2021-016480

特願２０１９－ ７２２８７「ＡＡＶベクター、及び抗ＡＡＶ（アデノ関連ウイルス）中和抗体についてのアッセイ」拒絶査定不服審判事件〔令和 １年 ９月２６日出願公開、特開２０１９－１６２１０９、請求項の数（３８）〕について、次のとおり審決する。

結 論 本件審判の請求は、成り立たない。

理 由 第１ 手続の経緯 本願は、平成２６年７月１１日（パリ条約による優先権主張 ２０１３年７月１２日 米国）を国際出願日とする特願２０１６－５２５８２７号の一部を新たな特許出願として平成３１年４月４日に出願されたものであって、その主な手続の経緯は以下のとおりである。 令和２年 ８月 ４日 手続補正書の提出 同年 ８月１２日付け 特許法第５０条の２の通知を伴う拒絶理由通 知書 令和３年 ２月１８日 意見書、手続補正書の提出 同年 ７月２９日付け 令和３年２月１８日の手続補正についての補 正却下の決定、拒絶査定 同年１２月 ２日 審判請求書、手続補正書の提出 令和４年 ８月１５日 上申書の提出 第２ 令和３年１２月２日付の手続補正についての補正却下の決定 ［補正却下の決定の結論］ 令和３年１２月２日付の手続補正を却下する。 ［理由］ １ 補正の内容 本件補正前の特許請求の範囲の請求項１は、令和２年８月４日にされた手続補正により補正された、次のとおりのものである。 「ＡＡＶに結合する抗体を、測定又は定量するための方法において、以下： （ａ）組換えベクターを包膜する感染性組換えＡＡＶ粒子を用意するステップであって、 （ｉ）前記ベクターが、リポータトランスジーンを含み、（ｉｉ）前記リポータトランスジーンが、一本鎖若しくは自己相補的ゲノムを含むと共に、（ｉｉｉ）前記リポータトランスジーンが、１つ又は複数の発現調節エレメントに作動可能に連結され、かつ１つ又は複数のフランキングエレメントによってフランキングされている、ステップ； （ｂ）前記感染性組換えＡＡＶ粒子に感染し得る細胞を用意するステップ； （ｃ）（ａ）の感染性組換えＡＡＶ粒子を被験者からの生体サンプルと接触させるか、又はインキュベートし、これによって得られる混合物（Ｍ）を生成するステップ； （ｄ）得られた混合物（Ｍ）と（ｂ）の細胞を、（ａ）の前記感染性組換えＡＡＶ粒子が、前記細胞中の前記リポータトランスジーンに感染して、これを発現させることを可能にする条件下で、接触させるステップ； （ｅ）前記リポータトランスジーンの発現を測定するステップ；並びに （ｆ）（ｅ）の前記リポータトランスジーン発現をＡＡＶに結合する抗体が欠失した陰性（－）対照のリポータトランスジーン発現と比較するステップであって、これによって、前記生体サンプル中のＡＡＶに結合する抗体を測定又は定量するステップ を含む方法。」（以下、「本願発明」という。） 本件補正後の特許請求の範囲の請求項１は、次のとおりのものである（下線部は補正により追加された部分である。）。 「ＡＡＶに結合する抗体を、測定及び定量するための方法において、以下： （ａ）組換えベクターを包膜する感染性組換えＡＡＶ粒子を用意するステップであって、 （ｉ）前記ベクターが、リポータトランスジーンを含み、（ｉｉ）前記リポータトランスジーンが、一本鎖若しくは自己相補的ゲノムを含むと共に、（ｉｉｉ）前記リポータトランスジーンが、１つ又は複数の発現調節エレメントに作動可能に連結され、かつ１つ又は複数のフランキングエレメントによってフランキングされている、ステップ； （ｂ）前記感染性組換えＡＡＶ粒子に感染し得るＨＥＫ－２９３細胞であって最初の解凍後の継代数が２５継代までのＨＥＫ－２９３細胞を用意するステップ； （ｃ）（ａ）の感染性組換えＡＡＶ粒子を被験者からの生体サンプルと接触させるか、又はインキュベートし、これによって得られる混合物（Ｍ）を生成するステップ； （ｄ）得られた混合物（Ｍ）と（ｂ）のＨＥＫ－２９３細胞を、（ａ）の前記感染性組換えＡＡＶ粒子が、前記ＨＥＫ－２９３細胞中の前記リポータトランスジーンに感染して、これを発現させることを可能にする条件下で、接触させるステップ； （ｅ）前記リポータトランスジーンの発現を測定するステップ；並びに （ｆ）（ｅ）の前記リポータトランスジーン発現をＡＡＶに結合する抗体が欠失した陰性（－）対照のリポータトランスジーン発現と比較するステップであって、これによって、前記生体サンプル中のＡＡＶに結合する抗体を測定及び定量するステップ を含む方法。」（以下、「本願補正発明」という。） ２ 補正の適否 本件補正は、「測定又は定量するための方法」を「測定及び定量するための方法」とし、「感染性組換えＡＡＶ粒子に感染し得る細胞」を「感染性組換えＡＡＶ粒子に感染し得るＨＥＫ－２９３細胞であって最初の解凍後の継代数が２５継代までのＨＥＫ－２９３細胞」に限定するものであって、本願発明と本願補正発明の産業上の利用分野及び解決しようとする課題が同一であるから、特許法第１７条の２第５項２号の特許請求の範囲の減縮を目的とするものに該当する。 そこで、本願補正発明が特許出願の際独立して特許を受けることができるものであるかどうか（特許法第１７条の２第６項において準用する同法第１２６条第７項の規定に適合するかどうか）について以下に検討する。 （１）証拠の記載事項 ア 引用文献１（Gene Therapy, vol.20, pp.417-424 (2012.7.12 オンライン発行)） 原査定の拒絶の理由において引用された、本願優先日前に日本国内又は外国において頒布された又は電気通信回線を通じて公衆に利用可能となった引用文献１は、「滑膜組織への遺伝子導入におけるＡＶＶベクターに対する液性免疫の優勢と薬理学的変調」と題する学術論文であって、次の事項が記載されている。（翻訳及び下線は当審による。以下、イ、ウ、オについても同様である。） （ア）「アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに対する抗体は、ヒトにおいて非常に多く存在する。前臨床研究および臨床研究の両方で、ＡＡＶに対する抗体は、低力価であっても、特にベクターが血中に導入された場合には、トランスダクションを阻害することが示されている。ここでは、関節リウマチ患者の血清中及びマッチした滑液（ＳＦ）中のＡＡＶ血清型２、５、６、８に対する中和抗体（ＮＡｂ）の力価を測定した。」（第４１７頁要約第１～４行） （イ）「ここでは、様々な抗体スクリーニング法を用いて、マッチした血清とＳＦサンプルの様々なＡＡＶ血清型に対する中和活性を測定し、抗ＡＡＶ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）サブクラスも分析した。」（イントロダクションの項。第４１７頁右欄第１３～１６行） （ウ）「次に、血清のＮＡｂ価を測定し、ＳＦサンプルをＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８にマッチングさせた。ＮＡｂ力価は、β－ガラクトシダーゼリポータジーンの残留活性を、ＮＡｂによるＡＡＶベクター中和のサロゲートとして測定する、先に記載したｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ１２を用いて決定した。」（結果の項。第４１８頁左欄第１３～１８行） （エ）「細胞培養アッセイにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＮＡｂの検出感度を向上させるために、我々はＡＡＶ導入遺伝子発現カセットをβ－ガラクトシダーゼを発現する一本鎖ゲノム（ｓｓＡＡＶ－ＬａｃＺ）からルシフェラーゼリポータトランスジーン（ｓｃＡＡＶ－Ｌｕｃ）を発現する自己相補的なゲノムに切り替えた。一本鎖ＡＡＶと比較してｉｎ ｖｉｔｒｏでの自己相補的ＡＡＶの導入効率が高いこと、およびβ－ガラクトシダーゼよりもルシフェラーゼの検出感度が高いことから、ＮＡｂアッセイでは５０～１５０倍低い感染の多重性を使用することが可能となった。」（結果の項。第４１８頁右欄第２１～３０行） （オ）「抗ＡＡＶ ＮＡｂがベクター導入の効率に影響を与えることを考えると、ＮＡｂ力価を測定する高感度で信頼性の高い方法の開発は、ほとんどの遺伝子導入戦略の成功に不可欠である。細胞ベースのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＮＡｂアッセイは、ＮＡｂの最も一般的に使用されるスクリーニングアッセイの一つである２３－２６、３２－３４。 しかし、これらのアッセイの一つの大きな限界は、ＡＡＶ２以外のＡＡＶ血清型のｉｎ ｖｉｔｒｏ感染効率が悪いことであり、検出できるリポータジーンシグナルを得るために高い感染倍率を必要とするのでＮＡｂ価を過小評価する結果となった。我々のデータは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでより高い導入効率を持つＡＡＶベクターを使用し、高感度で検出できるルシフェラーゼなどのリポータジーンを発現させることにより、この障害を少なくとも部分的に克服できることを示している。」（ディスカッションの項。第４２１頁右欄第１行～第４２２頁左欄第６行） （カ）「抗ＡＡＶ抗体判定 抗ＡＡＶ２、５、６及び８ＮＡｂ力価は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ中和アッセイを使用して、前述１２と同様に決定した。このアッセイでは、サイトメガロウイルスプロモーターの制御下でβ－ガラクトシダーゼを発現する一本鎖ベクター（ｓｓＡＡＶ－ＬａｃＺ）、またはニワトリβ－アクチンプロモーターの制御下でレニラルシフェラーゼリポータジーンを発現する自己相補ベクター２０、２１（ｓｃＡＡＶ－Ｌｕｃ）の２種類のＡＡＶベクター構築物が用いられた。ＡＡＶベクターのｉｎ ｖｉｔｒｏでの導入効率を上げるため、誘導性プロモーターの制御下でアデノウイルス遺伝子Ｅ４を発現する２Ｖ６．１１細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ、ＵＳＡ）を使用した。細胞を９６ウェルプレートに１．２５×１０４細胞/ウェルの密度で播種し、培地にポナステロンＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）の１：１０００希釈液を加え、Ｅ４の発現を誘導した。アッセイ当日、熱不活性化血清サンプルの連続半ログ希釈液をウイルスを含む培地と混合した。ｓｓＡＡＶ－ＬａｃＺベクターの場合、アッセイに使用したウイルス濃度は、ＡＡＶ２については～１×１０１０ｖｇｍｌ－１、ＡＡＶ５、６又は８については～５．５×１０１０ｖｇｍｌ－１だった。ｓｃＡＡＶ－Ｌｕｃベクターの場合、アッセイでのウイルス濃度は～５０倍から１５０倍低い。リポータジーンの残存活性は、比色アッセイ（ｓｓＡＡＶ－ＬａｃＺ）またはルミノメーター（ｓｃＡＡＶ－Ｌｕｃ）のいずれかを使用して測定した。」（材料と方法の項。第４２２頁右欄第２８～４６行） （キ）「ウイルスの生産 ＡＡＶ２末端逆位反復配列で挟まれたβ－ガラクトシダーゼカセット（ｓｓＡＡＶ－ＬａｃＺ）、およびレニラルシフェラーゼ発現のための自己相補性カセット（ｓｃＡＡＶ－Ｌｕｃ）は、ＡＡＶ２、５、６又は８血清型のいずれかのキャプシドにパッケージされた。」（材料と方法の項。第４２２頁右欄第６１～６５行） イ 引用文献２（Nature Medicine, vol.12, pp.342-347 (2006)） 引用文献１が参照する「文献１２」（上記ア（ウ））である引用文献２には、次の事項が記載されている。 「ＡＡＶに対する中和抗体アッセイ ＡＡＶ－２特異的ＮＡＢ力価は、以前に記載されたように決定された６。」（第３４６頁右側欄下から第１９行～下から第１８行） ウ 引用文献３（Nature Genetics, vol.24, pp.257-261 (2000)） 引用文献２が参照する「文献６」（上記イ）である引用文献３には、次の事項が記載されている。 「抗体アッセイ ｌａｃＺを発現するＡＡＶベクターを連続希釈した患者血清とインキュベートすることにより、ＡＡＶ中和抗体価を決定し、この混合物をＨＥＫ２９３細胞に導入した。２４時間後に細胞を溶解し、ＯＮＰＧアッセイ１６を用いて酵素活性を測定した。サンプルは、β-ガラクトシダーゼ活性を測定するためにＯＤ４２０で読み取った。ＯＤ４２０がｒＡＡＶ－ｌａｃＺが陰性対照マウス血清とプレインキュベートされたときに観察される値の５０％以下であった場合、血清はＡＡＶ抗体を中和するための陽性としてスコア付けされた。陽性サンプルは力価を測定した、ＡＡＶ中和抗体の力価はＯＮＰＧアッセイに基づいて５０％でｒＡＡＶ－ＬａｃＺの感染を阻害する希釈物として示される。」（第２６０頁右側欄下から第２０行～下から第１１行） エ 周知例１（「改訂 培養細胞実験ハンドブック」（２００９年１月１日羊土社発行）第４２～４８頁） 「細胞は生物である。３０億年の歴史を経て、脈々と受け継がれてきた生物である。人間はさまざまな感染症に悩まされているし、長く生きていると遺伝子変異が蓄積して癌などの病気を発症する。細胞も同じである。長期間培養された細胞に変異が蓄積することは不可避なことである。それ故、細胞バンクでは、継代数（パッセージ数）を極力増やさない工夫と努力をしている。提供後の細胞も２０～３０パッセージ以内で使用を完了し、それを超えた場合には新たに細胞バンクから入手し直すことを推奨したい。」（第４８頁左欄第６～１５行） オ 周知例２（国際公開第２０１２／０６１５２９号） 「［００４６１］ 実施例４１． 安定した細胞株 細胞質中でまたは分泌型として本発明のＯｇＬｕｃ変異体を発現する、頑強で安定した細胞株の特定は、ルシフェラーゼの明るいシグナルおよび小サイズのＯｇＬｕｃ遺伝子によって容易となり得る。比較的小さな遺伝子配列は、外来ＤＮＡ組込みによってもたらされる遺伝的不安定性の可能性を減少させるはずである。 ［００４６２］ 本発明のＯｇＬｕｃ変異体を用いて安定な細胞株を作製するために、ＯｇＬｕｃ変異体および選択マーカー遺伝子、例えば、ネオマイシン、ハイグロマイシン、またはピューロマイシンのヌクレオチド配列を含むプラスミドＤＮＡを、目的の細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３細胞の形質移入に使用する。初期継代数、例えば１０継代未満の細胞を、Ｔ２５（１×１０6）またはＴ７５（３×１０6）組織培養フラスコに播種し、一晩増殖させて、およそ７５％コンフルエントにする。次に、細胞を、上記プラスミドＤＮＡおよび適切な形質移入試薬、例えば、ＴＲＡＮＳＩＴ（登録商標）－ＬＴ１またはＦＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤを用いて形質移入する。形質移入の４８時間後、培地を、細胞上で、選択薬剤、例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはピューロマイシンを、未形質移入細胞を死滅させるのに予め決定された濃度で含有する選択培地で置き換える。プラスミドＤＮＡを含有する細胞の選択は２～４週間かけて行われる。この期間中、細胞を、選択培地中で種々の濃度で、Ｔ２５またはＴ７５組織培養フラスコのいずれかに再播種する。再播種された細胞上の培地は、２～３週間、３～４日毎に、新しい選択培地と取り換える。フラスコは生細胞コロニーの情報を求めてモニターされる。最終的に、フラスコは、多くの大コロニーを含むが、死細胞はほとんど含まない。 ［００４６３］ フラスコ中の安定したコロニーのプールから、単一コロニーを単離し、１枚の２４ウェル組織培養プレート中に増殖させる。簡潔に説明すると、細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ法を用いて回収する。すなわち、培地を除去し、Ｃａ2+およびＭｇ2+を含有しないＰＢＳで洗い、トリプシン／ＥＤＴＡで処理することにより剥離して、細胞を回収する。細胞を、血球計数器を用いて計数し、完全培地中で１×１０5に希釈する。次に、細胞を、完全培地中で１００細胞／ｍＬ、３３細胞／ｍＬ、１０細胞／ｍＬ、および３．３細胞／ｍＬに希釈する。１００μＬの各希釈物を、９６ウェル組織培養プレートの全ウェルに播種し（各希釈に対し１プレート）、４～５日間増殖させて、その後、５０μＬの選択培地を細胞に加える。播種からおよそ１週間後、細胞を、コロニー増殖を求めて目視で選別し、別の５０μＬの選択培地を加える。単一コロニーがウェルの面積の４０～６０％を占めるまで、細胞を継続的にモニターする。コロニーが増殖および選別できる状態であるとき、トリプシン／ＥＤＴＡ法を用いてコロニーを回収する。各コロニーを以下のように選択培地に移す：１）機能アッセイ、例えば発光検出用に、１：１０に希釈して、９６ウェルアッセイプレートの６ウェルに移す；２）細胞生存率アッセイ、例えば細胞ＴＩＴＥＲ－ＧＬＯ（登録商標）発光細胞生存率アッセイ（プロメガ社）用に、１：１０に希釈して、透明底９６ウェルアッセイプレートの３ウェルに移す；並びに３）増殖用に、１：１０に希釈し、２４ウェル組織培養プレートに移す。次に、機能アッセイおよび細胞生存率アッセイ用のプレート中の細胞を２～３日間増殖させて、機能アッセイおよび細胞生存率アッセイを行う。２４ウェルプレート中の陽性クローンを、機能アッセイおよび細胞生存率アッセイを用いてさらに試験し、さらに、少なくとも２０継代の間の発現および応答の安定性、正常な増殖率形態を試験し、将来での使用のために可能な限り早期の継代で凍結する。」 カ 周知例３（国際公開第２０１２／０４２６８４号） 「［００７７］（実施例１） キメラＧαサブユニットとしてＧｉ/ｏｌｆ１３を具備する、キメラＧタンパク質が採用された。カリウムイオンチャネルとしては、変異型カリウムイオンチャネルKir3.1(F137S)が採用された。化学物質受容体としては、β１アドレナリン受容体が採用された。 ［００７８］ （キメラＧタンパク質発現細胞の調製） ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、plasmid（βＡＲ）、plasmidKir3.1(F137S)、およびplasmid（Ｇｉ／ｏｌｆ１３）を発現させた。当該発現の手順が以下に示される。約８０％コンフルエントに培養したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を回収し、新たな培養シャーレに蒔いた。使用した細胞の継代数は１０代以内であった。ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ(fetal bovine serum)、ストレプトマイシン）が用いられた。２４時間培養後、トランスフェクション試薬を用いて当該細胞にプラスミドが導入された。当該細胞はプラスミド導入後４８時間培養され、キメラＧタンパク質発現細胞が調製された。」 （２）引用発明 引用文献１には、間接リウマチ患者の体液性免疫の有病率を知るために、当該患者の血清中のＡＡＶに対する中和抗体（ＮＡｂ）の力価を、２種類のＡＡＶベクター構築物を用いて、参照文献１２に記載されたｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ法により、測定したことが記載されている（上記（１）ア（ア）～（ウ）、（カ））。ここで、ＡＡＶベクター構築物の１つは、サイトメガロウイルスプロモーターの制御下でβ－ガラクトシダーゼリポータジーンを発現する発現カセットを有する一本鎖ベクター（ｓｓＡＡＶ－ＬａｃＺ）であり、もう１つは、ニワトリβ－アクチンプロモーターの制御下でレニラルシフェラーゼリポータジーンを発現する発現カセットを有する自己相補ベクター（ｓｃＡＡＶ－Ｌｕｃ）であって、両方とも、発現カセットはＡＡＶ２末端逆位反復配列で挟まれており、ＡＡＶのキャプシドにパッケージされて使用されたことが記載されている（上記（１）ア（エ）～（キ））。そして、アッセイ法については参照文献１２を引用しており、詳細には記載されていないものの、アデノウイルス遺伝子Ｅ４を発現する２Ｖ６．１１細胞を用いること、血清サンプルをウイルスを含む培地と混合すること、及び、リポータジーンの残存活性を測定することが記載され（上記（１）ア（カ））、ここで血清サンプルと混合されるウイルスとは、ＡＡＶベクター構築物をパッケージしたＡＡＶのキャプシドのことと解されるから、引用文献１には、次のとおりの発明が記載されているといえる。 「ＡＡＶに対する中和抗体の力価を測定するための方法であって、 サイトメガロウイルスプロモーターの制御下でβ－ガラクトシダーゼリポータジーンを発現する発現カセットをＡＡＶ２末端逆位反復配列で挟まれた形で有する一本鎖ベクター（ｓｓＡＡＶ－ＬａｃＺ）、または、ニワトリβ－アクチンプロモーターの制御下でレニラルシフェラーゼリポータジーンを発現する発現カセットをＡＡＶ２末端逆位反復配列で挟まれた形で有する自己相補ベクター（ｓｃＡＡＶ－Ｌｕｃ）をパッケージしたＡＡＶキャプシドを用意するステップ ２Ｖ６．１１細胞を用意するステップ 上記ＡＡＶキャプシドを含む培地と関節リウマチ患者からの血清サンプルを混合するステップ リポータジーンの残存活性を測定するステップ ＡＡＶに対する中和抗体の力価を、参照文献１２に記載されたｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにより決定するステップ を含む方法。」（以下、「引用発明」という。） （３）対比 本願補正発明と引用発明とを対比すると、引用発明の「ＡＡＶに対する中和抗体の力価を測定するための方法」、「サイトメガロウイルスプロモーターの制御下でβ－ガラクトシダーゼリポータジーンを発現する発現カセットをＡＡＶ２末端逆位反復配列で挟まれた形で有する一本鎖ベクター（ｓｓＡＡＶ－ＬａｃＺ）」、「ニワトリβ－アクチンプロモーターの制御下でレニラルシフェラーゼリポータジーンを発現する発現カセットをＡＡＶ２末端逆位反復配列で挟まれた形で有する自己相補ベクター（ｓｃＡＡＶ－Ｌｕｃ）」、「ＡＡＶキャプシド」、及び「リポータジーンの残存活性を測定するステップ」は、それぞれ、本願補正発明の「ＡＡＶに結合する抗体を、測定及び定量するための方法」、「前記ベクターが、リポータトランスジーンを含み、（ｉｉ）前記リポータトランスジーンが自己相補的ゲノムを含むと共に、（ｉｉｉ）前記リポータトランスジーンが、１つ又は複数の発現調節エレメントに作動可能に連結され、かつ１つ又は複数のフランキングエレメントによってフランキングされている」、「前記ベクターが、リポータトランスジーンを含み、（ｉｉ）前記リポータトランスジーンが一本鎖ゲノムを含むと共に、（ｉｉｉ）前記リポータトランスジーンが、１つ又は複数の発現調節エレメントに作動可能に連結され、かつ１つ又は複数のフランキングエレメントによってフランキングされている」、「ＡＡＶ粒子」、及び「前記リポータトランスジーンの発現を測定するステップ」に相当する。そして、引用発明の「２Ｖ６．１１細胞」は、本願明細書（段落【０１１０】）に記載され、細胞株保存機関のリスト（例えば、https://www.cellosaurus.org/CVCL_6355）にも掲載されているとおり、アデノウイルスのＥ４遺伝子を安定的に発現するＨＥＫ－２９３細胞であるから、本願補正発明と引用発明は、 「ＡＡＶに結合する抗体を、測定及び定量するための方法において、以下： （ａ）組換えベクターを包膜する感染性組換えＡＡＶ粒子を用意するステップであって、 （ｉ）前記ベクターが、リポータトランスジーンを含み、（ｉｉ）前記リポータトランスジーンが、一本鎖若しくは自己相補的ゲノムを含むと共に、（ｉｉｉ）前記リポータトランスジーンが、１つ又は複数の発現調節エレメントに作動可能に連結され、かつ１つ又は複数のフランキングエレメントによってフランキングされている、ステップ； （ｂ）前記感染性組換えＡＡＶ粒子に感染し得るＨＥＫ－２９３細胞を用意するステップ； （ｃ）（ａ）の感染性組換えＡＡＶ粒子を被験者からの生体サンプルと接触させることによって得られる混合物（Ｍ）を生成するステップ； （ｅ）前記リポータトランスジーンの発現を測定するステップ を含む方法。」 である点で一致し、次の２点で相違する。 相違点１：本願補正発明では、「（ｄ）得られた混合物（Ｍ）と（ｂ）のＨＥＫ－２９３細胞を、（ａ）の前記感染性組換えＡＡＶ粒子が、前記ＨＥＫ－２９３細胞中の前記リポータトランスジーンに感染して、これを発現させることを可能にする条件下で、接触させるステップ」及び「（ｆ）（ｅ）の前記リポータトランスジーン発現をＡＡＶに結合する抗体が欠失した陰性（－）対照のリポータトランスジーン発現と比較するステップであって、これによって、前記生体サンプル中のＡＡＶに結合する抗体を測定及び定量するステップ」を含むことが特定されているのに対して、引用発明ではそのような特定がない点。 相違点２：「感染性組換えＡＡＶ粒子に感染し得るＨＥＫ－２９３細胞」の「最初の解凍後の継代数」が、本願補正発明では「２５継代まで」と特定されているのに対して、引用発明では特定されていない点。 （４）判断 ア 相違点１について 引用文献１においては、アッセイ法については参照文献１２（引用文献２）を引用しており（上記（１）ア（ウ））、詳細には記載されていないため、当該参照文献１２（引用文献２）を参照すると、アッセイ法の詳細は記載されておらず、さらに参照文献６（引用文献３）が引用されている（上記（１）イ）。そして、当該参照文献６（引用文献３）には、抗体アッセイは、ｌａｃＺを発現するＡＡＶベクターを患者血清とインキュベートしてなる混合物をＨＥＫ－２９３細胞に導入してβ－ガラクトシダーゼ活性を測定することにより行うこと、及び、患者血清のβ－ガラクトシダーゼ活性を、陰性対照マウス血清の値に対する割合として測定及び定量することが記載されている。ここで、β－ガラクトシダーゼはｌａｃＺの発現産物であることが周知だから、参照文献６（引用文献３）に記載された抗体アッセイは、リポータジーンであるｌａｃＺを含むＡＡＶベクターを患者血清と接触させることによって得られる混合物を、ＨＥＫ－２９３細胞中のレポータジーンに感染してこれを発現させることを可能にする条件下で接触させるステップを含むものであるといえる。また、参照文献６（引用文献３）における陰性対照マウス血清は、ＡＡＶに結合する抗体を含まないことが明らかだから、参照文献６（引用文献３）に記載された抗体アッセイは、患者血清のリポータジーン発現をＡＡＶに結合する抗体が欠失した陰性対照マウス血清のリポータジーン発現と比較するステップを含むものであるといえる。 したがって、引用文献１が引用する参照文献１２（引用文献２）、当該参照文献１２（引用文献２）が引用する参照文献６（引用文献３）の記載を参照すれば、引用発明は、上記相違点１に係る構成を備えていると認められるから、上記相違点１は実質的な相違点ではない。 イ 相違点２について 一般に、培養細胞は、継代を重ねると変異が蓄積して機能等が変化して、それを用いた実験結果の信頼性に悪影響を与えるため、２０～３０継代以内で使用を完了することが、本願優先日当時、周知技術であった（例えば、周知例１の第４８頁左欄第１０～１５行。通常、細胞は凍結保存されていることから、当該継代数は最初の解凍後の継代数を意味する。）。ＨＥＫ－２９３細胞についても、当該周知技術が当てはまることは、周知例２（上記（１）オ）や周知例３（上記（１）カ）からも明らかである。 そうすると、引用発明で用いる「感染性組換えＡＡＶ粒子に感染し得るＨＥＫ－２９３細胞」を「最初の解凍後の継代数」が２０～３０継代まで、例えば２５継代までのＨＥＫ－２９３細胞とすることは当業者が容易に推考しうる程度のことにすぎない。 ウ 本願補正発明の効果について 明細書には、ＨＥＫ２９３細胞（２Ｖ６．１１細胞）の継代数とシグナル強度との関係を検討した実験として実施例４（【０１３５】～【０１３７】、図１、２）が記載されているが、「決して２５回超継代しなかった」（【０１３６】）と記載されているとおり、いずれも２５継代までしか実験が行われていないため、「最初の解凍後の継代数が２５継代までのＨＥＫ－２９３細胞」を用いる本願補正発明が、２６継代以降の細胞を用いる場合と比較して格別顕著な効果を奏すると認めることはできない。 請求人は、令和３年１２月２日提出の審判請求書及び令和４年８月１５日提出の上申書において、甲第１号証（https://bite sizebio.com/45489/guide-to-hek293-cells/）及び甲第２号証（https://www.synthego.com/hek293）を示して、ＨＥＫ－２９３細胞は継代数を２０継代未満とすることが本願優先日前の当業者の技術常識であったところ、本願補正発明によれば、２５継代まではＡＡＶ ＮＡｂ力価のアッセイ結果に影響を与えないという当業者が予期し得なかった顕著な効果がある旨、従来よりも多くの回数にわたって継代された細胞を用いることができるため、細胞の解凍のための時間を節約でき、細胞をより有効に利用できるという有利な効果を奏する旨、主張する。 しかし、本願補正発明は、「最初の解凍後の継代数が２５継代まで」と特定するのみで、２０継代未満の場合も包含するのだから、請求人が主張する上記効果は本願補正発明特有の効果であるとは認められない。 なお、甲第１号証（２０２１年９月２７日発行）及び甲第２号証（Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ２０２１）は、本願優先日（２０１３年７月１３日）よりも後に公知となったものではあるが、念のため内容を検討すると、甲第１号証には「もし細胞株が２０継代以上培養されている場合、新しいストックを解凍し、もう一度始めるのが最善である。」（第２頁下から第３～１行）、甲第２号証には「正確な最大継代数については議論があるが、一般に２０継代以下が最良と考えられている。」（第６頁下から第４～３行）と記載され、いずれも２０継代程度までに使用を完了することが好ましいことを示すにとどまっており、ＨＥＫ－２９３細胞には、２０～３０継代以内で使用を完了することを推奨するという上記周知技術（上記第２の２（１）エ）は当てはまらず、２０継代以上の使用を阻害する事情があるとは認めることができない。 エ 小括 上記ア～ウのとおり、本願補正発明は、引用文献１、それが直接又は間接的に引用する引用文献２、３に記載された発明及び周知技術に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により、特許出願の際独立して特許を受けることができないものである。 （５）むすび 以上のとおりであるから、本件補正は、特許法第１７条の２第６項で準用する同法第１２６条第７項の規定に違反するものであり、同法第１５９条第１項の規定において読み替えて準用する同法第５３条第１項の規定により却下されるべきものである。 第３ 本願発明について １ 本願発明 令和３年１２月２日付の手続補正は上記のとおり却下されたので、本願の請求項１に係る発明は、上記第２の１に「本願発明」として記載した、以下のとおりのものである。 「ＡＡＶに結合する抗体を、測定又は定量するための方法において、以下： （ａ）組換えベクターを包膜する感染性組換えＡＡＶ粒子を用意するステップであって、 （ｉ）前記ベクターが、リポータトランスジーンを含み、（ｉｉ）前記リポータトランスジーンが、一本鎖若しくは自己相補的ゲノムを含むと共に、（ｉｉｉ）前記リポータトランスジーンが、１つ又は複数の発現調節エレメントに作動可能に連結され、かつ１つ又は複数のフランキングエレメントによってフランキングされている、ステップ； （ｂ）前記感染性組換えＡＡＶ粒子に感染し得る細胞を用意するステップ； （ｃ）（ａ）の感染性組換えＡＡＶ粒子を被験者からの生体サンプルと接触させるか、又はインキュベートし、これによって得られる混合物（Ｍ）を生成するステップ； （ｄ）得られた混合物（Ｍ）と（ｂ）の細胞を、（ａ）の前記感染性組換えＡＡＶ粒子が、前記細胞中の前記リポータトランスジーンに感染して、これを発現させることを可能にする条件下で、接触させるステップ； （ｅ）前記リポータトランスジーンの発現を測定するステップ；並びに （ｆ）（ｅ）の前記リポータトランスジーン発現をＡＡＶに結合する抗体が欠失した陰性（－）対照のリポータトランスジーン発現と比較するステップであって、これによって、前記生体サンプル中のＡＡＶに結合する抗体を測定又は定量するステップ を含む方法。」 ２ 原査定の拒絶の理由 原査定の拒絶の理由は、以下のとおりのものである。 本願発明は、本願優先日前に日本国内又は外国において頒布された又は電気通信回線を通じて公衆に利用可能となったGene Therapy, vol.20, pp.417-424 (2012.7.12 オンライン発行)（上記第２の２（１）アの「引用文献１」）、Nature Medicine, vol.12, pp.342-347 (2006)（上記第２の２（１）イの「引用文献２」）、及びNature Genetics, vol.24, pp.257-261 (2000)（上記第２の２（１）ウの「引用文献３」）に記載された発明であるか、そうでないとしても、当該発明に基づいて、その優先日前にその発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第１項第３号に該当するか、同条第２項の規定により特許を受けることができない。 ３ 引用文献の記載事項 原査定の拒絶の理由に引用された引用文献１～３の記載事項は、上記第２の２（１）ア～ウに記載したとおりである。 ４ 対比・判断 本願発明は、前記第２の２で検討した本願補正発明の「測定及び定量するための方法」を「測定又は定量するための方法」とし、「感染性組み換えＡＡＶ粒子に感染し得る細胞」が「ＨＥＫ－２９３細胞であって最初の解凍後の継代数が２５継代までのＨＥＫ－２９３細胞」であるとの限定事項を削除したものである。当該限定事項は、本願補正発明と引用発明との相違点２に係る構成であるから、本願発明と引用発明との間に当該相違点２は存在しないといえる。また、本願補正発明と引用発明との相違点１は、上記第２の２（４）アのとおり、実質的な相違点ではないから、本願発明と引用発明とは実質的に相違しないものである。 したがって、本願発明は、引用文献１が直接又は間接的に引用する引用文献２、３を参照すれば、引用文献１に記載された発明であるといえる。 第４ むすび 以上のとおり、本願発明は、特許法第２９条第１項第３号に該当し、又は同条第２項の規定により特許を受けることができないものであるから、その余について検討するまでもなく、本願は拒絶すべきものである。 よって、結論のとおり審決する。