2024-000398

本願は、２０１８年（平成３０年）５月１６日（パリ条約による優先権主張２０１７年５月１６日、英国）を国際出願日とする特願２０２０－５１４３３１号の一部を令和４年３月２９日に新たな特許出願としたものであって、令和５年１月２４日付けの拒絶理由の通知に対し、同年６月２２日に意見書が提出されるとともに手続補正がなされたが、同年９月５日付けで拒絶査定（以下「原査定」という。）がなされ、これに対して令和６年１月１１日に審判の請求がなされたものである。

その後、令和７年３月１７日付けで拒絶理由を通知し、これに対して同年４月３日に意見書の提出とともに手続補正がなされた。

原査定の拒絶の理由で引用され、本願の優先日前に電気通信回線を通じて公衆に利用可能となった引用文献である、国際公開第２０１７／０５０８５５号（２０１７年（平成２９年）３月３０日出願公開。以下「引用文献１」という。）には、図面とともに、以下の記載事項がある。なお、以下に示す行番号は国際公開公報に付されたものに基づく。また、括弧内に当審による翻訳文を記載し、引用発明の認定等に用いた箇所に下線を付した。

（ア）第１頁第４～５行

「The present invention relates to a computer implemented method for assessing the efficiency of a treatment based on anti-PD-1 and/or anti-PD-Ll monoclonal antibodies.」

（本発明は、抗ＰＤ－１及び／又は抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体に基づく治療の効率を評価するための、コンピュータによって実施される方法に関する。）

（イ）第３頁第１１～１２行

「PD-L2 is another ligand for PD-1 but there is no known standardized and reliable way to perform immuno-staining for PD-L2 expression.」

（ＰＤ－Ｌ２はＰＤ－１のもう一つのリガンドであるが、ＰＤ－Ｌ２発現の免疫染色を行う標準化された信頼できる方法は知られていない。）

（ウ）第３頁１４行

「The present invention aims to improve this situation.」

（本発明は、この状況を改善することを目的とする。）

（エ）第３頁第１６～２６行

「To that end, the invention proposes a method implemented by computer means for assessing an efficiency of a cure of a cancer disease based on at least one antibody against protein PD-1 and/or its ligand PD-L1, wherein the method comprises the steps:

- Obtaining data of at least one microscope image of cells of a tumor material treated for performing a test to assess an interaction between protein PD-1 and its ligand PD-Ll in at least some of said cells,

- Counting in said image a number of spots related to said interactions between PD-1 and PD- Ll, and a number of nuclei in said image, and

- Estimating a ratio between said number of spots and said number of nuclei with a view to assess an efficiency of a cure based on at least one antibody against protein PD-1 and/or its ligand PD-Ll on a cancer disease from which said tumor material results.」

（そのために、本発明は、タンパク質ＰＤ－１および／またはそのリガンドＰＤ－Ｌ１に対する少なくとも１つの抗体に基づいて、癌疾患の治癒の効率を評価するための、コンピュータ手段によって実施される方法を提案するものであり、この方法は、以下のステップを含む：

－ 細胞の少なくとも一部におけるタンパク質ＰＤ－１とそのリガンドＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を評価するための試験を実施するために処理された、腫瘍材料の細胞の少なくとも１つの顕微鏡画像のデータを取得し、

－ 前記画像において、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用に関連するスポットの数と、画像中の核の数をカウントし、そして、

－ 前記スポットの数と前記核の数の比率を推定することにより、タンパク質ＰＤ－１及び／又はその離岸土ＰＤ－Ｌ１に対する少なくとも１つの抗体に基づく、前記腫瘍材料が起因する癌疾患に対する治療効率を評価する。）

（オ）第３頁第２８～３５行

「As detailed below with reference to figures 1 to 5, it appeared that techniques to detect interactions between PD-1 and PD-Ll, such as Proximity Ligation Assay (PLA) for example, are much more robust than simple PD-1 and PD-Ll co-staining, yielding then a new characterization method for assessing the efficiency of a treatment based on PD-1 and/or PD-Ll antibodies.. The PLA allows the visualization of the subcellular localization of protein-protein interactions at single-molecule resolution (Soderberg et al, Nature Methods, 2006). Another technique which is given here as an example is the Forster or Fluorescence Resonance Energy Transfer assay (FRET), and has provided also satisfactory results. (Weibrecht et al, Expert Rev. Proteomics, 2010)」

（図１～図５を参照して以下に詳述するように、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を検出するための技術として、例えば、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）は、単純なＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との共染色より確実であり、その結果、ＰＤ－１及び／又はＰＤ－Ｌ１抗体に基づく処理の効果を評価するための新しい特性評価法を提供する。ＰＬＡは、タンパク質－タンパク質間の相互作用の細胞内での局在を、１分子分解能により可視化する（Soderbergら,Nature Methods,2006）。もう一つの技術は、例えば、フェルスター法又は蛍光共鳴エネルギー移動法（ＦＲＥＴ）があり、これも満足のいく結果をもたらす。（Weibrechtら、Expert Rev Proteomics,2010））

（カ）第７頁第１３～１８行

「This detection of the protein interaction may be performed by any conventional means allowing protein interaction detection on tissue section, such as Proximity ligation assay (PLA), Forster or Fluorescence resonance energy transfer (FRET) assays, fluorescence lifetime imaging (FLIM)-FRET, or "dual binders" (DBs), which are bispecific detection agents consisting of two Fab fragment molecules joined by a flexible linker (Van Dieck et al, Chemistry & Biology, 2014). Proximity ligation assay (PLA) is more preferred. However, the technique FRET can provide also good results.」

（このタンパク質相互作用の検出は、組織切片上でのタンパク質相互作用検出を可能にする任意の従来の手段によって行うことができ、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）、フェルスター又は蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイ、蛍光寿命イメージング（ＦＬＩＭ）－ＦＲＥＴ、又は柔軟なリンカーによって結合された２つのＦａｂフラグメント分子からなる二重特異性検出剤である「デュアルバインダー」（ＤＢｓ）などである（Van Dieckら, Chemistry & Biology, 2014）。近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）がより好ましい。しかしながら、ＦＲＥＴ技術も、良好な結果を提供することができる。）

（キ）第８頁第１０～１３行

「The integrity of the target complex in tissue samples is a second challenge. PD-1 and PD-L1 are expressed at the membrane of distinct types of cells. Freshly cut tissue sections only have to be used, and the slides must not be exposed to extreme temperature orders to preserve the structure of the cell membranes.」

（組織試料中の標的複合体の完全性は、第２の課題である。ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１は異なるタイプの細胞の膜に発現している。新鮮な組織切片のみを使用すべきであり、また、細胞膜の構造を維持するため、スライドは極端な温度変化にさらされてはならない。）

原査定の拒絶の理由で引用され、本願の優先日前に電気通信回線を通じて公衆に利用可能となった引用文献である、国際公開第２０１４／１４０５５４号（２０１４年（平成２６年）９月１８日出願公開。以下「引用文献２」という。）には、図面とともに、以下の記載事項がある。なお、以下に示す行番号は国際公開公報に付されたものに基づく。また、括弧内に当審による翻訳文を記載し、技術的事項の認定等に用いた箇所に下線を付した。

（ア）第１頁第７～１０行

「 The invention relates to methods for detecting molecules in a sample, in particular, protein sites and states in cells, such as those in tissue sections. The invention further provides for the quantification of molecular interactions, such as protein-protein interactions in a sample.」

（本発明は、試料中の分子、特に組織切片などの細胞中のタンパク質の部位や状態を検出する方法に関する。本発明はさらに、試料中のタンパク質間相互作用のような分子間相互作用の定量化を提供する。）

（イ）第１頁第１１～１７行

「 The invention relates to methods using Forster or Fluorescence resonance energy transfer (FRET) in combination with an enzyme activation system, such as tyramide signal amplification (TSA) to improve detection of molecules in a sample, such as protein states and a close spatial association of proteins. More specifically, the invention relates to two-site TSA-FRET methods, where the two sites are on the same protein or on different proteins, such as on a pair of proteins in a complex.」

（本発明は、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）の様な酵素活性化システムを組み合わせた、フェルスター又は蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用して、タンパク質の状態やタンパク質の密接な空間的関連などの、サンプル中の分子の検出を向上させる方法に関する。より具体的には、本発明は、２部位ＴＳＡ－ＦＲＥＴ法に関し、２部位は、同じタンパク質又は、複合体中のタンパク質対のような異なるタンパク質である。）

（ウ）第７頁第１０～１２行

「 The object of the present invention is to provide an improved method for detecting molecules, particularly protein states in cells, such as in tissue sections.」

（本発明の目的は、組織切片などの細胞内の分子、特にタンパク質の状態を検出するための改良された方法を提供することである。）

（エ）第７頁第１６～第８頁第２５行

「 The present invention provides a generic, high throughput method that combines FRET with an enzyme activation system, such as a tyramide signal amplification (TSA) system.

According to the present invention, there is provided a method for detecting molecules, employing:

a. at least two primary antibodies, wherein the first primary antibody binds to a first site on a molecule and the second primary antibody binds to a second site on a molecule, wherein the second site is different from the first site and wherein the first and second primary antibodies are immunologically distinct;

b. at least two secondary antibodies, wherein the first secondary antibody is labeled with a fluorescence resonance energy transfer (FRET) donor and binds to the first primary antibody; and the second secondary antibody is conjugated or fused to an enzyme and binds the second primary antibody, wherein the first secondary antibody does not bind the second primary antibody and the second secondary antibody does not bind the first primary antibody;

続きを表示（全11行）

c. a conjugate comprising a FRET acceptor and a substrate specific for the enzyme, wherein when the substrate reacts with the enzyme, an activated conjugate forms, which activated conjugate binds to electron rich moieties on a molecular surface adjacent to the enzyme;

wherein the method comprises:

d. contacting a sample with the at least two primary antibodies;

e. contacting the sample with the at least two secondary antibodies;

f. performing a wash step;

g. contacting the sample with the conjugate; and

h. detecting any FRET signal generated by the FRET acceptor.」

（ 本発明は、ＦＲＥＴとチラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）システムなどの酵素活性化システムとを組み合わせた、一般的な高スループットの方法を提供する。

本発明によれば、分子を検出する方法が提供され、

ａ．少なくとも２つの一次抗体であって、第１の一次抗体は分子の第１の部位に結合し、第２の一次抗体は分子の第２の部位に結合し、ここで、第２の部位は第１の部位とは異なり第２の一次抗体は免疫学的に異なるものであり、

ｂ．少なくとも２つの二次抗体であって、第１の二次抗体は蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）ドナーで標識され第１の一次抗体に結合するものであり、第２の二次抗体は酵素と結合又は融合され第２の一次抗体に結合するものであり、ここで、第１の二次抗体は第２の一次抗体に結合せず、第２の二次抗体は第１の一次抗体に結合せず、

ｃ．ＦＲＥＴアクセプターと酵素に特異的な基質とを含む接合体であって、ここで、基質は酵素によって反応することにより活性化接合体を形成し、活性化接合体は、酵素に隣接する分子表面の電子豊富な部分に結合し、

ｄ．試料と少なくとも２つの一次抗体を接触させ、

ｅ．試料と少なくとも２つの二次抗体を接触させ、

ｆ．洗浄工程を実施し、

ｇ．試料と接合体を接触させ、そして、

ｈ．ＦＥＲＴアクセプターにより発生したＦＲＥＴ信号を検出することを、含む方法。）

（オ）第８８頁第１～３０行

「Claims

1. A method for detecting molecules, employing:

a. at least two primary antibodies, wherein the first primary antibody binds to a first site on a molecule and the second primary antibody binds to a second site on a molecule, wherein the second site is different from the first site and wherein the first and second primary antibodies are immunologically distinct;

b. at least two secondary antibodies, wherein the first secondary antibody is labelled with a fluorescence resonance energy transfer (FRET) donor and binds to the first primary antibody; and the second secondary antibody is conjugated or fused to an enzyme and binds the second primary antibody, wherein the first secondary antibody does not bind the second primary antibody and the second secondary antibody does not bind the first primary antibody;

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c. a conjugate comprising a FRET acceptor and a substrate specific for the enzyme, wherein when the substrate reacts with the enzyme, an activated conjugate forms, which activated conjugate binds to electron rich moieties on a molecular surface adjacent to the enzyme;

wherein the method comprises:

d. contacting a sample with the at least two primary antibodies;

e. contacting the sample with the at least two secondary antibodies;

f. performing a wash step;

g. contacting the sample with the conjugate; and

h. detecting any FRET signal generated by the FRET acceptor.」

（請求の範囲

１．分子を検出する方法であって、

ａ．少なくとも２つの一次抗体であって、第１の一次抗体は分子の第１の部位に結合し、第２の一次抗体は分子の第２の部位に結合し、ここで、第２の部位は第１の部位とは異なり第２の一次抗体は免疫学的に異なるものであり、

ｂ．少なくとも２つの二次抗体であって、第１の二次抗体は蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）ドナーで標識され第１の一次抗体に結合するものであり、第２の二次抗体は酵素と結合又は融合され第２の一次抗体に結合するものであり、ここで、第１の二次抗体は第２の一次抗体に結合せず、第２の二次抗体は第１の一次抗体に結合せず、

ｃ．ＦＲＥＴアクセプターと酵素に特異的な基質とを含む接合体であって、ここで、基質は酵素によって反応することにより活性化接合体を形成し、活性化接合体は、酵素に隣接する分子表面の電子豊富な部分に結合し、

ｄ．試料と少なくとも２つの一次抗体を接触させ、

ｅ．試料と少なくとも２つの二次抗体を接触させ、

ｆ．洗浄工程を実施し、

ｇ．試料と接合体を接触させ、そして、

ｈ．ＦＥＲＴアクセプターにより発生したＦＲＥＴ信号を検出することを、含む方法。）