2022-019651

原査定の理由に引用された引用文献１には、次の記載がある。なお、引用文献１に対応する国際出願のファミリー出願の公表公報である特表２０１８－５３４２７８号の記載を邦訳文として示す。

記載（１）

「【請求項１】

個体の筋機能の低下を軽減する、個体の筋機能を向上させる、及び／又は個体の筋萎縮後の筋機能の回復を改善する方法であって、前記個体にポリフェノールを含む組成物を投与することを含む方法。

【請求項２】

前記ポリフェノールが、オレウロペイン、ルチン、ケルセチン、クルクミン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

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……

【請求項１０】

前記個体がサルコペニアを有する、又は移動能力障害若しくは筋力低下を有する高齢者である、請求項１に記載の方法。

【請求項１１】

（ｉ）サルコペニアを有する個体のサルコペニアを治療すること、（ｉｉ）個体のサルコペニアを予防すること、（ｉｉｉ）個体の筋機能の低下を軽減すること、（ｉｖ）個体の筋機能を向上させること、又は（ｖ）個体の筋萎縮又は筋損傷後の筋機能の回復を改善することのうちの少なくとも１つに関して治療的に有効な量のポリフェノールを含む組成物。

【請求項１２】

前記ポリフェノールが、オレウロペイン、ルチン、ケルセチン、クルクミン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。

……」

記載（２）

「[0001]本開示は、概して、骨格筋の健康の向上又は維持のため１種以上のポリフェノールを使用する組成物及び方法に関する。より詳細には、本開示は、サルコペニアの進行の治療、予防、若しくは軽減；筋機能（例えば、筋力、歩行速度など）低下の軽減；筋機能の向上、及び／又は筋萎縮若しくは筋損傷後の筋機能の回復の改善のため、１種以上のポリフェノールを含む組成物を投与することに関する。

[0002]筋力低下は、サルコペニアなどの生命を脅かすいくつかの疾患において顕在化する。萎縮（減少）と肥大（増大）とのバランスが、骨格筋量維持の鍵となる。しかしながら骨格筋は最終分化を起こしているため、この可塑性を可能とする機序を理解することが長期の健康及び生存の要となる。

[0003]サルコペニアは、加齢に伴う筋量及び筋機能（筋力及び歩行速度を含む）の低下として定義される。筋機能及び身体能力は筋量の低下に伴い衰える。……。」

記載（３）

「[0016]別の実施形態では、本開示は、（ｉ）サルコペニアを有する個体のサルコペニアを治療すること、（ｉｉ）個体のサルコペニアを予防すること、（ｉｉｉ）個体の筋機能の低下を軽減すること、（ｉｖ）個体の筋機能を向上させること、又は（ｖ）個体の筋萎縮後の筋機能の回復を改善することのうちの少なくとも１つに関して治療的に有効である栄養学的な量でポリフェノールを含む組成物を提供する。

[0017]一実施形態では、ポリフェノールは、オレウロペイン、ルチン、ケルセチン、クルクミン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。」

記載（４）

「[0048]「動物」としては、齧歯類、水生哺乳類、イヌ及びネコ等の飼育動物、ヒツジ、ブタ、ウシ及びウマ等の家畜、並びにヒトを含むがこれらに限定されない哺乳類が挙げられるが、これらに限定されない。「動物」、「哺乳類」、又はこれらの複数形が用いられる場合、これらの用語には、本節の文脈により効果が示され得る、又は示されるように意図され得るあらゆる動物が当てはまる。本明細書で使用するとき、用語「患者」は、本明細書において定義されるとおりの治療を受ける又は治療を受けることが意図される動物、特に哺乳類、及び更にはヒトを含むものと理解される。用語「個体」及び「患者」は、本明細書で使用するとき、多くの場合、ヒトを指して使用されるが、本開示はヒトに限定されはしない。したがって、用語「個体」及び「患者」は、治療により効果を得ることのできる任意の動物、哺乳類又はヒトを指す。」

記載（５）

「[0059]筋萎縮は、サルコペニア障害、即ち加齢に起因する筋肉の量、サイズ、及び機能の低下を引き起こし得る。……。加齢に伴うサルコペニアの治療又は予防に関わる機序は、若年者の筋機能低下の治療又は予防とは異なる。」

記載（６）

「[0061]２種以上のポリフェノールなど、ポリフェノールの混合物が用いられてもよい。」

記載（７）

「[0089]以下の非限定的な例は、１種以上のポリフェノールを含む組成物を投与して、組成物を投与された個体におけるサルコペニアを治療する、サルコペニアを予防する、筋機能（例えば、筋力、歩行速度など）の低下を軽減する、筋機能（例えば、筋力、歩行速度など）を向上させる、及び／又は筋機能（例えば、筋力、歩行速度など）の回復を改善するという概念を展開しかつ支持する科学的データを示す。

[0090]マウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞株（大腿筋由来のサテライト細胞）は、筋萎縮及び肥大の良好な説明となる。Ｃ２Ｃ１２細胞は、多核化筋管に分化する。筋芽細胞の分化、ひいては筋管形成は、Ｃ２Ｃ１２細胞におけるクレアチンキナーゼ（ＣＫ）活性を測定することにより生化学的に観察される。

[0091]実施例１：本発明者らが使用するモデルにおいて、Ｃ２Ｃ１２細胞を２種類のポリフェノール、すなわちオレウロペイン（オリーブ葉由来）及びケルセチン（アグリコン形態のルチン）で処理した。腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）は、多くの状態及び加齢における筋消耗のメディエーターとして関係付られている多面発現性のサイトカインであり、これを筋萎縮の対照として使用した。ＴＮＦ－αの存在下又は非存在下でポリフェノール治療を行った。更に、インスリン様増殖因子－１（ＩＧＦ－１）を肥大の対照として使用した（図１）。

[0092]結果として、１μＭでのオレウロペインは筋管の分化（肥大）を向上可能であったことが示された。

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[0093]実施例２：本発明者らにより使用されるモデルにおいて、ＴＮＦ－α（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下で４日間、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞をオレウロペイン（１．５μＭ）で処理した。ＴＮＦ－α（腫瘍壊死因子－α）は、多くの状態及び加齢における筋消耗のメディエーターとして関係付られている多面発現性のサイトカインであり、これを筋萎縮の対照として使用した。ＴＮＦ－αも使用して、Ｃ２Ｃ１２に炎症状態を誘導した。第３日目及び第４日目では、オレウロペインにより、非炎症状態において、筋管分化についてのマーカーであるミオゲニンＤ（ＭｙｏＤ）（図２）及びＭｙｏＧ（図３）が増加したことから、筋肥大の刺激が示唆される。炎症状態（ＴＮＦ－αによる）において、特定の筋炎症性サイトカイン、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフリガンド１（ＣＸＣＬ－１）（図４）及びＣ－Ｃモチーフリガンド５（ＣＣＬ－５）（図５）の発現は、第４日目にオレウロペインにより減少したことから、筋肉細胞の炎症応答の低下が示唆される。その他の筋特異性ではない炎症性サイトカイン（活性化Ｂ細胞の核因子κ軽鎖エンハンサー、すなわちＮＦＫ－Ｂ（図７）、シクロオキシゲナーゼ－２、すなわちＣｏｘ－２（図８）及びインターロイキン－６、すなわちＩＬ－６（図９）が減少していたことから、オレウロペインの抗炎症特性が示される。最終的に、トロンボスポンジンモチーフ４を有するディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ－４）（図６）もオレウロペインにより減少した。我々のモデルにおいて、フォークヘッドボックスＯ３（ＦＯＸＯ３）を測定することにより筋タンパク質の分解を評価したところ（図１０）、３日目と４日目でオレウロペインにより減少していた。

[0094]図１は、１．０μＭでのオレウロペイン（ＯＬＰ）のクレアチンキナーゼ活性（ＣＫ）に対する効果を示す。オレウロペインを添加又は非添加で、マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）を４日間単層培養した。タンパク質含量についてデータを正規化し、結果を平均±標準誤差で表した。ベースライン：増殖培地中で分化させた非分化細胞についての基礎対照。対照：分化培地（２％ウマ血清、１％ペニシリンストレプトマイシン、ＤＭＥＭ高グルコース）についての基礎対照（ＤＭ）。ＴＮＦａ １０ｎｇ／ｍＬ：ＤＭ（萎縮症の対照）中１０ｎｇ／ｍＬの濃度の腫瘍壊死因子α。ＩＧＦ－１ １０ｎＭ：ＤＭ（肥大の対照）中１０ｎＭの濃度のインスリン様増殖因子１。ＯＬＰ １μＭ：ＤＭ中１．０μＭ濃度のオレウロペイン。

[0095]図２は、１．５μＭでのオレウロペイン（ＯＬＰ）のＭｙｏＤ発現に対する効果を示す。オレウロペインを添加又は非添加で、マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）を４日間単層培養した。ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素）のｍＲＮＡレベルについてデータを正規化し、結果を平均±標準誤差で表した。ＤＭ：分化培地（２％ウマ血清、１％ペニシリンストレプトマイシン、ＤＭＥＭ高グルコース）についての基礎対照。ＯＬＰ １．５μＭ：ＤＭ中１．５μＭ濃度のオレウロペイン。

[0096]図３は、１．５μＭでのオレウロペイン（ＯＬＰ）のミオゲニン（ＭｙｏＧ）の発現に対する効果を示す。オレウロペインを添加又は非添加で、マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）を４日間単層培養した。ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素）のｍＲＮＡレベルについてデータを正規化し、結果を平均±標準誤差で表した。ＤＭ：分化培地（２％ウマ血清、１％ペニシリンストレプトマイシン、ＤＭＥＭ高グルコース）についての基礎対照。ＯＬＰ １．５μＭ：ＤＭ中１．５μＭ濃度のオレウロペイン。

[0097]図４は、１．５μＭでのオレウロペイン（ＯＬＰ）のケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１（ＣＸＣＬ－１）発現に対する効果を示す。ＴＮＦ－α刺激（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下、オレウロペインを添加又は非添加で、マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）を４日間単層培養した。ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素）のｍＲＮＡレベルについてデータを正規化し、結果を平均±標準誤差で表した。ＤＭ：分化培地（２％ウマ血清、１％ペニシリンストレプトマイシン、ＤＭＥＭ高グルコース）についての基礎対照。ＴＮＦａ １０ｎｇ／ｍＬ：ＤＭ中１０ｎｇ／ｍＬの濃度の腫瘍壊死因子α。ＯＬＰ １．５μＭ：ＤＭ中１．５μＭ濃度のオレウロペイン。ＴＮＦａ １０ｎｇ／ｍＬ＋ＯＬＰ １．５μＭ：ＤＭ中、１０ｎｇ／ｍＬの濃度の腫瘍壊死因子α及び１．５μＭ濃度のオレウロペイン。

[0098]図５は、１．５μＭでのオレウロペイン（ＯＬＰ）の、ＲＡＮＴＥＳ（活性化制御で、発現、分泌される正常Ｔ細胞）としても知られるケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＣＬ－１５）の発現に対する効果を示す。ＴＮＦ－α刺激（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下、オレウロペインを添加又は非添加で、マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）を４日間単層培養した。ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素）のｍＲＮＡレベルについてデータを正規化し、結果を平均±標準誤差で表した。ＤＭ：分化培地（２％ウマ血清、１％ペニシリンストレプトマイシン、ＤＭＥＭ高グルコース）についての基礎対照。ＴＮＦａ １０ｎｇ／ｍＬ：ＤＭ中１０ｎｇ／ｍＬの濃度の腫瘍壊死因子α。ＯＬＰ １．５μＭ：ＤＭ中１．５μＭ濃度のオレウロペイン。ＴＮＦａ １０ｎｇ／ｍＬ＋ＯＬＰ １．５μＭ：ＤＭ中、１０ｎｇ／ｍＬの濃度の腫瘍壊死因子α及び１．５μＭ濃度のオレウロペイン。

[0099]図６は、１．５μＭでのオレウロペイン（ＯＬＰ）の、トロンボスポンジンモチーフ４を有するディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ－４）の発現に対する効果を示す。ＴＮＦ－α刺激（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下、オレウロペインを添加又は非添加で、マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）を４日間単層培養した。ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素）のｍＲＮＡレベルについてデータを正規化し、結果を平均±標準誤差で表した。

[0100]ＤＭ：分化培地（２％ウマ血清、１％ペニシリンストレプトマイシン、ＤＭＥＭ高グルコース）についての基礎対照。ＴＮＦａ １０ｎｇ／ｍＬ：ＤＭ中１０ｎｇ／ｍＬの濃度の腫瘍壊死因子α。ＯＬＰ １．５μＭ：ＤＭ中１．５μＭ濃度のオレウロペイン。ＴＮＦａ １０ｎｇ／ｍＬ＋ＯＬＰ １．５μＭ：ＤＭ中、１０ｎｇ／ｍＬの濃度の腫瘍壊死因子α及び１．５μＭ濃度のオレウロペイン。

[0101]図７は、１．５μＭオレウロペイン（ＯＬＰ）のＮＦ－κＢ（活性化Ｂ細胞の核因子κ軽鎖エンハンサー）の発現に対する効果を示す。ＴＮＦ－α刺激（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下、オレウロペインを添加又は非添加で、マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）を４日間単層培養した。ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素）のｍＲＮＡレベルについてデータを正規化し、結果を平均±標準誤差で表した。ＤＭ：分化培地（２％ウマ血清、１％ペニシリンストレプトマイシン、ＤＭＥＭ高グルコース）についての基礎対照。ＴＮＦａ １０ｎｇ／ｍＬ：ＤＭ中１０ｎｇ／ｍＬの濃度の腫瘍壊死因子α。ＯＬＰ １．５μＭ：ＤＭ中１．５μＭ濃度のオレウロペイン。ＴＮＦａ １０ｎｇ／ｍＬ＋ＯＬＰ １．５μＭ：ＤＭ中、１０ｎｇ／ｍＬの濃度の腫瘍壊死因子α及び１．５μＭ濃度のオレウロペイン。

[0102]図８は、１．５μＭでのオレウロペイン（ＯＬＰ）の、シクロオキシゲナーゼ－２（ＣＯＸ－２）としても知られるプロスタグランジン－エンドペルオキシドシンターゼ２の発現に対する効果を示す。ＴＮＦ－α刺激（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下、オレウロペインを添加又は非添加で、マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）を４日間単層培養した。ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素）のｍＲＮＡレベルについてデータを正規化し、結果を平均±標準誤差で表した。ＤＭ：分化培地（２％ウマ血清、１％ペニシリンストレプトマイシン、ＤＭＥＭ高グルコース）についての基礎対照。ＴＮＦａ １０ｎｇ／ｍＬ：ＤＭ中１０ｎｇ／ｍＬの濃度の腫瘍壊死因子α。ＯＬＰ １．５μＭ：ＤＭ中１．５μＭ濃度のオレウロペイン。ＴＮＦａ １０ｎｇ／ｍＬ＋ＯＬＰ １．５μＭ：ＤＭ中、１０ｎｇ／ｍＬの濃度の腫瘍壊死因子α及び１．５μＭ濃度のオレウロペイン。

[0103]図９は、１．５μＭでのオレウロペイン（ＯＬＰ）の、インターロイキン－６（ＩＬ－６）発現に対する効果を示す。ＴＮＦ－α刺激（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下、オレウロペインを添加又は非添加で、マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）を４日間単層培養した。ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素）のｍＲＮＡレベルについてデータを正規化し、結果を平均±標準誤差で表した。ＤＭ：分化培地（２％ウマ血清、１％ペニシリンストレプトマイシン、ＤＭＥＭ高グルコース）についての基礎対照。ＴＮＦａ １０ｎｇ／ｍＬ：ＤＭ中１０ｎｇ／ｍＬの濃度の腫瘍壊死因子α。ＯＬＰ １．５μＭ：ＤＭ中１．５μＭ濃度のオレウロペイン。ＴＮＦα １０ｎｇ／ｍＬ＋ＯＬＰ １．５μＭ：ＤＭ中、１０ｎｇ／ｍＬの濃度の腫瘍壊死因子α及び１．５μＭ濃度のオレウロペイン。

[0104]図１０は、１．５μＭでのオレウロペイン（ＯＬＰ）の、フォークヘッドボックスＯ３（ＦＯＸＯ３）発現に対する効果を示す。ＴＮＦ－α刺激（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下、オレウロペインを添加又は非添加で、マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）を４日間単層培養した。ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素）のｍＲＮＡレベルについてデータを正規化し、結果を平均±標準誤差で表した。ＤＭ：分化培地（２％ウマ血清、１％ペニシリンストレプトマイシン、ＤＭＥＭ高グルコース）についての基礎対照。ＴＮＦα １０ｎｇ／ｍＬ：ＤＭ中１０ｎｇ／ｍＬの濃度の腫瘍壊死因子α。ＯＬＰ １．５μＭ：ＤＭ中１．５μＭ濃度のオレウロペイン。ＴＮＦα １０ｎｇ／ｍＬ＋ＯＬＰ １．５μＭ：ＤＭ中、１０ｎｇ／ｍＬの濃度の腫瘍壊死因子α及び１．５μＭ濃度のオレウロペイン。

[0105]これらの結果を併せて、オレウロペインは、炎症経路を介した炎症の影響を抑えてタンパク質分解を制限し、筋肥大を刺激することが示唆された。」