2022-015605

特願２０１９－５６１２３８「幹細胞分化の促進」拒絶査定不服審判事件〔平成３０年１１月１５日国際公開、ＷＯ２０１８／２０８８３６、令和 ２年 ６月２５日国内公表、特表２０２０－５１８２７７〕について、次のとおり審決する。

結 論 本件審判の請求は、成り立たない。

理 由 第１ 手続の経緯 本願は、２０１８年５月８日（パリ条約による優先権主張２０１７年５月８日 （ＵＳ）アメリカ合衆国）を国際出願日とする出願であって、その主な手続の経緯は次のとおりである。 令和３年 ８月１６日付け：拒絶理由通知書 令和４年 １月３１日 ：意見書、手続補正書の提出 同年 ５月３０日付け：拒絶査定 同年 ９月３０日 ：審判請求書、手続補正書の提出 令和６年 ４月２３日付け：拒絶理由通知書 同年１０月１８日 ：意見書、手続補正書の提出 第２ 本願発明 本願請求項１～６に係る発明は、令和６年１０月１８日付け手続補正書の特許請求の範囲１～６に記載された事項により特定されたものであるところ、そのうち請求項１に係る発明（以下、「本願発明」という。）は、以下のとおりである。 「【請求項１】 幹細胞の分化を誘導するための方法であって、前記方法は、 ａ）ｉ）多能性幹細胞を含む細胞培養物と、 ｉｉ）ＬＤＮ－１９３１８９を含むアクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）２／３シグナル伝達の阻害剤と、 ｉｉｉ）ＢＧＪ３９８を含む線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達の阻害剤と、 を提供することと、 ｂ）ｉ）の前記多能性幹細胞を、ｉｉ）の前記ＡＬＫ２／３シグナル伝達の阻害剤と、ｉｉｉ）の前記ＦＧＦシグナル伝達の阻害剤と、を含む培地に同時に２４時間曝露することと、 ｃ）前記接触した多能性幹細胞の分化を誘導して、培養した前部外胚葉細胞の集団を生成することであって、前記前部外胚葉細胞が、前記阻害剤への曝露の２４時間以内に生じる、生成することと、 ｄ）前記前部外胚葉を単離することと、 を含み、 前記幹細胞がヒト幹細胞であり、 前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞（ＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からなる群より選択される、方法。」 第３ 当審が通知した拒絶の理由 当審が令和６年１０月１８日付け手続補正書による補正前の請求項１に関して令和６年４月２３日付けで通知した拒絶の理由のうち、拒絶理由１は、この出願は、特許請求の範囲の記載が特許法第３６条第６項第１号に規定する要件を満たしていないというものであり、拒絶理由２は、この出願は、発明の詳細な説明の記載が特許法第３６条第４項第１号に規定する要件を満たしていないというものである。 第４ 当審の判断 上記拒絶理由通知に対し、請求人は令和６年１０月１８日付けで手続補正書を提出して、請求項１の記載を上記「第２」で示したとおり補正した。 本願発明に関し、上記拒絶理由１及び２が解消したか否かを、以下検討する。 １ 発明の詳細な説明の記載事項 本願発明に関し、発明の詳細な説明及び図面には、以下の記載がある。なお、下線は当審で付した。 （１） 「【０００２】 ヒト多能性幹細胞の分化は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで漸進的により成熟した発生的に類似した胚構造を生成するために段階特異的に進行する。ｉｎ ｖｉｔｒｏで外胚葉胚芽層を生成する最初の段階は、１９９８年に当該技術分野が始まって以来６日以内に進行することはない。そのため、外胚葉由来の細胞型を作製するには、外胚葉胚芽層を誘導するために少なくとも最低６日間は必要であり、その後発生的に後の事象が発生するためのさらなる時間が必要である。 【０００３】 この外胚葉胚芽層の位置的特徴は、一般的に前方とみなされ、頭頸部の細胞／組織を形成することができる。しかしながら、最近のデータは神経中胚葉と称される細胞集団を提示しており、それは後部外胚葉胚芽層および後部中胚葉胚芽層である。現在のところ、ヒト多能性幹細胞からの前部外胚葉胚芽層および後部神経中胚葉胚芽層の形成は、異なる時間枠内の異なる培養条件を利用してｉｎ ｖｉｔｒｏで起こっている。」 （２） 「【００２９】 一実施形態は、単離した（ｉｓｏｌａｔｅｄ）原始外胚葉を含む組成物を提供する。一実施形態において、前記単離された外胚葉は胚細胞に由来する。一実施形態において、前記原始外胚葉は、インビトロで（培養培地とともに）培養される。一実施形態において、前記外胚葉は基質に固定されている。一実施形態において、前記外胚葉および胚性幹細胞はヒトのものである。 【００３０】 一実施形態は、単離された神経中胚葉を含む組成物を提供する。一実施形態において、前記単離された神経中胚葉は胚細胞に由来する。一実施形態において、前記神経中胚葉は、インビトロで（培養培地とともに）培養される。一実施形態において、前記神経中胚葉は基質に固定される。一実施形態において、前記神経中胚葉および胚性幹細胞はヒトのものである。 【００３１】 一実施形態は、生物学的薬剤をスクリーニングする方法を提供し、同方法は、ｉ）外胚葉または神経中胚葉を含む細胞培養物、およびｉｉ）試験化合物を提供することと、ｂ）前記外胚葉または神経中胚葉を前記試験化合物と接触させることと、を含む。一実施形態において、生物学的薬剤は、外胚葉または神経中胚葉を所望の細胞系統にさらに分化させる能力についてスクリーニングされる。 【００３２】 本発明は、誘導された外胚葉の外胚葉アイデンティティ（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を評価する方法を企図している。この方法は、形態学的手段、機能的評価、および特定の系統に関連するタンパク質の発現またはダウンレギュレーションの測定を通じて行うことができる。 【００３３】 本発明はさらに、誘導された神経中胚葉の神経中胚葉アイデンティティを評価する方法を企図している。この方法は、形態学的手段、機能的評価、特定の系統に関連するタンパク質の発現またはダウンレギュレーションの測定を通じて行うことができる。」 （３） 「【００３５】 …… 【図６】ＳＵは主にＭＥＫ／ＥＲＫを介してＦＧＦＲ阻害剤として機能し、２４時間 後の神経外胚葉形成を促進する。 【図７】ＦＧＦＲ２／ＶＥＧＦＲ２およびＡＬＫ２／３（ＬＤＮ／ＳＵ）の阻害は、 ２４時間のインキュベーション後にＳＯＸ１を促進するのに十分である。 【図８】神経上皮は前部デフォルトを採用している。 …… 【図１０】ＦＧＦ阻害とＢＭＰシグナル伝達の組み合わせは、中脳前駆細胞からの同 種の頭蓋神経堤を促進する。 【図１１】１日目の神経上皮は、中脳底板（尾側／腹側）の表現型にパターン化でき る。 …… 【図２２Ａ】多能性から外胚葉系統への離脱（ｅｘｉｔ）を調節するためのモデル。 Ａ）確立された方法論は、未調節の内因性ＦＧＦシグナル伝達により、アクチビンシ グナル伝達を抑制する。したがって、多能性の喪失は、ＦＧＦ５エピブラスト（ｅｐ ｉｂｌａｓｔ）中間体への移行を遅らせる。エピブラストからの移行中に、アクチビ ン（ａｃｔｉｖｉｎｇ）およびＢＭＰ抑制により外胚葉が生成される。Ｂ）ＦＧＦと アクチビンの両方が抑制されるため、ＦＧＦシグナル伝達の制御は、多能性からのよ り迅速な離脱を促進する。同様に、制御されたＦＧＦシグナル伝達によりエピブラス ト中間体は一時的なものとなり、アクチビンおよびＢＭＰシグナル伝達の抑制により 外胚葉が急速に促進される。これにより、誘導動態における６日の改善（６－ｄａｙ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ）が得られる。 【図２２Ｂ】多能性から外胚葉系統への離脱（ｅｘｉｔ）を調節するためのモデル。 Ａ）確立された方法論は、未調節の内因性ＦＧＦシグナル伝達により、アクチビンシ グナル伝達を抑制する。したがって、多能性の喪失は、ＦＧＦ５エピブラスト（ｅｐ ｉｂｌａｓｔ）中間体への移行を遅らせる。エピブラストからの移行中に、アクチビ ン（ａｃｔｉｖｉｎｇ）およびＢＭＰ抑制により外胚葉が生成される。Ｂ）ＦＧＦと アクチビンの両方が抑制されるため、ＦＧＦシグナル伝達の制御は、多能性からのよ り迅速な離脱を促進する。同様に、制御されたＦＧＦシグナル伝達によりエピブラス ト中間体は一時的なものとなり、アクチビンおよびＢＭＰシグナル伝達の抑制により 外胚葉が急速に促進される。これにより、誘導動態における６日の改善（６－ｄａｙ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ）が得られる。 ……」 （４） 「【００３８】 ヒト多能性幹細胞の分化は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで漸進的により成熟した発生的に類似した胚構造を生成するために段階特異的に進行する。ｉｎ ｖｉｔｒｏですべての外胚葉を生成する最初の段階は、この分野が１９９８年に始まって以来６日より早く進行してはいなかった。そのため、任意の神経細胞型を作製するには、外胚葉を誘導するために少なくとも６日間が必要であり、その後、発生的に後の事象が生ずるまでの時間がさらに必要である。本明細書で提供される組成物および方法は、この間隔を２４時間未満に短縮し、これらの発生的に後の事象が生ずるための新しい加速された時間枠を作製する。したがって、既存のニューロン分化プロトコルは、効率を高めるために、本明細書で開示されている新しい時間枠内で書き直すことができる。 …… 【００４０】 本明細書では、外胚葉を１日／２４時間（またはそれ以下）で生成するための組成物と方法を提供し、それにより、実験を計画し、実行し、データ分析することになり、ダウンタイムまたは失敗した実験ブランチの追跡による生産性の損失を抑えながら最善の道を進めることができるため、効率が向上する。外胚葉には、前臨床および臨床環境での用途がある。 【００４１】 アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）２、３および細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）の併用阻害は、同期神経誘導を２４時間以内に促進する。未分化ヒト多能性幹細胞は、ＬＤＮ１９３１８９およびＢＧＪ３９８の小分子の組み合わせに曝露されたとき、９５％ＮＡＮＯＧ／ＳＯＸ２陽性、ＳＯＸ１／ＰＡＸ６陰性の免疫表現型から、９５％ＮＡＮＯＧ陰性／ＳＯＸ２陽性、ＰＡＸ６および／またはＳＯＸ１陽性の免疫表現型へ移行する。ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤ＰＤ０３２５９０１はこの環境でのＢＧＪ３９８の使用を完全に置き換えるため、線維芽細胞成長因子受容体阻害剤ＢＧＪ３９８は下流のＥＲＫシグナル伝達を阻害することがわかっている。この発見は現在、すべての神経系統の細胞型を導出するためのプロトコルを構築できる最もシンプルかつ効率的なプラットフォームであり、既存の方法を大幅に改善している。 【００４２】 同様に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで神経中胚葉を生成する最初の段階は３日より早く進行することはなかった。そのため、神経細胞または中胚葉細胞型を作製するには、神経中胚葉を誘導するのに少なくとも３日間必要であり、その後、発生的に後の事象が生ずるまでの時間がさらに必要である。本明細書で提供される組成物および方法は、この間隔を２４時間未満に短縮し、これらの発生的に後の事象が生ずるための新しい加速された時間枠を作製する。したがって、既存の神経中胚葉分化プロトコルは、効率を高めるために、本明細書で開示されている新しい時間枠内で書き直すことができる。」 （５） 「【００６７】 幹細胞 方法は、広範な未分化幹細胞株にわたり機能し、実施が簡単である。本明細書で提供される組成物、方法およびキットで使用するための幹細胞は、ヒトを含む任意の脊椎動物幹細胞であり得る。 【００６８】 幹細胞には、限定されるものではないが、胚性幹細胞（ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を含む）、体性幹細胞（例えば、ヒト）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ（例えば、ヒト））が含まれる。 …… 【０１０１】 分化した細胞型 一実施形態において、前記幹細胞は前部外胚葉に分化する。一実施形態において、本明細書に開示される分化方法に従って、分化した細胞（外胚葉）は、培養細胞の前記集団の少なくとも１０％から１００％までである。当業者は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）などの様々な周知の方法を使用して、集団における外胚葉細胞の割合を容易に決定することができる。外胚葉を含む集団の範囲は、本明細書に記載の方法により産生される外胚葉細胞の、約５０～５５％、……および４５～５０％などの純度の低い集団も有用である。外胚葉細胞の濃度は、集団内の遺伝子発現プロファイルに従って決定できる。 【０１０２】 本明細書で提供される方法によって作製された前部外胚葉は、中枢および／または末梢神経系前駆細胞、パターン化可能な前駆細胞、ニューロン（４，５）（ＮｅｕＮ／ベータ－ＩＩＩ－チューブリンを発現する）およびグリア（２６）（ＯＬＩＧ２／ＳＯＸ１０を発現する）；および表皮の派生物（２７）（サイトケラチン１４およびｐ６３を発現する）および神経堤（１１）（Ｐａｘ３／ＳＯＸ１０／ＳＯＸ９／ｐ７５／ＨＮＫを発現する）からなる群から選択される細胞にさらに分化され得る。さらに、これらの集団は、表面外胚葉、神経堤幹細胞、脊髄神経上皮、脊髄（２８）、および体節（ＴＢＸ６を発現する）を形成できる神経中胚葉前駆体（３０）（ＳＯＸ２／Ｔを発現する）を形成するように誘導でき、それは、筋肉前駆細胞（ミオゲニン／ＰＡＸ３／７）、軟骨細胞前駆細胞、線維芽細胞前駆細胞、および骨芽細胞前駆細胞にさらに分化し得る。」 （６） 「【０１３６】 神経上皮へのｈｉＰＳＣの加速分化 ＬＤＮ－１９３１８９ＨＣｌ（……）およびＢＧＪ３９８（……）を補充したＥｓｓｅｎｔｉａｌ６からなる分化培地を組み合わせて、６ウェルプレートのビトロネクチンでコーティングしたウェル毎に２ｍＬを分配した。上記のように、ｈＰＳＣは小さな塊（塊ごとに２５～５０個の細胞）に解離した。０．２～０．４ｍＬの培養液を、分化培地を含むｒｈＶＴＮでコーティングしたウェルに播種した。 【０１３７】 中脳底板神経上皮の加速された生産 １日目に分化した神経上皮細胞は、ＣＨＩＲ９９０２１（……）、ＳＡＧ（……）およびＦＧＦ２（……）を補充したＥｓｓｅｎｔｉａｌ６で２４～４８時間処理した。２日目または３日目の中脳前駆細胞は、ｗｎｔ－ｃ５９（……）、ＳＡＧ（……）およびＢＧＪ３９８（……）を補充したＥｓｓｅｎｔｉａｌ６で２４時間処理し、２４～４８時間以内にＯＴＸ２／ＬＭＸ１Ａ／ＦＯＸＡ２陽性細胞を作製した。」 （７） 「【０１３８】 神経中胚葉前駆細胞の加速された生産 ＬＤＮ－１９３１８９ＨＣｌ（……）、ＢＧＪ３９８（……）およびＣＨＩＲ９９０２１（……）を補充したＥｓｓｅｎｔｉａｌ ６からなる分化培地を組み合わせて、６ウェルプレートのビトロネクチンでコーティングしたウェル毎に２ｍＬを分配した。上記のように、ｈＰＳＣは小さな塊（塊ごとに２５～５０個の細胞）に解離した。０．２～０．４ｍＬの培養液を、分化培地を含むｒｈＶＴＮでコーティングしたウェルに播種した。 【０１３９】 脊髄神経上皮の加速された生産 １日目の神経中胚葉前駆細胞を、ＣＨＩＲ９９０２１（……）およびＦＧＦ－ＢａｓｉｃＴＳ（登録商標）（……）を補充したＥｓｓｅｎｔｉａｌ６からなる分化培地に２４時間、曝露した。この２日目の神経中胚葉は、ＢＧＪ３９８（……）を補充したＥｓｓｅｎｔｉａｌ６からなる分化培地にさらに曝露され、ＰＡＸ３／ＳＯＸ１／ＨＯＸＢ４陽性神経上皮細胞の３日目の集団を作製した。 【０１４０】 脊椎底板神経上皮の加速された生産 ２日目の脊髄神経中胚葉前駆細胞を、ＳＡＧ（……）、ＢＧＪ３９８（……）およびＷＮＴ－ｃ５９（……）を補充したＥｓｓｅｎｔｉａｌ６からなる分化培地に２４時間曝露して、ＳＯＸ１＋／ＦＯＸＡ２＋／ＮＫＸ２．２＋／ＨＯＸＢ４＋細胞の集団を３日目と４日目の間に作製した。」 （８） 「【０１４１】 結果 ヒト中枢神経系の発生は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の分化によってｉｎ ｖｉｔｒｏでモデル化できる。ｈＰＳＣ分化の初期段階では、神経外胚葉（ＮＥ）および中内胚葉（ｍｅｓｅｎｄｏｄｅｒｍ）の胚芽層が作製され、それらは最終的に成人の体内のすべての組織を生じる。…… …… 【０１４５】 多能性およびＮＥ形成に関連するさまざまな転写因子について、細胞死の前に２４時間分化培養物を分析した。未分化の対照培養物と比較して、ＳＵ５４０２で処理した培養物ではＮＡＮＯＧ陽性の減少が示され、それは初期段階の多能性離脱（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｅｘｉｔ）を示唆している。ｈＰＳＣとＮＥの両方に共通するＳＯＸ２が維持された。一方、ＳＵ５４０２で処理した培養物は、９０％超の細胞でＳＯＸ１陽性を示し、初期段階のＮＥ形成を示した（図３）。 【０１４６】 追加のｈＰＳＣ系統を、３つの阻害剤のカクテルを使用して同じ方法でアッセイし、ＳＯＸ１免疫反応性の観点から示差的な応答が認められた。ＳＵ５４０２は、ＦＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ２に対する制限された特異性により、一部の系統のＦＧＦおよびＶＥＧＦシグナル伝達を不完全に抑制し、ＳＯＸ１免疫反応性の不完全な獲得をもたらすと考えられる。ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ４、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、 およびＶＥＧＦＲ４を標的とする汎ＦＧＦＲおよびＶＥＧＦＲ阻害剤ＢＧＪ３９８およびアキシチニブは別々の条件で使用され、アキシチニブは比較的高濃度でのみＳＯＸ１免疫反応性を誘導するが、ＢＧＪ３９８は低濃度でも、試験したすべての系統でＳＯＸ１を完全に誘導することが明らかとなった。これらのデータは、ＳＵ５４０２の神経化作用がＦＧＦＲ阻害剤としての機能に大きく起因することを示していた。 【０１４７】 阻害剤カクテルからの１つの分子の差し引き（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎｓ）は、ＢＧＪ３９８およびＬＤＮ１９３１８９の組み合わせによる共処置がＳＯＸ１免疫陽性細胞の大部分の集団を作製するのに十分である一方で、任意の他の２つの阻害剤の組み合わせは２４時間後にＳＯＸ１免疫反応性を誘導できなかったことを示した。単一阻害剤条件も同様に、ＳＯＸ１免疫反応性を誘導できなかった（図７）。」 （９） 「【図６】 ［図：0001422778000001.jpg］ 【図７】 ［図：0001422778000002.jpg］ 【図８】 ［図：0001422778000003.jpg］ 」 （１０） 「【図１０】 ［図：0001422778000004.jpg］ 【図１１】 ［図：0001422778000005.jpg］ 」 （１１） 「【図２２Ａ】 ［図：0001422778000006.jpg］ 【図２２Ｂ】 ［図：0001422778000007.jpg］ 」 ２ 拒絶理由１（特許法第３６条第６項第１号）に関する判断 （１） 上記１の【０００２】及び【００３８】の記載からみて、本願発明で解決されるべき課題は、従来、ヒト多能性幹細胞から外胚葉を生成するのに「少なくとも最低６日間」を必要としていたのを、例えば２４時間程度まで短縮することにあると認められる。 また、本願発明は「第２」のとおりのものであるから、本願発明が特許法第３６条第６項第１号に規定されるサポート要件を満足するためには、発明の詳細な説明に、ヒトのＥＳＣ又はｉＰＳＣをＬＤＮ－１９３１８９及びＢＧＪ３９８を含む培地に同時に２４時間曝露して、前部外胚葉細胞の集団が上記培地への曝露の２４時間以内に生成し、前記前部外胚葉を単離することを含む「幹細胞の分化を誘導するための方法」により、「前部外胚葉細胞」を生成ないし単離することができ、上記課題が解決できると当業者が認識できるように記載されている必要があるといえる。 そして、本願発明のような細胞の分化誘導の技術において、培地組成等の培養条件が細胞に与える影響は実験的に確認してみなくてはわからないというのが本願出願日当時の技術常識であるから、発明の詳細な説明に記載された具体的な実施例について以下検討する。 （２） 発明の詳細な説明には、本願発明の方法により生成ないし単離される「前部外胚葉細胞」を生成ないし単離したことを明示する実施例は記載されていない。そこで、本願発明の方法で用いるＬＤＮ－１９３１８９やＢＧＪ３９８を用いた実施例について検討すると、幹細胞を分化誘導する方法の実施例として実施例１が記載され、その「材料 方法」の項には、ヒトｉＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）の培養や、ヒトｉＰＳＣから各種細胞への分化誘導について、実験材料や方法が記載されている。このうち、「神経上皮へのｈｉＰＳＣの加速分化」（【０１３６】）及び「中脳底板神経上皮の加速された生産」（【０１３７】）はヒトｉＰＳＣを出発材料とする一連の実験（以下、「実施例１－１」という。）であり、また、「神経中胚葉前駆細胞の加速された生産」（【０１３８】）、「脊髄神経上皮の加速された生産」（【０１３９】）及び「脊椎底板神経上皮の加速された生産」（【０１４０】）は別の一連の実験（以下、「実施例１－２」という。）であると認められる。 実施例１－１では、ＬＤＮ－１９３１８９及びＢＧＪ３９８を含む培地に曝露された結果得られた細胞として、「１日目に分化した神経上皮細胞」と、「２４～４８時間以内に」「作製した」「ＯＴＸ２／ＬＭＸ１Ａ／ＦＯＸＡ２陽性細胞」が記載されている。しかし、前者について、「１日目に分化した神経上皮細胞」は、技術常識に照らすと外胚葉から分化したものと解されるから、当業者といえども、「１日目に分化した神経上皮細胞」が「前部外胚葉細胞の集団」にあたると解することができない。また、「ＯＴＸ２／ＬＭＸ１Ａ／ＦＯＸＡ２陽性細胞」は、「１日目に分化した神経上皮細胞」を更に分化誘導したものと解されるから、これも外胚葉であるとは考えられない。これらの点を踏まえると、実施例１－１では、外胚葉細胞を経由して神経上皮細胞やそれをさらに分化誘導した細胞が得られたとはいえても、当該外胚葉細胞が「前部外胚葉」の細胞であるのか明らかでない。仮に「前部外胚葉」の細胞であったとしても、その分化誘導を途中で止めて「前部外胚葉細胞の集団を生成」して、「前部外胚葉を単離」したとは理解できないし、どのような指標でどのように分化誘導を途中で止めて「前部外胚葉細胞の集団を生成」して、どのように「前部外胚葉を単離」できるのかについて、何ら記載も示唆もないのだから、当業者といえども、実施例１－１の記載に基づいて、ヒトのＥＳＣ又はｉＰＳＣをＬＤＮ－１９３１８９及びＢＧＪ３９８を含む培地に同時に２４時間曝露して、前部外胚葉細胞の集団が上記培地への曝露の２４時間以内に生成し、前記前部外胚葉を単離することができると認識するとは認められない。 実施例１－２では、ＬＤＮ－１９３１８９、ＢＧＪ３９８及びＣＨＩＲ９９０２１を含む培地に曝露された結果得られた細胞として「１日目の神経中胚葉前駆細胞」、「２日目の神経中胚葉」、「ＰＡＸ３／ＳＯＸ１／ＨＯＸＢ４陽性神経上皮細胞の３日目の集団」、「２日目の脊髄神経中胚葉前駆細胞」、及び、「３日目と４日目の間に作製した」「ＳＯＸ１＋／ＦＯＸＡ２＋／ＮＫＸ２．２＋／ＨＯＸＢ４＋細胞の集団」が記載されている。しかし、「１日目の神経中胚葉前駆細胞」、「２日目の神経中胚葉」及び「２日目の脊髄神経中胚葉前駆細胞」は、いずれも中胚葉又はその前駆細胞であることが明記され、「前部外胚葉細胞の集団」にはあたらないことはもちろん、外胚葉細胞に由来するものでもないことが明らかである。また、「ＰＡＸ３／ＳＯＸ１／ＨＯＸＢ４陽性神経上皮細胞の３日目の集団」及び「３日目と４日目の間に作製した」「ＳＯＸ１＋／ＦＯＸＡ２＋／ＮＫＸ２．２＋／ＨＯＸＢ４＋細胞の集団」は、いずれも神経中胚葉前駆細胞を更に分化誘導して得られたものであるから、外胚葉やそれに由来するものであるとは考えられない。よって、実施例１－２により「前部外胚葉細胞の集団」が得られたと理解できず、本願発明が記載されたものと解することができない。 （３） 実施例１の「結果」の項には、その「材料 方法」の項のいずれの方法の結果であるか判然としないものの、「ＢＧＪ３９８およびＬＤＮ１９３１８９の組み合わせによる共処置」に関する記載があり（【０１４７】）、また、上記「共処置」に関する記載として【図７】がある。 【０１４１】、【０１４５】～【０１４７】の記載からは、ＢＧＪ３９８およびＬＤＮ１９３１８９の組み合わせによる共処置で得られるものが「ＳＯＸ１免疫陽性細胞の大部分の集団」であり、ＳＯＸ１陽性の細胞は初期段階の神経外胚葉の細胞にあたることが理解できる。しかし、特に【０１４６】、【０１４７】で示された内容はどのような工程を経て得られた結果であるのかが明記されていない。このような点を踏まえると、「ＢＧＪ３９８およびＬＤＮ１９３１８９の組み合わせによる共処置」では、外胚葉細胞を経由して神経外胚葉が得られたとはいえても、当該外胚葉細胞が「前部外胚葉」の細胞であるのか明らかでない。仮に「前部外胚葉」の細胞であったとしても、その分化誘導を途中で止めて「前部外胚葉細胞の集団を生成」して、「前部外胚葉を単離」したとは理解できないし、どのような指標でどのように分化誘導を途中で止めて「前部外胚葉細胞の集団を生成」して、どのように「前部外胚葉を単離」できるのかについて、何ら記載も示唆もないのだから、当業者といえども、「ＢＧＪ３９８およびＬＤＮ１９３１８９の組み合わせによる共処置」に関する記載に基づいて、ヒトのＥＳＣ又はｉＰＳＣをＬＤＮ－１９３１８９及びＢＧＪ３９８を含む培地に同時に２４時間曝露して、前部外胚葉細胞の集団が上記培地への曝露の２４時間以内に生成し、前記前部外胚葉を単離することができると認識するとは認められない。 また、【０１４７】に「ＢＧＪ３９８およびＬＤＮ１９３１８９の組み合わせによる共処置」の結果を示すものとして記載された【図７】の記載をみると、最左列にサンプル番号（♯）が付され、各サンプルについて、その右側にある３列には「ＬＤＮ（μＭ）」、「ＳＢ（μＭ）」、及び「ＳＵ（μＭ）」の数値、更に右側の３列には「ＳＯＸ２」、「ＮＡＮＯＧ」、及び「ＳＯＸ１」とのタイトルが付された画像が、それぞれ記載されている。このうち「ＬＤＮ（μＭ）」及び「ＳＵ（μＭ）」については、本願明細書の他の記載を考慮すれば、それぞれ「ＬＤＮ１９３１８９」及び「ＳＵ５４０２」の頭文字を用いて略記しつつ、各成分の使用濃度を示したものと解される。これに対し、「ＳＢ」に関しては【０１４７】に関連する記載がなく、本願明細書の他の記載をみても、「ＳＢ」を頭文字とする成分がＳＢ４３１５４２（【００２８】、【００７３】）、ＳＢ３５４３２（【０１００】）、ＳＢ２３９０６３（【０１４８】）と複数記載されているため、「ＳＢ」の記載でどのような成分を指すのかは特定できず、この点は【００３５】にある【図７】の説明をみても同様である。加えて、【０１４６】、【０１４７】で挙げられているＢＧＪ３９８の使用に関する情報は【図７】をみても記載がない。そうすると、【図７】をみても【０１４７】にある「ＢＧＪ３９８およびＬＤＮ１９３１８９の組み合わせによる共処置がＳＯＸ１免疫陽性細胞の大部分の集団を作製するのに十分である」ことを確認することができない。 結果として、技術常識を踏まえても、「ＢＧＪ３９８およびＬＤＮ１９３１８９の組み合わせによる共処置」に関する記載によって本願発明が記載されたと解することができない。 （４） 上記（１）～（３）で検討したとおり、本願の発明の詳細な説明における記載をみても、外胚葉細胞を経由して神経上皮細胞や神経外胚葉、これらをさらに分化誘導した細胞が得られたとはいえても、当該外胚葉細胞が「前部外胚葉」の細胞であるのか明らかでない。仮に「前部外胚葉」の細胞であったとしても、その分化誘導を途中で止めて「前部外胚葉細胞の集団を生成」して、「前部外胚葉を単離」したとは理解できないし、どのような指標でどのように分化誘導を途中で止めて「前部外胚葉細胞の集団を生成」して、どのように「前部外胚葉を単離」できるのかについて、本願の発明の詳細な説明における記載をみても何ら記載も示唆もないのだから、当業者といえども、ヒトのＥＳＣ又はｉＰＳＣをＬＤＮ－１９３１８９及びＢＧＪ３９８を含む培地に同時に２４時間曝露して、前部外胚葉細胞の集団が上記培地への曝露の２４時間以内に生成し、前記前部外胚葉を単離することができると認識するとは認められない。 したがって、本願発明は、発明の詳細な説明において、発明の課題が解決できることを当業者が本願出願時において認識できるように記載された範囲のものとはいえないから、本願は特許法第３６条第６項第１号に規定する要件を満たすものとはいえない。 ３ 拒絶理由２（特許法第３６条第４項第１号）に関する判断 本願発明は「第２」のとおりのものであるから、本願発明は特許法第３６条第４項第１号に規定される実施可能要件を満足するためには、当業者が、ヒトのＥＳＣ又はｉＰＳＣをＬＤＮ－１９３１８９及びＢＧＪ３９８を含む培地に同時に２４時間曝露して、前部外胚葉細胞の集団が上記培地への曝露の２４時間以内に生成し、前記前部外胚葉を単離することを含む「幹細胞の分化を誘導するための方法」により、「前部外胚葉細胞」を生成ないし単離することができる程度に、発明の詳細な説明が明確かつ十分に記載されている必要があるといえる。 そして、２（１）でも検討したように、本願発明のような細胞の分化誘導の技術において、培地組成等の培養条件が細胞に与える影響は実験的に確認してみなくてはわからないというのが本願出願日当時の技術常識である しかし、発明の詳細な説明や図面の記載は２の（２）及び（３）で検討したとおりであり、技術常識を踏まえても、このような発明の詳細な説明の記載によっては、当業者が容易に本願発明を実施することができる程度に明確かつ十分に記載されたものとはいえず、本願は特許法第３６条第４項第１号に規定する要件を満たすものとはいえない。 ４ 請求人の主張について （１） 本願発明に関して当審が検討した上記２及び３の点について、請求人は、令和６年１０月１８日付け意見書において、上記２及び３で検討した点のほか、以下のア～オの旨を主張して、本願が特許法第３６条第６項第１号および特許法第３６条第４項第１号に規定する要件を満たすことは明らかであると主張する。 ア 本願明細書は、免疫細胞化学の画像、細胞培養プロトコル、理論的な概略図など、補正後の請求項１を当業者が実施する、すなわち、外胚葉の形成および外胚葉誘導物の形成を促進するためにＬＤＮ１９３１８９およびＢＧＪ３９８（以下、「ＬＤＮ／ＢＧＪ」とも記載）を使用することを示す多くの形式のデータを提供している。 イ 本願の図７は、ＬＤＮ／ＳＵがＳＯＸ１陽性外胚葉を形成するのに十分であることを示しており、また、図６はＢＧＪまたはＰＤがＳＵの効果を再現できることを示している。そうすると、図６および図７を考慮した場合、ＬＤＮ／ＢＧＪはＬＤＮ／ＳＵと同様に機能することを理解でき、ＬＤＮ／ＢＧＪがＳＯＸ１陽性外胚葉を形成するのに十分であることを当業者は理解できる。 ウ ＳＯＸ１免疫陽性の存在と外胚葉の産生の証拠との関係について、幹細胞の分化に関する当業者であれば、ＳＯＸ１免疫陽性の存在が外胚葉の産生の証拠となり得ることを理解でき、本願明細書において引用された数多くの刊行物も、外胚葉形成の証拠としてＳＯＸ１を挙げており、また、ｈＰＳＣをＬＤＮ／ＢＧＪに暴露することによって製造されたＳＯＸ１免疫陽性の外胚葉が、中脳底板や頭蓋神経堤のような、他の外胚葉由来の構造に変化する能力を持つことを実証している。 エ 仮にＳＯＸ１が外胚葉の形成を示すのに不十分であったとしても、本願では図８にＯＴＸ２陽性としての外胚葉も記載されており、ＯＴＸ２とＳＯＸ１の免疫陽性の組み合わせは、ＳＯＸ１単独と同様に、幹細胞の分化に関する当業者にとっては周知の外胚葉の特徴である。 オ 本願発明の方法は本願の出願後に、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ誌に論文として提出されており（ＰＭＩＤ：３２７４５３１１）、ヒト多能性幹細胞から２４時間以内に外胚葉の形成を促進するためのＬＤＮとＢＧＪの使用が、全体を通して明確に詳述されている。 （２） しかしながら、上のような請求人の主張はいずれも採用することができない。その理由は以下のとおりである。 ア 本願明細書の免疫細胞化学の画像はいずれも前部外胚葉自体が生成されたことを示す画像ではなく、細胞培養プロトコル、理論的な概略図などの記載についても、ヒトのＥＳＣ又はｉＰＳＣをＬＤＮ－１９３１８９及びＢＧＪ３９８を含む培地に同時に２４時間曝露した結果を示したものではなく、前部外胚葉を単離したことを示すものではないから、いずれも「幹細胞の分化を誘導するための方法」が発明の詳細な説明に記載されていることを示すものではない。 イ 図７で示されたのはＳＯＸ１陽性の「神経外胚葉（ＮＥ）」であって、前部外胚葉に該当するわけではない。また、図７の結果を得るための手順については１の（３）及び（８）に記載される一方、図６については１の（３）に図６の内容に関する記載があるものの、明細書をみてもその他に記載はなく、どのような方法を経て得られた結果であったのかは不明であるから、「ＢＧＪまたはＰＤがＳＵの効果を再現でき」、「ＬＤＮ／ＢＧＪはＬＤＮ／ＳＵと同様に機能する」と解することはできない。 ウ 本願明細書の記載からみて、「ＳＯＸ１免疫陽性の外胚葉」は、１の（３）及び（８）に記載されているように「神経外胚葉（ＮＥ）」であることがわかる一方、これは前部外胚葉に該当するわけではない。そうすると、「ＳＯＸ１免疫陽性の外胚葉」を生成するプロセスにおいて前部外胚葉を生成していたのか、生成していた場合であってもどの段階で生成していたのかが不明であり、そのような不明な状態で前部外胚葉を単離できると解することはできない。 エ 図８にＯＴＸ２陽性としての外胚葉が記載されていると主張するが、明細書をみても図８で示された結果を得るための手順について記載がなく、図面の簡単な説明をみても「神経上皮は前部デフォルトを採用している。」と記載されるのみであるから、そもそもどのような細胞に関する結果であるのかが不明であり、ヒトのＥＳＣ又はｉＰＳＣをＬＤＮ－１９３１８９及びＢＧＪ３９８を含む培地に同時に２４時間曝露した結果に関するものであるとも理解できず、「幹細胞の分化を誘導するための方法」を示すものと解することができない。 オ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ誌掲載の論文に関しては、ＰｕｂＭｅｄデータベースにおける登録番号であるＰＭＩＤを記載するだけで、当該論文の具体的な記載内容についても触れていない上、そもそも本願出願日後に発行された論文であるのだから、当該論文の内容について検討するまでもなく、上記主張は採用できない。 第５ むすび 以上のとおりであるから、本願は、特許法第３６条第６項第１号及び同条第４項第１号に規定する要件を満たしておらず、同法第４９条第４号の規定により拒絶すべきである。 よって、結論のとおり審決する。