2022-016091

特願２０１９－５５０５３５「免疫反応が弱化された結合体」拒絶査定不服審判事件〔平成３０年 ６月１４日国際公開、ＷＯ２０１８／１０５９８８、令和 １年１２月１９日特許出願公表、特表２０１９－５３６８２３〕について、次のとおり審決する。

結 論 本件審判の請求は、成り立たない。

理 由 第１ 手続の経緯 本願は、平成２９年１２月 ５日（パリ条約による優先権主張 ２０１６年１２月 ５日（ＫＲ）大韓民国）を国際出願日とする出願であって、その主な手続の経緯は以下のとおりである。 令和３年１１月 ８日付け：拒絶理由通知書 令和４年 ２月１０日 ：意見書、手続補正書の提出 令和４年 ６月 ６日付け：拒絶査定 令和４年１０月 ７日 ：審判請求書、手続補正書の提出 令和４年１１月 ２日 ：手続補正書（請求の理由）の提出 令和６年 ５月１４日付け：拒絶理由通知書 令和６年 ８月１５日 ：意見書、手続補正書の提出 第２ 本願発明 本願の請求項１に係る発明は、令和６年８月１５日付け手続補正書により補正された特許請求の範囲の請求項１に記載された事項により特定される、次のとおりのものである。 「【請求項１】 下記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する、ヒト血清由来の免疫グロブリンＧまたはそのＦｃ断片に比べて免疫反応が弱化された免疫グロブリンＦｃ断片に生理活性ポリペプチドが連結された、生理活性ポリペプチド－免疫グロブリンＦｃ断片の結合体であって： （ａ）前記結合体が、生理活性ポリペプチド単独による免疫反応に比べても弱化された免疫反応を示し； （ｂ）前記結合体が、前記免疫グロブリンＦｃ断片自体の免疫反応と相応したり、減少された程度の免疫反応を示し、 前記免疫グロブリンＦｃ断片は、非糖鎖化されたＩｇＧ４ Ｆｃ断片であり、Ｆｃガンマ受容体との結合力がヒト血清由来の免疫グロブリンＧまたはそのＦｃ断片に比べて９０％以下に減少し、前記免疫グロブリンＦｃ断片は、補体１ｑとの結合力がヒト血清由来の免疫グロブリンＧまたはそのＦｃ断片に比べて９０％以下に減少し、 前記生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンＦｃ断片が、非ペプチド性リンカーを介して連結され、 ポリエチレングリコールである非ペプチド性リンカーが生理活性ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に連結され、ポリエチレングリコールである非ペプチド性リンカーが免疫グロブリンＦｃ断片のＮ末端に連結され、 前記生理活性ポリペプチドは、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）、好中球増加因子（Ｇ－ＣＳＦ）、グルカゴン、オキシントモジュリン、インスリン、エクセンディン、イミグルセラーゼ及びこれらのアナログからなる群から選択される、前記結合体。」（以下、「本願発明」という。） 第３ 当審における拒絶の理由の概要 令和６年５月１４日付けで当審が通知した拒絶理由は、次の理由を含むものである。 本願発明は、本願の優先権主張の日（以下、「本願優先日」という。）前に日本国内又は外国において頒布された又は電気通信回線を通じて公衆に利用可能となった以下の引用文献１に記載された発明であるから、特許法第２９条第１項第３号に該当し、特許を受けることができない。 本願発明は、本願優先日前に日本国内又は外国において頒布された又は電気通信回線を通じて公衆に利用可能となった以下の引用文献１、３～６に記載された発明に基いて、その本願優先日前にその発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。 引用文献１：特表２００９－５１３１１０号公報 引用文献３：特表２０１６－５１０００３号公報 引用文献４：国際公開第２０１５／１８６９８８号 引用文献５：特表２０１６－５１１７５２号公報 引用文献６：特開２０１５－１４６８０５号公報 第４ 当審の判断 １ 引用文献の記載事項 （１）引用文献１（特表２００９－５１３１１０号公報） 引用文献１には、以下の事項が記載されている。下線は、当審にて付したものである（以下、同様である）。 ア 発明の名称 「開始メチオニン残基が除去された免疫グロブリンＦｃ領域の大量生産方法」 イ 特許請求の範囲 「【請求項１】 ペプチド結合を介して免疫グロブリンヒンジ領域のＮ末端に連結された免疫グロブリンヒンジ領域を含む組み換え免疫グロブリンＦｃ領域をコードする核酸配列を含む組み換え発現ベクターを製造する段階と、 前記組み換え発現ベクターで原核細胞を形質転換して形質転換体を製造する段階と、 前記形質転換体を培養し、前記免疫グロブリンＦｃ領域を凝集体形態で発現させる段階と、 前記免疫グロブリンＦｃ領域を分離精製する段階とを含む、開始メチオニン残基が除去された免疫グロブリンＦｃ領域を大量生産する方法。 ・・・ 【請求項８】 前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、およびこれらの組み合わせおよびハイブリッドよりなる群から選ばれるＩｇＧのＦｃ領域である、請求項７に記載の方法。 ・・・ 【請求項１２】 前記原核細胞が大腸菌である、請求項１に記載の方法。」 ウ 背景技術 「【０００２】 遺伝工学技術の発展に伴い、多種のタンパク質医薬品が製造されて用いられている。ところが、タンパク質医薬品の場合、容易に変性し或いは生体内プロテアーゼなどによって容易に分解して生体内濃度および力価を長らく持続させることができないという致命的な欠点を持っている。したがって、タンパク質の安定性を増加させてタンパク質医薬品の血中、生体内濃度を適正の水準に維持させることは、効果的な治療だけでなく、頻繁に注射などによりタンパク質の供給を受けるべき患者の不便軽減および経済的な側面でも非常に重要な問題である。 したがって、タンパク質医薬品の生体内安定性を増加させるために、タンパク質の剤形を変化させるか、他のタンパク質を融合させるか、或いはタンパク質の表面に適当な高分子を化学的または生物学的方法で付着させるなどの多様な方法が長い前から試みられてきた。 他のタンパク質との融合によってタンパク質の安定性を増加させるための試みの一つが、免疫グロブリンＦｃとタンパク質との融合である。 ・・・ ところが、前記Ｆｃとの融合タンパク質は、目的タンパク質の血中半減期が増加するが、これと同時に、Ｆｃ領域の持っているエフェクター機能が発揮されるという問題点がある（米国特許第５，３４９，０５３号）。Ｆｃ領域のエフェクター機能によって補体を固定させ、或いはＦｃγＲｓを発現する細胞に結合して特定の細胞を破壊させ、炎症を誘発する様々なサイトカインの生成および分泌を誘導することにより、所望しない炎症を誘発させる。また、融合部位のタンパク質配列は、人体に存在しない新規のタンパク質配列なので、長期投与の際に免疫反応誘発可能性もあるなどいろいろの欠点を持っている。 そこで、長い血中半減期を維持するがエフェクター機能の欠失された免疫グロブリン、或いは免疫グロブリン断片を利用しようとする研究が行われてきた。・・・ ・・・ かかる点を改善するために、本発明者らは、従来の組み換え方法による融合ではなく、Ｆｃ領域およびタンパク質医薬品を各最上の発現システムで個別のポリペプチドに製造した後、共有結合させてＦｃを薬物のキャリアとして使用したことがある。この場合、糖化されたポリペプチド薬物と非糖化されたＦｃの結合体を製造することができるので、不適切な免疫反応は除去され、これと同時に生理学的薬物活性、生体的持続性および安定性は全て充足させる。 前記の場合、Ｆｃは非糖化された形態が好ましいので、大腸菌などの原核細胞発現システムを利用するようにする。大腸菌の発現体系を利用する生産方法は、既存の動物細胞を用いた方法に比べて様々な利点があるが、大腸菌は発現ベクターの製作が容易であって発現有無を速く検証することができ、成長速度が非常に速いため低いコストで大量生産することができ、比較的単純な発現方法を適用することができるから、商業的利用の側面でも他の宿主細胞を用いることより有用である。 大腸菌においてＦｃ領域を過発現させる場合、Ｆｃ領域は大部分、凝集体形態で発現される。Ｆｃ領域を産業的に利用するために、水溶性状態で発現されるＦｃ領域を利用しようとする試みがあった。・・・ このような背景の下に、本発明者らは、糖鎖が除去されて免疫反応誘発のおそれがない活性型の免疫グロブリンＦｃ領域を産業化可能な、より改善された収率で大量に生産する方法を探そうと努力したところ、特定のヒンジ領域を免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に連結させて発現させると、凝集体形態で発現された免疫グロブリンＦｃ領域が、水溶化およびリフォールディング過程によって開始メチオニン残基の除去された二量体または単量体形態の免疫グロブリンＦｃ領域として生産されることを確認し、メチオニン開始コドンが除去された免疫グロブリンＦｃ領域を大量に生産する本発明を完成した。」（第３頁第１８行～第５頁第３６行） エ 発明を実施するための最良の形態 「前記方法によって大腸菌などの原核細胞で生産された免疫グロブリンＦｃ領域の産業的適用は特に限定されない。一つの例示的適用は、任意の薬物との結合体形成のためのキャリアとして使用することである。免疫グロブリンＦｃ領域と薬物とが結合した結合体の形態は特に限定されない。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域と薬物とは多様な割合で結合可能であり、リンカーなどによって結合が媒介されることも可能である。 薬物はポリペプチド、化合物、抽出物、核酸などを含むが、好ましくはポリペプチド（タンパク質と同等な用語で使用）薬物である。リンカーは、ペプチド性リカーまたは非ペプチド性リンカーを全て含むが、好ましくは非ペプチド性リンカーであり、より好ましくは非ペプチド性重合体である。免疫グロブリン重鎖領域の好適な例はＦｃである。 本発明の方法で製造された免疫グロブリンＦｃ領域と結合して使用できる生理活性ポリペプチドとしては、血中半減期を増加させる必要があるものであればいずれも特別な制限なく使用することができる。例えば、ヒトの疾病を治療または予防する目的で使用されるサイトカイン、インターロイキン、インターロイキン結合タンパク質、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質または受容体、細胞表面抗原、受容体拮抗物質などの多様な生理活性ポリペプチド、これらの誘導体または類似体を例示することができる。 具体的に、生理活性ポリペプチドは、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類とインターフェロン受容体類（例えば：インターフェロン－α、βおよびγ、水溶性タイプIインターフェロン受容体など）、コロニー刺激因子、インターロイキン類（例えば：インターロイキン－１、－２、－３、－４、－５、－６、－７、－８、－９、－１０、－１１、－１２、－１３、－１４、－１５、－１６、－１７、－１８、－１９、－２０、－２１、－２２、－２３、－２４、－２５、－２６、－２７、－２８、－２９、－３０等）とインターロイキン受容体類（例えば：ＩＬ－１受容体、ＩＬ－４受容体など）、酵素類（例えば：グルコセレブロシダーゼ(glucocerebrosidase)、イズロネート－２－スルファターゼ(iduronate-2-sulfatase)、α－ガラクトシダーゼ－Ａ、アガルシダーゼα、β、α－Ｌ－イズロニダーゼ(alpha-L-iduronidase)、ブチリルコリンエステラーゼ(butyrylcholinesterase)、キチナーゼ(chitinase)、グルタミン酸デカルボキシラーゼ(glutamate decarboxylase)、イミグルセラーゼ(imiglucerase)、リパーゼ(lipase)、ウリカーゼ(uricase)、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ(platelet-activating factor acetylhydrolase)、中性エンドペプチダーゼ(neutral endopeptidase)、ミエロペルオキシダーゼ(myeloperoxidase)、インターロイキンおよびサイトカイン結合タンパク質類（例えば：ＩＬ－１８ｂｐ、ＴＮＦ－結合タンパク質など）、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞怪死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍怪死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、α－１アンチトリプシン、アルブミン、α－ラクトアルブミン、アポリポタンパク質－Ｅ、赤血球生成因子、高糖化赤血球生成因子、アンジオポイエチン類、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液因子VII、血液因子VIIａ、血液因子VIII、血液因子IX、血液因子XIII、プラズミノゲン活性因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン(hirudin)、タンパク質Ｃ、Ｃ－反応性タンパク質、レニン抑制剤、コラゲナーゼ抑制剤、スーパオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンジオスタチン、アンジオテンシン、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、インスリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路抑制剤(tissue factor pathway inhibitor)、濾胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子類（例えば、神経成長因子、毛様体神経栄養因子(cilliary neurotrophic factor)、アキソジェネシス因子－１(axogenesis factor-1)、脳ナトリウム利尿ペプチド(brain-natriuretic peptide)、神経膠由来神経栄養因子(glial derived neurotrophic factor)、ネトリン(netrin)、中性球抑制因子(neurophil inhibitor factor)、神経栄養因子、ニュートリン(neuturin)など）、副甲状腺ホルモン、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インシュリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、自己毒素(autotaxin)、ラクトフェリン(lactoferrin)、ミオスタチン(myostatin)、受容体類（例えば：ＴＮＦＲ（Ｐ７５）、ＴＮＦＲ（Ｐ５５）、ＩＬ－１受容体、ＶＥＧＦ受容体、Ｂ細胞活性因子受容体など）、受容体拮抗物質（例えばＩＬ１－Ｒａなど）、細胞表面抗原（例えば、ＣＤ２、３、４、５、７、１１ａ、１１ｂ、１８、１９、２０、２３、２５、３３、３８、４０、４５、６９など）、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片類（例えば：ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｄ）、ウィルス由来ワクチン抗原などを例示することができるが、これに限定されるものではない。・・・本発明の具体的な実施では、形質転換体ＨＭ１１２０１から生産された免疫グロブリンＦｃ領域をポリエチレングリコールを用いてヒト赤血球生成促進因子（Erythropoietin；ＥＰＯ）に結合させてＥＰＯ－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ領域タンパク質結合体を製造し、前記タンパク質結合体が、天然型ＥＰＯ、および増加した血中半減期を示す２世代ＥＰＯとして知られているアラネスプ(Aranesp)（Ａｍｇｅｎ社）より優れた血中半減期を示すことを確認した。したがって、本発明によってヒンジ領域を用いて凝集体から生成された開始メチオニン残基の除去された免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫反応を誘発する危険性なしで生理活性ポリペプチドの血中半減期を増加させ、生理活性を改善させるのに有用に使用できることが分かる。」（第１０頁下から第１段落～第１２頁第１段落） オ 実施例 「＜実施例１＞ヒト免疫グロブリンＩｇＧ４ Ｆｃ領域発現ベクターの製作、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域の発現および精製、並びにＮ末端配列の確認 ・・・ ＜１－１＞ＩｇＧ４ Ｆｃ領域発現ベクターの製作 ＩｇＧ４のヒンジ領域を含む重鎖Ｆｃ領域をクローニングするために、ヒトの血液から収得した血球細胞のＲＮＡを鋳型として次のようにＲＴ－ＰＣＲを行った。・・・ ・・・ それぞれ製作された発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させて大腸菌形質転換体ＢＬ２１／ｐｍＳＣＰＦｃ（ＨＭ１１２００）、ＢＬ２１／ｐｍＰＳＣＦｃ（ＨＭ１１２０１）、ＢＬ２１／ｐｍＣＰＳＦｃ（ＨＭ１１２０４）およびＢＬ２１／ｐｍＣＰＦｃ（ＨＭ１１２０５）を製造し・・・ ＜１－２＞ＩｇＧ４Ｆｃ領域の発現および精製 前記実施例＜１－１＞で収得した微生物形質転換体を発酵器（Ｍａｒｕｂｉｓｈｉ社）に接種して発酵させた後、免疫グロブリンＦｃ領域断片の発現有無を確認した。・・・ ・・・ ＜１－３＞Ｎ末端配列の確認 前記実施例で凝集体をリフォールドして二量体形態で発現されるＦｃは、開始コドンであるメチオニンが付加されているため、天然型とは異なる配列を持つ。このようなメチオニン残基が大腸菌プロテアーゼによってプロセスされるかを確認するために、基礎科学支援研究所のソウル分所に前記タンパク質のＮ末端配列分析を依頼した。・・・」 「＜実施例４＞活性酵素免疫測定によるＣｌｑ結合能の確認 前記実施例＜１－２＞で大腸菌形質転換体から発現されて精製された免疫グロブリンＦｃ領域タンパク質がヒトＣｌｑと結合するか否かを確認するために、下記のように活性酵素免疫測定分析法（ＥＬＩＳＡ）を行った。・・・ ・・・ 図２に示すように、本発明によって大腸菌で生産した免疫グロブリンＦｃ領域タンパク質は、糖があるものに比べて著しく低下したＣｌｑに対する結合能を示すため、生理活性ポリペプチドとの結合タンパク質形成の際にキャリアとして使用されて人体に投与される場合にも、細胞毒性や炎症などの免疫反応を誘発する危険性が非常に低いことが分かる。」 「＜実施例５＞活性酵素免疫測定によるヒトＦｃγＲI、ＦｃγＲIII、ＦｃＲｎαβ２との結合能の確認 免疫グロブリンＦｃは、生体内血液細胞の受容体であるＦｃγＲI、ＦｃγＲIIIと結合して抗体依存的細胞毒性のようなエフェクター機能を行うものと知られている。大腸菌で生産した免疫グロブリンＦｃもこのようなエフェクター機能を引き起こすかを調べるために、各受容体を収得した後、活性酵素免疫測定法を行ってその結合能を確認した。・・・ ・・・ ＜５－４＞ＦｃγＲIII結合能の確認 実施例＜１－２＞で精製されたＨＭ１１２００とＨＭ１１２０１産物、そして対照群として糖鎖のあるヒト由来ｓｅｒｕｍＩｇＧとｓｅｒｕｍＩｇＧをパパイン処理して分離したＦｃをそれぞれ９μｇ／ｍＬの濃度で炭酸塩緩衝溶液（ｐＨ９．０）で希釈した後、さらに炭酸塩緩衝溶液で１／３ずつ７段階希釈して９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ，Ｍａｘｉｓｏｒｐ）にウェル当り１００μＬずつ分注して４℃の冷蔵状態で１８時間反応させてウェルの底部に結合するようにした。・・・ ・・・図４から分かるように、大腸菌で生産したＦｃはＦｃγＲIIIとほぼ結合せず、糖鎖のあるヒト由来ＩｇＧとＦｃの場合は強く結合することが分かる。」 「＜実施例６＞ヒト赤血球生成促進因子結合体の製造および薬物動力学 ・・・ ＜６－２＞ヒト赤血球生成因子－ＰＥＧ連結体の製造 両側末端にアルデヒド反応基を持つ分子量３．４ｋＤａのポリエチレングリコールＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ社）を、前記で生産されたＥＰＯが５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解している１００ｍＭリン酸塩緩衝液に、ＥＰＯ：ＰＥＧのモル比が１：１、１：２．５、１：５、１：１０および１：２０となるように添加した。ここに還元剤としてのナトリウムシアノボロヒドリド（ＮａＣＮＢＨ３、Ｓｉｇｍａ社）を最終濃度が２０ｍＭとなるように添加し、４℃で徐々に攪拌しながら２時間反応させた。ＥＰＯのアミノ末端部位に選択的にＰＥＧが連結され、ＰＥＧとインターフェロンαが１：１で結合した連結体を得るために、前記反応混合物をもってスーパーデキス（ＳｕｐｅｒｄｅｘＲ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）サイズ排除クロマトグラフィーを行った。溶出液として１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用いてＥＰＯ－ＰＥＧ連結体を精製し、ＰＥＧに結合していないＥＰＯ、未反応ＰＥＧ、および２つのＥＰＯがＰＥＧと連結された二量体副産物を除去した。精製されたＥＰＯ－ＰＥＧ連結体を５ｍｇ／ｍＬの濃度で濃縮した。これから反応性が最も良く、二量体などの副産物が少ないＥＰＯ：ＰＥＧの最適反応モル比は１：２．５～１：５であることを確認した。 ＜６－３＞ヒト赤血球生成因子－ＰＥＧ連結体と組み換え免疫グロブリンＦｃ領域の結合体の製造 前記実施例＜６－２＞で製造したＥＰＯ－ＰＥＧ連結体と、実施例＜１－３＞でＨＭ１１２０１形質転換体で生産した免疫グロブリンＦｃ領域とを結合させた。具体的に、実施例＜１－３＞で準備された免疫グロブリンＦｃ領域断片（約５３ｋＤａ）を１０ｍＭリン酸塩緩衝液に溶解させた後、ＥＰＯ－ＰＥＧ連結体：Ｆｃ領域断片のモル比がそれぞれ１：１、１：２、１：４および１：８となるようにＥＰＯ－ＰＥＧ連結体と混合して反応させた。反応液を１００ｍＭリン酸塩緩衝溶液状態に作り、還元剤としてＮａＣＮＢＨ３を最終濃度が２０ｍＭとなるように添加した後、４℃で２０時間徐々に攪拌しながら反応させた。これから反応性が最も良く、二量体などの副産物が少ないＥＰＯ－ＰＥＧ連結体：Ｆｃ領域断片の最適反応モル比は１：２であることを確認した。 結合反応の後、未反応物質および副産物を除去し、生成されたＥＰＯ－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ領域タンパク質結合体を精製するために、高圧液体クロマトグラフィーを行った。カップリング反応液を脱塩カラムＨｉＰｒｅｐ２６／１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で交換した後、Ｑ ＨＰ ２６／１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）５０ｍＬに８ｍＬ／分の流速で負荷して結合させた後、直線濃度勾配（塩化ナトリウム濃度０Ｍ→０．２Ｍ）方法で所望の分画を得た。溶出された分画を、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）で平衡化されたｐｏｌｙＣＡＴ２１．５×２５０カラム（ｐｏｌｙＬＣ社）に１５ｍＬ／分の流速で再び結合させた後、直線濃度勾配（塩化ナトリウム濃度０．１Ｍ→０．３Ｍ）方法で溶出して高純度の分画を得ることができた。」 カ 図面 「【図２】ヒト免疫グロブリンＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＣ１ｑとの結合能を確認した結果である。 ［図：0001422779000001.jpg］ 」 「【図４】ヒト免疫グロブリンＩｇＧ Ｆｃ領域のＦｃγＲIIIとの結合能を確認した結果である。 ［図：0001422779000002.jpg］ 」 （２）引用文献３（特表２０１６－５１０００３号公報） 引用文献３には、以下の事項が記載されている。 ア 発明の名称 「新規なインスリンアナログ及びその用途」 イ 発明の概要 「【００１３】 本発明の非天然型のインスリンアナログは、天然型に比べてインスリン力価が減少しただけなく、インスリン受容体に対する結合力減少により生体内除去メカニズムを回避して生体内血中半減期が延長したインスリンアナログを提供するだけでなく、それを用いたインスリンアナログ－免疫グロブリンＦｃ結合体は血中半減期を大幅に延長させることにより、インスリン投与を必要とする患者の利便性を向上させることができる。」 ウ 発明を実施するための形態 「【００４５】 ヒト由来のＦｃ領域を微生物から得られた組換え免疫グロブリンＦｃ領域であることが好ましい。 また、免疫グロブリンＦｃ領域は、天然糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖、又は糖鎖が除去された形態であってもよい。このような免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増減又は除去には、化学的方法、酵素学的方法及び微生物を用いた遺伝工学的方法などの通常の方法が用いられる。ここで、Ｆｃから糖鎖が除去された免疫グロブリンＦｃ領域は、補体（ｃ１ｑ）の結合力が著しく低下し、抗体依存性細胞毒性又は補体依存性細胞毒性が低減又は除去されるので、生体内で不要な免疫反応を誘発しない。このような点から、薬物のキャリアとして本発明の目的に適する形態は、糖鎖が除去されるか、非グリコシル化された免疫グロブリンＦｃ領域であると言えるであろう。」 エ 実施例 「【００９４】 ・・・ 実施例８：インスリンアナログ（７番）－免疫グロブリンＦｃ結合体の作製 インスリンアナログβ鎖のＮ末端を３．４Ｋ ＡＬＤ２ ＰＥＧ（ＮＯＦ，日本）でペグ化するために、インスリンアナログ：ＰＥＧのモル比を１：４とし、インスリンアナログ濃度を５ｍｇ／ｍｌとして４℃で約２時間反応させた。ここで、反応はｐＨ６．０の５０ｍＭクエン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ）、４５％イソプロパノールで行われ、３．０ｍＭの濃度のシアノ水素化ホウ素ナトリウム還元剤を添加して反応させた。反応液はクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）、４５％エタノールが含まれる緩衝液とＫＣｌ濃度勾配を用いたＳＰ－ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，米国）カラムを用いて精製した。 【００９５】 インスリンアナログ－免疫グロブリンＦｃフラグメント結合体を作製するために、上で精製されたモノペグ化された（ｍｏｎｏ－ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）インスリンアナログと免疫グロブリンＦｃフラグメントのモル比が１：１～１：２になるようにし、総タンパク質濃度を約２０ｍｇ／ｍｌとして２５℃で１３時間反応させた。ここで、反応緩衝液条件は１００ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．２であり、還元剤として２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。こうすることにより、ＦｃフラグメントのＮ末端にＰＥＧが結合した。 【００９６】 反応終了後、Ｑ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，米国）カラムにおいて、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液とＮａＣｌ濃度勾配を用いて、反応液から反応していない免疫グロブリンＦｃフラグメント、モノペグ化されたインスリンアナログを分離精製した。 【００９７】 その後、Ｓｏｕｒｃｅ １５ＩＳＯ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，米国）を２次カラムとして用いて、残留している免疫グロブリンＦｃフラグメント及びインスリンアナログが免疫グロブリンＦｃフラグメントに２つ以上結合された結合体を除去し、インスリンアナログ－免疫グロブリンＦｃフラグメント結合体を得た。ここで、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）が含まれる硫酸アンモニウムの濃度勾配を用いて溶出し、溶出したインスリンアナログ－免疫グロブリンＦｃ結合体は、タンパク質電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，図４）及び高圧クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて分析した（図５）。その結果、約９９％の純度に精製されたことが確認された。」 （３）引用文献４（国際公開第２０１５／１８６９８８号） 引用文献４には、以下の事項が記載されている。なお、引用文献４は、英文で記載されているところ、以下の日本語訳による摘示は、引用文献４のパテントファミリーである特表２０１７－５２１３８１号公報の記載に基づくものであり、その段落番号も便宜上そのまま記載した。 ア 発明の名称 「タンパク質及びペプチドの免疫原性を減少させる方法」 イ 発明を実施するための形態 「【００２８】 本発明は、生理活性タンパク質またはペプチドの非末端内部残基にキャリアを結合させる工程を含む、キャリアが結合されていない生理活性タンパク質またはペプチドに比べて生理活性タンパク質またはペプチドの免疫原性を減少させる方法に関する。 【００２９】 本発明において本発明者らは、生理活性タンパク質またはペプチドの末端より内部残基に非ペプチジルリンカーとＦｃ断片を結合して、目的タンパク質またはペプチドが抗原として作用しメカニズムを阻害することにより、生理活性タンパク質またはペプチドの免疫原性を低下させる方法を開発した。本発明者らは、このような方法を使用する場合、ペプチドのＮ末端などの他の位置に修飾して結合体を製造することに比べて、 Ｔ細胞の活性化及び動物における抗体の生成反応を顕著に抑制することを確認した。その結果、本発明者らは、既存のタンパク質医薬製剤として使用された生理活性タンパク質またはペプチド結合体を生理活性タンパク質またはペプチドの免疫原性減少用組成物、または方法として新たな用途で使用することができることを発見した。」 ウ 実施例 「【０１１９】 ＜実施例２＞：ＣＡエキセンディン－４リジン残基のペグ化（Ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）と位置異性体分離 ３．４Ｋ ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤ（２）ＰＥＧをＣＡエキセンディン－４（米国のAmerican Peptides）のリジン（Ｌｙｓ）残基にペグ化させるため、３ｍｇ／ｍｌ濃度のＣＡエキセンディン－４とＰＥＧとのモル比を１：３０にして、４℃で３時間反応させた。ＣＡエキセンディン－４は、天然型エキセンディンのＮ－末端ヒスチジン残基でアルファ炭素が削除され、側鎖のβ－炭素が直接カルボキシル炭素に結合したＮ－末端変形エキセンディン－４である。」 「【０１２８】 ＜実施例５＞：ＥｐｉＳｃｒｅｅｎTMエクス・ビボ（ex vivo）T細胞増殖試験 代表的な生理活性タンパク質またはペプチドであるインスリン分泌ペプチドのペグ化位置に応じた免疫原性抑制メカニズムを確認するために、非結合天然型エキセンディン－４、非結合ＣＡエキセンディン－４、ＣＡエキセンディン－４のリジン残基にペグ化された連結体ペプチド（ＣＡエキセンディン－４－ＰＥＧ（ｉｎｔｅｒ））及び天然型エキセンディン－４のＮ－末端にペグ化された連結体ペプチド（エキセンディン－４－ＰＥＧ（Ｎ－ｔｅｒｍ））のＴ細胞増殖能を比較した。この時、ＣＡエキセンディン－４はペグ化することができるＮ－末端残基を有していないため、ＣＡエキセンディン－４に対してはＮ－末端ペグ化連結体を製造していなかった。 【０１２９】 Ｔ細胞の増殖試験のために、前記ドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を解凍して細胞数と生存率を測定した。細胞は、ＡＩＭ－Ｖ培地で４－６ｘ１０６細胞／ｍｌになるように希釈した。各ドナー細胞を２４ウェル培養プレートに分注した後、試験試料を最終濃度５０μｇ／ｍｌになるように添加した（ｎ＝３）。各ドナー細胞に対する再現性の確認のために抗原ペプチドＫＬＨ処理群を準備して置いた。すべての試験群と対照群は、３７℃、５％ＣＯ2の条件の培養器で８日間培養した。５、６、７、８日目にそれぞれ細胞の一部を取って、９６ウェルの培養プレートに移して細胞増殖率を測定した。細胞増殖率の測定のためにウェル当り０．７５μｉ［3Ｈ］－Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（Perkin Elmer Buckinghamshire、UK）を添加して１８時間培養した後、ＴｏｍＴｅｃ Ｍａｃｈ ＩＩＩ細胞回収器を利用して９６ウェルのフィルタープレートに細胞を回収した。各ウェルの放射線活性度（cpm、count per minute）は１４５０ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｗａｌｌａｃ Ｔｒｉｌｕｘ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Perkin Elmer Buckinghamshire、UK）を用いて測定した。その結果、刺激指標（SI、stimulation index）の実験的閾値に基づいて２以上（ＳＩ≧２、ｐ＜０．０５）の場合を陽性（Ｐ）と判定した。ＳＩ≧１．９に該当する境界値を含む場合には、別途表示（Ｐ＊）した。その結果、ＣＡエキセンディン－４及びエキセンディン－４に対してそれぞれ１２％及び１０％のドナーから陽性反応を確認した。しかし、前記ペプチドの内部残基にペグ化されたＣＡエキセンディン－４は、すべてのドナーから陰性と確認された。一方、Ｎ－末端にペグ化されたエキセンディン－４は、６％のドナーで陽性を示した。・・・ ・・・ 【０１３１】 表３は、Ｔ細胞の増殖反応強度及び頻度（ＳＩ≧１．９境界値を含む）を示す。 【０１３２】 【表３】 ［図：0001422779000003.jpg］ 【０１３３】 上記のような結果は、生理活性タンパク質またはペプチドの末端ではなく、内部残基に非ペプチド性ポリマー、特にPEGを連結した連結体の免疫原性が阻害されることを示唆するものである。」 「【０１３４】 ＜実施例６＞：ＥｐｉＳｃｒｅｅｎTMエクス・ビボ（ex vivo）インターロイキン－２（ＩＬ－２）分泌試験 代表的な生理活性タンパク質またはペプチドであるインスリン分泌ペプチドのペグ化位置に応じた免疫原性抑制メカニズムを確認するために、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎTMＴ細胞の増殖アッセイでの同じ試料及びドナー細胞を用いて、実施例５のペグ化されたエキセンディン－４及び非結合エキセンディン－４に対してインターロイキン－２分泌能を比較測定した。抗インターロイキン－２抗体（R＆D Systems、Abingdon、UK）はＥＬＩＳｐｏｔプレート（Millipore、Herts、UK）に結合させた。前記プレートをＰＢＳ（phosphate-buffered saline）で３回洗浄した後、１％の牛血清アルブミンが補充されたＰＢＳを添加して反応させた。ＡＩＭ－Ｖ培養培地で洗浄した後、ＡＩＭ－Ｖ培養培地で希釈（４－６ｘ１０６細胞／ｍｌ）したドナー細胞を１００μｌ／ウェルずつ分注した。最終濃度が５０μｇ／ｍｌになるように試験試料を５０μｌずつ添加した（ｎ＝６）。８日間培養した後、ＥＬＩＳｐｏｔプレートにビオチン標識されたインターロイキン－２検出抗体とストレプトアビジン－ＡＰ（R＆D Systems、Abingdon、UK）を順次的に結合させた後、スポットを表現するためにＢＣＩＰ／ＮＢＴ（（R＆D Systems、Abingdon、UK）をプレートに添加した。蒸留水で洗浄して前記反応を終了させた後、プレートを乾燥させた。Ｉｍｍｕｎｏｓｃａｎ Ａｎａｌｙｓｅｒを使用し、ウェル当り生成されたスポット（spw、spots per well）をスキャンして分析した。前記エクス・ビボ（ex vivo）Ｔ細胞活性度の測定試験の結果は、刺激指標（SI、stimulation index）の実験的閾値に基づいて、２以上（ＳＩ≧２、ｐ＜０．０５）の場合を陽性（Ｅ）と判定した。ＳＩ≧１．９に該当する境界値を含む場合には、別途表示（Ｅ＊）した。その結果、ＣＡエキセンディン－４及びエキセンディン－４に対してそれぞれ１２％及び１６％のドナーからの陽性反応が確認された。しかし、ペプチド内部残基にペグ化されたＣＡエキセンディン－４は、ドナーから２％のみであった。一方、Ｎ－末端にペグ化されたエキセンディン－４は、６％のドナーで陽性を示した。即ち、Ｎ－末端よりペプチドの内部リジン残基にペグ化された場合、前記ペプチドの免疫原性は顕著に阻害された（表２～４）。表４は、Ｔ細胞のインターロイキン－２の分泌反応の強度及び頻度（ＳＩ≧１．９境界値を含む）を示す。 【０１３５】 【表４】 ［図：0001422779000004.jpg］ 【０１３６】 上記のような結果は、生理活性タンパク質またはペプチドの末端ではなく、内部残基に非ペプチド性ポリマー、特にＰＥＧを連結した連結体の免疫原性が阻害されることを示唆するものである。」 （４）引用文献５（特表２０１６－５１１７５２号公報） 引用文献５には、以下の事項が記載されている。 ア 発明の名称 「代謝障害の処置における組成物及び使用方法」 イ 発明の概要 「【０００９】 概要 本開示は、様々な疾患、障害、及び状態、ならびに／またはそれらの症状を処置する、及び／または予防するための、本明細書に記載される薬剤及びその組成物の使用を想定する。いくつかの実施形態では、疾患、障害、及び状態、ならびに／またはそれらの症状は、グルコース代謝障害及び他の代謝関連障害に関し、一方、他の実施形態では、それらは体重障害に関する。例として、薬剤及びその組成物は、真性糖尿病（例えば、２型糖尿病）、インスリン抵抗性、ならびにインスリン抵抗性を特徴とする疾患、障害、及び状態、インスリン産生の減少、高血糖、低インスリン血症、ならびに代謝症候群の処置及び／または予防に使用され得るが、これらに限定されない。薬剤及びその組成物は、例えば、食欲抑制をもたらすことにより、肥満及び他の体重障害の処置及び／または予防にも使用され得る。 ・・・ 【００１９】 本開示のいくつかの実施形態では、ポリペプチドに対する修飾は、ペグ化、グリコシル化、ポリシアル酸化、ＨＥＳ化、アルブミン融合、共役脂肪酸鎖を介したアルブミン結合、Ｆｃ融合、またはＰＥＧ模倣体との融合を含む。」 ウ 発明を実施するための形態 「【０１３７】 ペグ化：タンパク質治療薬の臨床的効果は、短い血漿半減期及びプロテアーゼ分解を受けやすいことにより制限されることが多い。様々な治療用タンパク質（例えば、フィルグラスチム）の研究は、そのような困難が、様々な非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンのいずれかにポリペプチド配列をコンジュゲートする、または連結する（例えば、典型的には、タンパク質と非タンパク質性ポリマー、例えば、ＰＥＧの両方に共有結合する連結部分を介して）ことを含む、様々な修飾により克服され得ることを示した。そのようなＰＥＧコンジュゲート生体分子は、良好な物理的及び熱的安定性、酵素分解への感受性に対する保護、溶解度の増加、より長いインビボ循環半減期、及びクリアランスの減少、免疫原性及び抗原性の減少、ならびに毒性の減少を含む、臨床的に有用な性質を保有することを示した。」 （５）引用文献６（特開２０１５－１４６８０５号公報） 引用文献６には、以下の事項が記載されている。 ア 発明の名称 「アミノ酸変異が導入されたＩｇＧ２を有する抗体」 イ 発明を実施するための形態 「【００２０】 本発明は、アゴニスト活性を示す、ＩｇＧ２－ＡＡＳである重鎖定常領域を有するヒトＣＤ４０に結合するモノクローナル抗体に関する。 ・・・ 【００４４】 ・・・ 本発明のモノクローナル抗体は、ＣＤ４０に結合するモノクローナル抗体に放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、抗体などの蛋白質などを化学的あるいは遺伝子工学的に結合させた抗体の誘導体を包含する。 ・・・ 【００５０】 高分子の薬剤としては、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと表記する）、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、またはヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどがあげられる。これらの高分子化合物を抗体に結合させることにより、（１）化学的、物理的あるいは生物的な種々の因子に対する安定性の向上、（２）血中半減期の顕著な延長、（３）免疫原性の消失または抗体産生の抑制、などの効果が期待される［バイオコンジュゲート医薬品，廣川書店（１９９３）］。例えば、ＰＥＧと抗体を結合させる方法としては、ＰＥＧ化修飾試薬と反応させる方法などがあげられる［バイオコンジュゲート医薬品，廣川書店（１９９３）］。ＰＥＧ化修飾試薬としては、リジンのε－アミノ基への修飾剤（日本国特開昭６１－１７８９２６号公報）、アスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシル基への修飾剤（日本国特開昭５６－２３５８７号公報）、またはアルギニンのグアニジノ基への修飾剤（日本国特開平２－１１７９２０号公報）などがあげられる。」 ２ 判断 （１）引用発明の認定 引用文献１には、免疫グロブリンＦｃとタンパク質との融合によってタンパク質の安定性を増加させることが知られているが、Ｆｃ領域の持つエフェクター機能が発揮されるという問題点があり、大腸菌などの原核細胞発現システムで得られる非糖化されたＦｃをタンパク質と結合させることにより、不適切な免疫反応は除去され、これと同時に安定性等が充足されること、このような背景の下、糖鎖が除去されて免疫反応誘発のおそれがない活性型の免疫グロブリンＦｃ領域を大量に生産する方法として、特定のヒンジ領域をＦｃ領域のＮ末端に連結させ、開始メチオニン残基の除去されたＦｃ領域を大量に生産する発明を完成したことが記載されている（前記１（１）ウ）。 上記のとおりに作製したＦｃ領域の適用として、Ｆｃ領域を生理活性ポリペプチド等の薬物とリンカーを介して結合させること、この際の生理活性ポリペプチドとして、コロニー刺激因子、グルカゴン、インスリン、イミグルセラーゼ等が挙げられること、本発明の具体的な実施では、ＥＰＯ－ＰＥＧ－Ｆｃ領域タンパク質結合体を製造して、当該結合体が優れた血中半減期を示すことを確認したことも記載されている（前記１（１）エ）。 そして、上記の非糖化されたＦｃとして、具体的には、ＩｇＧ４のヒンジ領域を含むＦｃ領域を大腸菌で発現、精製させて、そのＮ末端配列を確認したこと（前記１（１）オ、実施例１、＜１－２＞、＜１－３＞）とともに、実施例＜１－２＞で精製されたＦｃ領域、すなわち当該ＩｇＧ４のヒンジ領域を含むＦｃ領域に対するＣ１ｑの結合能が、糖を有するＦｃ領域に比べて著しく低下したこと（前記１（１）オ、実施例４）、同じく実施例＜１－２＞で精製されたＦｃ領域、すなわち当該ＩｇＧ４のヒンジ領域を含むＦｃ領域はＦｃγＲＩＩＩとほぼ結合せず、糖鎖のあるヒト由来ＩｇＧとＦｃの場合は強く結合すること（前記１（１）オ、実施例５、＜５－４＞）が記載されている。 さらに、上記ＥＰＯ－ＰＥＧ－Ｆｃ領域タンパク質結合体の具体的な製造方法として、両側末端にアルデヒド反応基を持つＰＥＧを用い、ＥＰＯのＮ末端部位にＰＥＧが連結されたＥＰＯ－ＰＥＧ連結体を製造した後（前記１（１）オ、実施例６、＜６－２＞）、当該連結体に実施例＜１－３＞で生産したＦｃ領域、すなわちＩｇＧ４のヒンジ領域を含むＦｃ領域を結合させるために、ＥＰＯ－ＰＥＧ連結体：Ｆｃ領域断片のモル比を最適な１：２として、反応液は１００ｍＭリン酸塩緩衝溶液、還元剤として２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を用い、４℃で２０時間徐々に撹拌という条件で反応させて、ＥＰＯ－ＰＥＧ連結体とＦｃ領域の結合体を製造したこと（前記１（１）オ、実施例６、＜６－３＞）が記載されている。 以上のとおり、引用文献１の実施例には、大腸菌で発現されたＩｇＧ４のＦｃ領域であって、糖鎖のあるヒト由来ＩｇＧのＦｃに比べてＣ１ｑ、ＦｃγＲＩＩＩとの結合が著しく低下したものが開示され、ＥＰＯのＮ末端部位にＰＥＧが連結してなるＥＰＯ－ＰＥＧ－Ｆｃ結合体が具体的に開示されているのだから、引用文献１には、次のとおりの発明が記載されている。 「大腸菌で発現され、糖鎖のあるヒト由来ＩｇＧのＦｃに比べてＣ１ｑ、ＦｃγＲＩＩＩとの結合が著しく低下した、ＩｇＧ４のＦｃ領域に、ＰＥＧでＥＰＯを結合した結合体であって、当該ＥＰＯのＮ末端に連結された、前記結合体。」（以下、引用発明という。） （２）対比 本願発明と引用発明とを対比する。 引用文献１における、「Ｆｃは非糖化された形態が好ましいので、大腸菌などの原核細胞発現システムを利用するようにする」（前記１（１）ウ）、「本発明によって大腸菌で生産した免疫グロブリンＦｃ領域タンパク質は、糖があるものに比べて著しく低下したＣｌｑに対する結合能を示すため・・・細胞毒性や炎症などの免疫反応を誘発する危険性が非常に低い」（前記１（１）オ、実施例４）との記載、大腸菌で発現したＩｇＧ４のＦｃと糖鎖を有するＩｇＧのＦｃとを比較してＣ１ｑ又はＦｃγＲＩＩＩとの結合能を示す具体的なデータ（前記１（１）カ）を参酌すると、引用発明における「大腸菌で発現され、糖鎖のあるヒト由来ＩｇＧのＦｃに比べてＣ１ｑ、ＦｃγＲＩＩＩとの結合が著しく低下した、ＩｇＧ４のＦｃ領域」は、糖鎖のあるヒトＩｇＧのＦｃに比べて免疫反応が弱化されたものと認められ、本願発明における「ヒト血清由来の免疫グロブリンまたはそのＦｃ断片に比べて免疫反応が弱化された免疫グロブリンＦｃ断片」、及び「非糖鎖化されたＩｇＧ４ Ｆｃ断片であり、Ｆｃガンマ受容体との結合力がヒト血清由来の免疫グロブリンＧまたはそのＦｃ断片に比べて９０％以下に減少し、前記免疫グロブリンＦｃ断片は、補体１ｑとの結合力がヒト血清由来の免疫グロブリンＧまたはそのＦｃ断片に比べて９０％以下に減少し」た免疫グロブリンＦｃ断片に相当する。 また、引用発明における「ＩｇＧ４のＦｃ領域に、ＰＥＧでＥＰＯを結合した結合体であって、当該ＥＰＯのＮ末端に連結された、前記結合体」は、本願発明における「免疫グロブリンＦｃ断片に生理活性ポリペプチドが連結された、生理活性ポリペプチド－免疫グロブリンＦｃ断片の結合体であって」「前記生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンＦｃ断片が、非ペプチド性リンカーを介して連結され、」「ポリエチレングリコールである非ペプチド性リンカーが生理活性ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に連結され」た結合体に相当する。 そうすると、両者の一致点及び一応の相違点は、以下のとおりである。 ＜一致点＞ ヒト血清由来の免疫グロブリンＧまたはそのＦｃ断片に比べて免疫反応が弱化された免疫グロブリンＦｃ断片に生理活性ポリペプチドが連結された、生理活性ポリペプチド－免疫グロブリンＦｃ断片の結合体であって： 前記免疫グロブリンＦｃ断片は、非糖鎖化されたＩｇＧ４ Ｆｃ断片であり、Ｆｃガンマ受容体との結合力がヒト血清由来の免疫グロブリンＧまたはそのＦｃ断片に比べて９０％以下に減少し、前記免疫グロブリンＦｃ断片は、補体１ｑとの結合力がヒト血清由来の免疫グロブリンＧまたはそのＦｃ断片に比べて９０％以下に減少し、 前記生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンＦｃ断片が、非ペプチド性リンカーを介して連結され、 ポリエチレングリコールである非ペプチド性リンカーが生理活性ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に連結される、前記結合体。 ＜一応の相違点１＞ 生理活性ポリペプチド－免疫グロブリンＦｃ断片の結合体の性質について、本願発明では「（ａ）前記結合体が、生理活性ポリペプチド単独による免疫反応に比べても弱化された 免疫反応を示し；（ｂ）前記結合体が、前記免疫グロブリンＦｃ断片自体の免疫反応と相応したり、減少された程度の免疫反応を示し」と特定されるのに対し、引用発明では当該特定がない点。 ＜一応の相違点２＞ 生理活性ポリペプチド－免疫グロブリンＦｃ断片の結合体の構造について、本願発明では、「前記生理活性ポリペプチドは、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）、好中球増加因子（Ｇ－ＣＳＦ）、グルカゴン、オキシントモジュリン、インスリン、エクセンディン、イミグルセラーゼ及びこれらのアナログからなる群から選択され」、「ポリエチレングリコールである非ペプチド性リンカーが免疫グロブリンＦｃ断片のＮ末端に連結され」るのに対し、引用発明では、生理活性ポリペプチドがＥＰＯであり、ポリエチレングリコールがＦｃのどの位置に連結されているか明記されていない点。 （３）一応の相違点についての判断 まず、前記（２）で示した、結合体の性質に係る一応の相違点１について、以下に検討する。 生理活性ポリペプチドに対してＰＥＧを付加することにより、本願明細書の実施例５で使われているＴ細胞増殖試験、ＩＬ－２分泌試験といったアッセイで測定される免疫反応が抑制されることは、本願優先日前に一般的に知られていた事項である。 例えば、引用文献１と同一出願人である引用文献４には、生理活性タンパク質の免疫原性を減少させる方法として、同タンパク質の末端より内部末端に非ペプチジルリンカーとＦｃ断片を結合することが記載され（前記１（３）イ）、具体的には、インスリン分泌ペプチドのペグ化位置に応じた免疫原性抑制メカニズムを確認するために、（１）非結合天然型エキセンディン－４、（２）非結合ＣＡエキセンディン－４、（３）ＣＡエキセンディン－４のリジン残基にペグ化された連結体ペプチド（ＣＡエキセンディン－４－ＰＥＧ（ｉｎｔｅｒ））、及び（４）天然型エキセンディン－４のＮ－末端にペグ化された連結体ペプチド（エキセンディン－４－ＰＥＧ（Ｎ－ｔｅｒｍ））を準備し、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎTM エクス・ビボ（ex vivo）Ｔ細胞増殖試験、及びＥｐｉＳｃｒｅｅｎTM エクス・ビボ（ex vivo）インターロイキン－２（ＩＬ－２）分泌試験を行い、ＰＥＧを結合しない（１）及び（２）に比べて、ＰＥＧを結合した（３）及び（４）が、Ｔ細胞増殖及びＩＬ－２分泌という点で、免疫反応が抑制され、その効果は、ＰＥＧをＮ末端に結合した（４）に比べてＰＥＧを内部末端に結合した（３）が高かったことが示されている（前記１（３）ウ、実施例５、６）。ここで、引用発明と比較して一応の相違点１と認定した、本願発明の「（ａ）前記結合体が、生理活性ポリペプチド単独による免疫反応に比べても弱化された 免疫反応を示し；（ｂ）前記結合体が、前記免疫グロブリンＦｃ断片自体の免疫反応と相応したり、減少された程度の免疫反応を示し」という性質は、本願明細書の「実験例５：ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ分析を介した免疫原性の確認」（【０１５６】～【０１６２】）で開示される、Ｔ細胞の増殖頻度とＩＬ－２の分泌度を確認する試験に基づく結果に対応するものといえ、本願明細書における当該試験は、その名称と内容から、引用文献４に記載される上記のＥｐｉＳｃｒｅｅｎTM エクス・ビボ（ex vivo）Ｔ細胞増殖試験、及びＥｐｉＳｃｒｅｅｎTM エクス・ビボ（ex vivo）インターロイキン－２（ＩＬ－２）分泌試験と同等のものと認められる。 さらに、引用文献５には、様々な疾患、症状を処置、予防するための薬剤、組成物の使用において（前記１（４）イ）、タンパク質治療薬をＰＥＧ化することにより、良好な物理的及び熱的安定性、免疫原性及び抗原性の減少等の臨床的に有用な性質が得られること（前記１（４）ウ）、引用文献６には、高分子の薬剤等を結合させたモノクローナル抗体の誘導体について（前記１（５）イ、【００２０】、【００４４】）、高分子の薬剤としてＰＥＧ等が挙げられ、高分子の薬剤を抗体に結合させることにより、安定性の向上とともに、免疫原性の消失又は抗体産生の抑制等の効果が期待させること（前記１（５）イ、【００５０】）が記載されている。 このとおり、生理活性ポリペプチドに対してＰＥＧを付加することにより、免疫反応が抑制されることは、本願優先日前に一般的に知られていた事項であって、引用発明の結合体は、生理活性ポリペプチドに対して、免疫反応を抑制させる性質を有するＰＥＧをリンカーとして、免疫反応誘発のおそれがない免疫グロブリンＦｃ領域を連結させたものであるから、当該生理活性ポリペプチド単独による免疫反応に比べて弱化された免疫反応を示し、さらに当該免疫グロブリンＦｃ領域自体の免疫と相応する、又は減少された程度の免疫反応を示す蓋然性が極めて高いと認められる。 したがって、上記一応の相違点１は、実質的な相違点とは認められない。 次に、前記（２）で示した、結合体の構造に係る一応の相違点２について、以下に検討する。 引用文献１には、ＥＰＯ－ＰＥＧ－Ｆｃ結合体を製造する方法として、両側末端にアルデヒド反応基を持つＰＥＧを用い、ＥＰＯのＮ末端部位にＰＥＧが連結されたＥＰＯ－ＰＥＧ連結体を製造した後、Ｆｃ領域を結合させたこと、その反応条件は、ＥＰＯ－ＰＥＧ連結体：Ｆｃ領域断片のモル比を１：２とし、１００ｍＭリン酸塩緩衝溶液、還元剤として２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を反応液とし、４℃で２０時間徐々に撹拌したことが記載されており（前記１（１）オ、実施例６、＜６－２＞、＜６－３＞）、ここで、ＮａＣＮＢＨ３の存在下でアルデヒド基とアミノ基が反応して結合することは文献を挙げるまでもなく一般的に知られた事項であるところ、上記記載から、ＰＥＧの末端にあるアルデヒド反応基がＦｃのアミノ基に対して結合したことを把握でき、ＦｃのＮ末端の露出しているアミノ基にＰＥＧが結合した結合体が得られているものと認められる。 この点は、引用文献１と出願人が同一の引用文献３において、インスリンアナログ－Ｆｃ結合体の具体的な製造方法として、、引用文献１に記載された上記の反応条件と同等の反応条件（前記１（２）エ、【００９４】～【００９５】）によって、ＦｃのＮ末端にＰＥＧを結合させたことが明記されていることからも明らかである。 また、引用文献１には、結合体に用いる生理活性ポリペプチドとして、ＥＰＯ以外に、コロニー刺激因子、イミグルセラーゼ、インスリン、グルカゴン等の種々のポリペプチドが例示されるとともに、これらに限定されるものではないと記載されており（前記１（１）エ）、引用発明において、ＥＰＯを公知の種々のポリペプチドに変更することは、当業者が適宜なし得た設計事項にすぎない。 そうすると、上記一応の相違点２は、実質的な相違点とは認められない。 仮に上記一応の相違点１、２が実質的な相違点であるとしても、いずれも軽微な相違点にすぎず、本願発明は、引用文献１、３～６の記載に基づいて、当業者が容易になし得た範囲のものである。 （４）請求人の主張について 請求人は、令和６年８月１５日提出の意見書において、新規性及び進歩性に関して、以下の点を主張している。 ア 引用文献４には、生理活性ペプチドの非末端内部残基にＰＥＧを連結して免疫原性を低下させることによる顕著な効果を示すことが示唆されている一方、本願発明においては、ＰＥＧは、生理活性ペプチドの末端に結合し、ＰＥＧの他端が免疫グロブリンＦｃ断片に結合していることを特徴としており、引用文献４に記載の技術とは異なる。 イ 本願発明における、（ａ）結合体が、生理活性ポリペプチド単独による免疫反応に比べても弱化された免疫反応を示し、（ｂ）結合体が、前記免疫グロブリンＦｃ断片自体の免疫反応と相応したり、減少された程度の免疫反応を示す、という技術的特徴は、非糖鎖化されたＩｇＧ４ Ｆｃ断片のＮ末端と生理活性ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端にＰＥＧを連結して結合体を形成することにより達成されるが、どの引用文献にも、これらの技術的特徴は記載されていない。 上記主張アについて、引用文献４の実施例５、６（前記１（３）ウ）には、生理活性ペプチドの末端残基にＰＥＧを連結させる場合も、免疫原性が低下することが具体的に記載されているから、前記（３）に述べたとおり、引用発明の結合体は、本願発明の（ａ）及び（ｂ）の性質を有するものと合理的に認められる。 上記主張イでは、当該性質について、「非糖鎖化されたＩｇＧ４ Ｆｃ断片のＮ末端と生理活性ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端にＰＥＧを連結して結合体を形成することにより達成される」と述べられているところ、引用発明の結合体は、ＰＥＧが生理活性ポリペプチドのＮ末端に連結され、さらに当該ＰＥＧが、糖鎖が除去されたＩｇＧ由来のＦｃ領域のＮ末端に連結されたものであるから、引用発明の結合体は、自ずと本願発明の（ａ）及び（ｂ）の性質を有するものとなり、これは、前記（３）の判断と整合する。 （５）小括 前記（１）～（４）の次第であるから、本願発明は、引用文献３、４～６を参考文献とした上で、引用文献１に記載された発明であり、また、引用文献１、３～６に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものである。 第５ むすび 以上のとおり、本願発明は、特許法第２９条第１項第３号の規定により特許を受けることができず、また、同法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであるから、その余について検討するまでもなく、本願は拒絶すべきものである。 よって、結論のとおり審決する。