2022-003553

１ 引用文献の記載事項

(１)引用文献１

当審の拒絶理由で引用した特表２０１７－５０３５１０号公報（以下「引用文献１」という。）には、以下の事項が記載されている。（下線は当審で付与した。以下も同様。）

ア 特許請求の範囲

「【請求項１】

ヒトＣＤ１６の抗体Ｆｃ結合親和性よりも高い抗体Ｆｃ結合親和性を有するエクトドメイン、膜貫通ドメイン、ならびにＡＤＣＣ活性化および増幅を媒介するためのエンドドメインを含む膜貫通キメラレセプターをコードする遺伝子構築物。」

「【請求項１１】

配列番号１、３、５、７、および９からなる群より選択されるＤＮＡ配列を含む、請求項１に記載の遺伝子構築物。」

「【請求項２０】

請求項１～１１に記載の遺伝子構築物もしくは請求項１２～２０のタンパク質で、エキソビボで、感染させたかもしくはトランスフェクトされた、免疫エフェクター細胞。

【請求項２１】

細胞傷害性Ｔリンパ球を含む、請求項２１に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項２２】

ナチュラルキラー細胞を含む、請求項２１に記載の免疫エフェクター細胞。」

イ 課題を解決するための手段

「【００１２】

（発明の簡単な要旨）

本発明により新たなアプローチがもたらされ、がん、感染および他の疾患に対する免疫系の防御が改善される。合成生物学および組換え技術のツールを使用して、本発明は、がんを含む多くの種類の疾患に対するＡＤＣＣ応答の有効性を大いに改善するＡＤＣＣエンハンサーもしくは増強システムを設計および構築することを目的とする。」

「【００１６】

よって、一実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ１６のＦ１５８改変体の抗体Ｆｃ結合親和性よりも高い抗体Ｆｃ結合親和性を有するエクトドメイン、膜貫通ドメイン、ならびにＡＤＣＣ活性化および増幅を媒介するためのエンドドメインを含む膜貫通キメラレセプターをコードする遺伝子構築物を提供する。

【００１７】

本発明の遺伝子構築物は、ＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子を含み得る。上記構築物は、（例えば、ヒトの）ＣＤ６４の実質的にＥＣ３エキソン、もしくはさらに（ヒト）ＣＤ６４の実質的にＥＣ１およびＥＣ２エキソンを含み得る。あるいは、本発明の遺伝子構築物は、実質的にＣＤ６４のエクトドメインを含むエクトドメインへと翻訳されるＲＮＡを含む。ある特徴において、上記エクトドメインは、ＣＤ６４中のエキソンもしくはドメインの境界に基づいて選択される。好ましくは、上記エクトドメインは、ヒトＣＤ１６のＶ１５８改変体よりも高いＦｃ親和性を有する。別の特徴において、上記膜貫通キメラレセプターは、融合タンパク質として発現される。また、上記エンドドメインは、ＣＤ３ζの、ＣＤ２８の、ＣＤ１３４の、ＣＤ１３７の、ＣＤ２７の、ＣＤ７９ａの、ＣＤ７９ｂの、ＣＤ４０の、およびＧＭ－ＣＳＦレセプターの細胞内ドメインの一部もしくはすべてからなる群より選択され得る増幅モジュールを含み得る。」

「【００１９】

別の実施形態において、本発明は、本発明の遺伝子構築物もしくはタンパク質をエキソビボで感染させたかもしくはトランスフェクトした免疫エフェクター細胞を提供する。上記免疫エフェクター細胞は、例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞、好酸球、マクロファージ、好中球

、好塩基球、単球、Ｂ細胞、および細胞傷害性因子を発現するかもしくは発現するように操作されている他の細胞であり得る。

【００２０】

さらに別の実施形態において、本発明は、本発明の遺伝子構築物、タンパク質、もしくは免疫エフェクター細胞、および薬学的に受容可能な賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。」

ウ 図面の簡単な説明

「【００３６】

【図１４】図１４は、ヒトＣＤ６４の細胞外領域が、エキソンベースのストラテジーを使用してヒトＣＤ１６の領域へと融合され、図１３に示される増幅モジュールへとさらに融合される、本発明の実施形態に従うキメラレセプターへと翻訳されるＤＮＡ配列（配列番号９）（上）を収載する。その対応するタンパク質配列（配列番号１０）は、下に収載する。スペーサー配列および変異配列は、小文字で書かれる。」

エ 発明を実施するための形態

「【００４５】

（１）（ａ）エクトドメイン

図１を参照すると、一実施形態（左側）において、本発明のキメラレセプターは、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）のエクトドメインの一部もしくは全てを組み込む。・・・図２に示されるように、ＦｃγＲＩは、細胞外ドメインが抗体への結合を担う３つの免疫グロブリンドメインから構成される糖タンパク質α鎖を含み、３つ全ての存在が抗体との高親和性相互作用に重要であることが示された。対照的に、ＣＤ１６のエクトドメインは、２個の免疫グロブリン様ドメインを有するのみである。・・・

【００４６】

本発明の実施形態によれば、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）のエクトドメインは、ＡＤＣＣを媒介する高親和性Ｆｃレセプターを生成するために、任意の適切な膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインへと融合される。好ましい実施形態において、ヒトＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）のエクトドメインは、ヒトＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）の一部、例えば、ＣＤ１６の、好ましくは、ＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）の、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインの両方に融合される。」

「【００４８】

（１）（ｂ）膜貫通ドメイン

本発明のキメラレセプターの膜貫通ドメインは、（好ましくは安定した様式で）細胞膜にまたがり得る任意の適切な疎水性領域であり得る。好ましい実施形態において、上記膜貫通ドメインは、上記細胞内ドメインのその隣接する成分に対して天然である。例えば、図１に示されるように、膜に最も近い細胞内ドメインの成分もしくは領域がＣＤ１６に由来する実施形態において、上記膜貫通ドメインは、好ましくは、ＣＤ１６の膜貫通ドメインである。

【００４９】

（１）（ｃ）エンドドメイン

（１）（ｃ）（ｉ）ＡＤＣＣのシグナル伝達

再び図１を参照すると、本発明の種々の実施形態において、上記キメラレセプターは、ＡＤＣＣに関する１もしくはそれより多くのシグナル伝達モジュールを含む。ＣＤ１６は、我々の身体においてＡＤＣＣ活性の大部分を担うエフェクター細胞（特にＮＫ細胞）を活性化する天然の抗体レセプターである。よって、種々の実施形態において、本発明のキメラレセプターのエンドドメインは、ＣＤ１６（好ましくは、ＣＤ１６ａ）の細胞内ドメインの一部もしくは全体を含む。ＣＤ１６ａと類似のＩＴＡＭドメインを共有する、ＣＤ３ζのような他のモジュールもまた、ＡＤＣＣシグナル伝達に寄与するように含まれ得る。」

オ 実施例

「【００７０】

本発明の実施形態に従って、上記キメラＡＤＣＣ増強レセプターのエクトドメインを、２つの方法で生成した：

・・・

【００７２】

続きを表示（全17行）

（ｂ）エキソンベースの融合体： ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩにおけるエキソン境界に基づいて、ヒトＦｃγＲＩの推定されるエクトドメインを、ヒトＦｃγＲＩＩＩの膜貫通領域および細胞内領域に融合した。図３に示されるように、両方のタンパク質は、分泌ペプチドをコードする２個のエキソン（Ｓ１およびＳ２）、続いて、細胞外領域をコードする３個のエキソン（ＣＤ６４）もしくは２個のエキソン（ＣＤ１６）を有する。具体的には、ＣＤ６４のＳ１からＥＣ３までのエキソンを、ＣＤ１６におけるＴＭ／Ｃエキソンと融合した。融合レセプターにおいて得られた領域のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号３および４）を、図１１に示す。

・・・

【００７４】

ここで図４を参照すると、ヒトＣＤ６４のエクトドメインを、ヒトＣＤ１６の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインへといったん融合した後、それらをさらに、種々のヒトタンパク質において見出される種々の増幅モジュール（具体的には、ＣＤ２８（ａ．ａ． １６２～２０２）、ＣＤ１３４（ａ．ａ． ２１３～２４９）、ＣＤ１３７（ａ．ａ． １８７～２３２）およびＣＤ３ζ（ａ．ａ． ３１～１４２）（全てのアミノ酸位置は、成熟タンパク質配列に基づく））に融合した。変異を、以下のとおりアスタリスクによって印を付けたとおりに配列の中に導入した：市販のＣＤ１６ ｃＤＮＡは、復帰した多型を有する。さらに、表面発現を下方調節することが公知の

ＣＤ２８中のジロイシンモチーフを変異させた。各モジュールを、２個のスペーサーアミノ酸を導入した－ＧＧＡＴＣＴ－配列によって分離した。上記融合レセプターにおいて得られた領域のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号５および６）を、図１２に示す。ＣＤ６４、ＣＤ１６および上記の４個の増幅モジュール（配列番号７～１０）に由来する領域を伴う融合体／キメラレセプター全体のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、図１３（ドメイン融合体）および図１４（エキソンベースの融合体）に示す。ヒトＣＤ１６の「高親和性」変異体（Ｖ１５８）を、コントロールとして使用した。

【００７５】

次いで、上記キメラレセプターを、代理マーカーあり（例えば、図５に示されるｐＳＭＰＵＷ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ）もしくは代理マーカーなし（例えば、図６に示されるｐＳＭＰＵＷ－ｐｕｒｏ）のいずれかで、市販のレンチウイルスベクターへとクローニングした。・・・

【００７７】

（２）細胞発現

【００７８】

レンチウイルスベクター（ｐＳＭＰＵＷ）を、２９３Ｔ細胞もしくはＥｘｐｉ２９３細胞においてトランスフェクトして、フローサイトメトリーによって上記のキメラレセプターの発現を試験した。・・・

【００８０】

ドメイン融合ストラテジーを使用して作製した上記ＣＤ６４－ＣＤ１６キメラレセプターは、上記エキソンベースの融合を使用して作製したものより遙かに弱い発現（データは示さず）を示した。」

カ 図

「【図１４】

64-16E-M4G DNA

（略）

64-16E-M4Gタンパク質(588a.a.)

MWFLTTLLLWVPVDGQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEETVTLHCEVLHLPGSSSTQWFLNGTATQTSTPSYRITSASVNDSGEYRCQRGLSGRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPLALRCHAWKDKLVYNVLYYRNGKAFKFFHWNSNLTILKTNISHNGTYHCSGMGKHRYTSAGISVTVKELFPAPVLNASVTSPLLEGNLVTLSCETKLLLQRPGLQLYFSFYMGSKTLRGRNTSSEYQILTARREDSGLYWCEAATEDGNVLKRSPELELQVLGLAVSTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDKGSRSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSGSRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIGSRFSVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR」

(２)引用文献２

当審の拒絶理由で引用した国際公開第２０１５／１４８９２６号（以下「引用文献２」という。）には、以下の事項が記載されている。引用文献２は英文であるので、対応する特表２０１７－５１１１３５号公報の対応箇所の記載を翻訳文として示す。

「【００２２】初代ＮＫ細胞によってＣＤ１６ａシェディングに対するＳ１９７Ｐ突然変異の効果を確立するために、我々は、ヒトｉＰＳＣｓを使用して、遺伝子操作したＮＫ細胞を作出した。我々は以前に、ｉＰＳＣｓからの機能的ＮＫ細胞の誘導、及び末梢血ＮＫ細胞とそれらの類似性について報告した（Knorr et al., 2013 Stem Cells Transl Med. 2:274-283; Ni et al, 2014, Stem Cells 32: 1021-1031）。ｉＰＳＣ細胞における遺伝子挿入と安定発現のためにＣＤ１６ａ及びＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐ ｃＤＮＡをSleeping Beautyトランスポゾンプラスミド内にクローニングし、続いて、それを成熟ＮＫ細胞に分化させた。

【００２３】モック形質導入ｉＰＳＣ細胞から得られたＮＫ細胞は、低レベルの内因性ＣＤ１６ａを発現する一方で、形質導入したＣＤ１６ａ及びＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐはより高いレベルで発現された（図４Ｆ）。ＮＫ細胞の活性化は、ＢＹ５５／ＣＤ１６０を含めたＫ５６２細胞とそれらの相互作用によって様々な受容体を通して起こり、ＡＤＡＭ１７活性化及びＣＤ１６ａシェディングをもたらした。我々は、Ｋ５６２細胞でｉＰＳＣ誘導ＮＫ細胞を刺激して、ＣＤ１６ａが細胞表面発現の顕著な下方調整を受けた一方で、ＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐの発現は安定した状態を保ったことを見出した（図４Ｆ）。」（引用文献２の８頁２７行目～９頁８行目）

(３)引用文献３

当審の拒絶理由で引用した国際公開第２０１６／１２３３３３号（以下「引用文献３」という。）には、以下の事項が記載されている。引用文献３は英文であるので、対応する特表２０１８－５０５１７４号公報の対応箇所の記載を翻訳文として示す。

「【００２５】いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＮＫ特異的キメラ抗原受容体をｉＰＳＣで発現させることができ、次に、これをＮＫ細胞に分化させることができる。ｉＰＳＣは、Ｋｎｏｒｒら、２０１３、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２（４）：２７４－２８３、又はＮｉら、２０１４、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３２（４）：１０２１－１０３１に記載されるように分化され得る。図１１は、ＣＤ４５＋ＣＤ５６＋細胞の産生により示されるように、誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）による例示的なＮＫ ＣＡＲの発現を示す（上段、第５パネル）。図１２は、ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞によるＣＡＲ表面発現を示す。図１２の下３行は、ＣＡＲを発現していないＰＢ－ＮＫ細胞及びｉＰＳＣ－ＮＫ細胞（未修飾対照細胞、第４欄、４行目及び５行目）と比較して、ｉＰＳＣ－ＣＡＲ４ｖ２（第４欄、下３行）の表面にのみＣＡＲ発現を示す。図１１及び図１２の他のパネルは、ｉＰＳＣ－ＣＡＲ４ｖ２上の他の典型的なＮＫ細胞表面抗原／受容体が未修飾の対照細胞上に見られるものと類似していることを示す。これらの結果は、ｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞が、図９及び図１０のメソテリン標的化ＣＡＲ発現ＮＫ細胞と同じ標的特異的細胞殺傷性を示し得ることを指示する。

【００２６】ＮＫ ＣＡＲ構築物をコードするポリヌクレオチドは、従来のトランスフェクション法を用いてＮＫ細胞又はｉＰＳＣに導入することができる。したがって、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドがＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンシステムを用いて細胞にトランスフェクトされる例示的な実施形態の文脈において本明細書に開示されているが、ＮＫ細胞（及び／又はｉＰＳＣ）は、任意の適切なトランスフェクション方法を用いて修飾され得る。」（引用文献３の７頁２３行目～８頁４行目）

２ 引用発明の認定

上記１(１)ア～イ、エ～オ（特に、上記１(１)アの請求項１、１１、２０）から、引用文献１には、「ヒトＣＤ１６の抗体Ｆｃ結合親和性よりも高い抗体Ｆｃ結合親和性を有するエクトドメイン、膜貫通ドメイン、ならびにＡＤＣＣ活性化および増幅を媒介するためのエンドドメインを含む膜貫通キメラレセプターをコードする遺伝子構築物であって、配列番号９のＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物でトランスフェクトされた細胞。」が記載されている。

ここで、上記１(１)ウには、引用文献１の図１４に、上記配列番号９のＤＮＡ配列、及び、配列番号９のＤＮＡがコードする配列番号１０のタンパク質のアミノ酸配列が掲載されていることが記載され、上記１(１)オの【００７４】には、「図１４（エキソンベースの融合体）」について、「ＣＤ６４、ＣＤ１６および上記の４個の増幅モジュール（配列番号７～１０）に由来する領域を伴う融合体／キメラレセプター全体のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列」が示されていること、及び、「ヒトＣＤ６４のエクトドメインを、ヒトＣＤ１６の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインへといったん融合した後、それらをさらに、種々のヒトタンパク質において見出される種々の増幅モジュール（具体的には、ＣＤ２８（ａ．ａ．１６２～２０２）、ＣＤ１３４（ａ．ａ． ２１３～２４９）、ＣＤ１３７（ａ．ａ． １８７～２３２）およびＣＤ３ζ（ａ．ａ． ３１～１４２）（全てのアミノ酸位置は、成熟タンパク質配列に基づく））に融合した」ものであることが記載されている。

そうすると、上記配列番号９のＤＮＡがコードする配列番号１０のタンパク質は、「ヒトＣＤ６４のエクトドメイン」に「ヒトＣＤ１６の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン」と「ＣＤ２８」、「ＣＤ１３４」、「ＣＤ１３７」および「ＣＤ３ζ」の「４個の増幅モジュールに由来する領域」が融合された「融合体／キメラレセプター（エキソンベースの融合体）」であると認められる。

以上から、引用文献１には、

「ヒトＣＤ１６の抗体Ｆｃ結合親和性よりも高い抗体Ｆｃ結合親和性を有するエクトドメイン、膜貫通ドメイン、ならびにＡＤＣＣ活性化および増幅を媒介するためのエンドドメインを含む膜貫通キメラレセプターであって、ヒトＣＤ６４のエクトドメインに、ヒトＣＤ１６の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインと、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ３ζの４個の増幅モジュールに由来する領域が融合された、エキソンベースの融合体／キメラレセプター、をコードするＤＮＡを含む遺伝子構築物でトランスフェクトされた細胞。」（以下「引用発明」という。）が記載されている。

審判請求人は、令和５年１０月５日提出の意見書において、Ｔｈｅｍｅｌｉ－１～Ｔｈｅｍｅｌｉ－３なる文献の記載を引用し、「上記の引用は、ＮＫ細胞よりもむしろＴ細胞の分化に関連するものですが、それにもかかわらず、それらはｉＰＳＣ分化を指向する際に認識される課題、および分化前よりもむしろ分化後に細胞を修飾する一般的な方向性を示しています。したがって、たとえ当業者がＮＫ細胞の誘導のためにｉＰＳＣを使用したとしても(これは、実際には、引用文献１において開示も示唆もされていない)、当業者は、このアプローチの認識された予測不可能性のために、分化の前にｉＰＳＣを改変することを容易に想到することはありませんでした。」と主張する。

しかし、審判請求人が挙げる上記文献の記載は、いずれもＴ細胞の分化に関連するものであり、ＮＫ細胞へ分化させることを前提とする本願発明との関連は密接でないし、具体的な記載内容を検討しても、引用文献１～３の開示に基づいて分化の前にｉＰＳＣを改変することを妨げるほどの事情があるとは解せない。

審判請求人は、上記意見において、ＮＫ－９２－ＣＤ６４／１６Ａ細胞の図１５Ｄに示される結果とｉＮＫ－ＣＤ６４／１６Ａ細胞について図１７に示される結果との対比から、ｉＰＳＣに由来するＮＫ細胞が、治療用ｍＡｂの存在下でより大きな細胞傷害活性増加を示すという、特定の有利な活性を示す旨も主張するが、本願発明は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であり、当該細胞は、それを分化して得られるｉＮＫ細胞ではないから、審判請求人主張する上記の活性を本願発明が奏する効果として参酌する理由はない。

また、仮に、審判請求人主張する上記の活性について検討しても、当該活性は、ｉＮＫ細胞のソースとして用いるｉＰＳＣが有していた性質や、ｉＰＳＣからｉＮＫ細胞への分化条件等に依存して種々に変わり得るものであるから、これを本願発明の全体が奏する効果として参酌することはできない。

以上から、審判請求人の主張はいずれも採用することができない。