2020-006220

本願は、平成２６年１２月１２日（パリ条約による優先権主張 ２０１３年１２月１２日 米国、パリ条約による優先権主張 ２０１４年４月１６日 米国、パリ条約による優先権主張 ２０１４年７月８日 米国、パリ条約による優先権主張 ２０１４年７月８日 米国、パリ条約による優先権主張 ２０１４年７月８日 米国、パリ条約による優先権主張 ２０１４年７月８日 米国、パリ条約による優先権主張 ２０１４年７月８日 米国、パリ条約による優先権主張 ２０１４年７月８日 米国、パリ条約による優先権主張 ２０１４年７月８日 米国）を国際出願日とする出願であって、令和１年１２月１９日付けで拒絶査定がなされ、これに対し令和２年５月７日に拒絶査定不服審判が請求され、令和３年１０月２８日付けで当審より拒絶理由が通知され、令和４年５月２日に手続補正がなされたものである。

当審の拒絶の理由で引用された、本願優先日前に頒布された刊行物である引用文献１には、次の事項が記載されている。なお、下記摘記事項は、引用文献１のファミリーである特表２０１５－５２３８５６号公報の記載に基づく。また、下線及び図５４Ｂにおける枠線は当審で付与したものである。

（１） 「【請求項１８】

（ｉ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および

（ｉｉ）部位特異的酵素活性を示す活性部位であって、酵素活性の部位が前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定される、活性部位

を含む、キメラ部位特異的修飾ポリペプチド。

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【請求項１９】

図３に示されるＣａｓ９／Ｃｓｎ１アミノ酸配列のアミノ酸７～１６６もしくは７３１～１００３に対して、または配列番号１～２５６および７９５～１３４６として記載されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応部分に対して、少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載のキメラ部位特異的修飾ポリペプチド

【請求項２０】

前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、配列番号５６３～６８２に記載のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つに対して、一連の少なくとも８個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１８に記載のキメラ部位特異的修飾ポリペプチド。

【請求項２１】

前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、配列番号４３１～５６２に記載のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つに対して、一連の少なくとも８個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１８に記載のキメラ部位特異的修飾ポリペプチド。

【請求項２２】

前記酵素活性が前記標的ＤＮＡを修飾する、請求項１８に記載のキメラ部位特異的修飾ポリペプチド。

【請求項２３】

前記酵素活性が、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポサーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、光回復酵素活性またはグリコシラーゼ活性である、請求項２２に記載のキメラ部位特異的修飾ポリペプチド。

【請求項２４】

前記酵素活性がヌクレアーゼ活性である、請求項２３に記載のキメラ部位特異的修飾ポリペプチド。

【請求項２５】

前記ヌクレアーゼ活性が前記標的ＤＮＡ内で二重鎖切断を引き起こす、請求項２４に記載のキメラ部位特異的修飾ポリペプチド。

【請求項２６】

前記酵素活性が前記標的ＤＮＡと結合した標的ポリペプチドを修飾する、請求項１８に記載のキメラ部位特異的修飾ポリペプチド。

【請求項２７】

前記酵素活性が、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性または脱ミリストイル化活性である、請求項２６に記載のキメラ部位特異的修飾ポリペプチド。

【請求項２８】

前記標的ポリペプチドがヒストンであり、前記酵素活性がメチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性または脱ユビキチン化活性である、請求項２６に記載のキメラ部位特異的修飾ポリペプチド。」

（２） 「【図面の簡単な説明】

【００３３】

・・・

【図３Ｂ】ストレプトコッカス・ピオゲネス（配列番号８）のＣａｓ９／Ｃｓｎ１タンパク質のアミノ酸配列を示す。Ｃａｓ９は、ＨＮＨおよびＲｕｖＣエンドヌクレアーゼの双方と相同であるドメインを有する。ドメイン１および２に上線が引かれる。

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・・・

【図９】二つの種からの例示ｔｒａｃｒＲＮＡ（活性化ＲＮＡ）およびｃｒＲＮＡ（標的化ＲＮＡ）配列を示す。ある程度の互換性が存在する；たとえば、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９／Ｃｓｎ１タンパク質はＬ．イノキュア由来のｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡと機能する。「｜」は、標準的なワトソン‐クリック塩基対を表し、一方で、「・」はＧ‐Ｕゆらぎ塩基対を表す。「可変２０ｎｔ」または「２０ｎｔ」は標的ＤＮＡに相補的なＤＮＡ標的断片を意味する（この領域は長さが最大約１００ｎｔであり得る）。また、標的化ＲＮＡおよび活性化ＲＮＡの特色を組み込む単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡの設計も示される（幅広い種類の種からのＣａｓ９／Ｃｓｎ１タンパク質配列が図３で示され、配列番号１～２５６および７９５～１３４６として示される）。ストレプトコッカス・ピオゲネス：上から下：（配列番号／／、／／、／／）；リステリア・イノキュア：上から下：（配列番号／／、／／、／／）。提供される配列は、非制限的な例であり、単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび二分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、幅広い種類の種からの天然に存在する配列を基に、どのように設計され得るかを図示することを目的とする。幅広い種類の種からの適切な配列の様々な例が次のように示される（Ｃａｓ９タンパク質：配列番号１～２５９；ｔｒａｃｒＲＮＡ：配列番号４３１～５６２、またはそれらの補体；ｃｒＲＮＡ：配列番号５６３～６７９、またはそれらの補体；および例示単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡ：配列番号６８０～６８２）。

・・・

【図５３】図５３Ａ～Ｃは、変異形Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチド（ｄＣａｓ９）が、ｄＣａｓ９がＲｕｖＣ１ドメインのみ（たとえば、Ｄ１０Ａ）、ＨＮＨドメインのみ（たとえば、Ｈ８４０Ａ）、または双方のドメイン（たとえば、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ）で活性を低下させる場合、対象方法のための機構であることを示す実験結果である。

【図５４Ａ】対象変異形Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドのための適切な融合パートナー（またはそれらの断片）の例を列挙する。例には列挙されたものが含まれるが、これらに限定されない。

【図５４Ｂ】同上。

【図５４Ｃ】同上。」

（３） 「【０１７５】

活性部位

ＲＮＡ結合部位に加えて、キメラ部位特異的修飾ポリペプチドは「活性部位」を含む。いくつかの実施形態において、主題のキメラ部位特異的修飾ポリペプチドの活性部位は、部位特異的修飾ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１エンドヌクレアーゼ）の自然発生的な活性部位を含む。他の実施形態では、主題のキメラ部位特異的修飾ポリペプチドの活性部位は、部位特異的修飾ポリペプチドの自然発生的な活性部位の修飾されたアミノ酸配列（例えば、置換、欠失、挿入）を含む。目的の自然発生的な活性部位は、当該技術分野において公知の部位特異的修飾ポリペプチドに由来する。例えば、配列番号１～２５６および７９５～１３４６は、部位特異的修飾ポリペプチドとして用いることができる自然発生的なＣａｓ９／Ｃｓｎ１エンドヌクレアーゼの非限定的且つ非網羅的な列挙を提供する。主題のキメラ部位特異的修飾ポリペプチドの活性部位は可変であり、本明細書で開示される方法に有用であり得るいずれの異種ポリペプチド配列を含んでいてもよい。

【０１７６】

続きを表示（全31行）

いくつかの実施形態において、主題のキメラ部位特異的修飾ポリペプチドは、（ｉ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用 するＲＮＡ結合部位；および（ｉｉ）部位特異的酵素活性を示す活性部位（例えば、ＤＮＡメチル化活性、ＤＮＡ切断活性、ヒストンアセチル化活性、ヒストンメチル化活性等）を含み、酵素活性の部位はＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定される。

【０１７７】

他の実施形態では、主題のキメラ部位特異的修飾ポリペプチドは、（ｉ）標的ＤＮＡ内の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部位；および（ｉｉ）標的ＤＮＡ内の転写を調節する活性部位（例えば、転写を増加または減少させるための）を含み、標的ＤＮＡ内の調節される転写の部位はＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定される。

【０１７８】

いくつかの例において、主題のキメラ部位特異的修飾ポリペプチドの活性部位は、標的ＤＮＡを修飾する酵素活性（例えば、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性 、脱メチル化酵素活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポサーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、光回復酵素活性またはグリコシラーゼ活性）を有する。

【０１７９】

他の例において、主題のキメラ部位特異的修飾ポリペプチドの活性部位は、標的ＤＮＡと結合したポリペプチド（例えば、ヒストン）を修飾する酵素活性（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性または脱ミリストイル化活性）を有する。

【０１８０】

いくつかの例において、主題のキメラ部位特異的修飾ポリペプチドの活性部位は、酵素活性を示す（上記）。他の例において、主題のキメラ部位特異的修飾ポリペプチドの活性部位は、標的ＤＮＡの転写を調節する（上記）。主題のキメラ部位特異的修飾ポリペプチドの活性部位は可変であり、本明細書で開示される方法に有用であり得るいずれの異種ポリペプチド配列を含んでいてもよい。

【０１８１】

例示的なキメラ部位特異的修飾ポリペプチド

いくつかの実施形態において、キメラ部位特異的修飾ポリペプチドの活性部位は、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１タンパク質の修飾形態を含む。いくつかの例において、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１タンパク質の修飾形態は、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１タンパク質の自然発生的なヌクレアーゼ活性を低減させるアミノ酸変化（例えば、欠失、挿入、または置換）を含む。例えば、いくつかの例において、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１タンパク質の修飾形態は、対応する野生型Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチドの５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満のヌクレアーゼ活性を有する。いくつかの例において、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチドの修飾形態は、実質的なヌクレアーゼ活性を有さない。

【０１８２】

いくつかの実施例において、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチドの修飾形態は、標的ＤＮＡの相補鎖を切断することができるが、標的ＤＮＡの非相補鎖を切断する能力が低減している、Ｄ１０Ａ（配列番号８のアミノ酸位置１０におけるアスパラギン酸からアラニン）変異（または配列番号１～２５６および７９５～１３４６に示されるタンパク質のうちのいずれかの対応する変異）である（図１１を参照）。いくつかの実施例において、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチドの修飾形態は、標的ＤＮＡの非相補鎖を切断することができるが、標的ＤＮＡの相補鎖を切断する能力が低減している、Ｈ８４０Ａ（アミノ酸位置８４０におけるヒスチジンからアラニン）変異（または配列番号１～２５６および７９５～１３４６として記載されるタンパク質のうちのいずれかの対応する変異）である（図１１を参照）。いくつかの実施例において、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチドの修飾形態は、ポリペプチドが標的ＤＮＡの相補鎖および非相補鎖の両方を切断する能力が低減しているような、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ変異（または配列番号１～２５６および７９５～１３４６として記載されるタンパク質のうちのいずれかの対応する変異）の両方を有する。他の残基を変異させることで、上記の効果（すなわち、１つまたはその他のヌクレアーゼ部分を失活させる）を得ることができる。非限定例として、残基Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、および／またはＡ９８７（または配列番号１～２５６および７９５～１３４６として記載されるタンパ質のうちのいずれかの対応する変異）を、変化（すなわち、置換）させることができる（Ｃａｓ９アミノ酸残基の保存に関するさらなる情報については図３、図５、図１１Ａ、および表１を参照）。また、アラニン置換以外の変異も適切である。

【０１８３】

目的のさらなる情報について

表１． 表１は種々の種に由来するＣａｓ９配列内に存在する４つのモチーフを列挙している（図３および図５も参照）。表に列挙されるアミノ酸は、Ｓ．ピオゲネス由来のＣａｓ９のものである（配列番号８）。

【表１】

・・・

【０１８４】

いくつかの例において、キメラ部位特異的修飾ポリペプチドは、図３に示されるＣａｓ９／Ｃｓｎ１アミノ酸配列のアミノ酸７～１６６または７３１～１００３に対して、または配列番号１～２５６および７９５～１３４６として記載されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応部分に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例において、キメラ部位特異的修飾ポリペプチドは、４つのモチーフ（表４に列挙され、図３Ａおよび図５に示される）を含み、それぞれは、表１に列挙される４つのモチーフ（配列番号２６０～２６３）のそれぞれに対して、または、配列番号１～２５６および７９５～１３４６として記載されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応部分に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの例において、キメラ部位特異的修飾ポリペプチドは、図３に示されるＣａｓ９／Ｃｓｎ１アミノ酸配列のアミノ酸７～１６６または７３１～１００３に対して、または配列番号１～２５６および７９５～１３４６として記載されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応部分に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【０１８５】

いくつかの実施形態において、部位特異的修飾ポリペプチドの活性部位は、ＤＮＡ修飾活性および／または転写因子活性および／またはＤＮＡ結合ポリペプチド修飾活性を有する異種ポリペプチドを含む。いくつかの例において、異種ポリペプチドは、ヌクレアーゼ活性を与えるＣａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチドの位置と置換されている。他の実施形態では、主題の部位特異的修飾ポリペプチドは、ヌクレアーゼ活性を正常に与えるＣａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチドの部分（および十分に活性な、または代わりに、対応する野生型活性の１００％未満を有するよう修飾されていてもよいＣａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチドの部分）、および異種ポリペプチドの両方を含む。言い換えれば、いくつかの例において、主題のキメラ部位特異的修飾ポリペプチドは、ヌクレアーゼ活性を正常に与えるＣａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチドの部分および異種ポリペプチドの両方を含む融合ポリペプチドである。他の例において、主題のキメラ部位特異的修飾ポリペプチドは、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチドの活性部位の修飾変異体（例えば、アミノ酸変化、欠失、挿入）および異種ポリペプチドを含む融合ポリペプチドである。さらに別の例では、主題のキメラ部位特異的修飾ポリペプチドは、異種ポリペプチドおよび自然発生的なまたは修飾された部位特異的修飾ポリペプチドのＲＮＡ結合部位を含む融合ポリペプチドである。

【０１８６】

例えば、キメラＣａｓ９／Ｃｓｎ１タンパク質において、自然発生的な（または修飾（例えば、変異、欠失、挿入）された）細菌Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチドは、異種ポリペプチド配列（すなわち、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１以外のタンパク質由来のポリペプチド配列または別の生物由来のポリペプチド配列）に融合されていてもよい。異種ポリペプチド配列は、キメラＣａｓ９／Ｃｓｎ１タンパク質によっても示される活性（例えば、酵素活性）を示し得る（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、キナーゼ活性、ユビキチン化活性等）。異種核酸配列を別の核酸配列に連結して（例えば、遺伝子操作によって）、キメラポリペプチドをコードするキメラヌクレオチド配列を作製してもよい。いくつかの実施形態において、キメラＣａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチドは、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチド（例えば、野生型Ｃａｓ９またはＣａｓ９変異型、例えば、ヌクレアーゼ活性が低減または不活性化されたＣａｓ９）を、細胞内局在を与える異種配列（例えば、核に標的化するための核局在化シグナル（ＮＬＳ）；ミトコンドリアに標的化するためのミトコンドリア局在化シグナル；葉緑体に標的化するための葉緑体局在化シグナル；ＥＲ保留シグナル；等）と融合することにより作製される。いくつかの実施形態において、異種配列は、追跡または精製を容易にするためのタグを与え得る（例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ等；Ｈｉｓタグ、例えば、６ＸＨｉｓタグ；赤血球凝集素（ＨＡ）タグ；ＦＬＡＧタグ；Ｍｙｃタグ；等）。いくつかの実施形態において、異種配列は、安定性の増加または減少を与え得る。いくつかの実施形態において、異種配列は、（例えば、キメラＣａｓ９ポリペプチドが別の目的タンパク質、例えば、ＤＮＡまたはヒストン修飾タンパク質、転写因子または転写抑制因子、動員（ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ）タンパク質等に結合する能力を与えるための）結合ドメインを与え得る。

【０１８７】

主題の変異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドの、種々のさらなる適切な融合パートナー（またはその断片）の例には、限定はされないが、図５４に列挙されるものが含まれる。」

（４） 「【０２０６】

いくつかの実施形態において、部位特異的修飾ポリペプチドは、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１タンパク質の修飾形態を含む。いくつかの例において、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１タンパク質の修飾形態は、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１タンパク質の自然発生的なヌクレアーゼ活性を低減させるアミノ酸変化（例えば、欠失、挿入、または置換）を含む。例えば、いくつかの例において、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１タンパク質の修飾形態は、対応する野生型Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチドの５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満のヌクレアーゼ活性を有する。いくつかの例において、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチドの修飾形態は、実質的なヌクレアーゼ活性を有さない。主題の部位特異的修飾ポリペプチドは、実質的なヌクレアーゼ活性を有さないＣａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチドの修飾形態である場合、「ｄＣａｓ９」と称され得る。

【０２０７】

いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチドの修飾形態は、標的ＤＮＡの相補鎖を切断することができるが、標的ＤＮＡの非相補鎖を切断する能力が低減している（従って、ＤＳＢではなく一本鎖切断（ＳＳＢ）をもたらす；図１１を参照）、Ｄ１０Ａ（配列番号８のアミノ酸位置１０におけるアスパラギン酸からアラニン）変異（または配列番号１～２５６および７９５～１３４６として記載されるタンパク質のうちのいずれかの対応する変異）である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチドの修飾形態は、標的ＤＮＡの非相補鎖を切断することができるが、標的ＤＮＡの相補鎖を切断する能力が低減している（従って、ＤＳＢではなく一本鎖切断（ＳＳＢ）をもたらす；図１１を参照）、Ｈ８４０Ａ（配列番号８のアミノ酸位置８４０におけるヒスチジンからアラニン）変異（または配列番号１～２５６および７９５～１３４６として記載されるタンパク質のうちのいずれかの対応する変異）である。Ｃａｓ９のＤ１０ＡまたはＨ８４０Ａ変異体（または配列番号１～２５６および７９５～１３４６として記載されるタンパク質のいずれかにおける対応する変異）を用いることで、ＳＳＢとは対照的に、ＤＳＢが存在する場合、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）が起こる可能性がさらにより大きいために、期待される生物学的結果を変化させることができる。従って、ＤＳＢの可能性を減少させる（および、従って、ＮＨＥＪの可能性を減少させる）ことが望ましいいくつかの例においては、Ｃａｓ９のＤ１０ＡまたはＨ８４０Ａ変異体を用いることができる。他の残基を変異させて、同一の効果を得る（すなわち、１つまたはその他のヌクレアーゼ部分を失活させる）ことができる。非限定例として、残基Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、および／またはＡ９８７（または配列番号１～２５６および７９５～１３４６として記載されるタンパク質のうちのいずれかの対応する変異）を、変化（すなわち、置換）させることができる（Ｃａｓ９アミノ酸残基の保存に関する

さらなる情報については図３、図５、図１１Ａ、および表１を参照）。また、アラニン置換以外の変異も適切である。部位特異的ポリペプチド（例えば、部位特異的修飾ポリペプチド）が低減された触媒活性を有する場合（例えば、Ｃａｓ９タンパク質がＤ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、および／またはＡ９８７変異、例えば、Ｄ１０Ａ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１７Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８２Ａ、Ｈ９８３Ａ、Ａ９８４Ａ、および／またはＤ９８６Ａを有する場合）のいくつかの実施形態において、該ポリペプチドは、該ポリペプチドがＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用する能力を保持している限り、部位特異的に標的ＤＮＡになお結合することができる（該ポリペプチドはＤＮＡ標的化ＲＮＡによって標的ＤＮＡ配列になお誘導されるため）。

【０２０８】

いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチドの修飾形態は、該ポリペプチドが標的ＤＮＡの相補鎖および非相補鎖の両方を切断する能力が低減しているような（すなわち、該変異体が実質的なヌクレアーゼ活性を有さない可能性がある）、Ｄ１０Ａ変異およびＨ８４０Ａ変異の両方（または配列番号１～２５６および７９５～１３４６として記載されるタンパク質のうちのいずれかの対応する変異）を有する。他の残基を変異させて、同一の効果を得る（すなわち、１つまたはその他のヌクレアーゼ部分を失活させる）ことができる。非限定例として、残基Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、および／またはＡ９８７（または配列番号１～２５６および７９５～１３４６として記載されるタンパク質のうちのいずれかの対応する変異）を、変化（すなわち、置換）させることができる（Ｃａｓ９アミノ酸残基の保存に関するさらなる情報については図３、図５、図１１Ａ、および表１を参照）。また、アラニン置換以外の変異も適切である。」

（５） 「【０２１２】

いくつかの例において、部位特異的修飾ポリペプチドは、二重鎖切断を導入する以外の方法で標的ＤＮＡを修飾する酵素活性を有する。標的ＤＮＡを（例えば、酵素活性を有する異種ポリペプチドを部位特異的修飾ポリペプチドに融合することにより、キメラ部位特異的修飾ポリペプチドを作製することによって）修飾するのに用いられ得る目的の酵素活性には、限定はされないが、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポサーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、光回復酵素活性またはグリコシラーゼ活性）が含まれる。ＤＮＡの損傷および修復の活性が環境ストレスに応答した細胞生存および適切なゲノム維持のために必須である一方で、メチル化および脱メチル化は、当該技術分野において、後成的遺伝子制御の重要な方法として認識されている。」

（６） 「【０３６４】

追加の融合パートナー

転写の増加または減少を達成するための融合パートナーの非限定例は、図５４に列挙されており、転写活性化因子ドメインおよび転写抑制因子ドメイン（例えば、クルッペル結合ボックス（Ｋｒｕｐｐｅｌ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂｏｘ）（ＫＲＡＢまたはＳＫＤ）；Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）；ＥＲＦ抑制因子ドメイン（ＥＲＤ）等）が含まれる。いくつかのそのような例において、ｄＣａｓ９融合タンパク質は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡによって、標的ＤＮＡ内の特定の位置（すなわち、配列）に標的化され、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターへの結合の阻止（転写活性化因子機能を選択的に阻害）、および／または局所的なクロマチン状態の修飾（例えば、標的ＤＮＡを修飾するまたは標的ＤＮＡと結合したポリペプチドを修飾する融合配列が用いられた場合）等の遺伝子座特異的調節を及ぼす。いくつかの例において、変化は一過性である（例えば、転写の抑制または活性化）。いくつかの例において、変化は遺伝性である（例えば、後成的修飾が標的ＤＮＡまたは標的ＤＮＡと結合したタンパク質（例えば、ヌクレオソームヒストン）に起こった場合）。

【０３６５】

いくつかの実施形態において、異種配列はｄＣａｓ９ポリペプチドのＣ末端に融合され得る。いくつかの実施形態において、異種配列はｄＣａｓ９ポリペプチドのＮ末端に融合され得る。いくつかの実施形態において、異種配列はｄＣａｓ９ポリペプチドの内部部分（すなわち、Ｎ末端またはＣ末端以外の部分）に融合され得る。」

（７） 「【０４０４】

例示的なデグロン配列は、細胞および動物の両方において十分に特徴付けされ、試験されている。従って、ｄＣａｓ９をデグロン配列に融合することにより、「調節可能」且つ「誘導性」のｄＣａｓ９ポリペプチドが作製される。本明細書に記載の融合パートナーのいずれも、あらゆる望ましい組み合わせで用いることができる。この点を説明するための１つの非限定例として、ｄＣａｓ９融合タンパク質は、検出のためのＹＦＰ配列、安定性のためのデグロン配列、および標的ＤＮＡの転写を増加させるための転写活性化因子配列を含み得る。さらに、ｄＣａｓ９融合タンパク質内に用いることができる融合パートナーの数は限定されている。いくつかの例において、ｄＣａｓ９融合タンパク質は、一つまたは複数（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上）の異種配列を含む。

【０４０５】

適切な融合パートナーとしては、限定はされないが、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性または脱ミリストイル化活性を与えるポリペプチドが挙げられ、これらの活性はいずれも、ＤＮＡの直接修飾（例えば、ＤＮＡのメチル化）に、またはＤＮＡ結合ポリペプチドの修飾（例えば、ヒストンまたはＤＮＡ結合タンパク質）に向けられることができる。さらに、適切な融合パートナーとしては、限定はされないが、境界エレメント（例えば、ＣＴＣＦ）、末梢動員（ｐｅｒｉｐｈｅｒｙ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）を与えるタンパク質およびその断片（例えば、ラミンＡ、ラミンＢ等）、並びにタンパク質ドッキングエレメント（例えば、ＦＫＢＰ／ＦＲＢ、Ｐｉｌ１／Ａｂｙ１等）が挙げられる。

【０４０６】

主題の異型Ｃａｓ９部位特異的ポリペプチドの、種々の追加の適切な融合パートナー（またはその断片）の例としては、限定はされないが、図５４に列挙されるものが挙げられる。」

（８） 「

［図：0001389998000001.jpg］

」（図３Ｂ）

（９） 「

［図：0001389998000002.jpg］

」（図５４Ｂ）

（ア）引用文献１の「融合タンパク質」に関する記載のうち、Ｃａｓ９ドメインと、標的ＤＮＡの標的シトシン（Ｃ）を脱アミノ化するデアミナーゼドメインとを含む融合タンパク質を記載または示唆するものは１つもないから、引用文献１は、Ｃａｓ９ドメインと、標的ＤＮＡの標的シトシン（Ｃ）を脱アミノ化するデアミナーゼドメインとを含む融合タンパク質を記載も示唆もしていない。

（イ）引用文献１において開示されている「リンカー」という用語は、Ｃａｓ９ドメインとデアミナーゼとを結合するリンカーを教示または示唆するものではないから、引用文献１は、本願発明に記載のリンカーを記載も示唆もしない。

（ウ）引用文献１は、図４１に描かれ、かつ実施例４で議論されるように、「エンドヌクレアーゼ活性に欠けた、触媒的に死んだＣａｓ９が、誘導ＲＮＡと共に同時発現されると、転写伸長、ＲＮＡポリメラーゼ結合または転写因子結合に特異的に干渉し得るＤＮＡ認識複合体を生成する」ＣＲＩＳＰＲ干渉(「ＣＲＩＳＰＲｉ」)を開示し、さらに、ＣＲＩＳＰＲｉが、ＲＮＡＰとｄＣａｓ９－ｓｇＲＮＡとの間の「物理的衝突」によって機能することが提唱されているから、仮に引用文献１がＣａｓ９ドメインと、標的ＤＮＡ中の標的シトシン（Ｃ）を脱アミノ化するデアミナーゼドメインの融合を開示していたとしても、当業者であれば、かかるデアミナーゼがＣａｓ９ドメインとの物理的衝突のために阻害されるであろうと当然に予測でき、Ｃａｓ９-デアミナーゼの融合が標的ＤＮＡ分子の標的シトシン（Ｃ）の脱アミノ化をもたらすことは期待しなかったというべきである。