2022-017715

第２ 本願発明

本願の請求項１～１２に係る発明は、令和６年７月１日提出の手続補正書により補正された特許請求の範囲の請求項１～１２に記載された事項により特定されるものであるところ、その請求項１に係る発明（以下、「本願発明」という。）は、次のとおりである。

「【請求項１】

下記式（１）の結合体であって、

Ｘ-Ｌ-Ｆ （１）；

（ここで、

Ｘが、インスリンであり、

Ｌが、リンカーであって、０ｋＤａ超え～３．４ｋＤａ未満の大きさを有するポリエチレングリコールであり、

Ｆが、免疫グロブリンＦｃ領域である）

前記結合体とＸ及びＦが同じであるがリンカーＬが３．４ｋＤａの大きさを有するポリエチレングリコールである他の結合体よりも、増加した生体内半減期を示し、Ｌの両末端がそれぞれＦのアミン基またはチオール基及びＸのアミン基またはチオール基に結合している、前記式（１）の結合体。」

第３ 当審において通知した拒絶の理由

令和６年３月２８日付けで当審において通知した拒絶の理由のうち、請求項１に係る発明（本願発明に対応）についての理由の要旨は、次のとおりである（特に、理由１の１～３を参照）。

本願の請求項１に係る発明は、その優先日前に日本国内又は外国において、頒布された引用文献３及び４に記載された発明に基いて、その優先日前にその発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。

＜引用文献等一覧＞

３．米国特許出願公開第２０１７／００２０９９１号明細書

４．Ｂｉｏｌ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ．， ２０１２， Ｖｏｌ．３５（７）， ｐ．１０７６－１０８３

第４ 引用文献の記載

１ 引用文献３

引用文献３には、次の事項が記載されている。なお、原文は英文なので当審による和訳を示す。また、原文にない下線は、強調のために合議体によって付した。（以下、同様。）

（摘記３ａ） 特許請求の範囲

「１．（ｉ）ヒト野生型配列を有するインスリン部分；

（ｉｉ）サイズが約３．４ｋＤａから１０ｋＤａ未満のポリエチレングリコール部分；及び

（ｉｉｉ）免疫グロブリンＦｃ領域部分、

からなるインスリン複合体であり、

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ここで、インスリン部分は、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－の構造を有するリンカー官能基を介して、Ｂ鎖のＮ末端アミノ基でポリエチレングリコール部分の一端の酸素原子に共有結合しており、

ここで、ポリエチレングリコール部分の他端の酸素原子は、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－の構造を有するリンカー官能基を介して免疫グロブリンＦｃ領域部分に共有結合している、インスリン複合体。

２．前記ポリエチレングリコール部分のサイズが約３．４ｋＤａである、請求項１に記載のインスリン複合体。

・・・

１６．請求項１に記載のインスリン複合体を調製する方法であって、

（１）ポリエチレングリコール部分を（ｉ）免疫グロブリンＦｃ領域部分、又は、（ｉｉ）インスリン部分；に共有結合させる工程、

（２）（１）の反応混合物から複合体を単離する工程であって、該複合体は、

（ｉ）ポリエチレングリコール部分と共有結合した免疫グロブリンＦｃ領域部分、又は（ｉｉ）ポリエチレングリコール部分と共有結合したインスリン部分；を含み、さらに、

（３）（ｉ）免疫グロブリンＦｃ領域部分を、単離された複合体のポリエチレングリコール部分の他端に共有結合させて、ポリエチレングリコールの各末端に連結された免疫グロブリンＦｃ領域部分及びインスリン部分を含むインスリン複合体を生成する工程、又は、（ｉｉ）インスリン部分を、単離された複合体のポリエチレングリコール部分の他端に結合させて、ポリエチレングリコール部分の各末端に連結された免疫グロブリンＦｃ領域部分及びインスリン部分を含むインスリン複合体を生成する工程、を含む方法。

１７．（１）のポリエチレングリコール部分が、アルデヒド基、マレイミド基及びコハク酸イミド誘導体からなる群から選択される反応性基を有する、請求項１６に記載の方法。

・・・」

（摘記３ｂ） 段落［００１１］

「［００１１］本発明の目的は、インスリンの生体内活性を維持しながらも血中半減期を著しく延長した優れたインスリン複合体、それを含む持続型製剤、及びその製造方法を提供することである。」

（摘記３ｃ） 段落［００３９］

「［００３９］本発明の別の例示的な実施形態では、インスリン複合体は、インスリンと比較して、改善されたインビボ持続時間、安定性、及び延長された血糖降下効果を有し、インスリン複合体は、インスリンのインビボ活性を維持する。」

（摘記３ｄ） 段落［００７５］～［００７６］

「［００７５］本発明に用いられる非ペプチドポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ（乳酸））及びＰＬＧＡ（ポリ（乳酸－グリコール酸）などの生分解性ポリマー、脂質ポリマー、キチン類、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択することができ、好ましくは、ポリエチレングリコールである。当技術分野で知られており、当業者の技術範囲内で容易に調製され、及びそれらの誘導体も、本発明の範囲に含まれる。

［００７６］従来のインフレーム融合法により得られる融合タンパク質に用いられるペプチドリンカーは、生体内でタンパク質分解酵素により切断されやすいという欠点があり、担体による活性薬物の血中半減期延長効果が期待どおり十分に得ることができない。しかしながら、本発明においては、タンパク質分解酵素に対する耐性を有するポリマーを使用して、ペプチドの血清中半減期を担体と同様に維持することができる。したがって、上記機能を有するポリマー、すなわち生体内タンパク質分解酵素に対する耐性を有するポリマーであれば、どのような非ペプチド性ポリマーも特に制限なく使用することができる。非ペプチドポリマーは、１～１００ｋＤａの範囲、特に１～２０ｋＤａ、又は１～１００ｋＤａ未満、１～５ｋＤａ未満、１～２０ｋＤａ未満、約３．４～１０ｋＤａ未満、約３．４の分子量であるが、これに限定されない。免疫グロブリンＦｃ領域に連結された本発明の非ペプチドポリマーは、１つのポリマーであっても、異なるタイプのポリマーの組み合わせであってもよい。」

（摘記３ｅ） 段落［００８０］

「［００８０］本発明の別の態様では、本発明は、本発明のインスリン複合体を含む長時間作用型インスリン製剤を提供する。」

（摘記３ｆ） 段落［００８５］

「［００８５］本発明の長時間作用型製剤は、インスリンの生体内持続時間及び安定性を非常に高いレベルに維持するため、インスリン依存性糖尿病の治療に効果的に使用される。」

（摘記３ｇ） 段落［０１００］～［０１０３］

「［０１００］さらに別の態様では、本発明は、以下のステップを含む、インスリン複合体を調製する方法を提供する：

［０１０１］（１）各末端にアルデヒド、マレイミド、又はスクシンイミド誘導体の反応性基を有する非ペプチジルポリマー部分と、インスリン部分のアミン基又はチオール基とを共有結合させる工程；

［０１０２］（２）（１）の反応混合物から複合体を単離する工程であって、複合体は、非ペプチジルポリマー部分と共有結合したインスリン部分を含む工程、

そして

［０１０３］（３）非ペプチジルポリマーのそれぞれの末端に結合された免疫グロブリンＦｃ領域部分とインスリン部分とを含むペプチドコンジュゲートを生成するために、単離されたコンジュゲートの非ペプチジルポリマー部分の他端に免疫グロブリンＦｃ領域部分を共有結合させる工程。」

（摘記３ｈ） 段落［０１１１］～［０１２５］（実施例１～３）

「実施例１

ＰＥＧ（合議体注：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ、ポリエチレングリコール）化免疫グロブリンＦｃ領域の精製

［０１１１］免疫グロブリンＦｃのＮ末端のＰＥＧ化には、５Ｋ ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤ（３）ＰＥＧ（３つのプロピルアルデヒド基を有するＰＥＧ、日油（ＮＯＦ）、日本）を使用し、免疫グロブリンＦｃとＰＥＧを４℃で４．５時間、モル比１：２、免疫グロブリンＦｃ濃度１０ｍｇ／ｍｌで反応させてＰＥＧ化を行った。このとき、反応はｐＨ６．０の１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液中で行い、還元剤として２０ｍＭ ＳＣＢ（ＮａＣＮＢＨ３）を添加した。反応液からＳｏｕｒｃｅ １５Ｑ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムを用いてモノＰＥＧ化免疫グロブリンＦｃを精製した。

実施例２

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ＰＥＧ化インスリンの精製

［０１１２］２－１．３．４Ｋ モノＰＥＧ化インスリンの調製

［０１１３］さらに、インスリンＢ鎖のＮ末端のＰＥＧ化には、３．４Ｋ ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤ（２）ＰＥＧ（プロピルアルデヒド基を２つ有するＰＥＧ、日油（ＮＯＦ）、日本）を使用し、インスリンとＰＥＧを４℃で２時間、モル比１：２～４、インスリン濃度３～５ｍｇ／ｍｌで反応させてＰＥＧ化を行った。このとき、反応は４５％イソプロパノールを含むｐＨ５．０～６．０の５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液中で行い、還元剤として４～２０ｍＭのＳＣＢ（ＮａＣＮＢＨ３）を添加した。Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムを使用して、モノＰＥＧ化インスリンを反応溶液から精製した。

・・・

実施例３

インスリン－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ複合体の調製

・・・

［０１２０］３－２．インスリン３．４Ｋ ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃコンジュゲートの調製

実施例１－２で得られたモノＰＥＧ化インスリンと免疫グロブリンＦｃを、モル比１：１～２、室温下、１５～１７時間、総タンパク質濃度２０～５０ｍｇ／ｍｌで反応させた。このとき、反応は２Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ８．２の１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液中で行い、還元剤として２０ｍＭ ＳＣＢを添加した。反応終了後、反応液をＳｏｕｒｃｅ １５Ｑカラムを用いて一次精製した。その後、Ｓｏｕｒｃｅ ＩＳＯカラムを用いて二次精製を行い、インスリン－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ複合体を得た。

・・・

［０１２４］実施例１及び２による上記複合体は、還元的アミノ化反応によって調製された。ＰＥＧリンカーのプロピオンアルデヒド基と免疫グロブリンＦｃ領域又はインスリンのアミン基を相互に反応させ、還元的アミノ化によって複合体を形成した。

［０１２５］ＰＥＧのサイズに従って、各コンジュゲートは、インスリン－３．４Ｋ ＰＥＧ－Ｆｃ、インスリン－５Ｋ ＰＥＧ－Ｆｃ、及びインスリン－１０Ｋ ＰＥＧ－Ｆｃによって示される。」

（摘記３ｉ） 段落［０１４７］～［０１５２］（実施例１２）

「実施例１２

ＰＥＧサイズに応じたＰＫ（合議体注：Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ、薬物動態）プロファイル

［０１４７］ＰＥＧサイズによるＰＫプロファイルの変化を確認するために、以下の実験を行った。

［０１４８］ＰＥＧサイズによるインスリン－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ複合体の薬物動態を比較するために、正常ラット（７週齢、雄ＳＤラット、図７）を使用して、それらの血中濃度を経時的に分析した。

［０１４９］正常ラットに、インスリン－３．４Ｋ ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ複合体及びインスリン－１０Ｋ ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ複合体を同じ用量でそれぞれ１回皮下注射した。次に、各グループから１、４、８、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、及び１６８時間後に血液を採取した。

［０１５０］各時点で、インスリン－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ複合体の血中濃度を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定し、キットとしてインスリンＥＬＩＳＡ（ＡＬＰＣＯ、ＵＳＡ）を使用した。検出抗体として、マウス抗ヒトＩｇＧ４ ＨＲＰコンジュゲート（Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｌ，Ｉｎｃ，ＵＳＡ）を使用した。

［０１５１］インスリン－３．４Ｋ ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ複合体及びインスリン－１０Ｋ ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ複合体の血中持続時間を調べた結果、インスリン－３．４Ｋ ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ複合体は注射後１４４時間まで残留したが、インスリン１０Ｋ ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ複合体は、注射後７２時間まで残留した（図７）。インスリン－３．４Ｋ ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ複合体の血中半減期は、インスリン－１０Ｋ ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ複合体の血中半減期と比較して約５０％の増加を示す（図７）。

［０１５２］これらの結果は、インスリンがＰＥＧリンカーによって免疫グロブリンＦｃと結合される場合、複合体の生体内血中半減期がＰＥＧサイズに応じて変化する可能性があることを示唆している。」

（摘記３ｊ）図７

「

［図：0001420646000001.jpg］

」

２ 引用文献４

引用文献４には、次の事項が記載されている。なお、原文は英文なので当審による和訳を示す。

（摘記４ａ） 要約

「鼻腔内活性グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）製剤は、糖尿病患者の治療において、従来の注射療法に比べて大きな利点を有するであろう。この研究の目的は、鼻腔内に投与されたＰＥＧ化エキセンジン－４（ＰＥＧ－Ｅｘ４）類似体の生物学的可能性と、鼻腔吸収に対するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の分子量（１、２、５ｋＤａ）の影響を調査することであった。最初に、ＰＥＧＥｘ４類似体は部位特異的にＬｙｓ２７アミンにＰＥＧ化され、それらの生物活性と安定性がインビトロで研究された。これらの類似体の経鼻投与後の血糖降下作用及び薬物動態を、２型糖尿病動物モデルで評価した。ＰＥＧ－Ｅｘ４類似体は、Ｅｘ４よりもラット鼻ホモジネート中の安定性が３．１－、３．８－、及び５．９－倍増加していた。しかしながら、Ｌｙｓ２７－ＰＥＧ１ｋ－Ｅｘ４は、よく保存された生物活性を有し（Ｅｘ４に対して８３．３％の効力）、他の類似体は、Ｌｙｓ２７－ＰＥＧ１ｋ－Ｅｘ４よりもはるかに低い生物活性を有することが判明した。特に、鼻腔内投与されたラットにおけるＬｙｓ２７－ＰＥＧ１ｋ－Ｅｘ４のｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態パラメータは、ＰＥＧ化により著しく改善された。Ｌｙｓ２７－ＰＥＧ１ｋ－Ｅｘ４の曲線下面積（ＡＵＣ）の値は３３．６倍高く、循環ｔ１／２の値はＥｘ４より２７．１倍高かった。しかし、他の類似体は、より高い分子量のＰＥＧ（２ｋＤａを超える）により鼻腔内吸収が制限されるため、鼻腔内経路を介して効果的に吸収されなかった。最後に、生体内での血糖降下実験により、Ｌｙｓ２７－ＰＥＧ２ｋ－、Ｌｙｓ２７－ＰＥＧ５ｋ－Ｅｘ４はＬｙｓ２７－ＰＥＧ１ｋ－Ｅｘ４よりも大幅に血糖降下効果が低いことが示されたが、これはおそらくそれらの固有の生物活性が低いことと鼻腔内吸収が原因であると思われる。まとめると、我々の調査結果は、Ｅｘ４のようなペプチドへの適切なサイズのＰＥＧ（１ｋＤａ）の部位特異的結合が、鼻腔内経路による送達に２つの利点、すなわち、安定性の増加と循環半減期の延長を提供することを示唆している。」

（摘記４ｂ） １０７６頁右欄９行～１０７７頁左欄６行

「ＰＥＧ化はＰＥＧによる化学的修飾を表しており、ペプチドの生体内での生物学的効力を改善する効果的な手段であると考えられている１６）。この技術は、タンパク質分解と腎臓のクリアランスを減少させることによってペプチドの生物学的寿命を延長することが十分に文書化されており１７，１８）、さらにＰＥＧ化は、ＰＥＧ成分の分子量を変化させることによって薬物動態プロファイルを容易に変更できるため、固有の柔軟性も提供する１９，２０）。特に、ＰＥＧの分子量を増やすとペプチドの安定性が高まるが、関与するペプチドの生物学的機能が妨げられるリスクがある。したがって、生物学的活性と安定性、薬物動態の間のバランスを達成するために、最適なＰＥＧサイズを選択することが重要である。さらに、ＰＥＧ化は、生理活性ペプチドの抗原性／免疫原性を効果的に減少させる１８）。

最近、我々は、ＰＥＧ化治療用ペプチド（ＧＬＰ－１、サケカルシトニン）の鼻腔内投与により、タンパク質分解安定性が増加し、生物学的半減期が延長され、生体内での治療効力が改善されることを実証した２１，２２）。本研究では、Ｅｘ４の経鼻送達の有効性に対するＰＥＧ化の利点を検討した。そこで、分子量（Ｍｗ）（１、２、５ｋＤａ）のＰＥＧを用いて部位特異的（Ｌｙｓ２７）ＰＥＧ化Ｅｘ４類似体を調製し、鼻のタンパク質分解安定性、２型糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスにおけるこれらの類似体のｖｉｔｒｏ生物活性、及びｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態及び血糖降下作用（図表１）を評価することで、鼻腔内経路を介した全身送達の実現可能性を調査した。」

（摘記４ｃ） １０７９頁右欄下から１７行～１０８１頁左欄５行

「ＰＥＧ－Ｅｘ４類似体の生物学的活性とタンパク質分解安定性

Ｅｘ４類似体の受容体結合親和性を、高レベルのＧＬＰ－１受容体（ＧＬＰ－１Ｒ）を発現するＲＩＮ－ｍ５Ｆ細胞中で試験し、Ｅｘ４とＬｙｓ２７－ＰＥＧ１ｋ－、Ｌｙｓ２７－ＰＥＧ２ｋ－、及びＬｙｓ２７－ＰＥＧ５ｋ－Ｅｘ４の受容体結合親和性は、それぞれ０．０５±０．０１、０．０６±０．０２、０．６３±０．１７、１．８６±０．４９ｎＭと決定された（図２Ａ）。これらのＰＥＧ－Ｅｘ４類似体は、Ｅｘ４活性をそれぞれ８３．３、７．９、及び０．２％保持していることが判明した。ＰＥＧ－Ｅｘ４類似体のタンパク質分解耐性は、高レベルの鼻ペプチダーゼを含むラットの鼻のホモジネートで観察された。未修飾のＥｘ４は急速に分解され、半減期（ｔ１／２）は３９．４±３．１分であった。しかし、ＰＥＧ－Ｅｘ４類似体は著しく耐性があり、この耐性はＰＥＧのサイズとともに増加した。ＰＥＧ－Ｅｘ４類似体（ＰＥＧ Ｍｗ：１、２、５ｋＤａ）のｔ１／２値は、それぞれＥｘ４の３．１、３．８、５．９倍であった（ｐ＜０．００１）（ｔ１／２ｓ：それぞれ１１９．２±８．６、１４７．７±１３．２、２３３．６±１９．１分）（図２Ｂ）。特に、Ｌｙｓ２７－ＰＥＧ５ｋ－Ｅｘ４は、鼻ペプチダーゼに対して非常に耐性があった。

ＰＥＧ－Ｅｘ４類似体の薬物動態

鼻腔内投与されたＥｘ４及びＰＥＧ－Ｅｘ４類似体の平均血清濃度－時間プロファイルを図３に示し、それらの薬物動態パラメータを表２に示す。Ｌｙｓ２７－ＰＥＧ１ｋ－Ｅｘ４は、最大濃度に達するのに大幅に増加した時間を要したが（３１２．４±１０．２対２０．１±６．５分）、Ｅｘ４と比較して、Ｃｍａｘの有意差は観察されなかった（１１９６．４±８９．２対１１７２．８±９２．７ｐｇ／ｍＬ）。Ｌｙｓ２７－ＰＥＧ１ｋ－Ｅｘ４の見かけの消失半減期は、Ｅｘ４のそれより２７．１倍増加し（１５４７．６±１０２．４対５７．４±８．２ｍｉｎ）、ＡＵＣは３３．６倍増加した（２９４９１４９．３±１０２８２．６対８７６６８．７±４１３．１ｐｇ・ｍｉｎ／Ｌ）。しかし、Ｌｙｓ２７－ＰＥＧ２ｋ－及びＬｙｓ２７－ＰＥＧ５ｋ－Ｅｘ４は、おそらくＰＥＧ成分のより高い分子量のため、効果的に吸収されなかった。

経鼻投与されたＰＥＧ－Ｅｘ４アナログの生体内抗糖尿病効果

Ｅｘ４、Ｌｙｓ２７－ＰＥＧ２ｋ－、Ｌｙｓ２７－ＰＥＧ５ｋ－Ｅｘ４（５ｎｍｏｌ／ｋｇ）、又はＬｙｓ２７－ＰＥＧ１ｋ－Ｅｘ４（１、５、２５ｎｍｏｌ／ｋｇ）の血糖降下作用は、２型糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスにおけるＩＰＧＴＴにより調査された。図４Ａ、Ｂは、同じ用量５ｎｍｏｌ／ｋｇで投与したＰＥＧ－Ｅｘ４類似体の血糖降下作用を示す。対照と比較して、鼻腔内投与されたＥｘ４の血糖降下作用は無視できる程度であり（ＨＧＤ＝２５．２±２．３％）、Ｌｙｓ２７－ＰＥＧ２ｋ－Ｅｘ４もＨＧＤのわずかな増加のみをもたらした（４８．２±５．７％対Ｅｘ４）．一方、Ｌｙｓ２７－ＰＥＧ１ｋ－Ｅｘ４は、ＨＧＤの大幅な増加を引き起こした（８２．７±９．２％対Ｅｘ４）。ＰＥＧのＭｗと血糖降下作用との間の逆の関係は、ＰＥＧのＭｗが高い（２ｋＤａを超える）と鼻腔内吸収が減少することを示唆している。独立した実験でも、Ｌｙｓ２７－ＰＥＧ１ｋ－Ｅｘ４が用量依存的にＨＧＤを増加させることが示された（図５Ａ、Ｂ）。」

（摘記４ｄ） １０８２頁左欄下から２１行～右欄１５行

「最後に、ＰＥＧ－Ｅｘ４類似体の薬理学的可能性を、それらを２型糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスに鼻腔内投与し、血糖降下反応を決定することによって評価した。Ｌｙｓ２７－ＰＥＧ２ｋ－Ｅｘ４及びＬｙｓ２７－ＰＥＧ５ｋ－Ｅｘ４は、Ｌｙｓ２７－ＰＥＧ１ｋ－Ｅｘ４よりも血糖降下スコアが低いことが判明し、これは固有の生物学的活性及び薬物動態特性の喪失によるものと思われる。生物学的活性に関して、Ｌｙｓ２７－ＰＥＧ２ｋ－Ｅｘ４及びＬｙｓ２７－ＰＥＧ５ｋ－Ｅｘ４は、Ｅｘ４に対して８３．３％の活性を有するＬｙｓ２７－ＰＥＧ１ｋ－Ｅｘ４よりも有意に活性が低かった（Ｅｘ４に対して７．９、０．２％）。さらに、Ｌｙｓ２７－ＰＥＧ１ｋ－Ｅｘ４は、Ｅｘ４及びＬｙｓ２７－ＰＥＧ２ｋ－Ｅｘ４と比較して、生体内血糖降下作用が３．３倍及び１．９倍増加することが判明した。さらに、Ｌｙｓ２７－ＰＥＧ１ｋ－Ｅｘ４は、用量依存的な血糖降下作用を示した。しかし、５ｎｍｏｌ／ｋｇと２５ｎｍｏｌ／ｋｇの用量では、同様の血糖降下効果が示された（８２．５％対８８．１％）。この事実は、５～２５ｎｍｏｌ／ｋｇの用量が、経鼻投与されたＬｙｓ２７－ＰＥＧ１ｋ－Ｅｘ４の飽和点であることを証明した。これらの所見は、Ｌｙｓ２７－ＰＥＧ１ｋ－Ｅｘ４が鼻腔内経路を介して生物学的可能性を持っていることを示している。まとめると、ＰＥＧ化は、鼻酵素に対する耐性とその薬物動態学的挙動を改善することにより、Ｅｘ４の生体内鼻腔内治療効果を改善した。しかし、そのような生体内での有効性のスコアは、生物活性や鼻からの吸収などの別の要因に明らかに依存しているようである。Ｅｘ４の場合、鼻腔内経路による最大の血糖降下効果の最適なバランスは、１ｋＤａのＭｗのＰＥＧのＭｗで満たされた。

ここでは、我々は、ＰＥＧ化Ｅｘ４類似体の鼻腔内送達の有効性を初めて説明した。特に、Ｌｙｓ２７－ＰＥＧ１ｋ－Ｅｘ４は、鼻腔内投与した場合、Ｅｘ４や他のＰＥＧ－Ｅｘ４類似体よりも抗糖尿病効果が顕著に増加し、より持続した。重要なのは、調査された鼻腔内投与されたＰＥＧ－Ｅｘ４類似体の抗糖尿病効果が、結合したＰＥＧの分子量が増加するにつれて減少することである。この研究は、Ｅｘ４に結合した１ｋＤａのＰＥＧがＩＩ型糖尿病を標的とした鼻吸収系の有望な治療薬候補であることを示している。」

第５ 判断

１ 引用文献３に記載された発明

引用文献３の請求項１及び２の記載（摘記３ａ）から、引用文献３には、以下の発明が記載されているといえる。

「（ｉ）ヒト野生型配列を有するインスリン部分、

（ｉｉ）サイズが約３．４ｋＤａから１０ｋＤａ未満のポリエチレングリコール部分、及び

（ｉｉｉ）免疫グロブリンＦｃ領域部分、

からなるインスリン複合体であり、

ここで、インスリン部分は、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－の構造を有するリンカー官能基を介して、Ｂ鎖のＮ末端アミノ基でポリエチレングリコール部分の一端の酸素原子に共有結合しており、

ここで、ポリエチレングリコール部分の他端の酸素原子は、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－の構造を有するリンカー官能基を介して免疫グロブリンＦｃ領域部分に共有結合しており、ポリエチレングリコール部分のサイズが約３．４ｋＤａである、

インスリン複合体。」（以下、「引用発明３」という。）

２ 対比

本願発明と引用発明３を対比する。

引用発明３の「ヒト野生型配列を有するインスリン部分」は、本願発明の「Ｘ」及び「インスリン」に相当し、引用発明３の「ポリエチレングリコール部分」は、本願発明の「Ｌ」及び「リンカー」である「ポリエチレングリコール」に相当し、引用発明３の「免疫グロブリンＦｃ領域部分」は、本願発明の「Ｆ」及び「免疫グロブリンＦｃ領域」に相当する。

そして、引用発明３の「インスリン複合体」は、上記「ヒト野生型配列を有するインスリン部分」、「ポリエチレングリコール部分」及び「免疫グロブリンＦｃ領域部分」が共有結合した化合物である限りにおいて、本願発明の「式（１）の結合体（「Ｘ－Ｌ－Ｆ （１）」）」に相当する。

そうすると、本願発明と引用発明３との一致点及び相違点は以下のとおりである。

＜一致点＞

「下記式（１）の結合体。

Ｘ－Ｌ－Ｆ （１）；

（ここで、

Ｘが、インスリンであり、

Ｌが、リンカーであって、ポリエチレングリコールであり、

Ｆが、免疫グロブリンＦｃ領域である）」

＜相違点１＞

ポリエチレングリコールについて、本願発明は、「０ｋＤａ超え～３．４ｋＤａ未満の大きさを有する」のに対し、引用発明３は「約３．４ｋＤａ」である点。

＜相違点２＞

本願発明は、式（１）の「結合体とＸ及びＦが同じであるがリンカーＬが３．４ｋＤａの大きさを有するポリエチレングリコールである他の結合体よりも、増加した生体内半減期を示」すことが特定されているのに対し、引用発明３にはそのような特定がない点。

＜相違点３＞

本願発明は、式（１）の「Ｌの両末端がそれぞれＦのアミン基またはチオール基及びＸのアミン基またはチオール基に結合している」ことが特定されているのに対し、引用発明３にはそのような特定がない点。

３ 判断

（１）相違点１及び２について

引用文献３には、ポリエチレングリコールを含む非ペプチドポリマーの分子量は、１～１００ｋＤａの範囲、特に、「１～５ｋＤａ未満」であることが記載されている（摘記３ｄ）。

そして、「ＰＥＧサイズによるＰＫプロファイルの変化を確認するため」に実施例１２の「ＰＥＧサイズに応じたＰＫプロファイル」の試験を行い、その結果、ＰＥＧの分子量が３．４Ｋのインスリン複合体の血中半減期が、１０Ｋのインスリン複合体と比較して約５０％増加したことが具体的に確認され、この結果を受けて、インスリン複合体の生体内血中半減期がＰＥＧサイズに応じて変化する可能性があると記載されている（摘記３ｉ）。この記載によれば、ポリエチレングリコールの分子量が１０Ｋよりも小さい３．４Ｋの方が、血中半減期が約５０％増加するのであるから、より分子量の小さいポリエチレングリコールを用いることで、インスリン複合体の生体内血中半減期を延長できる可能性があると当業者は理解するといえる。

さらに、インスリンと同様にペプチド医薬であるエキセンジン－４について、経鼻送達の有効性に対するＰＥＧ化の利点を調査した引用文献４には、ＰＥＧの分子量を増やすとペプチドの安定性が高まるが、関与するペプチドの生物学的機能が妨げられるリスクがあるため、生物学的活性と安定性、薬物動態の間のバランスを達成するために、最適なＰＥＧサイズを選択することが重要であることが記載されている（摘記４ｂ）。そして、ＰＥＧの分子量（１、２、５ｋＤａ）の影響を調査したところ（摘記４ａ）、ＰＥＧの分子量が１ｋＤａであるＬｙｓ２７－ＰＥＧ１ｋ－Ｅｘ４が、ＰＥＧの分子量が２ｋＤａや５ｋＤａであるＬｙｓ２７－ＰＥＧ２ｋ－Ｅｘ４やＬｙｓ２７－ＰＥＧ５ｋ－Ｅｘ４よりも活性が高かったことが記載されている（摘記４ａ、ｃ、ｄ）。そうすると、上記記載に接した当業者は、分子量が小さいポリエチレングリコールを用いることによって、ＰＥＧ修飾による活性低下を抑えることができると理解するものといえる。また、ペプチド医薬の修飾に使用されるポリエチレングリコールとして、１ｋＤａや２ｋＤａ程度の分子量のものが知られていたことも理解できる。

一方、引用発明３は、「インスリンの生体内活性を維持しながらも血中半減期を著しく延長した優れたインスリン複合体」「を提供すること」を目的としたものであるから（摘記３ｂ）、引用発明３のインスリン複合体のポリエチレングリコールについて、３．４ｋＤａよりも小さい分子量であって、引用文献４にも具体的に記載されている１ｋＤａや２ｋＤａ等の「０ｋＤａ超え～３．４ｋＤａ未満の大きさを有する」ポリエチレングリコールとすること、それにより、「結合体とＸ及びＦが同じであるがリンカーＬが３．４ｋＤａの大きさを有するポリエチレングリコールである他の結合体よりも、増加した生体内半減期を示」すものとすること、すなわち、相違点１及び２に係る構成を有する結合体とすることは当業者が容易になし得たことである。

（２）相違点３について

引用文献３にはインスリン複合体の製造方法について、各末端にアルデヒド、マレイミド、又はスクシンイミド誘導体の反応性基を有する非ペプチジルポリマー部分と、インスリン部分のアミン基又はチオール基とを共有結合して非ペプチジルポリマー部分と共有結合したインスリン部分を形成し、非ペプチジルポリマー部分のインスリンとは逆の末端に免疫グロブリンＦｃ領域部分を結合させることが記載されているから（摘記３ｇ）、引用文献３には、インスリン部分（本願発明のＸに相当）は、アミン基又はチオール基によって結合していることが記載されているといえる。そして、具体的な製造例として、インスリンと「プロピルアルデヒド基」を２つ有するＰＥＧを還元的アミノ化反応によってモノＰＥＧ化インスリンを形成し、さらにこれを、免疫グロブリンＦｃと反応させてから還元剤で処理することによって、インスリン－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ複合体を得たことも記載されている（摘記３ｈ）。ここで、モノＰＥＧ化インスリンと免疫グロブリンＦｃを連結する反応は、インスリンと「プロピルアルデヒド基」を２つ有するＰＥＧを連結した反応と同じ還元的アミノ化であるところ、還元的アミノ化はアルデヒド基とアミン基の反応によりＣ－Ｎ結合が形成される反応であり、ＰＥＧ側の反応性基が上記の２つの「プロピルアルデヒド基」のうちの一方のアルデヒド基であるので、必然的に免疫グロブリンＦｃの反応性基はアミン基であるといえる。

そうすると、引用文献３に記載された上記製造方法は、ＰＥＧの両末端に、インスリンのアミン基又はチオール基、及び、免疫グロブリンＦｃのアミン基を結合させる方法であり、この方法で製造されたインスリン複合体は、「Ｌの両末端がそれぞれＦのアミン基又はチオール基及びＸのアミン基又はチオール基に結合している」ものといえる。

したがって、引用発明３のインスリン複合体を、引用文献３に具体的に記載された製造例と同様の方法で製造し、「Ｌの両末端がそれぞれＦのアミン基又はチオール基及びＸのアミン基又はチオール基に結合している」インスリン複合体とすること、すなわち、相違点３に係る構成を有する結合体とすることは、当業者が容易になし得たことである。

（３）本願発明の効果について

ア 本願明細書には、本願発明の効果について、以下のとおり記載されている。

「【発明の効果】

【００５６】

本発明の生理活性物質の結合体は、当該生理活性が必要な分野に有用に用いることができる。

・・・

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【０２５４】

実施例６：持続型インスリン結合体のＰＥＧリンカーの長さに応じた正常ラットでの薬効持続性効果の分析

正常ラットに前記で製造した１ｋＤａ、２ｋＤａ、２．５ｋＤａ、３ｋＤａ、または３．４ｋＤａＰＥＧリンカーが結合された持続型インスリン結合体を投与して、持続型インスリン結合体のＰＥＧリンカーの長さに応じた薬効持続性の違いを確認した。

【０２５５】

・・・

【０２５６】

その結果、３．４ｋＤａＰＥＧリンカーが結合された持続型インスリン結合体の投与群に比べて１ｋＤａＰＥＧリンカーが結合された持続型インスリン結合体は、ＡＵＣが１．８４倍、２ｋＤａＰＥＧリンカーが結合された持続型インスリン結合体は１．８０倍、２．５ｋＤａＰＥＧリンカーが結合された持続型インスリン結合体は１．４１倍、そして３ｋＤａＰＥＧリンカーが結合された持続型インスリン結合体は、１．４３倍に増加したことを確認した（図６）。

【０２５７】

このような結果は、リンカーとして用いられるポリエチレングリコールの大きさが短いほど、インスリン結合体が驚くべきことに生体内で血中半減期が増加して安定的なインスリン製剤として提供することができ、糖尿病の治療剤として効果的に用いられることを示唆する。

【０２５８】

また、リンカーとして用いられるポリエチレングリコールの大きさが短いほど、これを用いた生理活性ポリペプチド結合体の生体内での血中半減期が驚くほど増加して、安定的な薬剤として提供することができることを示唆するものである。」

イ 上記アによれば、本願発明の生理活性物質の結合体は、当該生理活性が必要な分野に有用に用い得ること（【００５６】）、リンカーとして用いられるポリエチレングリコールの大きさが短いほど、インスリン結合体のＡＵＣが増加したことで、ポリエチレングリコールの大きさが短いほど、血中半減期が増加して安定的なインスリン製剤として提供でき、糖尿病の治療剤として効果的に用いられることが示唆されることが理解できる。

しかしながら、引用文献３記載のインスリン複合体は、インスリンの生体内活性を維持しながらも血中半減期を著しく延長したインスリン複合体であって、長時間作用型インスリン製剤として糖尿病の治療に効果的に使用できることが記載されている（摘記３ｂ、３ｅ、３ｆ）。そして、具体的には、ポリエチレングリコールが３．４ｋＤａであるインスリン複合体は、１０ｋＤａであるインスリン複合体と比較して血中半減期が約５０％増加したことが記載されているから（摘記３ｉ及び３ｊ）、より分子量の小さいポリエチレングリコールを用いることで、インスリン複合体の生体内血中半減期を延長できる可能性があると理解できることは、上記（１）のとおりである。また、引用文献４の記載によれば、分子量が小さいポリエチレングリコールを用いることによって、ＰＥＧ修飾による活性低下を抑えることができ、修飾に用いるポリエチレングリコールとして、１ｋＤａや２ｋＤａのものも知られていたのであるから、ポリエチレングリコールの大きさを１ｋＤａや２ｋＤａのように短くすることで、血中半減期が増加して安定的なインスリン製剤として提供でき、糖尿病の治療剤として効果的に用いられるとの効果は、引用文献３及び４の記載から予測し得る効果であるといえる。

したがって、本願発明が、引用文献３及び４の記載から予測し得ないような優れた効果を奏するものということはできない。

４ 小括

よって、本願発明は、引用文献３及び４に記載された発明に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものである。

第６ 請求人の主張について

３ 小括

よって、請求人の主張は、いずれも採用できない。

第７ むすび

以上のとおり、本願発明は、引用文献３及び４に記載された発明に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであり、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであるから、他の請求項に係る発明について検討するまでもなく、本願は拒絶されるべきものである。

よって、結論のとおり審決する。