2023-007625

特願２０２０－５０６１３３「操作された共生細菌及び使用方法」拒絶査定不服審判事件〔平成３０年１０月２５日国際公開、ＷＯ２０１８／１９５０９７、令和 ２年 ６月１１日国内公表、特表２０２０－５１６３１８〕について、次のとおり審決する。

結 論 本件審判の請求は、成り立たない。

理 由 第１ 手続の経緯 本願は、平成３０年 ４月１７日（パリ条約による優先権主張 ２０１７年 ４月１７日 （ＵＳ）米国）を国際出願日とする出願であって、その後の手続の概要は、以下のとおりである。 令和 ３年 ４月１９日 手続補正書の提出 令和 ４年 ４月１３日付け 拒絶理由通知書 同年１０月 ６日 意見書・手続補正書の提出 令和 ５年 １月１９日付け 拒絶査定 同年 ５月１０日 審判請求書の提出 令和 ６年１１月１９日付け 拒絶理由通知書 令和 ７年 ２月２８日 意見書・手続補正書の提出（以下、この手続補正書による手続補正を「本件補正」という。） 第２ 本願発明 本件補正によって補正された特許請求の範囲の請求項１に係る発明（以下「本願発明」という。）は、以下のとおりである。 「治療用ポリペプチドをそれを必要とする哺乳類対象に送達するために使用する、形質転換された細菌細胞の集団を製造する方法であって、 ａ）供与対象から、細菌細胞を含むマイクロバイオームサンプルを得る工程； ｂ）マイクロバイオームサンプルから細菌細胞を単離する工程であり、細菌細胞は、供与対象にとって共生的な／天然の菌株に由来し、実験室に適合した菌株に由来しない、工程； ｃ）単離された細菌細胞をインビトロで培養して、単離された細菌細胞とその子孫の培養された集団を得る工程； ｄ）培養された集団を、細菌細胞にとって異種である１つ又は複数のポリヌクレオチドで形質転換し、異種ポリヌクレオチドを含む形質転換された細菌細胞の集団を生成する工程であり、１つ又は複数のポリヌクレオチドは、１つ又は複数の治療用ポリペプチドをコードする、工程； を含み、及び 受容対象に投与される異種ポリヌクレオチドを含む形質転換された細菌細胞の集団は、少なくとも２４時間の間、哺乳類対象中又はその上に定着し、１つ又は複数の治療用ポリペプチドを発現し、受容対象は、抗生物質を投与されておらず、供与対象と受容対象は、哺乳類の同種から由来する、方法。」 第３ 拒絶の理由 令和 ６年１１月１９日付けで当審が通知した拒絶理由の理由１（１）は、次のとおりのものである。 理由１（１） 本願発明は、その出願前に日本国内又は外国において、頒布された下記の刊行物に記載された発明又は電気通信回線を通じて公衆に利用可能となった発明に基いて、その出願前にその発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。 引用文献１ 米国特許出願公開第２００３／０２２８２９７号明細書 第４ 引用文献の記載事項 本願優先日前の２００３年１２月１１日に頒布された又は電気通信回線を通じて公衆に利用可能となった引用文献１には、次のとおり記載されている。引用文献１は英文であるため、当審による翻訳文で示す。また、下線は当審による。 引１ア 「請求の範囲 １．粘膜表面に定着し、生物学的に活性なタンパク質を発現するように組換え改変されたラクトバチルス ジェンセニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）細菌。 ２．請求項１に記載の細菌であって、粘膜表面が膣である細菌。 ３．請求項１に記載の細菌であって、粘膜表面が胃腸管である細菌。 ・・・ １０．請求項１に記載の細菌であって、前記生物学的に活性なタンパク質が病原体と接触すると、前記生物学的に活性なタンパク質が病原体に結合する細菌。 ・・・ １３．請求項１０に記載の細菌であって、病原体がウイルス病原体である細菌。 １４．請求項１３に記載の細菌であって、ウイルス病原体がＨＩＶである細菌。 ・・・ １６．請求項１０に記載の細菌であって、生物学的に活性なタンパク質がＣＤ４またはＣＤ４のＨＩＶ結合断片である細菌。 １７．請求項１６に記載の細菌であって、生物学的に活性なタンパク質が２Ｄ－ＣＤ４である細菌。 ・・・ ２０．請求項１に記載の細菌であって、生物学的に活性なタンパク質が治療用ポリペプチドである細菌。 ・・・ ２３．哺乳動物の粘膜表面に生物学的に活性なタンパク質を提供する方法であって、粘膜表面から採取したサンプル中に検出可能な量の生物学的に活性なタンパク質を発現するように組換え改変されたラクトバチルス ジェンセニイ細菌を粘膜表面に接触させる工程を含む方法。 ２４．請求項２３に記載の方法であって、粘膜表面が膣内に存在する方法。 ２５．請求項２３に記載の方法であって、粘膜表面が胃腸管内に存在する方法。 ２６．請求項２３に記載の方法であって、接触させる工程は、ラクトバチルス ジェンセニイ細菌を経口投与することを含む、方法。 ２７．請求項２３に記載の方法であって、接触させる工程は、ラクトバチルス ジェンセニイ細菌を膣内に投与することを含む、方法。 ２８．請求項２３に記載の方法であって、接触させる工程は、ラクトバチルス ジェンセニイ細菌を直腸投与することを含む、方法。 ・・・ ３２．請求項２３に記載の方法であって、前記生物学的に活性なタンパク質が病原体と接触すると、前記生物学的に活性なタンパク質が病原体に結合する、方法。 ・・・ ３５．請求項３２に記載の方法であって、病原体がウイルス病原体である方法。 ３６．請求項３５に記載の方法であって、ウイルス病原体がＨＩＶである方法。 ・・・ ３８．請求項３６に記載の方法であって、生物学的に活性なタンパク質がＣＤ４またはＣＤ４のＨＩＶ結合断片である方法。 ３９．請求項３８に記載の方法であって、生物学的に活性なタンパク質が２Ｄ－ＣＤ４である方法。 ・・・ ４２．請求項３２に記載の方法であって、生物学的に活性なタンパク質が治療用ポリペプチドである方法。」（請求の範囲） 引１イ 「［０００３］ 人間の粘膜には、自然に細菌が定着している。最近の科学的証拠により、これらの細菌が体内の細胞や組織と密接に相互作用して、自然な生物学的プロセスを調節しているという事実が立証されている。この粘膜微生物叢が、人間の細胞や組織に影響を与える数多くの病気にも大きく関与していることが、ますます明らかになっている。 ［０００４］ 一般的に、膣と消化管内の微生物叢が乳酸菌と関連細菌によって支配されていることは、良好な健康状態と関連する。これらの部位内の微生物叢を健全に保ち、感染を予防する目的で、天然の乳酸菌株が「プロバイオティクス」として長年投与されてきた。これらの「健全な細菌」が細菌、ウイルス、真菌などの病原体と競合して、病原体関連疾患の発症と進行を抑制することはよく知られている。しかし、この微生物叢は脆弱で動的な環境であり、健全な微生物叢の自然なターンオーバーと破壊は日和見感染の確立と関連する。したがって、病気の予防または治療手段として、微生物叢の完全性と自然特性を維持または強化するアプローチは、生物医学コミュニティによって切望されるだろう。 ・・・ ［０００６］ 粘膜微生物叢は、粘膜表面に影響を与える他の多くの局所疾患の原因となる。たとえば、潰瘍性大腸炎やクローン病などの炎症性腸疾患の原因は、破壊された粘膜微生物叢と宿主の細胞や組織との不適切な相互作用から生じる可能性がある。粘膜微生物叢内の細菌の特性を調整する手段は、これらの疾患や粘膜表面に影響を与える関連疾患の予防や治療に役立つ可能性がある。 ［０００７］ 本発明は、これらの問題およびその他の問題に対処する。 ［０００８］ 本発明は、生物学的に活性なタンパク質を発現するように組換え改変された、粘膜表面に定着するラクトバチルス ジェンセニイ細菌を提供する。いくつかの実施形態では、粘膜表面は膣内に存在する。いくつかの実施形態では、粘膜表面は胃腸管内に存在する。いくつかの実施形態では、粘膜表面はヒトの粘膜表面である。」（［０００３］～［０００８］） 引１ウ 「［００１８］ 本発明はまた、発現カセットを含むベクターおよびそのようなベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細胞はグラム陽性細菌である。 定義 ［００１９］ 「膣定着細菌」とは、膣に自然に定着する細菌、またはそのような細菌の組換えによって変化した株を指す。膣定着細菌の例には、Ｌ． ジェンセニイ（Ｌ． ｊｅｎｓｅｎｉｉ）やＬ．クリスパタス（Ｌ． ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）などがある。 ・・・ ［００２３］ 「２Ｄ－ＣＤ４」は、２ドメインＣＤ４の最初の約１８３アミノ酸を指す。ＣＤ４は、成熟したヘルパーＴ細胞と未熟な胸腺細胞、および単球とマクロファージに見られる細胞表面糖タンパク質である。２Ｄ－ＣＤ４は、完全なタンパク質と同じ親和性でＨＩＶ－１ ｇｐ１２０に結合し（Ｓａｌｚｗｅｄｅｌら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７４：３２６－３３３ （２０００））、ｇｐ１２０の結合部位を含む。ＣＤ４には、アミノ末端細胞外ドメイン（アミノ酸残基１～３７１）、膜貫通領域（３７２～３９５）、および細胞質テール（３９６～４３３）が含まれる。 ・・・ ［００２６］ 「治療用タンパク質」または「治療用ポリペプチド」とは、疾患の予防および／または治療に使用できる生物学的活性を有するポリペプチドを指す。治療用ポリペプチドの例には、代謝、免疫調節、ホルモン調節、酵素または膜関連構造機能における遺伝性または非遺伝性の遺伝子欠陥を予防、阻害、安定化または逆転させることができるものが含まれる。たとえば、治療用タンパク質は、欠損または欠陥のある細胞タンパク質または酵素を置き換えたり、欠陥のあるまたは発現が低い細胞タンパク質または酵素の産生を補ったりすることができる。 ・・・ ［００５６］ 「発現カセット」とは、宿主細胞内で特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸要素を持つ、組換えまたは合成によって生成された核酸である。発現カセットは、プラスミド、ウイルス、または核酸フラグメントの一部である可能性がある。通常、発現ベクターには、プロモーターに機能的にリンクされた転写される核酸が含まれる。」（［００１８］～［００５６］） 引１エ 「［００６４］ 本発明は、生物学的に活性なタンパク質を発現するように組換え改変された、粘膜表面に定着するラクトバチルス種およびその使用を提供する。本発明者らは、驚くべきことに、Ｌ． クリスパタスなどの他の粘膜表面に定着するラクトバチルスとは対照的に、Ｌ． ジェンセニイは哺乳動物由来のタンパク質を含む生物学的に活性なタンパク質を発現するように容易に形質転換できることを発見した。 ［００６５］ 生物活性タンパク質には、例えば、少なくとも１つのジスルフィド結合を有するタンパク質が含まれる。例示的な生物活性タンパク質には、抗ウイルス、抗菌、抗真菌、または治療用ポリペプチド、例えば抗炎症タンパク質、成長因子および成長因子拮抗薬、糖結合ポリペプチド、抗体および酵素が含まれる。本発明の細菌は、例えば、疾患の予防および／または治療を目的として、膣または胃腸管内で生物活性タンパク質を発現するのに有用である。」（［００６４］～［００６５］） 引１オ 「［００８２］ 必要に応じて、本発明の細菌を膣または胃腸管に導入する前に、使用者の抗生物質前処理を使用して粘膜表面の常在細菌を事前に除去することができる。例えば、Ｆｒｅｔｅｒら， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．、３９：６８６－７０３ （１９８３）を参照。抗生物質は経口投与することも、膣に直接塗布することもできる。 ［００８３］ 最初の方法は、動物またはヒトの粘膜層に急速に定着する細菌を繰り返し選択することである。たとえば、野生型の細菌株を粘膜表面に塗布し、細菌を繰り返し分離してインビトロ培養し、各ステップで粘膜表面に戻す。最終的に、定着能力が強化された細菌が得られる。 ［００８４］ ２番目の方法は、組換え細菌の表面で融合タンパク質を発現することである。融合タンパク質は、対象のポリペプチドにリンクされた宿主結合ドメインで構成される。宿主結合ドメインにより、細菌は選択された宿主粘膜表面の特定の決定因子（タンパク質または炭水化物）に高い親和性で結合できるようになり、その結果、細菌は常在微生物群よりも生存上の優位性を獲得する。 ・・・ ［００８６］ 粘膜上皮細胞を刺激しない特定の薬剤を、コロニー形成を助けるために、カプセルまたは錠剤内の細菌の単位用量に加えることもできる。粘膜表面の多くの細菌は、粘膜表面全体を覆うバイオフィルムを形成するために合体する莢膜物質を分泌する。コロニー形成の成功率を高めるために、このバイオフィルム物質を分解する酵素を加えると有益な場合がある。酵素には、ＤＮＡ分解酵素、ペプチダーゼ、コラーゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、およびその他の炭水化物分解酵素が含まれる。粘膜表面の常在細菌の数を減らし、遺伝子組換え細菌のための場所を作るために、遺伝子組換え細菌自体が感受性のない抗生物質を加えることもできる。」（［００８２］～［００８６］） 引１カ 「［００９７］ ＩＩＩ．本発明のタンパク質 ［００９８］ ラクトバチルス属で発現される本発明のポリペプチドは、任意のポリペプチドであり得る。通常、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドの生物学的活性を可能にする条件下で発現される。いくつかの実施形態では、発現されたポリペプチドにジスルフィド結合が存在する。いくつかの実施形態では、ジスルフィド結合は、ポリペプチドの生物学的活性に必要である。 ［００９９］ 本発明のポリペプチドは、任意の分子サイズであり得る。例えば、ポリペプチドは、約１００～１００，０００ダルトン、約５００～４０，０００ダルトン、約５００～１０，０００ダルトン、約１０，０００～５０，０００ダルトン、または約５０，０００～１００，０００ダルトンであり得る。 ［０１００］ 本発明の方法に従って病原体感染を予防または治療するために使用できるポリペプチドのクラスの例としては、例えば、抗ウイルスポリペプチド、抗菌ポリペプチド、抗真菌ポリペプチド、および抗体、抗体断片、または単鎖抗体を含む、ウイルス、細菌または真菌に結合するポリペプチドが挙げられる。 ［０１０１］ 場合によっては、本発明のポリペプチドは、ウイルスまたは細菌病原体が結合して宿主に感染する受容体となる。あるいは、ポリペプチドは、例えば、病原体の複製、生存、侵入を阻害するか、または病原体に結合する薬剤である。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、性感染病原体および膣にまたは膣から感染する他の病原体に結合または阻害する。例えば、ウイルスは感染するために標的細胞表面の受容体に結合する必要があるため、ウイルスと宿主受容体との相互作用を阻害することを目的とした戦略は、感染を予防するのに効果的である。 ［０１０２］ 例示的な抗ウイルスポリペプチドは、例えば、ＣＤ４またはそのウイルス結合フラグメント（例えば、２Ｄ－ＣＤ４）（例えば、Ｏｒｌｏｆｆら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７：１４６１－１４７１ （１９９３））、三量体モチーフを介して形成される安定したＣＤ４三量体（例えば、Ｙａｎｇら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７６：４６３４－４６４２ （２００２））、１２量体ＣＤ４－Ｉｇ融合タンパク質（Ａｒｔｈｏｓら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７：１１４５６－１１４６４ （２００２））、α－ディフェンシン（例えば、Ｚｈａｎｇ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８：９９５－１０００ （２００２））、１７ ｂモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の単一鎖可変領域と融合したＣＤ４（Ｄｅｙら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７７：２８５９－２８６５ （２００３）、シアノビリン－Ｎ（例えば、Ｂｏｌｍｓｔｅｄｔら， Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５９：９４９－５４ （２００１））、ＨｖｅＣ（例えば、Ｃｏｃｃｈｉら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９５：１５７００－１５７０５ （１９９８））、および細胞間接着分子－１（ＩＣＡＭ－１）を含む。他の実施形態には、例えば、ウイルス受容体またはヘパリンまたはヘパリン様分子、樹状細胞特異的ＩＣＡＭ－３捕捉非インテグリンを含むマンノース結合レクチン（例えば、Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら， Ｃｅｌｌ １００：５８７－５９７ （２０００）； Ｆｅｉｎｂｅｒｇら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９４：２１６３－２１６６ （２００１））、抗ＨＳＶ－１ ｇｐ１２０単鎖抗体（例えば、Ｍａｒａｓｃｏら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：７８８９－７８９３ （１９９３））、ＨＩＶ－１ ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位を認識するヒトｍＡｂ ｂ１２（例えば、Ｓａｐｈｉｒｅら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３：１１５５－１１５９ （２００１））、またはＨＳＶに結合する中和抗体（例えば、Ｂｕｒｉｏｎｉら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９１：３５５－３５９ （１９９４））、およびＨＩＶ－１侵入阻害タンパク質（例えば、Ｒｏｏｔら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１：８８４－８８８ （２００１）； Ｓｉａら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９９：１４６６４－１４６６９ （２００２））などの同様の特異性を持つ他の分子が挙げられる。 ・・・ ［０１０４］ ＨＩＶ、ＨＳＶ、ＨＰＶなどのウイルス感染は母子感染を伴い、経膣分娩が感染経路の１つとなる（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら， Ｌａｎｃｅｔ ３６０：６４３－６４４ （２００２）； Ｂｒｏｗｎら， ＪＡＭＡ ２８９：２０３－２０９ （２００３）； Ｐｕｒａｎｅｎら， Ａｍ． Ｊ． Ｏｂｓｔｅｔ． Ｇｙｎｅｃｏｌ． １７４：６９４－６９９ （１９９６））。したがって、膣内に定着した乳酸菌でＨＩＶ、ＨＳＶ、ＨＰＶを阻害または結合する分子を発現させることは、感染した女性の感染性ウイルス粒子の量を減らすのに役立ち、出産中に妊婦から新生児へのウイルスの垂直感染を制限する手段として役立つ。 ［０１０５］ ウイルスや細菌などの病原体に結合する能力は、少なくともいくつかの方法で本発明の細菌に付与することができる。第１の方法は、細菌の表面に、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）（主要グループ）のＩＣＡＭ－１やＨＩＶのＣＤ４などのウイルスに対する通常の宿主受容体を発現させることである。これらは通常のヒトタンパク質であり、これらの遺伝子の多くの完全な配列が決定されており、データベースＧｅｎＢａｎｋに保存されている。 ［０１０６］ ２番目の方法は、ポリオウイルスのＶＰ４やＨＩＶのｇｐ１２０など、ウイルス表面の保存された決定因子に結合する抗体フラグメントまたは他のポリペプチドを細菌表面に発現させることである。基本的に任意の抗原に特異的な抗体フラグメント（およびペプチド）は、たとえばファージディスプレイライブラリから選択できる（Ｍａｒｋｓら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：１６００７－１６０１０ （１９９２））。抗体は、病原体上または病原体に関連する任意のエピトープ、および以下で説明するような他のエピトープに向けることができる。 ［０１０７］ ３番目の方法は、細菌の表面で炭水化物結合ポリペプチドを発現させることである。これらの分子の例には、ヘパリン結合ポリペプチドやマンノース結合ポリペプチドなどがある。 ［０１０８］ 尿路病原性大腸菌に結合するか、またはその増殖もしくは定着を阻害するものが含まれる。例示的な抗菌性ポリペプチドには、例えば、グラム陰性細菌に対する透過性増加タンパク質（Ｌｅｖｙ， Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔｉｇ． Ｄｒｕｇｓ １１：１５９－１６７ （２００２））、哺乳類抗菌ペプチド、β－ディフェンシン（ＧａｎｚとＬｅｈｒｅｒ、 Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ． ６６：１９１－２０５ （１９９５））、バクテリオシン（例えば、Ｌｏｅｆｆｌｅｒら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９４：２１７０－２１７２ （２００１））、および細菌に特異的に結合する抗体が含まれる。 ［０１０９］ 抗真菌ポリペプチドには、カンジダなどの真菌に結合したり、真菌の増殖や定着を阻害するものが含まれる。 ［０１１０］ 本発明で有用な生物学的に活性なポリペプチドのさらなる例としては、抗炎症分子、成長因子、成長因子に結合するかまたは成長因子に拮抗する分子、治療用酵素、抗体（例えば、抗体フラグメントまたは単鎖抗体を含む）、および子宮頸癌を含む癌を阻害または治療する分子などの治療用ポリペプチドまたは薬剤が挙げられる。これらの例は限定するものではなく、他の多数の治療活性ポリペプチドを容易に挙げることができる。 ［０１１１］ 抗炎症分子には、例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）またはインターロイキン－８（ＩＬ－８）に特異的に結合する抗体またはその他の分子が含まれる。その他の例示的な抗炎症分子には、ＩＬ－１０およびＩＬ－１１が含まれる。 ［０１１２］ 本発明で有用な成長因子としては、例えば、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ヘパリン結合表皮成長因子（ＨＢ－ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、および形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ－β）などの局所組織修復に関与するもの、またはこれらの分子の拮抗薬が挙げられる。 ［０１１３］ 治療用酵素には、例えば、一酸化窒素（ＮＯ）合成酵素が含まれる。 ［０１１４］ 抗がん分子には、アポトーシスを誘導するもの、ｐ５３などの細胞周期を調節するもの、がん特有のエピトープを標的とするワクチンとして機能するものなどがある。 ［０１１５］ 本発明で有用なワクチン分子には、ウイルス、細菌、または真菌に対する免疫応答を誘発するポリペプチドが含まれる。例示的なウイルスワクチンは、例えば、ＨＩＶ、ＨＰＶ、ＨＳＶ、または天然痘に対する応答を誘発する。」（［００９７］～［０１１５］） 引１キ 「［０１１６］ ＩＶ．送達 ［０１１７］ 人工細菌を目的の粘膜表面に送達できるかどうかは、その部位へのアクセスのしやすさと局所的条件によって決まる。例えば、人工細菌を生理食塩水または泡に入れて膣粘膜に送達することができる。泡には、例えばセルロースやキトサンなどの疎水的に修飾された多糖類を１つ以上含めることができる。セルロースには、例えばヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロースなどが含まれる。キトサンには、例えば以下のキトサン塩が含まれる。キトサン乳酸塩、キトサンサリチル酸塩、キトサンピロリドンカルボキシレート、キトサンイタコン酸塩、キトサンナイアシン酸塩、キトサンギ酸塩、キトサンアセテート、キトサン没食子酸塩、キトサングルタミン酸塩、キトサンマレイン酸塩、キトサンアスパラギン酸塩、キトサングリコール酸塩、第四級アミン置換キトサンおよびその塩など。泡には、水、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、グリセリン、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトールなどの他の成分も含まれ得る。殺精子剤は、任意で細菌組成物に含まれる。泡および泡送達媒体のさらなる例は、例えば、米国特許第５，５９５，９８０号および第４，９２２，９２８号に記載されている。 ［０１１８］ あるいは、細菌は坐薬またはペッサリーとして送達することもできる。例えば、米国特許第４，３２２，３９９号を参照。いくつかの実施形態では、本発明の細菌は、米国特許第６，４６８，５２６号に記載されているような保存マトリックスで調製され、溶解特性について選択された溶解性ポリマー材料および／または複合炭水化物材料で作られた溶解性要素で送達され、使用前は実質的に固体形態のままであり、使用中に人体の温度および湿気により溶解して、所望の時間放出および投与量で薬剤材料を放出する。例えば、米国特許第５，５２９，７８２号を参照。細菌は、米国特許第４，６９３，７０５号に記載されているようなスポンジ送達媒体で送達することもできる。 ［０１１９］ いくつかの実施形態では、細菌は経口投与される。例えば、１日あたり約１０８個の乳酸菌を投与すると、正常な泌尿生殖器内細菌叢を回復することができる。例えば、Ｒｅｉｄら， ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏ． Ｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３２， ３７－４１ （２００１）を参照。 ［０１２０］ いくつかの実施形態では、粘膜表面への人工細菌の適用は定期的に繰り返す必要がある。最適な投与間隔は定期的に決定されるが、粘膜環境および細菌株によって異なる。投与間隔は、１日１回から２～４週間に１回まで変化する可能性がある。」（［０１１６］～［０１２０］） 引１ク 「実施例 ［０１２３］ 以下の例は、請求された発明を説明するために提供されるものであり、限定するものではない。 ［０１２４］ 導入 ［０１２５］ ラクトバチルス ジェンセニイのヒト分離株を遺伝子改変して、生物学的に活性なポリペプチドを発現、分泌、または表面に固定することに関する。本発明を実証するために、高親和性のＨＩＶまたはＨＳＶ結合タンパク質をラクトバチルス ジェンセニイで発現させた。これらの組換え細菌は膣内に注入されることが意図されており、そこで粘膜に定着してウイルス結合タンパク質を生成し、このウイルス結合タンパク質はこれらの細菌の細胞表面に付着したままになるか、周囲の粘膜バイオフィルムマトリックスに分泌される。その後、感染性ウイルス粒子がこれらのタンパク質に結合することでウイルスが捕捉され、保護粘膜バリアを介したウイルスの移動が妨げられる。粘膜内での滞留時間が長くなるとウイルス粒子が殺ウイルス物質（乳酸や過酸化物など）にさらされるため、感染した男性パートナーの射精液から膣内に導入されたウイルスのかなりの集団は、この敵対的な環境内に留まると不活性化される可能性が高い。このようにして、バイオフィルム全体がより効果的な生物学的バリアに変換され、女性宿主へのウイルス感染に対する保護シールドとして機能する。 ［０１２６］ この研究のうち、ヒト膣由来の乳酸菌分離株を発現宿主として使用することに注力したものはほとんど、あるいはまったくなかった。実際、本明細書に記載のとおり、発明者らは、一部の膣分離株（例えば、Ｌ． クリスパタス）は形質転換できなかったが、Ｌ． ジェンセニイは効率的に形質転換できることを発見した。本明細書では、分離されたＬ． ジェンセニイ膣定着株の遺伝子改変について説明する。これらの細菌は、プロトタイプのＨＩＶ結合タンパク質である２Ｄ－ＣＤ４を発現するように改変されている。これらの遺伝子改変細菌によって生成される２Ｄ－ＣＤ４分子は、ｇｐ１２０に結合してインビトロでＨＩＶ感染性を阻害する能力など、強力な生物学的活性を示す。この研究は、膣定着している乳酸菌分離株で複雑なジスルフィド結合哺乳類タンパク質をうまく発現できることを示している。さらに、これにより、女性におけるＨＩＶ感染を阻止する、改変細菌の臨床的有効性が可能になる。」（［０１２３］～［０１２６］） 引１ケ 「［０１２７］ 実験方法 ［０１２８］ 細菌株とプラスミド。Ｌ． ジェンセニイおよび Ｌ． クリスパタスの自然発生的なヒト膣分離株は、健康なボランティアの膣スワブから採取された。Ｍａｎｎ Ｒｏｇｏｓａ Ｓｈａｒｐｅ（ＭＲＳ）ブロスおよびＲｏｇｏｓａ ＳＬブロスが含まれる、Ｌ． ジェンセニイおよびＬ． クリスパタスの通常の増殖用培地（３７℃、５％ＣＯ２）は、Ｄｉｆｃｏ（デトロイト、ミシガン州）から入手した。プラスミドは、次の方法により、エレクトロポレーション法でＬ． ジェンセニイに導入された。 ［０１２９］ プラスミドの選択と維持のために、エリスロマイシン（２０μｇ／ｍｌ）を液体培地または固体培地に添加した。シャトルプラスミドの構築と維持のために、組換え構築物を持つ大腸菌ＤＨ１２ｓ細胞を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢブロス（Ｄｉｆｃｏ）で３７℃で増殖させた。大腸菌由来のプラスミドを、Ｌｕｃｈａｎｓｋｙら， Ｊ． Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ． ７４：３２９３－３３０２ （１９９１）のプロトコルの修正を使用してＬ． ジェンセニイに形質転換した。簡単に説明すると、接種したばかりのＬ． ジェンセニイをＭＲＳブロスで３７℃、５％ＣＯ２でＯＤ６００が０．６－０．７になるまで培養した。細菌細胞を採取し、洗浄し、４℃で９５２ｍＭスクロースおよび３．５ｍＭ ＭｇＣｌ２に再懸濁した。事前に冷却した０．２ｃｍギャップのキュベットを使用して、コンピテント細胞を１～２μｇのＤＮＡに加え、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カリフォルニア州ヘラクレス）を使用して２．５ｋＶ／ｃｍおよび２００オームで直ちにエレクトロポレーションした。その後、細胞を３７℃で２時間、事前に温めたＭＲＳブロスで回復させ、その後、２０μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含む選択ＭＲＳ寒天プレートに播種した。 ［０１３０］ 発現ベクター。これらの研究で使用された主なシャトルベクターは、ｐＯＳＥＬ１４４（図１）であり、これはｐＬＥＭ７（Ｆｏｎｓら， Ｐｌａｓｍｉｄ． ３７：１９９－２０３（１９９７））の修正版であり、ＡｃｃＩ部位にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔからｃｏｌＥ１複製起点が追加されている。部分的なＩＳ要素は、最初にＳｍａＩで切断し、ＮｄｅＩで部分的に消化し、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントで平滑化し、次に再連結することによって削除された。最後に、プラスミドを部位特異的変異誘発にかけ、ｅｒｍ遺伝子内の２つのＭｆｅＩ部位を除去して、ｐＯＳＥＬ１７５を作成した。 ・・・ ［０１３３］ この研究で使用されたプロモーターは、ラクトコッカス ラクティスのＰ２３およびＰ５９であった（ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｏｓｓｅｎら， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５３：２４５２－２４５７ （１９８７））。ヒトＣＤ４（２Ｄ－ＣＤ４）のＮ末端の２つの細胞外ドメインを構成する最初の１８３残基は、ラクトバチルスの好ましいコドン使用頻度に一致するようにアセンブリＰＣＲ（Ｓｔｅｍｍｅｒら， Ｇｅｎｅ １６４：４９－５３ （１９９５））によって再コード化された。シアノビリン－ＮをコードするＤＮＡ配列（Ｂｏｙｄら， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４１：１５２１－１５３０ （１９９７））もアセンブリＰＣＲによって合成された。ＨｖｅＣ－ＶをコードするＤＮＡ配列（Ｋｒｕｍｍｅｎａｃｈｅｒら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３：８１２７－８１３７ （１９９９））は、ヒトｃＤＮＡライブラリのＰＣＲ増幅によって得られ、一方、ＨｖｅＣ－γの分泌型をコードするＤＮＡ配列（Ｌｏｐｅｚら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７５：５６８４－５６９１ （２００１））は、このタンパク質をコードするヒトｃＤＮＡクローン（ＩＭＡＧＥ クローン ＃１４３１７７）のＰＣＲ増幅によって得られた。すべての発現コンストラクトは、ＤＮＡ配列分析によって確認された。 ［０１３４］ Ｌ． ジェンセニイにおける異種タンパク質発現の分析。組換えＬ． ジェンセニイ細胞は、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）で緩衝化されたＲｏｇｏｓａブロスで培養された（３７℃、５％ＣＯ２）。細胞培養はさまざまな密度で培養され、その後、細菌は遠心分離（３，８００×ｇ、１５ｍ）によって除去された。上清は新しい容器に移され、この使用済み培地に分泌されたタンパク質は、最終濃度２０％で氷冷トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）の添加によって沈殿された。タンパク質沈殿物を７０％エタノールで洗浄し、風乾し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥローディングバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．８、０．４％ＳＤＳ、６％スクロース、０．０１％ブロモフェノールブルー）で熱変性させた。このバッファーにはジチオトレイトール（１０ｍＭ）が添加されている場合と添加されていない場合があった。Ｌ． ジェンセニイの細胞表面結合タンパク質の相対量を推定するために、細菌細胞をＳＤＳ－ＰＡＧＥローディングバッファーで室温で１５分間抽出した。抽出したタンパク質は、１４，０００×ｇで５分間遠心分離して不溶性残渣から分離し、４－１２％ＮｕＰＡＧＥシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離した。ウェスタン分析では、製造元の指示に従って、タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気転写した。膜は、ポリクローナルウサギ抗ＣＤ４抗体Ｔ４－４（国立衛生研究所のエイズ研究および参照試薬プログラム）またはウサギ抗Ｓ． ピオゲネス Ｍ６、またはウサギ抗シアノビリン抗体でプローブされ、その後、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合抗ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）および発色検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して可視化された。あるいは、抗原抗体反応は、増強化学発光試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して可視化された。 ［０１３５］ 乳酸菌由来２Ｄ－ＣＤ４の部分精製。培養上清をプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）で処理し、１０ｋＤａカットオフ透析膜で５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、４℃で透析した後、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のカラムに通した。次に、フロースルー中の２Ｄ－ＣＤ４タンパク質をＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に結合させ、０．８Ｍ ＮａＣｌを含むバッファーで溶出した。溶出された２Ｄ－ＣＤ４の量はウェスタンブロットで測定し、活性は可溶性ＣＤ４（国立衛生研究所のＡＩＤＳ研究および参照試薬プログラム）を標準としてＣＤ４ ＥＬＩＳＡおよびｇｐ１２０結合で分析した。分離された可溶性タンパク質は、カリフォルニア大学デービス校分子構造施設でＮ末端アミノ酸配列解析も行われた。 ［０１３６］ ＣＤ４ ＥＬＩＳＡおよびｇｐ１２０結合アッセイ。正しく折り畳まれた２Ｄ－ＣＤ４タンパク質の濃度は、９６ウェルマイクロタイタープレート形式のＣＤ４キャプチャーＥＬＩＳＡによって評価された。Ｌ． ジェンセニイによって分泌された２Ｄ－ＣＤ４タンパク質は、ＣＤ４特異的モノクローナル抗体Ｓｉｍ．４（ＭｃＣａｌｌｕｓら， Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５：１６３－７２０）によって１０ｎｇ／ｍｌで捕捉された。結合したＣＤ４分子は、ポリクローナルウサギ抗体Ｔ４－４（ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ）で検出され、ＡＰ結合抗ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）およびＡＭＰＡＫ ＥＬＩＳＡ増幅システム（Ｄａｋｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．）とのインキュベーションによって可視化された。２Ｄ－ＣＤ４のｇｐ１２０結合活性は、基本的にＭｏｏｒｅ， ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ．で説明されているとおりに実施された。Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ９： ２０９－２１９ （１９９３）に若干の修正を加えた。簡単に説明すると、ポリクローナル羊抗ｇｐ１２０抗体Ｄ７３２４（Ａａｌｔｏ Ｂｉｏ Ｒｅａｇｅｎｔｓ、ダブリン、アイルランド）でコーティングした９６ウェルマイクロタイタープレートをブロック（ＴＢＳ、２％脱脂粉乳）し、１０ｎｇ／ウェルの組換えｇｐ１２０（ｒｇｐ１２０、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．）とともにインキュベートした。次に、ＣＤ４分子を含むサンプルをｒｇｐ１２０で捕捉し、結合したＣＤ４分子を、上記のようにポリクローナルウサギ抗体Ｔ４－４を使用して検出した。乳酸菌由来シアノビリンの生物学的活性も、ｇｐ１２０結合アッセイで測定した。シアノビリンを含むサンプルを最初にｒｇｐ１２０で捕捉し、結合したシアノビリン分子をポリクローナルウサギ抗シアノビリン抗体を使用して検出した。 ［０１３７］ ＨＩＶ感染性アッセイ。Ｌ． ジェンセニイから分泌される２Ｄ－ＣＤ４タンパク質のＨＩＶ－１侵入に対する効果を、単一サイクル感染アッセイを使用して測定した（Ｃｏｎｎｏｒら， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８５：６２１－６２８ （１９９７）； Ｃｈｅｎら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８：６５４－６０ （１９９４））。ルシフェラーゼを発現するレポーターウイルス（ＨＩＶ－１ＨｘＢ２株 Ｅｎｖ）は、エンベロープ欠損ＨＩＶ－１ ＮＬ４－３ウイルスをコードするプラスミド、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含むｐＮＬ－Ｌｕｃプラスミド、およびＨＩＶ－１ＨｘＢ２株由来の糖タンパク質を発現するｐＳＶプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトすることによって生成された。トランスフェクションの４８時間後に上清を収集し、濾過した。ウイルスストックは、ＥＬＩＳＡによってＨＩＶ－１ ｐ２４抗原濃度について分析された。その後、ウイルスを含む上清中のウイルスｐ２４抗原濃度がｐ２４抗原ＥＬＩＳＡによって測定された。 ［０１３８］ 感染の１日前に、ＣＸＣＲ４を発現するＨｅＬａ－ＣＤ４細胞を４８ウェル組織培養プレートに１ウェルあたり５×１０４細胞で播種した。Ｅｎｖ－擬似型、ルシフェラーゼ発現レポーターＨＩＶ－１ＨｘＢ２ウイルスを、培養上清から直接、または部分精製後に調製した、さまざまな濃度の２Ｄ－ＣＤ４タンパク質とともに最初にインキュベートした（３７℃、３０分）。続いて、反応混合物中のウイルスを使用して細胞を感染させた（３７℃、１時間）。結合していないウイルスはＰＢＳで洗浄して除去した。あるいは、２．５または５×１０８細胞／ｍｌで再懸濁したＬ． ジェンセニイ細菌を培地１９９で培養した（３７℃、３０分）。次に、細菌を入力ウイルスとともに、ＣＤ４－ＣＸＣＲ４を発現するＨｅＬａ細胞に加えた（３７℃、１時間）。その後、細胞は１０％ＦＢＳを添加したダルベッコ改変イーグル培地で培養された（３７℃、４８時間、５％ＣＯ２）。細胞はＰＢＳで１回洗浄され、レポーター溶解バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ． ウィスコンシン州マディソン）で溶解された。ルシフェラーゼ基質と細胞溶解液の混合物中のルシフェラーゼ活性は、Ｃｈｉｒｏｎマイクロプレートルミノメーターで相対光単位（ＲＬＵ）で測定された。」（［０１２７］～［０１３８］） 引１コ 「［０１３９］ 結果： ［０１４０］ 人間の膣の生態系には複雑な微生物叢が存在する。健康なアメリカ人とヨーロッパ人の女性の微生物叢では乳酸菌が優勢で、インビトロで膣上皮細胞にしっかりと付着することがわかっている。健康な女性のほとんどは、他の乳酸菌種と比較して、Ｌ． クリスパタスまたはＬ． ジェンセニイのいずれかが優勢にコロニーを形成している。したがって、インビトロでの成長特性、コロニー形成、内因性プラスミドプロファイル、抗生物質感受性、相対的形質転換効率、および機能的タンパク質発現レベルを分析するために選択された２種の乳酸菌種は、Ｌ． クリスパタスとＬ． ジェンセニイだった。 ［０１４１］ 成長特性：Ｌ． ジェンセニイ株は、健康な人の膣スワブから分離された。これらの分離株は、最終的な人工製品で維持する必要があるさまざまな表現型特性（乳酸生成、自己凝集、膣上皮細胞への付着など）の特定に役立つ。比較のために、Ｌ． クリスパタス 、Ｌ． ジェンセニイ、Ｌ． ガセリ、Ｌ． フォルニカリス、Ｌ． ヴァギナリスなど、さまざまな膣乳酸菌分離株の参照株が、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手された。 ［０１４２］ 抗生物質感受性／プラスミドプロファイル：環境（ＷＴ）細菌分離株には、生体内での生存に遺伝的利点をもたらす伝達可能な遺伝要素（プラスミド、トランスポゾン、および温帯バクテリオファージ）が頻繁に含まれている。ただし、天然のプラスミドまたは組み込まれたトランスポゾンの存在は、複製を妨害するか、抗生物質選択を使用する能力を低下させるため、予備研究で使用したプラスミドベースの発現コンストラクトの安定性に悪影響を及ぼす可能性がある。あるいは、ＷＴ Ｌ． ジェンセニイから分離された天然のプラスミドは、抗生物質選択を必要とせずに異種タンパク質生産用に操作できる可能性がある。感受性試験は、作用機序が明確なさまざまな抗生物質化合物に対するＬ． ジェンセニイおよびＬ． クリスパタスのＷＴ分離株の感受性の範囲を決定するために使用された。特定の化合物に耐性があることが判明したＬ． ジェンセニイの株は、耐性遺伝子を一般的に含むプラスミドとトランスポゾンについてさらに徹底的に検査された。抗生物質感受性を評価するために、ディスク拡散法とブロス微量希釈法（ＭＲＳ法）の両方を使用した。試験したすべての菌株はエリスロマイシンに感受性があり（＜０．５μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリンには中程度の感受性があった（４μｇ／ｍｌ）。ほとんどの菌株はオキサシリンに感受性があった（＜０．５μｇ／ｍｌ）が、２つの菌株は高度に耐性があるように見えた（＞１２８μｇ／ｍｌ）。すべての菌株はアミノグリコシド（カナマイシン、ゲンタマイシン）に耐性があることがわかった（＞１２８μｇ／ｍｌ）。これは、呼吸キノンを合成しない耐気性細菌では予想されることである。 ［０１４３］ 乳酸菌におけるエレクトロポレーションの最適化：これらの膣乳酸菌株のクローニングと異種タンパク質発現をサポートするために、Ｌ． ジェンセニイおよび Ｌ． クリスパタスに適用するエレクトロポレーション法が開発された。培養培地、細胞増殖段階、ＤＮＡ濃度、洗浄またはエレクトロポレーション緩衝液の組成、キュベットギャップサイズ、電圧などのさまざまなパラメータを評価し、当社のコレクションのＷＴ乳酸菌株の形質転換頻度を向上させる条件を決定した。大腸菌由来のプラスミドは、Ｌｕｃｈａｎｓｋｙらの方法（Ｊ． Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ． ７４：３２９３－３０２ （１９９１））に従ってエレクトロポレーションによりＬ． ジェンセニイに形質転換された。簡単に説明すると、接種したばかりのＬ． ジェンセニイをＭＲＳブロスで３７℃、５％ＣＯ２でＯＤ６００が０．６－０．７になるまで培養した。細菌細胞を採取し、洗浄し、４℃で９５２ｍＭスクロースおよび３．５ｍＭ ＭｇＣｌ２に再懸濁した。事前に冷却した ０．２ｃｍ ギャップキュベットを使用して、コンピテント細胞に１～２μｇのプラスミドＤＮＡ（例：ｐＯＳＥＬ１７５）を加え、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カリフォルニア州ヘラクレス）を使用して２．５ｋＶ／ｃｍおよび２００オームで直ちにエレクトロポレーションした。その後、細胞を３７℃で２時間、事前に温めたＭＲＳブロスで回復させ、その後、２０μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含む選択ＭＲＳ寒天プレートに播種した。 ［０１４４］ Ｌ． ジェンセニイの形質転換とは対照的に、Ｌ． クリスパタスの臨床分離株は、熱心な努力にもかかわらず、形質転換に成功しなかった。次の表は、Ｌ． ジェンセニイと Ｌ． クリスパタスで達成されたプロトコルと成功率を示している。Ｌ． クリスパタスの形質転換を試みるために統合されたプロトコルには、Ｌｕｃｈａｎｓｋｙらで説明されているパラメータが含まれていた（Ｊ． Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ． ７４：３２９３－３０２ （１９９１）； Ｍａａｓｓｅｎ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２３：１３１－１３６ （１９９９）（蒸留水で細胞を２回洗浄し、３０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ－１０００で１回洗浄した後、３０％ＰＥＧ－１０００、１００Ω、２５ｍＦの静電容量で（８５００Ｖ／ｃｍ２）でエレクトロポレーションを行う）； ＢｈｏｗｍｉｋとＳｔｅｅｌｅ， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １３９：１４３３－１４３９ （１９９３）（ＭＲＳブロスプラス１％グリシンで増殖した細菌、緩衝液（０．５Ｍスクロース、０．１ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０）で４回洗浄し、同じ緩衝液でエレクトロポレーションを行う、０．４ｃｍキュベット、２．５ｋＶ、２５μＦ、２００Ω））。現在までに、Ｌ． クリスパタスのヒト膣分離株は、試験したいかなる条件下でも形質転換できなかった。 ［図：0001428431000001.jpg］ ［図：0001428431000002.jpg］ ［０１４５］ ラクトバチルスにおける発現ベクターの構築：ラクトバチルスにおける発現ベクターは、Ｌ． ロイテリ ＬＥＭ３の内因性プラスミドから改変されたクローニングベクター（ｐＬＥＭ７）に基づいて製造された（Ｆｏｎｓら， Ｐｌａｓｍｉｄ ３７：１９９－２０３ （２００２））。これらのベクターの１つであるｐＯＳＥＬ１４４には、多重クローニングサイト、大腸菌における複製起点（ｃｏｌＥ１）、乳酸菌における追加の複製起点（ｒｅｐＡ）、および大腸菌と乳酸菌の両方でプラスミドの正の選択を行うためのエリスロマイシン耐性マーカー（ｅｒｍ）が含まれている（図１）。 ［０１４６］ ＨＩＶ結合リガンドなどの異種ポリペプチドのクローニングと発現を容易にするモジュールクローニングアプローチ。さまざまな発現戦略の組み合わせを使用して、これらの分子は細胞外空間（つまり周囲の培地）に分泌されるか、細菌細胞壁（ペプチドグリカン）への自然な共有結合修飾によって結合された表面発現タンパク質として保持されるように設計される。カセットには、プロモーター要素、シグナルペプチド、ウイルス結合リガンド、アンカー配列の４つのコンポーネントを含めることができる（図１）。さまざまなリガンドの発現のために、各モジュール間に固有の制限部位が配置され、ワンステップクローニングが容易になった。 ［０１４７］ このモジュール方式が機能するかどうかの証拠を得るために、いくつかのシグナル配列とアンカー配列を分析し、Ｐ２３またはＰ５９プロモーターの制御下で発現される生物学的に活性なＣＤ４タンパク質融合物の発現を決定した。Ｓ． ピオゲネスのＭ６タンパク質シグナル配列を利用することに加えて、Ｌ． アミロボラスのα－アミラーゼ（Ａｍｙ）遺伝子（ａｍｙＡ）とＬ． クリスパタスのＳ層遺伝子（ｃｂｓＡ）のシグナル配列がクローニングされた。両方の配列は、Ｌ． アミロボラスまたはＬ． クリスパタスのいずれかから単離された染色体ＤＮＡからＰＣＲによって得られ、リボソーム結合部位を含み、いずれかの遺伝子のＮ末端配列からシグナルペプチダーゼ切断部位まで及ぶように設計された。Ａｍｙシグナル配列（Ａｍｙｓｓ）は、ＭＫＫＫＫＳＦＷＬＶＳＦＬＶＩＶＡＳＶＦＦＩＳＦＧＦＳＮＨＳＫＱＶＡＱＡ（配列番号３）であった。ＣｂｓＡシグナル配列（ＣｂｓＡｓｓ）は、ＭＫＫＮＬＲＩＶＳＡＡＡＡＡＬＬＡＶＡＴＶＳＡ（配列番号２）であった。プライマーの末端に固有の制限エンドヌクレアーゼ部位を追加したことにより、潜在的なリガンドタンパク質は、いずれかのシグナル配列とインフレームでクローニングできる。増幅されたカセット（ＣｂｓＡｓｓまたはＡｍｙｓｓのいずれかを含む）は、その後、消化され、モジュラーシステムにクローニングされた。 ［０１４８］ Ｌ． ジェンセニイによる異種タンパク質（例えば２Ｄ－ＣＤ４）の分泌は、膜を介した前駆体タンパク質の転座を仲介するＳｅｃ機構に依存する。２Ｄ－ＣＤ４タンパク質は、シグナル配列（例えばＣｂｓＡｓｓ）を持つ前駆体として最初に合成される。膜を介した転座時に、ＣｂｓＡｓｓはシグナルペプチダーゼによって切断され、成熟した２Ｄ－ＣＤ４が細胞外環境に放出される。分泌タンパク質のＮ末端アミノ酸配列は、成熟タンパク質の予測配列と一致する。 ［０１４９］ Ｌ． ジェンセニイの表面でＣＤ４を発現させるために、Ｓ． ピオゲネスのＭ６タンパク質（ｅｍｍ６）またはＬ． パラカゼイのＰｒｔＰプロテアーゼのいずれかから２つの細胞壁アンカーを使用した。特徴的なＬＰＸＴＧ細胞壁選別シグナルを持つＭ６タンパク質とは異なり、ＰｒｔＰの選別モチーフはＬＰＫＴＡである。ＰｒｔＰアンカーは、Ｌ． パラカゼイＡＴＣＣ ２５３０２からＰＣＲ増幅によって調製され、その後、クローン化されてＤＮＡ配列分析によって確認された。 ［０１５０］ ヒトＣＤ４（２Ｄ－ＣＤ４）の最初の２つの細胞外ドメイン（Ｋ１－Ｓ１８３）が表面発現用に選択された。２Ｄ－ＣＤ４は、４ドメインｓＣＤ４と同様にｇｐ１２０に高親和性で結合できる。コドンバイアスの違いがＬ． ジェンセニイでのタンパク質発現に影響するため、ヒト２Ｄ－ＣＤ４のｃＤＮＡクローンは、最適な乳酸菌コドン使用頻度にさらに厳密に適合するように再コード化された。５’末端にＮｈｅＩ部位、３’末端にＭｆｅＩ部位を含む２Ｄ－ＣＤ４配列は、再コード化されたＣＤ４配列から増幅された。得られたＰＣＲ産物はＮｈｅＩとＭｆｅＩで切断され、２Ｄ－ＣＤ４の表面発現用にＮｈｅＩ／ＭｆｅＩ処理ベクターと連結された。コンストラクトのヌクレオチド配列は、Ｌ． ジェンセニイへの形質転換前に検証された。 ［０１５１］ Ｌ． ジェンセニイにおける２Ｄ－ＣＤ４の表面アンカー：２Ｄ－ＣＤ４の表面発現の程度を決定するために、異なる表面アンカーを持つ一連のコンストラクトを、ネガティブコントロールとして使用したｐＯＳＥＬ１４４とともに分析した。改変された細菌からのタンパク質は、細胞、細胞壁、およびプロトプラスト関連プールに分画された。２Ｄ－ＣＤ４は、細胞壁関連およびプロトプラスト分画でＰ５９プロモーター制御下で検出されたが、細胞壁アンカーとしてＭ６またはＣＷＡ１００のいずれかを持つＰ２３プロモーターを持つコンストラクトの細胞壁分画では検出されなかった。ここで、ＣＷＡ１００は、Ｓ． ピオゲネスの１００アミノ酸長の細胞壁アンカードメインを表す。この細胞壁関連２Ｄ－ＣＤ４が検出されないのは、細胞壁消化中のタンパク質の不安定性によるものではなかった。Ｓ． ピオゲネスのＭ６またはＬ． パラカゼイのＰｒｔＰプロテアーゼからの細胞壁選別シグナルによって駆動される２Ｄ－ＣＤ４の非効率的な表面固定により、Ｌ． ジェンセニイにおける天然の細胞壁選別シグナルの特定と使用が必要になった。 ［０１５２］ 生物学的に活性な２Ｄ－ＣＤ４の分泌：表面に固定された構造物の分析により、２Ｄ－ＣＤ４の大部分が培養培地に放出されたことが実証された。さらに、インビトロ結合研究では、一部の可溶性２ドメインまたは４ドメインＣＤ４分子が生体液中で自由に拡散せず、むしろ細胞表面に結合していることが示された。ＣＤ４を発現する乳酸菌の増殖および接着特性は野生株のものと類似しているようで、これらのウイルス結合タンパク質の発現は、遺伝子組換え乳酸菌がヒト宿主に定着する能力を妨げないことを示唆している。したがって、これらのＣＤ４分子を発現する遺伝子組換え乳酸菌は、ペプチドグリカンへの共有結合を明示的に必要とせずに、分子の高濃度を局所的に維持できる。 ［０１５３］ カセットベースの発現システムでは、アンカードメインによって、発現したウイルス結合タンパク質が表面に固定されるか、分泌されるかが決定される。ＨＩＶ結合タンパク質の分泌型を生成するために、細胞壁固定ドメインのＮ末端領域に停止コドンが導入された。以下のコンポーネントを含むタンパク質分泌用に設計された一連のプラスミドが構築された：Ｓ． ピオゲネス Ｍ６のＰ２３プロモーターシグナル配列（Ｍ６ｓｓ）－Ｍ６１２０－２Ｄ－ＣＤ４（ｐＯＳＥＬ１２８）、Ｐ５９プロモーター－Ｍ６ｓｓ－Ｍ６１２０－２Ｄ－ＣＤ４（ｐＯＳＥＬ１９７）、およびＰ２３プロモーター－ＣｂｓＡｓｓ－２Ｄ－ＣＤ４（ｐＯＳＥＬ６５１）。ここで、Ｍ６１２０はＳ． ピオゲネス Ｍ６のＮ末端１２０アミノ酸残基を表す。Ｌ． ジェンセニイ １１５３ およびＸｎａをｐＯＳＥＬ１２８、１９７、または６５１で形質転換し、対数増殖期まで増殖させたところ、中程度および高レベルの組換え２Ｄ－ＣＤ４が生産された。一晩培養した後、培養培地のｐＨが酸性化しても、発現したタンパク質は蓄積し続けた。図２は、ｐＯＳＥＬ６５１を有するＬ．ジェンセニイ Ｘｎａによる２Ｄ－ＣＤ４の時間依存的放出の、コントロールプラスミドｐＯＳＥＬ１４４を持つ細菌と比較を示す。分泌された２Ｄ－ＣＤ４タンパク質の生物学的活性を特徴付けるために、ＣＤ４ ＥＬＩＳＡおよびｇｐ１２０結合アッセイを実施した。ＣＤ４ ＥＬＩＳＡは、吸着抗体Ｌｅｕ３ａまたはＳｉｍ．４によって固相上に捕捉された、正しく折り畳まれたＣＤ４分子の存在を判定するために開発された。ＣＤ４ハイブリドーマ（Ｓｉｍ．４）およびＣＤ４モノクローナル（Ｓｉｍ．４）は、ＮＩＨ ＡＩＤＳ研究および参照試薬プログラムで入手できる。Ｌｅｕ３ａ ｍＡｂは、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎで入手できる。両方の抗体は、ｇｐ１２０結合部位と重複するＣＤ４のドメイン１を認識した。結合したＣＤ４分子を検出するために、ＣＤ４に対するポリクローナル抗体（Ｔ４－４）を使用した。使用済み上清中に、約１００ｎｇ／ｍｌのＭ６１２０－２Ｄ－ＣＤ４または２Ｄ－ＣＤ４が検出された（図３）。分泌されたＭ６１２０－２Ｄ－ＣＤ４または２Ｄ－ＣＤ４タンパク質のｇｐ１２０結合活性は、ＣＤ４ ＥＬＩＳＡの結果とよく相関した（図３）。したがって、２Ｄ－ＣＤ４は、コンフォメーション依存性抗体Ｓｉｍ．４との免疫反応性およびカウンターリガンドｇｐ１２０に結合する能力に基づいて、ネイティブなコンフォメーションで発現されている。 ［０１５４］ Ｌ． ジェンセニイ由来の２Ｄ－ＣＤ４は、インビトロでＨＩＶ－１の感染性を阻害した。Ｘｎａ－６５１株から分泌された２Ｄ－ＣＤ４が、ルシフェラーゼレポーターを持つＨＩＶ－１ＨｘＢ２ウイルスが、単一サイクルウイルスエントリフォーマットでＣＤ４－ＣＸＣＲ４を発現するＨｅＬａ細胞に感染する能力を阻害するかどうかを決定するために、いくつかの異なるアプローチが使用された。 ［０１５５］ 最初に、Ｌ． ジェンセニイ（ｐＯＳＥＬ６５１）によって培養上清に分泌された可溶性２Ｄ－ＣＤ４を、イオン交換クロマトグラフィーを使用して部分的に精製した。陽性対照として、生物学的に活性な２Ｄ－ＣＤ４タンパク質を対照株（ｐＯＳＥＬ１４４）から調製したサンプルに加えた。陽性対照と同様に、Ｌ． ジェンセニイ（ｐＯＳＥＬ６５１）からのサンプルは用量依存的にＨＩＶ－１感染性を阻害したが、対照株（ｐＯＳＥＬ１４４）から調製したサンプルには明らかな効果はなかった（図４）。 ［０１５６］ 次に、ＨｅＬａ細胞に適合する培地であるＭｅｄｉｕｍ１９９で対数増殖期のＬ． ジェンセニイを培養して馴化培地を調製した。ＣＤ４ ＥＬＩＳＡとＨＩＶ－１ ｇｐ１２０結合分析の両方に基づき、Ｌ． ジェンセニイ（ｐＯＳＥＬ６５１）の馴化上清中に５０ｎｇ／５×１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌの生物学的に活性な２Ｄ－ＣＤ４が定期的に検出された。この馴化培地をＨｅＬａ－ＣＤ４細胞に添加すると、用量依存的にＨＩＶ－１感染性が阻害された。この場合も、Ｌ． ジェンセニイ由来の２Ｄ－ＣＤ４の阻害濃度は、添加した２Ｄ－ＣＤ４コントロール標準の阻害濃度と同程度だったが、Ｌ． ジェンセニイ（ｐＯＳＥＬ１４４）の馴化培地は不活性だった（図４）。 ［０１５７］ Ｌ． ジェンセニイ Ｘｎａ－６５１細菌と組換えウイルスを共培養すると、試験管内でＨＩＶ－１ウイルスの標的細胞への侵入が阻害された。別の一連の研究では、Ｌ． ジェンセニイ Ｘｎａ－６５１とＣＤ４－ＣＸＣＲ４および組換えウイルスを発現するＨｅＬａ細胞を共培養するとＨＩＶ－１感染性が低下するかどうかを評価する実験が行われた（図５）。Ｌ． ジェンセニイ Ｘｎａ－６５１は培地１９９で事前に培養され、その後組換えウイルスとともにＣＤ４－ＣＸＣＲ４細胞を発現するＨｅＬａ細胞に加えられた。感染後４８時間でウイルス関連ルシフェラーゼ活性を測定したところ、Ｌ． ジェンセニイ Ｘｎａ－６５１株はＨＩＶ－１侵入に対して有意な阻害効果を示したが、対照株Ｘｎａ－１４４にはその効果が見られなかった。Ｌ． ジェンセニイ Ｘｎａ－６５１は、Ｌ． ジェンセニイ Ｘｎａ－１４４と比較して、細胞密度２．５×１０８／ｍｌでＨＩＶ－１の侵入を７９％（Ｐ＜０．０１）、細胞密度５×１０８／ｍｌでＨＩＶ－１の侵入を９０％（Ｐ＜０．０１）阻害した。細菌とウイルスを培地１９９で事前にインキュベートせずに培養細胞に加えた場合にも、同様の結果が観察された。総合すると、これらの結果は、２Ｄ－ＣＤ４を発現するように設計されたＬ． ジェンセニイの膣定着分離株が、組換えＨＩＶ－１ウイルスによる培養細胞の感染を著しく阻害することを明確に示しており、この抗感染戦略のインビトロ実証となっている。 ［０１５８］ Ｌ． ジェンセニイにおけるシアノビリン－Ｎの発現。発現システムの多用途性をさらに実証するために、プラスミドｐＯＳＥＬ６５１の２Ｄ ＣＤ４コード配列を除去し、シアノビリン－Ｎをコードする構造遺伝子に置き換えて、ｐＯＳＥＬ６４７を作成した。ｐＯＳＥＬ６４７を含むＬ． ジェンセニイ １１５３またはＸｎａがシアノビリンを分泌するかどうかを調べるために、さまざまな成長段階の調整培地中のタンパク質をＴＣＡ沈殿し、エタノールで洗浄し、４～１２％還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して分離した。ポリクローナル抗シアノビリン抗体を使用したウェスタンブロット分析では、予測されたサイズの乳酸菌由来シアノビリンが適度なレベルで検出された。さらに、分泌されたシアノビリンはＨＩＶ－１ ｇｐ１２０に結合した。これは、発現されたタンパク質がかなりの程度、本来の立体構造に適切に折り畳まれていることを示唆している。 ［０１５９］ Ｌ． ジェンセニイにおけるＨｖｅＣの発現。ヒトヘルペスウイルス侵入メディエーターＣ（ＨｖｅＣ）は、ＨＳＶが細胞受容体として利用する免疫グロブリンファミリーの一員であり（例えば、Ｇｅｒａｇｈｔｙら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８０：１６１８－１６２０ （１９９８））、そのｇＤ結合ドメインはＨｖｅＣのＶドメイン内に位置している（例えば、Ｋｒｕｍｍｅｎａｃｈｅｒら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ． ７３：８１２７－８１３７ （１９９９））。ＨｖｅＣのＶドメイン内の点変異により糖タンパク質Ｄの結合が排除され、ＨＳＶ－１とＨＳＶ－２の両方の侵入活性が損なわれることが示されている（ＭａｒｔｉｎｅｚとＳｐｅａｒ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ． ７６：７２５５－７２６２）。さらに、ＨｖｅＣγと呼ばれる天然の可溶性アイソフォームも、ＨＳＶ感染に対する宿主細胞の感受性を調節する（例えば、Ｌｏｐｅｚら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７５：５６８４－５６９１（２００１））。Ｌ． ジェンセニイ １１５３でＭ６１２０と融合したＨｖｅＣを分泌するために、Ｐ５９プロモーターとＣｂｓＡｓｓの制御下でＨｖｅＣ発現プラスミドを構築した。これらのプラスミドには、Ｍ６１２０－ＨｖｅＣ Ｖドメインの分泌用に設計されたｐＯＳＥＬ２１５、Ｍ６１２０－ＨｖｅＣγの分泌用のｐＯＳＥＬ２２０、およびコントロールプラスミドｐＯＳＥＬ１７５が含まれていた。これらのプラスミドはすべて、エレクトロポレーションによってＬ． ジェンセニイ １１５３に導入された。これらの細菌株がＨｖｅＣを分泌するかどうかを調べるために、成長のさまざまな段階の培養液中のタンパク質をＴＣＡ沈殿させ、エタノールで洗浄し、４～１２％還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して分離した。 ［０１６０］ ＨｖｅＣ抗体を用いたウェスタンブロット分析では、予測されたサイズのＭ６１２０－ＨｖｅＣ Ｖドメイン（図６）およびＭ６，２０－ＨｖｅＣγの両方が適度なレベルで検出された。さらに、Ｍ６１２０－ＨｖｅＣ ＶドメインがｍＡｂ Ｒ１．３０２と反応する能力は、Ｔｒｉｓ－グリシンＰＡＧＥ（例えば、Ｋｒｕｍｍｅｎａｃｈｅｒら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３：８１２７－８１３７（１９９９））に続いてウェスタンブロット形式で分析された。Ｍ６１２０－ＨｖｅＣはｍＡｂ Ｒ１．３０２（Ｖドメイン内の立体構造依存エピトープを認識する）に結合し、分泌されたＭ６１２０－ＨｖｅＣ Ｖタンパク質が天然の立体構造をとることを示した。」（［０１３９］～［０１６０］） 「 ［図：0001428431000003.jpg］ ［図：0001428431000004.jpg］ 」（図１） 「 ［図：0001428431000005.jpg］ 」（図２） 「 ［図：0001428431000006.jpg］ 」（図３） 「 ［図：0001428431000007.jpg］ 」（図４） 「 ［図：0001428431000008.jpg］ 」（図５） 「 ［図：0001428431000009.jpg］ 」（図６） 第５ 当審の判断 １ 引用文献１に記載された発明 引用文献１は、組換え改変されたラクトバチルス ジェンセニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）細菌を、ヒトの膣又は胃腸管に投与して、その粘膜表面に定着させ、治療用ポリペプチド等の生物学的に活性なタンパク質を発現させて、粘膜表面に生物学的に活性なタンパク質を提供すること（引１アの特に請求項１～３、２０、２３～２８、４２、引１イ［０００８］、引１ウ［００２６］、引１エ［００６５］、引１カの全体）に関する発明を開示する特許文献である。そして当該組換え改変されたラクトバチルス ジェンセニイ細菌は、健康なボランティアの膣スワブから採取されたラクトバチルス ジェンセニイにプラスミド等を導入する遺伝子組換えにより製造されるものである（引１ウ［００５６］、引１エ［００６４］、引１ク［０１２５］、引１ケ［０１２８］）。また、実施例においては、組換え改変されたラクトバチルス ジェンセニイ細菌が、生物学的に活性なタンパク質である２Ｄ－ＣＤ４等を発現することも確認している（引１コの特に［０１５２］～［０１６０］、図１～６）。 したがって、引用文献１には以下の発明が記載されているといえる。 「ヒトの膣又は胃腸管に投与して治療用ポリペプチドをヒトの膣又は胃腸管から選択される粘膜表面で発現させるために使用する、粘膜表面に定着し、生物学的に活性なタンパク質である治療用ポリペプチドを発現するように組換え改変されたラクトバチルス ジェンセニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）細菌の製造方法であって、 健康なボランティアから採取した膣スワブから、ラクトバチルス ジェンセニイ細菌を採取する工程、 採取したラクトバチルス ジェンセニイ細菌を治療用ポリペプチドをコードするプラスミドで形質転換する工程を含み、 投与された、形質転換されたラクトバチルス ジェンセニイ細菌は粘膜表面に定着する、方法。」（以下、「引用発明」という。） ２ 本願発明と引用発明の対比 本願発明と引用発明とを対比する。 引用発明の「ヒト」は、本願発明の「それを必要とする哺乳類対象」、「受容対象」に相当し、引用発明の「健康なボランティア」は、本願発明の「供与対象」に相当する。 引用発明の「膣スワブ」、「採取」は、本願発明の「細菌細胞を含むマイクロバイオームサンプル」、「単離」に相当する。 引用発明の「ラクトバチルス ジェンセニイ細菌」は、本願発明の「細菌細胞」に相当する。 引用発明の採取したラクトバチルス ジェンセニイ細菌が、健康なボランティアに「共生的な／天然の菌株に由来」することは明らかであり、当該ラクトバチルス ジェンセニイ細菌は、実験室に適合するような処理を特に受けていないから、本願発明の「実験室に適合した菌株に由来しない」ものといえる。 細菌の形質転換にある程度の細菌細胞数が必要となることは本願優先日前の技術常識であるから、引用発明において、ラクトバチルス ジェンセニイ細菌が採取された後、形質転換工程の前に、「インビトロで培養して、単離された細菌細胞とその子孫の培養された集団を得」ていることは自明である。 引用発明の「治療用ポリペプチドをコードするプラスミド」は、本願発明の「細菌細胞にとって異種である１つ又は複数のポリヌクレオチド」に相当する。 引用発明におけるヒトへの投与及びタンパク質の発現によって、「治療用ポリペプチド」が「それを必要とする対象に送達」されることは明らかである。 また、引用発明において、ラクトバチルス ジェンセニイ細菌の供与対象（健康なボランティア、すなわちヒト）と受容対象（ヒト）は、本願発明でいう「哺乳類の同種」であるといえる。 よって、本願発明と引用発明は、 「治療用ポリペプチドをそれを必要とする哺乳類対象に送達するために使用する、形質転換された細菌細胞の集団を製造する方法であって、 ａ）供与対象から、細菌細胞を含むマイクロバイオームサンプルを得る工程； ｂ）マイクロバイオームサンプルから細菌細胞を単離する工程であり、細菌細胞は、供与対象にとって共生的な／天然の菌株に由来し、実験室に適合した菌株に由来しない、工程； ｃ）単離された細菌細胞をインビトロで培養して、単離された細菌細胞とその子孫の培養された集団を得る工程； ｄ）培養された集団を、細菌細胞にとって異種である１つ又は複数のポリヌクレオチドで形質転換し、異種ポリヌクレオチドを含む形質転換された細菌細胞の集団を生成する工程であり、１つ又は複数のポリヌクレオチドは、１つ又は複数の治療用ポリペプチドをコードする、工程； を含み、供与対象と受容対象は、哺乳類の同種から由来する、方法。」 である点で一致し、以下の点で相違する。 （相違点） 本願発明では、「受容対象に投与される異種ポリヌクレオチドを含む形質転換された細菌細胞の集団は、少なくとも２４時間の間、哺乳類対象中又はその上に定着し、１つ又は複数の治療用ポリペプチドを発現し、受容対象は、抗生物質を投与されて」いないものであることが特定されているのに対して、引用発明ではそのことが特定されていない点。 ３ 相違点についての判断 引用文献１において、組換え改変されたラクトバチルス ジェンセニイ細菌の投与対象であるヒトについては、膣に投与する場合は必然的に女性が対象となること以外に何ら限定は付されていないから、引用発明が、抗生物質を投与されていないヒトを投与対象とすることを前提としていることは自明である。 また、引用文献１には、用いる細菌について、粘膜表面に自然に定着する細菌を使用すること（引１ウ［００１９］、引１コ［０１４０］）、環境（ＷＴ）細菌分離株には、生体内での生存に遺伝的利点をもたらす伝達可能な遺伝要素（プラスミド、トランスポゾン、および温帯バクテリオファージ）が頻繁に含まれていること（引１コ［０１４２］）、遺伝子組換えを行うことがヒト宿主に定着する能力を妨げないこと（引１コ［０１５２］）なども記載されていることから、引用発明のラクトバチルス ジェンセニイ細菌が、ヒト体内の環境に適応しているものであり、投与した細菌が相当な期間定着し、治療用ポリペプチドを発現し得ることを当業者は十分に理解できるといえる。 そして、引用文献１には、投与間隔について、１日１回から２～４週間に１回まで変化する可能性があること（引１キ［０１２０］）が記載されていることからしても、引用発明１において投与した細菌が相当の期間、投与対象中又はその上に定着し得ることは自明である。具体的には、繰り返し投与において前回投与分が完全に消失するより前に次回の投与を行うのは当然のことであるから、例えば最短の投与間隔として記載された１日１回の投与について検討したとしても、投与した菌株の少なくとも一部が優に１日（２４時間）以上投与対象中又はその上に定着し得ることを当業者は理解できるものといえる。 そうすると、引用文献１の記載事項を考慮すれば、引用発明において「受容対象は、抗生物質を投与されておらず」、「受容対象に投与される異種ポリヌクレオチドを含む形質転換された細菌細胞の集団は、少なくとも２４時間の間、哺乳類対象中又はその上に定着し、1つ又は複数の治療用ポリペプチドを発現し」とすることは当業者であれば容易に想到し得たことである。 なお、引用文献１には、必要に応じて、抗生物質前処理により粘膜表面の常在細菌を事前に除去することができる、との記載があるが（引１オ［００８２］、［００８６］）、当該記載は、投与するラクトバチルス ジェンセニイ細菌の良好な定着を図るために追加的に採用し得る任意的な手段の１つとして、粘膜層に急速に定着する細菌の選択、宿主結合ドメインの発現、バイオフィルム物質を分解する酵素の添加などと並列して記載されたに過ぎないものである（引１オ）。よって、当該記載が引用発明の投与対象を、抗生物質を投与していないヒトとすることを妨げるものでないことはいうまでもない。 ４ 請求人の主張について （１）請求人の主張 請求人は、令和 ７年 ２月２８日提出の意見書において、概ね以下のとおり主張している。 ア 主張１ ２０１６年のレビュー論文（Ｍｉｍｅｅら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ｔｈｅｒａｐｙ － Ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ． Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ １０５（２０１６）４４－５４）にも記載されているように、本願優先日時点では、遺伝子操作された微生物の安定した定着を達成することは未解決の問題とみなされていた。出願当初明細書の［０１４６］でも、研究グループが以前に腸内微生物叢によく見られるラクトバチルスなどの細菌ファミリーを操作したが、「ＣＲ－ＷＴ宿主における定着物を生じてこなかった」ことを認めている。 イ 主張２ 引用文献１は、ラクトバチルス ジェンセニイ細菌を何らかの対象に投与することに関する教示または説明を記載していないため、改変細菌の安定した定着を達成するという課題を解決していない。実際、引用文献１には、改変細菌細胞が治療効果を有するという証拠はなく、その旨の説明もない。投与量に関する記載も、定着の予想される期間も記載されていない。引用文献１は、ラクトバチルス ジェンセニイのヒト分離株の遺伝子改変を記載しているだけなので、本願の優先日当時に当業者が引用文献１を出発点として本願発明に到達できたと結論付けるのは、まったくの事後判断であり、後知恵の理論に過ぎない。 ウ 主張３ 引用文献１には、安定したコロニー形成を達成するための成功の合理的な期待を当業者に提供する動機付けは一切存在しない。引用文献１の人工細菌細胞は膣分離株に由来するが、引用文献１は、分離株からの収集から被験者への投与までの培養時間の制限に関する記載を一切提供していない。細菌細胞を実験室ではなく内腔環境に適応させることが不可欠であるという本願の記載を考慮すると、これは重要な記載である。本願出願当初明細書の［００５７］段落 は、この点を強調し、「哺乳類支配の長期間にわたる又は永続的な定着の能力（例えば、哺乳類マイクロバイオームへの再導入を成功させる能力）を維持するために、１つ又は複数の異種ポリペプチドを発現するように形質転換された天然／共生細菌の集団は、実験室での又はインビトロでの培養環境に適合されていない。ＥＮＢは、可能な限り分裂を少なくするために、実験環境においてインビトロで培養される」と述べている。上記のレビュー論文によって証明されているように、実験室に適応した分離株に由来する片利共生菌株は、定着性能が低いものなので、優先日当時でマイクロバイオーム治療の分野に関する共通の一般知識を有する当業者が、少なくとも２４時間対象の内部または表面に定着し、治療用ポリペプチドを発現することができる、哺乳類対象に共生する改変された天然細菌細胞の集団に到達することを期待して引用文献１の記載を適用しても、成功するという合理的な期待は持たないことは明らかである。 （２）請求人の主張の検討 ア 主張１について 請求人が根拠とするレビュー論文には、投与する菌株について、本願発明で特定されるように、少なくとも２４時間の間、哺乳類対象中又はその上に定着させることが不可能であったことは何ら言及されていない。むしろ同文献には、一般的なシャーシであるニッスル株は治療中止から２週間後、６ヶ月後という、２４時間よりはるかに長い期間経過後であっても、便中から検出されたこと、すなわち哺乳類対象中又はその上に定着していたことすら記載されている（４．１ Ｓｔａｂｌｅ Ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔの第１段落）。 そして、上述のように、引用文献１には、粘膜表面に自然に定着する細菌を使用すること（引１ウ［００１９］、引１コ［０１４０］）、環境（ＷＴ）細菌分離株には、生体内での生存に遺伝的利点をもたらす伝達可能な遺伝要素（プラスミド、トランスポゾン、および温帯バクテリオファージ）が頻繁に含まれていること（引１コ［０１４２］）、遺伝子組換えを行うことがヒト宿主に定着する能力を妨げないこと（引１コ［０１５２］）などが記載されていることから、引用発明のラクトバチルス ジェンセニイ細菌について、ヒト体内の環境に適応しているものであり、優に２４時間以上はヒト対象中又はその上に定着し得ることを当業者は認識できたといえる。 よって、主張１は採用できない。 イ 主張２について 引用文献１は上記のとおり、ヒトに投与して定着させるための、組換え改変されたラクトバチルス ジェンセニイ細菌に関する発明を開示する文献である。投与量についても、経口投与に関して、先行技術の内容から例えば１日あたり１０８個という数字が例示されているし（引キ１［０１１９］）、仮に当該記載がなかったとしても、目的や効果に応じて投与量を調節できることを当業者は理解できる。定着の予想される期間について引用文献１には明記がないが、投与間隔については、１日１回から２～４週間に１回まで変化する可能性があるとの記載があり（引キ１［０１２０］）、「３ 相違点についての判断」の欄でも検討したように、当該記載は、投与した菌株が優に２４時間以上、投与対象中又はその上にとどまることを前提とした記載といえる。また、引用文献１の実施例では、組換え改変ラクトバチルス ジェンセニイ細菌が生物学的に活性なタンパク質を発現できることを確認しており（引１コの特に［０１５２］～［０１６０］、図１～６）、当業者は、生物学的に活性なタンパク質の発現が生体内においても生じ、治療用ポリペプチドの種類に応じて所望の治療効果が達成されることを理解できる。 よって、主張２も採用できない。 ウ 主張３について 引用文献１には、生体内での生存に関する環境（ＷＴ）細菌分離株の利点について記載されていること（引１コ［０１４２］）等を踏まえると、引用発明に基づいて、当該利点を失うような処理、例えば実験室に適合させるような処理を当業者が積極的に採用するとはいえない。そもそも、本願発明では、細菌の採取後の培養条件について、インビトロで培養して、単離された細菌細胞とその子孫の培養された集団を得ること以外に、具体的な培養条件やその期間は何ら具体的に特定されておらず、本願発明は、明細書［００５７］に記載されるような「可能な限り分裂を少なくする」態様に限定されていないので、請求人の主張は特許請求の範囲の記載に基づかないものである。 よって、主張３も採用できない。 このように、請求人の主張はいずれも採用することができない。 第６ むすび 以上のとおり、本願発明は、引用文献１に記載された発明、及び引用文献１に記載された事項に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであって、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないから、他の請求項に係る発明について検討するまでもなく、本願は拒絶されるべきものである。