のとおり作成した。……

実施例１および実施例２で得られた組換え型Ｌ６１２（実施例１、Ｊ鎖＋、およびＪ鎖－）および組換え型Ｌ５５（実施例２、Ｊ鎖＋、およびＪ鎖－）の培養上清を上記の電気泳動ゲル、電気泳動バッファー、２×サンプルバッファーを用いて定電圧６０Ｖで１３時間、電気泳動を行なった。その後、抗μ鎖抗体を一次抗体に用いたＷｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇにより検出した。Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇは以下のとおりに行なった。

……

その結果、組換え型Ｌ６１２（Ｊ鎖＋）は、主にＬ６１２発現Ｂ細胞から得られたＬ６１２の５量体に相当するバンドが得られた（図１）。組換え型Ｌ６１２（Ｊ鎖－）は、主にＬ６１２発現Ｂ細胞から得られたＬ６１２の６量体に相当するバンドが得られた。電気泳動の各バンドについては５量体、あるいは６量体であることを電子顕微鏡で確認済みである。組換え型Ｌ５５においても同様の結果が得られた。（図２）

この結果より、ＩｇＭ産生細胞の培養上清中の、５量体、あるいは６量体の確認ができることが明らかになった。また、Ｊ鎖＋で発現させた組換え型ＩｇＭは主に５量体を形成しており、Ｊ鎖－で発現させた組換え型ＩｇＭは主に６量体を形成していることが明らかになった。Ｊ鎖の有無をコントロールすることで、組換え型ＩｇＭの５量体、および６量体を作り分けできることが明らかになった。」

（３） 周知例３

本願優先日前に日本国内又は外国において頒布された刊行物である特表２０１５－５０１２９１号公報（以下、「周知例３」という。）には、以下の事項が記載されている。

ア 特許請求の範囲

「【請求項１】

各々がＩｇＧアイソタイプもしくはＩｇＡアイソタイプであるＣＨ２領域およびＣＨ３領域、ならびに、Ｃμ３領域およびＣμ４領域を、Ｎ末端からＣ末端に向かって順に含む免疫グロブリン重鎖定常領域を含むことを特徴とする抗体または融合タンパク。

……

【請求項３】

前記免疫グロブリン重鎖は、さらに、前記ヒンジ領域のＮ末端にＣＨ１領域を含むことを特徴とする請求項１に記載の抗体または融合タンパク。

【請求項４】

前記重鎖定常領域が重鎖可変領域に融合した抗体であって、さらに、軽鎖可変領域および定常領域を含む軽鎖を含む抗体であることを特徴とする請求項３に記載の抗体または融合タンパク。

……

【請求項４０】

Ｎ末端ＩｇＧ定常領域区分およびＣ末端ＩｇＭ定常領域区分を含むハイブリッド定常領域を含む抗体または融合タンパクであって、前記抗体は、ｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合を呈し、プロテインＧに特異的に結合し、前記ＩｇＭ定常領域を介して多量化して少なくとも五量体または六量体を形成することを特徴とする抗体または融合タンパク。」

イ 段落００５６～００５８

「【００５６】

基本的な抗体構造ユニットは、サブユニットの四量体である。各四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖対を含み、各対は１つの「軽」（約２５ｋＤａ）鎖および「重」（約５０～７０ｋＤａ）鎖を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識に主要な関与をする、約１００～１１０個またはそれより多数のアミノ酸の可変領域を含む。この可変領域は、最初、開裂可能なシグナルペプチドに連結して発現される。シグナルペプチドを有しない可変領域は、成熟可変領域と呼ばれることもある。したがって、たとえば、軽鎖成熟可変領域は、軽鎖シグナルペプチドを有しない軽鎖可変領域を意味する。ただし、可変領域と呼ぶことは、シグナル配列が必ず存在することを意味せず、実際のところ、本発明の抗体または融合タンパクは、発現され分泌されると、シグナル配列が開裂する。重鎖可変領域と軽鎖可変領域との対は、抗体の結合領域を規定する。軽鎖および重鎖のカルボキシ末端部分は、それぞれ、軽鎖定常領域および重鎖定常領域を規定する。……ＩｇＭ抗体において、μ重鎖定常領域（Ｃμ）は、４つの領域、Ｃμ１，Ｃμ２，Ｃμ３およびＣμ４にさらに区分される。Ｃμ３領域およびＣμ４領域は、１つ以上のＪ鎖と協働して、天然ＩｇＭ抗体および本発明の抗体または融合タンパクにおいて、多量化機能を提供することがある。ミュー尾部は、ＩｇＭ重鎖定常領域のＣ末端に位置する１８アミノ酸長のポリペプチドである。ＩｇＭは多量化して、Ｊ鎖が存在するときは五量体構造を、Ｊ鎖が存在しないときは六量体構造を、形成する。

【００５７】

軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンに分類され、それぞれ、抗体アイソタイプをＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤまたはＩｇＥと規定する。軽鎖および重鎖において、可変領域および定常領域は、約１２個またはそれより多数のアミノ酸の「Ｊ」区分によって結合されており、重鎖は、約１０個またはそれより多数のアミノ酸の「Ｄ」区分も含む（……）（あらゆる目的のために、参照によってその全体が組み込まれる）。

【００５８】

軽鎖／重鎖の各対の成熟可変領域は、抗体結合部位を形成する。したがって、抗体全体は、２つの結合部位を有し、すなわち２価である。天然の抗体において、これらの結合部位は同じである。ただし、２つの結合部位が異なる二重特異性抗体を作製することが可能である（……）。可変領域はすべて、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域によって連結され、比較的保存されている同じ一般構造のフレームワーク領域（ＦＲ）を示す。各対の２つの鎖からのＣＤＲは、フレームワーク領域によって整合され、これにより特異的エピトープへの結合が可能になっている。Ｎ末端からＣ末端に向かって、軽鎖および重鎖の両者は、ＦＲ１，ＣＤＲ１，ＦＲ２，ＣＤＲ２，ＦＲ３，ＣＤＲ３およびＦＲ４のドメインを含む。……」

ウ 実施例１～２

「【０１４３】

実施例１：発現ベクター

本研究における遺伝子クローニング、突然変異生成、およびプラスミド構築は、標準的な生物学的手法を用いて行った。……

【０１４４】

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マウス抗ヒトＣＤ７９ａモノクローナル抗体９Ｇ６（Ｃｈ９Ｇ６－ＩｇＧ１）からキメラＩｇＧ１を生成するための哺乳類発現ベクターｐＣｈ９Ｇ６－ＩｇＧ１（図１）を、次の遺伝要素を含むように構築した。図１のｐＣｈ９Ｇ６－ＩｇＧ１のＳａｌＩ部位から時計回りに進んで、プラスミドは、抗体重鎖遺伝子の転写を開始する、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）主要最初期プロモーターおよびエンハンサー（図におけるＣＭＶ－Ｐ）で始まる重鎖転写ユニットを含む。ＣＭＶプロモーターに続いて、ＳｐｅＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位が隣接するマウス抗ヒトＣＤ７９ａモノクローナル抗体９Ｇ６の重鎖可変領域エクソン（９Ｇ６ ＶＨ）、介在するイントロン共に、ＣＨ１エクソン（ＣＨ１（γ１））、ヒンジエクソン（ｈ（γ１））、ＣＨ２エクソン（ＣＨ２（γ１））およびＣＨ３エクソン（ＣＨ３（γ１））を含むヒトγ－１重鎖定常領域を含むゲノム配列、ならびに、ヒトγ－１重鎖遺伝子のポリアデニル化部位が存在する。重鎖遺伝子配列の後には、ＣＭＶプロモーター（ＣＭＶ－Ｐ）で始まる軽鎖転写ユニットがあり、これに続いて、ＮｈｅＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位が隣接するマウス抗ヒトＣＤ７９ａモノクローナル抗体９Ｇ６の軽鎖可変領域エクソン（９Ｇ６ ＶＬ）、イントロンの一部が先行するヒトカッパー鎖定常領域エクソン（ＣＬ）を含むゲノム配列、ならびに、ＣＬエクソンに続くヒトカッパー鎖遺伝子のポリアデニル化部位が存在する。その後、軽鎖遺伝子には、ＳＶ４０早期プロモーター（ＳＶ４０－Ｐ）、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシル転移遺伝子（ｇｐｔ）、および、ＳＶ４０ポリアデニル化部位（ＳＶ４０－Ａ）を含む区分が続く。最後に、プラスミドは、細菌起原の複製（ｐＵＣ ｏｒｉ）およびβラクタマーゼ遺伝子（β ｌａｃｔａｍａｓｅ）を含むプラスミドの一部ｐＵＣ１９を含む。図における矢印は、転写の方向を示す。

……

【０１４９】

ｐＣｈ９Ｇ６－ＩｇＧ１にコードされる免疫グロブリン重鎖定常領域のアミノ酸配列を以下に示す。

【０１５０】

ｐＣｈ９Ｇ６－ＩｇＧ１にコードされる重鎖定常領域（配列番号３）：

ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ。

【０１５１】

ｐＣｈ９Ｇ６－ＩｇＧ１にコードされる免疫グロブリン軽鎖定常領域のアミノ酸配列を以下に示す。

【０１５２】

ｐＣｈ９Ｇ６－ＩｇＧ１にコードされる軽鎖定常領域（配列番号４）：

ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ。

【０１５３】

発現ベクターｐＣｈ９Ｇ６－ＩｇＧ１を変更して、ヒトμ重鎖のＣＨ３領域およびＣＨ４領域（それぞれＣμ３およびＣμ４）をコードするｃＤＮＡ由来のフラグメントが、ｐＣｈ９Ｇ６－ＩｇＧ１のヒンジ領域の最後のアミノ酸にインフレームで融合するように、新たな発現ベクターｐＣｈ９Ｇ６－ＩｇＧ１／Ｍを構築した。Ｃμ３およびＣμ４のアミノ酸配列を以下に示す。

【０１５４】

ヒトμ重鎖のＣμ３およびＣμ４（配列番号５）：

ＤＱＤＴＡＩＲＶＦＡＩＰＰＳＦＡＳＩＦＬＴＫＳＴＫＬＴＣＬＶＴＤＬＴＴＹＤＳＶＴＩＳＷＴＲＱＮＧＥＡＶＫＴＨＴＮＩＳＥＳＨＰＮＡＴＦＳＡＶＧＥＡＳＩＣＥＤＤＷＮＳＧＥＲＦＴＣＴＶＴＨＴＤＬＰＳＰＬＫＱＴＩＳＲＰＫＧＶＡＬＨＲＰＤＶＹＬＬＰＰＡＲＥＱＬＮＬＲＥＳＡＴＩＴＣＬＶＴＧＦＳＰＡＤＶＦＶＱＷＭＱＲＧＱＰＬＳＰＥＫＹＶＴＳＡＰＭＰＥＰＱＡＰＧＲＹＦＡＨＳＩＬＴＶＳＥＥＥＷＮＴＧＥＴＹＴＣＶＶＡＨＥＡＬＰＮＲＶＴＥＲＴＶＤＫＳＴＧＫＰＴＬＹＮＶＳＬＶＭＳＤＴＡＧＴＣＹ。

……

【０１５７】

発現ベクターｐＣｈ９Ｇ６－ＩｇＧ１もまた、Ｃμ３およびＣμ４のコード化領域が、ｐＣｈ９Ｇ６－ＩｇＧ１のＣＨ３エクソンの最後のアミノ酸にインフレームで融合するように、変更した。軽鎖配列は変更しなかった。得られたプラスミドｐＣｈ９Ｇ６－ＭＶＩｇＧ１の模式的な構造を図１に示す。ｐＣｈ９Ｇ６－ＭＶＩｇＧ１にコードされる重鎖定常領域のアミノ酸配列を以下に示す。

【０１５８】

ｐＣｈ９Ｇ６－ＭＶＩｇＧ１にコードされる重鎖定常領域（配列番号７）：

ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＤＱＤＴＡＩＲＶＦＡＩＰＰＳＦＡＳＩＦＬＴＫＳＴＫＬＴＣＬＶＴＤＬＴＴＹＤＳＶＴＩＳＷＴＲＱＮＧＥＡＶＫＴＨＴＮＩＳＥＳＨＰＮＡＴＦＳＡＶＧＥＡＳＩＣＥＤＤＷＮＳＧＥＲＦＴＣＴＶＴＨＴＤＬＰＳＰＬＫＱＴＩＳＲＰＫＧＶＡＬＨＲＰＤＶＹＬＬＰＰＡＲＥＱＬＮＬＲＥＳＡＴＩＴＣＬＶＴＧＦＳＰＡＤＶＦＶＱＷＭＱＲＧＱＰＬＳＰＥＫＹＶＴＳＡＰＭＰＥＰＱＡＰＧＲＹＦＡＨＳＩＬＴＶＳＥＥＥＷＮＴＧＥＴＹＴＣＶＶＡＨＥＡＬＰＮＲＶＴＥＲＴＶＤＫＳＴＧＫＰＴＬＹＮＶＳＬＶＭＳＤＴＡＧＴＣＹ。

【０１５９】

ｐＣｈ９Ｇ６－ＩｇＧ１，ｐＣｈ９Ｇ６－ＩｇＧ１／ＭおよびｐＣｈ９Ｇ６－ＭＶＩｇＧ１から産生される単量体型の抗体（それぞれ、Ｃｈ９Ｇ６－ＩｇＧ１，Ｃｈ９Ｇ６－ＩｇＧ１／ＭおよびＣｈ９Ｇ６－ＭＶＩｇＧ１）の模式的な構造を、図２に示す。図中の記号「ＣＨ１」、「ヒンジ」、「ＣＨ２」および「ＣＨ３」は、ヒトガンマ重鎖のＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域をそれぞれ示す。記号「Ｃμ３」および「Ｃμ４」は、ヒトμ重鎖のＣＨ３領域およびＣＨ４領域をそれぞれ示す。記号「ＣＬ」は、ヒトカッパー定常領域を示す。

【０１６０】

実施例２：多価抗ＣＤ７９ａ ＩｇＧ１抗体の発現、精製および特徴付け

発現ベクターｐＣｈ９Ｇ６－ＩｇＧ１，ｐＣｈ９Ｇ６－ＩｇＧ１／ＭおよびｐＣｈ９Ｇ６－ＭＶＩｇＧ１を、マウス骨髄腫細胞株ＮＳ０（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ）に導入して、それぞれＣｈ９Ｇ６－ＩｇＧ１抗体，Ｃｈ９Ｇ６－ＩｇＧ１／Ｍ抗体およびＣｈ９Ｇ６－ＭＶＩｇＧ１抗体を安定的に産生する細胞株を得た。ＮＳ０細胞を、７．５％ＣＯ２インキュベータにおいて、３７℃にて、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を含有するＤＭＥ培地で培養した。ＮＳ０への安定導入を、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９－１７５，１９９２）に記載されているように、エレクトロポレーションによって行った。導入に先立ち、各発現ベクターを、ＦｓｐＩを用いて直線化した。一般的な実験において、約１０７個の細胞に、２０μｇの直線化プラスミドを形質移入し、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥ培地に懸濁し、９６ウェルプレートに播いた。４８時間後、選択培地（１０％ＦＢＳ、ＨＴ培地添加物（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、０．２５ｍｇ／ｍｌキサンチンゲルおよび１μｇ／ｍｌミコフェノール酸を含有するＤＭＥ培地）を適用した。選択開始の約１０日後、形質転換体の培養上清を、抗体産生についてアッセイした。

……

【０１６４】

Ｃｈ９Ｇ６－ＩｇＧ１，Ｃｈ９Ｇ６－ＩｇＧ１／ＭおよびＣｈ９Ｇ６－ＭＶＩｇＧ１の天然型での分子サイズを、球状タンパクの分離範囲が５ｋＤａ～５，０００ｋＤａであるＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０／３００ ＧＬカラムを有する、ＡＫＴＡ Ｂａｓｉｃ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いるゲルろ過により分析した。溶出緩衝液にはＰＢＳを使用した。図３Ｃ～図３Ｅに、Ｃｈ９Ｇ６－ＩｇＧ１（図３Ｃ）、Ｃｈ９Ｇ６－ＩｇＧ１／Ｍ（図３Ｄ）およびＣｈ９Ｇ６－ＭＶＩｇＧ１（図３Ｅ）の溶出パターンを示す。Ｃｈ９Ｇ６－ＩｇＧ１およびＣｈ９Ｇ６－ＭＶＩｇＧ１については、それぞれ、溶出量１６．７ｍｌおよび９．９ｍｌに、１つの主要なピークのみが観察され、一方、Ｃｈ９Ｇ６－ＩｇＧ１／Ｍについては、２つの主要なピークと、いくつかの小さなピークが存在した。骨髄腫細胞株から精製したヒトモノクローナルＩｇＭ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）は、１０．４ｍｌに溶出した（図３Ｂ）。分子量標準物質（Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ，ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）の溶出パターン（図３Ａ）と比較することにより、溶出量１１．７ｍｌおよび１４．８ｍｌの２つの大きなピークにおけるＣｈ９Ｇ６－ＩｇＧ１／Ｍの分子量は、それぞれ、約８００ｋＤａおよび２２０ｋＤａと見積もられた。主要なピークにおけるＣｈ９Ｇ６－ＩｇＧ１の分子量は、１５４ｋＤａと見積もられ、これは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でのその重鎖および軽鎖のサイズに基づく、Ｃｈ９Ｇ６－ＩｇＧ１単量体の予測分子量（１６０ｋＤａ）に対応する。ヒトＩｇＭが１０．４ｍｌに溶出したのに対して、Ｃｈ９Ｇ６－ＭＶＩｇＧ１は９．９ｍｌに溶出しており、これは、Ｃｈ９Ｇ６－ＭＶＩｇＧ１がヒトＩｇＭよりも僅かに大きいことを示唆している。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、Ｃｈ９Ｇ６－ＭＶＩｇＧ１の重鎖および軽鎖の分子量が、それぞれ、７６ｋＤａおよび２６ｋＤａであることを示唆しているので、Ｃｈ９Ｇ６－ＭＶＩｇＧ１の単量体の分子量は約２００ｋＤａであると計算され、これは、ヒトＩｇＭの単量体（概略１８０ｋＤａ）よりも僅かに大きい。骨髄腫細胞から精製したヒトＩｇＭは、五量体として（または、おそらく六量体として）存在し易いので、したがって、ＮＳ０細胞から精製したＣｈ９Ｇ６－ＭＶＩｇＧ１もまた、天然型では五量体または六量体として存在すると結論付けられた。」

エ 実施例９～１２

「【０１８５】

実施例９：多価抗ＣＤ７９ａ ＩｇＧ４抗体の生成

ｐＣｈ９Ｇ６－ＩｇＧ１におけるヒトガンマ－１重鎖のゲノムＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域の配列を、ヒトガンマ－４重鎖のＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域（図中、それぞれＣＨ１（γ４），ｈ（γ４），ＣＨ２（γ４）およびＣＨ３（γ４））（図１）をコードするｃＤＮＡ由来フラグメントで置き換えることによって、キメラ抗ＣＤ７９ａ ＩｇＧ４モノクローナル抗体を発現するためのｐＣｈ９Ｇ６－ＩｇＧ４ベクターを構築した。ｐＣｈ９Ｇ６－ＩｇＧ４にコードされるガンマ－４重鎖定常領域のアミノ酸配列を以下に示す。

【０１８６】

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ｐＣｈ９Ｇ６－ＩｇＧ４にコードされる重鎖定常領域（配列番号１０）：

ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ。

【０１８７】

Ｃμ３領域およびＣμ４領域（配列番号５）を、ｐＣｈ９Ｇ６－ＩｇＧ４（図１）のＣＨ３領域の最後のアミノ酸にインフレームで融合することによって、多価キメラ抗ＣＤ７９ａ ＩｇＧ４モノクローナル抗体を発現するためのｐＣｈ９Ｇ６－ＭＶＩｇＧ４ベクターを構築した。ｐＣｈ９Ｇ６－ＭＶＩｇＧ４にコードされる重鎖定常領域のアミノ酸配列を以下に示す。

【０１８８】

ｐＣｈ９Ｇ６－ＭＶＩｇＧ４にコードされる重鎖定常領域（配列番号１１）：

ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫＤＱＤＴＡＩＲＶＦＡＩＰＰＳＦＡＳＩＦＬＴＫＳＴＫＬＴＣＬＶＴＤＬＴＴＹＤＳＶＴＩＳＷＴＲＱＮＧＥＡＶＫＴＨＴＮＩＳＥＳＨＰＮＡＴＦＳＡＶＧＥＡＳＩＣＥＤＤＷＮＳＧＥＲＦＴＣＴＶＴＨＴＤＬＰＳＰＬＫＱＴＩＳＲＰＫＧＶＡＬＨＲＰＤＶＹＬＬＰＰＡＲＥＱＬＮＬＲＥＳＡＴＩＴＣＬＶＴＧＦＳＰＡＤＶＦＶＱＷＭＱＲＧＱＰＬＳＰＥＫＹＶＴＳＡＰＭＰＥＰＱＡＰＧＲＹＦＡＨＳＩＬＴＶＳＥＥＥＷＮＴＧＥＴＹＴＣＶＶＡＨＥＡＬＰＮＲＶＴＥＲＴＶＤＫＳＴＧＫＰＴＬＹＮＶＳＬＶＭＳＤＴＡＧＴＣＹ。

【０１８９】

Ｃｈ９Ｇ６－ＭＶＩｇＧ４を産生するＮＳ０安定形質転換体の生成を、実施例２に記載のように行った。プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーによるＣｈ９Ｇ６－ＭＶＩｇＧ４の精製を、実施例２に記載の方法で行った。還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、Ｃｈ９Ｇ６－ＭＶＩｇＧ４が約２５ｋＤａの軽鎖および約７８ｋＤＡの重鎖を含むことを示した。

【０１９０】

天然Ｃｈ９Ｇ６－ＭＶＩｇＧ４の分子サイズを、実施例２に記載のように、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０／３００ ＧＬカラムを用いるゲルろ過によって分析した。１つの大きいピーク（溶出量１０．１ｍｌ）および１つの小さいピーク（溶出量１４．１ｍｌ）が、Ｃｈ９Ｇ６－ＭＶＩｇＧ４の溶出パターンに観察された（図１２）。ＢｉｏＲａｄの分子量標準物質（図１２Ａ）およびヒトＩｇＭ（１０．４ｍｌに溶出；図１２Ｂ）と比較し、単量体型のＣｈ９Ｇ６－ＭＶＩｇＧ４（～２０８ｋＤａ）およびＩｇＭ（～１８０ｋＤａ）の予想サイズを考慮することによって、１０．１ｍｌに溶出するＣｈ９Ｇ６－ＭＶＩｇＧ４は、五量体または六量体であると結論付けられた。このような多量体型Ｃｈ９Ｇ６－ＭＶＩｇＧ４が、全精製抗体の８３％を成した。

【０１９１】

実施例１０：多価ＩｇＧ３抗体の発現、精製および特徴付け

キメラ抗ＣＤ７９ａ ＩｇＧ３モノクローナル抗体およびその２つの誘導体を発現するために、３つのベクターを構築した。ｐＣｈ９Ｇ６－ＩｇＧ１におけるヒトガンマ－１重鎖のゲノムＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を担持するｄＩＩＩ～ＥａｇＩフラグメントを、ヒトガンマ－３重鎖のゲノムＣＨ１領域、第４ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域（図中、それぞれＣＨ１（γ３），ｈ（γ３），ＣＨ２（γ３）およびＣＨ３（γ３））（図１）を担持するＨｉｎｄＩＩＩ～ＥａｇＩフラグメントで置き換えることによって、ｐＣｈ９Ｇ６－ＩｇＧ３Ｄベクターを構築した。ｐＣｈ９Ｇ６－ＩｇＧ３Ｄにおいて、第１、第２および第３のヒンジ領域のコード化配列は除外した。ｐＣｈ９Ｇ６－ＩｇＧ３Ｄにコードされる重鎖定常領域のアミノ酸配列を以下に示す。

【０１９２】

ｐＣｈ９Ｇ６－ＩｇＧ３Ｄにコードされる重鎖定常領域（配列番号１２）：

ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＴＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＫＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ。

【０１９３】

ヒトμ重鎖のＣμ３領域およびＣμ４領域（配列番号５）を、ｐＣｈ９Ｇ６－ＩｇＧ３Ｄ（図１）のヒンジ領域の最後のアミノ酸にインフレームで融合することによって、ｐＣｈ９Ｇ６－ＩｇＧ３Ｄ／Ｍを構築した。ｐＣｈ９Ｇ６－ＩｇＧ３Ｄ／Ｍにおいて、ヒトガンマ－３重鎖のＣＨ２エクソンおよびＣＨ３エクソンは除いた。Ｎ末端からＣ末端に向かって、ヒトガンマ－３重鎖のＣＨ１領域および第４ヒンジ領域、ならびに、ヒトμ重鎖のＣＨ３領域およびＣＨ４領域から成る、ｐＣｈ９Ｇ６－ＩｇＧ３Ｄ／Ｍにコードされる得られた重鎖定常領域は、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１９－２７ ２０００）により報告されているＩｇＧ－Ｃμ３－Ｃμ４重鎖定常領域と同一であった。ｐＣｈ９Ｇ６－ＩｇＧ３Ｄ／Ｍにコードされる重鎖定常領域のアミノ酸配列を以下に示す。

【０１９４】

ｐＣｈ９Ｇ６－ＩｇＧ３Ｄ／Ｍにコードされる重鎖定常領域（配列番号１３）：

ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＴＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＤＱＤＴＡＩＲＶＦＡＩＰＰＳＦＡＳＩＦＬＴＫＳＴＫＬＴＣＬＶＴＤＬＴＴＹＤＳＶＴＩＳＷＴＲＱＮＧＥＡＶＫＴＨＴＮＩＳＥＳＨＰＮＡＴＦＳＡＶＧＥＡＳＩＣＥＤＤＷＮＳＧＥＲＦＴＣＴＶＴＨＴＤＬＰＳＰＬＫＱＴＩＳＲＰＫＧＶＡＬＨＲＰＤＶＹＬＬＰＰＡＲＥＱＬＮＬＲＥＳＡＴＩＴＣＬＶＴＧＦＳＰＡＤＶＦＶＱＷＭＱＲＧＱＰＬＳＰＥＫＹＶＴＳＡＰＭＰＥＰＱＡＰＧＲＹＦＡＨＳＩＬＴＶＳＥＥＥＷＮＴＧＥＴＹＴＣＶＶＡＨＥＡＬＰＮＲＶＴＥＲＴＶＤＫＳＴＧＫＰＴＬＹＮＶＳＬＶＭＳＤＴＡＧＴＣＹ。

【０１９５】

ヒトμ重鎖のＣμ３領域およびＣμ４領域（配列番号５）を、ｐＣｈ９Ｇ６－ＩｇＧ３Ｄ（図１）のヒトガンマ－３重鎖のＣＨ３エクソンの最後のアミノ酸に、インフレームで融合することによって、ｐＣｈ９Ｇ６－ＭＶＩｇＧ３Ｄベクターを構築した。ｐＣｈ９Ｇ６－ＭＶＩｇＧ３Ｄにコードされる得られた重鎖定常領域のアミノ酸配列を以下に示す。

【０１９６】

ｐＣｈ９Ｇ６－ＭＶＩｇＧ３Ｄにコードされる重鎖定常領域（配列番号１４）：

ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＴＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＫＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＤＱＤＴＡＩＲＶＦＡＩＰＰＳＦＡＳＩＦＬＴＫＳＴＫＬＴＣＬＶＴＤＬＴＴＹＤＳＶＴＩＳＷＴＲＱＮＧＥＡＶＫＴＨＴＮＩＳＥＳＨＰＮＡＴＦＳＡＶＧＥＡＳＩＣＥＤＤＷＮＳＧＥＲＦＴＣＴＶＴＨＴＤＬＰＳＰＬＫＱＴＩＳＲＰＫＧＶＡＬＨＲＰＤＶＹＬＬＰＰＡＲＥＱＬＮＬＲＥＳＡＴＩＴＣＬＶＴＧＦＳＰＡＤＶＦＶＱＷＭＱＲＧＱＰＬＳＰＥＫＹＶＴＳＡＰＭＰＥＰＱＡＰＧＲＹＦＡＨＳＩＬＴＶＳＥＥＥＷＮＴＧＥＴＹＴＣＶＶＡＨＥＡＬＰＮＲＶＴＥＲＴＶＤＫＳＴＧＫＰＴＬＹＮＶＳＬＶＭＳＤＴＡＧＴＣＹ。

【０１９７】

ｐＣｈ９Ｇ６－ＩｇＧ３Ｄ，ｐＣｈ９Ｇ６－ＩｇＧ３Ｄ／ＭおよびｐＣｈ９Ｇ６－ＭＶＩｇＧ３Ｄから産生される抗体の単量体型の模式的構造（それぞれ、Ｃｈ９Ｇ６－ＩｇＧ３Ｄ，Ｃｈ９Ｇ６－ＩｇＧ３Ｄ／ＭおよびＣｈ９Ｇ６－ＭＶＩｇＧ３Ｄ）を図２に示す。

【０１９８】

Ｃｈ９Ｇ６－ＩｇＧ３Ｄ抗体、Ｃｈ９Ｇ６－ＩｇＧ３Ｄ／Ｍ抗体およびＣｈ９Ｇ６－ＭＶＩｇＧ３Ｄ抗体の各々を産生するＮＳ０安定形質転換体の生成を、実施例２に概説したように行った。Ｃｈ９Ｇ６－ＩｇＧ３Ｄ抗体、Ｃｈ９Ｇ６－ＩｇＧ３Ｄ／Ｍ抗体およびＣｈ９Ｇ６－ＭＶＩｇＧ３Ｄ抗体を産生するＮＳ０安定形質転換体を、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＳＦＭを用いる無血清媒体での増殖に適用し、実施例２に記載のようにローラーボトルに展開した。遠心分離およびろ過の後、Ｃｈ９Ｇ６－ＩｇＧ３ＤおよびＣｈ９Ｇ６－ＭＶＩｇＧ３Ｄについて、培養上清をプロテインＧセファロースカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に載せた。プロテインＧセファロースカラムをＰＢＳで洗浄し、その後、０．１Ｍグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ２．５）で抗体を溶出した。１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）で中和した後、溶出した抗体の緩衝液を透析によってＰＢＳに変えた。

……

【０２０３】

Ｃｈ９Ｇ６－ＭＶＩｇＧ３Ｄでは、単一の主要なピークが、溶出量１０．４ｍｌに観察された（図１３Ｅ）。ヒトＩｇＭも１０．４ｍｌに溶出した（図１３Ｂ）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果から見積もられたＣｈ９Ｇ６－ＭＶＩｇＧ３Ｄ（～２００ｋＤａ）およびＩｇＭ（～１８０ｋＤａ）の単量体のサイズを考慮して、Ｃｈ９Ｇ６－ＭＶＩｇＧ３Ｄは、天然型では五量体または六量体で産生されると結論付けられた。」

（４） 周知例４

本願優先日前に日本国内又は外国において頒布された刊行物であるVirginie Pascal, et al., Haematologica 2012;97(11):1686-1694, doi:10.3324/haematol.2011.061408（以下、「周知例４」という。）には、以下の事項が記載されている。

ア 要約（１６８６ページ）

「背景

抗体ベースの治療のほとんどは、その生物学的特性がよく知られていることからＩｇＧを使用しているが、これらの抗体の機能上の制限により、他の治療機能を持つ誘導体の開発が求められている。血清中の量はＩｇＧより少ないものの、ＩｇＡはヒトで最も多く産生されるＩｇクラスである。二量体形態が粘膜領域に特異的に標的化されることに加え、ＩｇＡは特定の標的に対してＩｇＧ１よりも効率的に多形核好中球を動員することが示されている。

……

結論

抗ＣＤ２０ ＩｇＡ抗体は、リンパ腫細胞に対する独自の治療特性を持ち、強い直接効果、細胞傷害性のために好中球を動員する能力、さらには間接的な方法ではあるものの補体の動員も行うことを示している。」

イ 導入（１６８７ページ）

「……単量体ＩｇＡ（ｍＩｇＡ）……ポリマーＩｇＡ（ｐＩｇＡ）……。ｐＩｇＡには、結合鎖 （Ｊ鎖）に結合した二量体（ｄＩｇＡ）、三量体、またはより高次のポリマーの混合物が含まれる。……

治療用抗体の中でも、キメラ抗ＣＤ２０リツキシマブは多くのリンパ腫の治療におけるゴールドスタンダードとなっており、その作用はおそらく最も広く研究されている。ＣＤ２０に結合するリツキシマブは、リンパ腫細胞株のサブセットにおいて増殖阻害およびアポトーシス誘導を引き起こす。しかし、さまざまなｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ実験では、ＣＤ２０細胞の除去は主にリツキシマブのγ１定常鎖によるものであり、これが補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘発し、ナチュラルキラー細胞を動員してＡＤＣＣを引き起こすことが報告されている。マウスモデルでのｉｎ ｖｉｖｏ実験では、ＣＤ２０架橋による直接的な増殖阻害およびアポトーシスシグナル伝達は、ＣＤ２０移植腫瘍を制御するのに十分ではないことも示された。本研究では、ＩｇＧ１と比較して抗ＣＤ２０ ＩｇＡの治療可能性と作用機序を分析した。この目的のために、我々はリツキシマブ可変領域を特徴とするＩｇＧまたはＩｇＡクラスのキメラＣＤ２０抗体を生成し、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイを通じてＣＤ２０発現腫瘍細胞を殺す能力を分析した。」

ウ 表１

「

［図：0001424964000004.jpg］

（説明部分の訳文：

除去ヒト血清の存在下で抗ＣＤ２０ＩｇＡにより誘発されるＣＤＣの評価。ＤＨＬ－４細胞を、正常ヒト血清（ＮＨＳ）、熱不活化血清、または特異的に除去された血清（Ｃ１ｑ－、Ｃ２－、または因子Ｂ－を欠く血清）のいずれかでモノクローナル抗体（１０ ｍｇ／ｍＬ）とともに３７°で４時間インキュベートした。ＣＤＣは、ヨウ化プロピジウム陽性細胞の割合として評価した。データは、３つの独立した実験の平均±ＳＥＭとして示されている（アスタリスクは、無対応のないｔ検定で各除去血清とＮＨＳで観察された値間の統計的に有意な差を示す：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ：有意ではない）。）」

エ 表４Ａ

「

［図：0001424964000005.jpg］

表４ 抗ＣＤ２０－ＩｇＡの生体内保護効果。（Ａ）ＲＡＧ２γｃ－／－に１０６個のＤＨＬ－４ 細胞を腹腔内注射した。また、細胞注射直後に、さまざまな量の抗ＣＤ２０またはコントロールモノクローナル抗体を腹腔内投与した。個々のマウスにおけるＤＨＬ－４特異的殺傷は、ＤＨＬ－４細胞とＪｕｒｋａｔ参照細胞の比率として計算された。データは、３つの独立した実験の平均±ＳＥＭとして示されている。」

３ 対比・判断

（１） 引用発明

上記１で挙げた摘示事項（特に、【請求項１６】及び【表１－２】）の記載からみて、引用文献には次の発明（以下、「引用発明」という。）が記載されていると認める。

「ＣＤ２０に結合するモノクローナル抗体１．５．３（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ－７３３０）であって、重鎖可変領域をコードするアミノ酸配列が配列番号３０、軽鎖可変領域をコードするアミノ酸配列が配列番号３２である、標的結合剤。」

（２） 対比

本願発明と引用発明を対比する。

引用発明のモノクローナル抗体１．５．３はＣＤ２０に結合する活性を有すること、抗体はそれぞれ１本の軽鎖が会合する２本の重鎖が会合する単位構造をとること、重鎖と軽鎖との会合により結合ドメインを構成する、二価の結合単位を含む分子であるから、これは本願発明の「二価結合単位を含む」「結合分子であって、各結合単位が、抗原結合ドメインと各々会合している２つの重鎖定常領域を含み、前記結合分子の少なくとも１つの抗原結合ドメインが、」「ＣＤ２０抗原結合ドメインである」ものに相当する。

また、引用発明の「配列番号３０」で表されるアミノ酸配列は「重鎖可変領域をコードするアミノ酸配列」と記載され、技術常識と引用文献の請求項２０の記載からみて「重鎖可変領域のアミノ酸配列」を指すものと解すべきところ、これは本願発明の配列番号３８で表されるアミノ酸配列と同一であり、本願発明の配列番号３９～４１で表されるアミノ酸配列を含む。同様に、引用発明の「配列番号３２」で表されるアミノ酸配列は「軽鎖可変領域をコードするアミノ酸配列」とされ、技術常識と引用文献の請求項２１の記載からみて「軽鎖可変領域のアミノ酸配列」を指すものと解すべきところ、これは本願発明の配列番号４２で表されるアミノ酸配列と同一であり、本願発明の配列番号４３～４５で表されるアミノ酸配列を含む。さらに、重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１～３の配置は抗体に共通であるから、引用発明と本願発明の重鎖及び軽鎖のＣＤＲの位置は共通したものである。

そうすると、本願発明と引用発明の一致点及び相違点は以下のとおりである（なお、以下の配列番号は本願発明のものを用いた。）。

【一致点】

「二価結合単位を含む結合分子であって、各結合単位が、抗原結合ドメインと各々会合している２つの重鎖定常領域を含み、前記結合分子の少なくとも１つの抗原結合ドメインが、以下を含むＣＤ２０抗原結合ドメインである、前記結合分子：

（ａ） ６つの免疫グロブリン相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３であって、ここでＨＣＤＲ１が配列番号：３９のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２が配列番号：４０のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３が配列番号：４１のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１が配列番号：４３のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２が配列番号：４４のアミノ酸配列を含み；およびＬＣＤＲ３が配列番号：４５のアミノ酸配列を含む、前記６つの免疫グロブリン相補性決定領域、または

（ｂ） 抗体重鎖可変領域（ＶＨ）および抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）であって、ここでＶＨが配列番号：３８のアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号：４２のアミノ酸配列を含む、前記抗体重鎖可変領域（ＶＨ）および前記抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）。」

【相違点】

本願発明は「２つまたは６つの二価結合単位を含む多量体結合分子」であるのに対し、引用発明の「モノクローナル抗体１．５．３（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ－７３３０）」はアイソタイプが明らかにされておらず、「２つまたは６つの二価結合単位を含む多量体」であるかどうか判然としない点。

（３） 判断

引用文献の段落０１３０には、異なるアイソタイプの生物学的特性を生かすために、抗ＣＤ２０抗体のアイソタイプを転換できることや、転換先のアイソタイプとして抗体分子が２量体となるＩｇＡや５量体又は６量体となるＩｇＭを含む各種のものが挙げられるとともに、技術分野において周知である従来の技術を用いてアイソタイプを転換できることが記載されている。そして、周知例１～４には、抗体の重鎖、軽鎖における可変領域を用いて、遺伝子組換えの手法を用いて抗体を生成すること、その際にＩｇＡのような２量体やＩｇＭのような６量体とすることができる点が記載されており、このような方法は当業者において周知技術であったといえる。

そして当業者であれば、これらの記載に基づいて、変換先として、特有の生物学的特性を有し、多量体であることが周知のアイソタイプである２量体のＩｇＡや６量体のＩｇＭ（周知例１～４）を選択することは、適宜なし得る程度のことである。

（４） 本願発明の効果について

本願明細書をみると、実施例としてＣＤ２０に結合する活性を有する抗体を用いた多量体の生成、及び、生成した多量体を用いた補体依存性細胞障害、Ｔ細胞活性化アッセイ等に関する試験結果が記載されている。しかし、２量体の抗体に関する試験結果は記載がなく、６量体の抗体に関しても、抗体は生成されるもののその生理活性、薬理活性に関する試験結果は記載されていない。

そうすると、本願明細書の記載を参酌しても、本願発明が、引用文献に記載された発明及び本願優先日より前に周知であった技術からは当業者が予測できない顕著な効果を奏するものとは推認できない。

４ 審判請求人の主張について

（２） 判断

審判請求人による上記主張ア～ウは、いずれも採用することができない。その理由は、以下のとおりである。

ア 審判請求人の主張アについて

上記３（３）で検討したように、引用文献の段落０１３０の記載に基づき、異なるアイソタイプの生物学的特性を生かすために、抗ＣＤ２０抗体のアイソタイプを転換しようとすることや、転換先のアイソタイプとして抗体分子が２量体となるＩｇＡや５量体又は６量体となるＩｇＭを採用することについては十分に示唆されたものといえる。

イ 審判請求人の主張イについて

抗体の精製はプロテインＡやプロテインＧに限定されるものではなく、また、具体的な遺伝子組換え等の技術を用いてＩｇＡまたはＩｇＭを得ることは当業者に周知の技術であるところ、精製についても当業者が必要に応じて適宜なし得る程度の事項といえる。

ウ 審判請求人の主張ウについて

引用文献の段落０１３０にはアイソタイプの異なる抗体を用いる目的として異なるアイソタイプの生物学的特性を生かすことが記載されるなど、抗体としての効果が血清中半減期にのみで決まるものではないから、ＩｇＧとＩｇＡやＩｇＭの血清中半減期に差があるとしても、抗体アイソタイプの改変を妨げるものとはいえない。

５ まとめ

以上からみて、審判請求人の主張はいずれも採用できず、本願発明は、引用文献に記載された発明及び本願優先日より前に周知であった技術に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法２９条２項の規定により、特許を受けることができないものである。

第５ むすび

以上のとおり、本願発明は、特許法２９条２項の規定により特許を受けることができないから、他の請求項に係る発明について検討するまでもなく、本願は拒絶されるべきものである。