2021-012062

特願２０１８－５４１５２４「非造血組織常在性γδ Ｔ細胞の増幅および該細胞の使用」拒絶査定不服審判事件〔平成２９年 ５月 ４日国際公開、ＷＯ２０１７／０７２３６７、平成３０年１１月１５日国内公表、特表２０１８－５３３３７３〕について、次のとおり審決する。

結 論 本件審判の請求は、成り立たない。

理 由 第１ 手続の経緯 本願は、平成２８年１０月３１日（パリ条約による優先権主張 ２０１５年１０月３０日 （ＧＢ）英国（グレートブリテン及び北アイルランド連合王国） ２０１６年 ７月２２日 （ＧＢ）英国（グレートブリテン及び北アイルランド連合王国））を国際出願日とする出願であって、主な手続の経緯は以下のとおりものである。 令和 ２年 ７月１４日付け 拒絶理由通知書 令和 ３年 １月２５日 手続補正書・意見書の提出 令和 ３年 ４月２２日付け 拒絶査定 令和 ３年 ９月１０日 審判請求書・手続補正書の提出 第２ 令和３年９月１０日付けの手続補正についての補正の却下の決定 ［補正の却下の決定の結論］ 令和３年９月１０日付けの手続補正を却下する。 ［理由］ １ 補正の内容 令和３年９月１０日付けの手続補正（以下、「本件補正」という。）は、特許請求の範囲の請求項１を以下のように補正することを含むものである。 補正前： 「【請求項１】 インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）およびＩＬ－２の存在下で、ヒトまたは非ヒト動物の非造血組織から取得されるリンパ球を培養するステップを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏで非造血組織常在性γδ Ｔ細胞を増幅するための方法であって、該リンパ球は、培養中に間質細胞または上皮細胞と直接的に接触しないものであり、該リンパ球が外因的に添加されるＴ細胞受容体経路アゴニストの非存在下で培養される、上記方法。」 補正後： 「【請求項１】 インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）およびＩＬ－２の存在下で、ヒトまたは非ヒト動物の非造血組織から取得されるリンパ球を培養するステップを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏで非造血組織常在性γδ Ｔ細胞を増幅するための方法であって、該リンパ球は、間質細胞または上皮細胞の非存在下で培養されるものであり、該リンパ球が外因的に添加されるＴ細胞受容体経路アゴニストの非存在下で培養される、上記方法。」（下線部は、補正箇所である。） ２ 補正の適否 本件補正は、請求項１の「ヒトまたは非ヒト動物の非造血組織から取得されるリンパ球を培養するステップ」について、補正前には、該リンパ球が「培養中に間質細胞または上皮細胞と直接的に接触しない」ものであると特定されていたところを「間質細胞または上皮細胞の非存在下で培養される」ものであると補正するものである。 ここで、補正前の「ヒトまたは非ヒト動物の非造血組織から取得されるリンパ球」が「培養中に間質細胞または上皮細胞と直接的に接触しない」という発明特定事項には、発明の詳細な説明の段落【００２６】に記載されるように（１）上記リンパ球が間質細胞または上皮細胞の非存在下で培養される態様に加え、段落【００９７】に記載されるように（２）間質細胞または上皮細胞がリンパ球の培養中に存在するが、物理的に分離されることによって直接的に接触しない態様が含まれるものと認められる。 そうすると、本件補正は、補正前の請求項１が上記（１）および（２）の態様を含むものであったところ、上記（２）の、間質細胞または上皮細胞が、リンパ球の培養中に存在するが該リンパ球と直接的に接触しない態様を除いて、上記（１）の、リンパ球が間質細胞または上皮細胞の非存在下で培養される態様に限定するものであるといえるから、特許法第１７条の２第５項第２号に掲げる特許請求の範囲の減縮を目的とするものに該当する。 そこで、本件補正後の特許請求の範囲の請求項１に係る発明（以下、「本願補正発明」という。）が特許出願の際独立して特許を受けることができるものであるかどうか（特許法第１７条の２第６項において準用する同法第１２６条第７項の規定に適合するかどうか）について以下に検討する。 （１）本願明細書及び図面の記載事項 ア 本願明細書の記載事項 本願明細書には、以下の事項が記載されている。なお、下線は当審にて付した。以下、同様である。 （本ア） 「【００１４】 ・・・初代αβ Ｔ細胞の増幅での努力が、有益な増殖因子の供給源として他の支持細胞との共培養を一般的に用いてきた一方で（２９）、本発明者らは、予期せぬことに、皮膚および他の非造血組織に常在するγδ Ｔ細胞が、自家皮膚線維芽細胞および潜在的には他の間質成分（ケラチン生成細胞および内皮細胞など）と接触させてこれらの細胞を共培養することにより、大いにかつ特異的に抑制されることを示した。そのような相互作用の除去は、潜在的な臨床応用のために、該細胞を、大量に、迅速に増幅することを可能にする。 ・・・ 【００１６】 本明細書中には、皮膚および腸などの、ヒトまたは非ヒト動物非造血組織から、γδ Ｔ細胞を効率的かつ再現可能に単離および増幅するための新規な手段が開示される。増幅は、非造血組織由来非Ｖδ２ Ｔ細胞と、自家線維芽細胞および潜在的には他の間質成分との接触を分断することにより促進され、かつインターロイキン－２（ＩＬ－２）および／またはインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）中での培養により維持される。 【００１７】 αβ Ｔ細胞またはＶδ２発現Ｔ細胞またはＮＫ細胞の増幅は、自家線維芽細胞とのそれらの接触を分断することにより誘導されないので、増幅は非常に選択的である（図３Ａ、３Ｃ、および３Ｄ）。線維芽細胞媒介型チェックポイント調節からの解放による非造血組織常在性γδ Ｔ細胞のこの増幅はまた、細胞のエフェクター能の「自発的」活性化もまた引き起こし（図５Ａおよび５Ｂ）、このことは、抗腫瘍活性の文脈では非常に望ましい。・・・」（段落【００１４】～【００１７】） （本イ） 「【００２６】 一実施形態では、ヒトまたは非ヒト動物非造血組織から取得されるリンパ球は、間質細胞または上皮細胞の非存在下で培養することができる。例えば、間質細胞または上皮細胞を、培養に先立って除去することができる。好ましくは、ヒトまたは非ヒト動物非造血組織から取得されるリンパ球は、線維芽細胞の非存在下で培養することができる。例えば、線維芽細胞を、培養に先立って除去することができる。 ・・・ 【００２９】 ・・・方法は、ヒトまたは非ヒト動物非造血組織のサンプルを提供するステップ、および該サンプルの非造血細胞からリンパ球を分離して、間質細胞を実質的に含まないリンパ球集団を作製するステップを含むことができる。 ・・・ 【００３１】 非造血組織から取得されるγδ Ｔ細胞の集団は、γδ Ｔ細胞の実質的に純粋な集団であり得る。 ・・・ 【００３６】 第３の態様では、本発明は、以下のステップ：（ｉ）非造血細胞およびγδ Ｔ細胞を含む非造血組織を提供するステップ；（ｉｉ）非造血細胞からγδ Ｔ細胞を分離して、間質細胞を実質的に含有しない、γδ Ｔ細胞を含む集団を作製するステップ；および（ｉｉｉ）ＴＣＲ活性化シグナルまたは共刺激シグナルの非存在下でステップ（ｉｉ）の集団を培養して、γδ Ｔ細胞の増幅された集団を作製するステップを含む、γδ Ｔ細胞を増幅するための方法を提供する。」（段落【００２６】～【００３６】） （本ウ） 「【００５８】 ・・・ 【図３Ａ－１】皮膚常在性γδ Ｔ細胞のみが、強い活性化および増殖を伴って、皮膚間質からの分離に対して応答することを示す図である。図３Ａ：皮膚常在性リンパ球は、Ｃｌａｒｋプロトコールを用いて単離した。３週間の器官型培養後、皮膚リンパ球を回収し、線維芽細胞をはじめとするいかなる残余の皮膚細胞からも分離し、１百万個のリンパ球／ｍＬの密度で組織培養ウェルに移し、１００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を添加した。さらに３週間後、常在性γδ Ｔ細胞は著しく増幅しており、皮膚リンパ球培養物中で富化されていた。この著明な増殖現象は、皮膚常在性γδ Ｔ細胞に限定されており、このことは、大多数のＶδ１＋ Ｔ細胞が３週間のうちに平均して１２７．１８倍に増殖し、一方で、従来のαβ Ｔ細胞は平均で５．２１倍しか増殖しなかった（これは２０倍を超えて低いことになる）ことにより表わされる。 ・・・ 【図６Ａ】ヒト腸内の組織常在性γδ Ｔ細胞の分析を示す図である。図６Ａ：Ｃｌａｒｋプロトコールを適応させることにより、腸常在性リンパ球の単離が可能になった。混合型腸リンパ球は、通常は主にＶδ１細胞を含むが、Ｖδ２細胞および二重陰性γδ Ｔ細胞もまた含有する組織常在性γδ Ｔ細胞の大きな集団を含む。 【図６Ｂ】ヒト腸内の組織常在性γδ Ｔ細胞の分析を示す図である。図６Ｂ：腸器官型培養から単離されたγδ Ｔ細胞は、それらが腸間質から分離されれば時間と共にＫｉ－６７をアップレギュレーションするので、皮膚由来γδ Ｔ細胞と類似の応答を示す。 ・・・ 【図１２】ＩＬ－２（左側パネル）、ＩＬ－１５（中央パネル）およびＩＬ－２＋ＩＬ－５（右側パネル）中でのＶδ１ Ｔ細胞の増幅を示す図である。新鮮に単離された皮膚由来リンパ球を、１０％ＦＣＳおよび１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含有するＲＰＭＩ培地中、９６ウェル平底プレートで培養し、ＩＬ－２、ＩＬ－１５またはＩＬ－２＋ＩＬ－１５のいずれかをそれぞれ７日間添加した。ＩＬ－２およびＩＬ－１５の両方ならびに２種類のサイトカインの組み合わせが、間質細胞の非存在下でのアイソタイプ（真の陰性）染色と比較したＫｉ－６７染色でのシフトにより示される通り、Ｖδ１ Ｔ細胞の増殖を誘導した。・・・」（段落【００５８】） （本エ） 「【００６７】 リンパ球は、いずれかの好適なヒトまたは非ヒト動物非造血組織から取得することができる。非造血組織は、血液、骨髄または胸腺組織以外の組織である。・・・そのような好適なヒトまたは非ヒト動物非造血組織の例としては、皮膚もしくはその一部分（例えば、真皮、表皮）、消化管（例えば、消化管上皮、結腸、小腸、胃、虫垂、盲腸、または直腸）、乳腺組織、肺（好ましくは、この場合、組織は気管支肺胞洗浄により取得されない）、前立腺、肝臓、脾臓および膵臓が挙げられる。・・・非造血組織サンプルは、標準的な技術により、例えば、外植片（ｅｘｐｌａｎｔ）（例えば、生検）により、取得することができる。 【００６８】 リンパ球は、ヒトまたは非ヒト動物非造血組織からのリンパ球の単離を可能にするいずれかの好適な方法により取得することができる。１つのそのような方法は、Ｃｌａｒｋらの文献（２９）中に説明されており、該文献は、ヒト皮膚からリンパ球を単離するための三次元皮膚外植片プロトコールを記載している。外植片は、スキャホールド上への外植片からのリンパ球の放出を容易にするために、合成スキャホールドに接着させることができる。・・・この方法および他の方法を、複数の他の非造血組織タイプ（例えば、腸、前立腺および乳房）からリンパ球を単離するための用いることができる。 ・・・ 【００７１】 重要なステップは、非造血組織常在性Ｔ細胞（例えば、αβ Ｔ細胞、γδ２ Ｔ細胞および非γδ２ Ｔ細胞を例えば含むことができる、混合型リンパ球集団内の）を、Ｔ細胞が取得された組織の非造血細胞（例えば、間質細胞、特に線維芽細胞）から意図的に分離するステップ（例えば、数日間または数週間の培養後）、および下記で説明される通りのサイトカイン中でのリンパ球としての細胞のその後の培養ステップである。これは、組織由来γδ１ Ｔ細胞およびＤＮ γδ Ｔ細胞の、引き続く数日間および数週間にわたる選択的かつ著しい増幅を可能にする。 【００７２】 本明細書中で用いる場合、「分離」、「分離された」または「分離する」こととは、異なる細胞集団の間の物理的接触を破壊または妨害する動作を意味する。分離は、例えば、膜同士の結合を妨害するために細胞の混合集団を強くピペッティングすることにより、またはＣａｒｒａｓｃｏら（３０）により記載される通り、例えば、ケモカインまたはサイトカインと共に培養することにより、例えば、組織マトリックスから細胞の集団の「クロールアウト」を誘導することにより、行なうことができる。分離は、トランスウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）培養システムを用いて、または異なる細胞集団同士の物理的接触を妨げる同様の培養法により、培養の間、維持することができる。 【００７３】 本明細書中で用いる場合、「実質的に純粋な」とは、個数、質量、または体積により９０％超の純度を意味する。「実質的に含まない」とは、個数、質量、または体積により５％未満の所定の構成要素を有することを意味する。・・・」（段落【００６７】～【００７３】） （本オ） 「【００７８】 ＩＬ－２と組み合わせたＩＬ－１５の添加が、ＩＬ－２単独と比較して増殖性非造血組織常在性γδ Ｔ細胞の増幅の強化をもたらすので、リンパ球は、好ましくは、ＩＬ－２およびＩＬ－１５の存在下で培養される。ＩＬ－１５の濃度は、好ましくは少なくとも１０ｎｇ／ｍＬである。」（段落【００７８】） （本カ） 「【００８６】 一部の実施形態では、リンパ球は、ＣＤ３および／もしくはＣＤ２８活性化因子（例えば、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８モノクローナル抗体）；フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）；コンカナバリンＡ、合成ホスホ抗原（ＢｒＨＰＰ（ブロモヒドリンピロリン酸）、２Ｍ３Ｂ１ＰＰ（２－メチル－３－ブテニル－１－ピロリン酸）、ＨＭＢＰＰ（（Ｅ）－４－ヒドロキシ－３－メチル－ブタ－２－エニルピロリン酸）、またはＩＰＰ（イソペンテニルピロリン酸）など）；Ｎ－ビスホスホネート（ゾレドロネートなど）；組み換えＣＤ７０；抗ＣＤ２モノクローナル抗体；抗ＣＤ２７モノクローナル抗体；抗汎ＴＣＲγδ抗体：抗ＣＤ２７７モノクローナル抗体；または人工的抗原提示細胞（ａＡＰＣ）などの、外因的に添加されたＴ細胞受容体経路アゴニストの非存在下で培養することができる。Ｔ細胞シグナル伝達を活性化する物質としては、抗原提示細胞（ＡＰＣ）または人工的ＡＰＣと結合したＭＨＣ複合体またはＨＬＡ複合体などの、細胞表面結合型分子も挙げられる。ＴＣＲ経路アゴニストを外因的に添加することによりＴ細胞を活性化する好適な方法は、当技術分野で周知であり、かつＤｅｎｉｇｅｒらの文献（４４）のＦｉｇｕｒｅ １に概要が示されている。」（段落【００８６】） （本キ） 「【００９８】 Ｃｌａｒｋプロトコールを用いると、非造血組織常在性リンパ球を、例えば、しっかりとピペッティングすることにより、皮膚線維芽細胞などの間質細胞から回収および分離することができる。リンパ球回収物は、プロセス中に結合が緩やかになっている可能性がある線維芽細胞凝集体を保持するために、４０μｍナイロンメッシュを通してさらに洗浄することができる。例えば、ＣＤ４５抗体を用いる、蛍光または磁性結合細胞ソーティングを用いてリンパ球を単離することもできる。Ｔ細胞の活性化を最小限にするために、その前方および側方散乱特性を基準にして、リンパ球だけをソーティングすることもできる。・・・」（段落【００９８】） （本ク） 「【０１００】 間質細胞または上皮細胞は、好ましくはリンパ球の培養中に存在する（しかしリンパ球とは直接的に接触しない）が、それらを除去して、リンパ球が、間質細胞または上皮細胞の非存在下で（例えば、線維芽細胞の非存在下で）、培養されるようにすることができる。」（段落【０１００】） （本ケ） 「【実施例】 【０１３８】 方法 三次元外植片培養によるヒト皮膚由来リンパ球の単離 三次元皮膚外植片プロトコールは、他の文献で記載されている通りに（２９）、確立された。９ｍｍ×９ｍｍ×１．５ｍｍ Ｃｅｌｌｆｏａｍマトリックス（Ｃｙｔｏｍａｔｒｉｘ Ｐｔｙ Ｌｔｄ， Ｖｉｃｔｏｒｉａ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ）をオートクレーブし、続いて１００ｍｇ／ｍＬラット尾Ｉ型コラーゲン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）溶液（ＰＢＳ中）中で室温にて３０分間インキュベートし、その後、ＰＢＳ中で１回リンスした。成人ヒト皮膚のサンプルは、皮膚手術から３～６時間以内に取得した。皮下脂肪を除去し、残りの皮膚組織を、約１ｍｍ×１ｍｍの大きさの断片へと切り刻んだ。約５個の皮膚断片／外植片を配置し、各マトリックスの表面へと押し当てた。各マトリックスを、２ｍＬの「Ｓｋｉｎ－Ｔ」培地（・・・）が入った２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）の別々のウェル中に配置した。培養の最初の７日間、アンホテリシン（２．５μｇ／ｍＬ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を培地に加えた。培地は、週３回交換した。栄養供給のために、上部の１ｍＬの培地を各ウェルから吸引除去し、新鮮な培地と置き換えた。ＩＬ－２およびＩＬ－１５は、培養の開始時から、２１日目でのリンパ球の単離までの各培地交換時に添加した。・・・ 【０１３９】 リンパ球を単離するために、マトリックスを、０．０１ｍＭ ＨＥＰＥＳ含有１０ｍＬハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）が入った５０ｍＬ遠沈管（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）へと移した（最大１２個のマトリックス／遠沈管）。マトリックスを、１０ｍＬピペットを用いて細胞懸濁液でリンスし、細胞懸濁液を７０μｍフィルター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を通して新しい５０ｍＬ遠沈管（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）へと入れた。このマトリックスの「洗浄」をさらに２回繰り返した。培養ウェルからの培地も吸引し、７０μｍフィルター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を通して新しい５０ｍＬ遠沈管（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）へと入れた。ウェルを、１ｍＬの０．０１ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＨＢＳＳを用いてさらに２回洗浄し、７０μｍフィルター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に通した。続いて、遠心分離（１６００ｒｐｍ、１５分間）により細胞を単離した。ペレットを、「Ｓｋｉｎ－Ｔ」培地中に再懸濁した。最終的な細胞ペレットを、引き続くフローサイトメトリー分析または機能性研究のために、「Ｓｋｉｎ－Ｔ」培地中に再懸濁した。細胞カウント数が必要な場合には、以下のいずれかにより、この段階で白血球を係数した：（１）トリパンブルー染色（０．４％）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）および血球計算盤、または（２）ＣＡＳＹ（登録商標） Ｍｏｄｅｌ ＴＴセルカウンターおよびアナライザー（Ｒｏｃｈｅ社）。」（段落【０１３８】～【０１３９】） （本コ） 「【０１４１】 初代腸サンプルは汚染し易いので、取得された生検サンプルは、１０％ＦＣＳ、ペニシリン５００Ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン５００μｇ／ｍＬ、ゲンタマイシン１００μｇ／ｍＬ、アンホテリシンＢ １２．５μｇ／ｍＬおよびメトロニダゾール５μｇ／ｍＬを含有するＩＭＤＭ中で最初に洗浄し、切り刻んでグリッド上に配置する前に２回洗浄した。腸グリッド培養は、Ｇｕｔ－Ｔ培地（・・・）中で生育させた。生育の最初の１週間、本発明者らは、皮膚と同様にアンホテリシンＢ ２．５μｇ／ｍＬも用いた。培地は、ＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍＬ）およびＩＬ－１５（２０ｎｇ／ｍＬ）を含有し、週３回交換した。腸の構造は皮膚よりも緩やかであったので、１週間後にリンパ球を回収できた。」（段落【０１４１】） （本サ） 「【０１４２】 組織γδ Ｔ細胞の増幅 ヒト皮膚由来γδ Ｔ細胞の増幅のために、グリッド培養の３～４週間後に回収された混合型リンパ球を、ＰＢＳ中で洗浄し、遠沈し、１０％加熱不活性化胎児ウシ血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｌ－グルタミン（２９２μｇ／ｍＬ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ペニシリン（１００単位／ｍＬ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｎ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ－２－エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ；０．０１Ｍ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、最小必須培地（ＭＥＭ）非必須アミノ酸（１×；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）および１０μＬ／Ｌ ２－メルカプトエタノール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を含有するＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ １６４０培地（ＲＰＭＩ－１６４０；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中に、１×１０６／ｍＬの密度で再懸濁し、ＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍＬ）単独またはＩＬ－２＋ＩＬ－１５（２０ｎｇ／ｍＬ）を添加した。細胞を、２×１０５／ウェルで９６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）または２×１０６／ウェルで１２ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）中（増幅用）に播種した。・・・純粋なγδ Ｔ細胞が必要な場合には、細胞を、１ｍＬ ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、２％加熱不活性化胎児ウシ血清および０．０１Ｍ ＥＤＴＡ含有）中に再懸濁し、αβ Ｔ細胞受容体に関して（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＩＰ２６、１：５０）、暗所にて氷上で３０分間染色し、すべての陰性細胞を、ＤＩＶＡを実行するＡｒｉａソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いてソーティングした。」（段落【０１４２】） （本シ） 「【０１４９】 結果 ヒトγδ Ｔ細胞は皮膚に豊富に存在し、非Ｖδ２ ＴＣＲを発現し、ヒトリンパ系ストレス監視応答に従事する Ｃｌａｒｋプロトコール（２９）を用いて、本発明者らは、３週間の期間にわたって、組織常在性リンパ球の増殖を可能にするためにＩＬ－２およびＩＬ－１５を添加されたヒト余剰皮膚サンプルを用いて、１グリッド当たり平均で２４０，０００細胞のリンパ球集団を得た。・・・器官型培養後のリンパ球のこのサブセット表示は、約１００名のドナーで高度に再現可能であり、かつ新鮮消化皮膚サンプルと同等であり、γδ集団のわずかな増大でのみ異なったが、実用的に有用であり、標準的な組織消化プロトコールと比較して、はるかに大きくかつ純粋なリンパ球集団を提供した。・・・ ・・・ 【０１５３】 組織からの分離は、ヒト組織γδ Ｔ細胞の活性化および大幅な増幅を引き起こす ヒト組織、γδ Ｔ細胞およびそれらの生物学をさらに研究するために、本発明者らは、混合型皮膚リンパ球を細胞培養ウェルへと移し、長時間の生存率を維持するために、それらにＩＬ－２を添加した。興味深いことに、器官型培養中に存在する間質細胞および上皮細胞から分離することにより、Ｖδ１ Ｔ細胞が独特に、いかなる他の刺激も加えることなく、活性化および増殖の兆候を示したことを、本発明者らはすぐに見出した。７日間未満の間に、Ｖδ１＋ Ｔ細胞およびＤＮ γδ Ｔ細胞は独特かつ大幅に、核因子Ｋｉ－６７をアップレギュレーションし、かつＩＬ－２受容体α（ＣＤ２５）の表面発現を増加させた（図３Ｂおよび図４Ｂ）。際立ったことに、３週間の期間にわたって、およびＩＬ－２のみの存在下で、組織由来Ｖδ１＋ Ｔ細胞およびＤＮ γδ Ｔ細胞は、すべての他のＴ細胞サブセットよりも増殖し、それにより全皮膚リンパ球のうちの最大６５％となり、個数は平均で１２７．１８倍まで増加したが、一方で、αβ Ｔ細胞は、細胞絶対数により測定した場合に、５．２１倍（ｐ＝０．０１２４）しか増えなかった（図３Ａ）。細胞周期関連核因子Ｋｉ－６７のＭＦＩは、Ｖδ１＋ Ｔ細胞およびＤＮ γδ Ｔ細胞では１４日間で２６６４．５（±１８７６．１）から８４５７．７（±４５７４．２）まで増加し、一方で、αβ Ｔ細胞では、ＭＦＩは５９２．８（±３９０．５）から２８４．７（±１４０．１）へと同じ期間で減少した（図３Ｃ）。選択的な皮膚常在性γδ Ｔ細胞増殖のこの現象はさらに、追加の組み換えＩＬ－１５を用いて補助することができ、組み換えＩＬ－１５は、リンパ球の生存率および総数を増加させた。 【０１５４】 皮膚γδ Ｔ細胞は、接触依存的様式で、線維芽細胞により著しく抑制される 前段落に記載されるＶδ１＋ Ｔ細胞およびＤＮ γδ Ｔ細胞の際立った増幅は、多量の線維芽細胞増殖が存在する器官型培養システム中では一切生じなかった。したがって、本発明者らは、Ｖδ１＋ Ｔ細胞およびＤＮ γδ Ｔ細胞とのそれらの共培養がＴ細胞の増幅を阻害するか否かを直接的に調べるために、自家線維芽細胞を生育させた。３週間のグリッド培養後、本発明者らは、空であるかまたは事前に達成された線維芽細胞のコンフルエントな単層を含有するウェルへと混合型皮膚リンパ球を播種し、それぞれの場合で、培地に外因的にＩＬ－２を添加して、Ｔ細胞生育を維持させた。加えて、本発明者らは、同じウェル中でＴリンパ球が線維芽細胞と直接的に接触することを防止するが、線維芽細胞により生成されるいずれかの可溶性因子によりＴリンパ球が影響を受けることを可能にする、トランスウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）を用いた。１４日間の共培養中に、線維芽細胞がないウェル中およびＴ細胞が線維芽細胞と直接的に接触することを妨げられたウェル中では、Ｖδ１＋ Ｔ細胞およびＤＮ γδ Ｔ細胞は増殖し始めた。・・・目立ったことに、Ｔ細胞が線維芽細胞と直接接触させられた場合、Ｖδ１＋ Ｔ細胞およびＤＮ γδ Ｔ細胞の２週間にわたる生育率は、線維芽細胞接触のないウェルの２２．６（ＳＥＭ ８．０７）倍から３．３（ＳＥＭ ０．１７）倍へと著しく低下した（図４Ａ）。この接触媒介型阻害は、単独で生育させたリンパ球と比較した場合の、７日間の期間にわたるＶδ１でのＣＤ２５、Ｋｉ－６７および転写因子Ｔ－ｂｅｔのアップレギュレーションの非存在によりさらに確認された（図４Ｂ）。免疫系の組織媒介型制御の一部の形態が、組織ホメオスタシスの維持に対して基本的なものであることが明らかであろうが、これは、この制御なしでは、永続的な炎症の可能性が生じるであろうからである。間質線維芽細胞によるＶδ１＋ Ｔ細胞およびＤＮ γδ Ｔ細胞の抑制的調節は、そのような制御の一例であると思われる。 【０１５５】 総合すると、皮膚常在性Ｖδ１＋ Ｔ細胞およびＤＮ γδ Ｔ細胞の表現型ならびにそれらの際立った機能的潜在能力は、これから特性決定される接触依存性メカニズムを介して、隣接する皮膚線維芽細胞により通常は抑制されている、活性化前のＴ細胞を反映している。Ｔ細胞を線維芽細胞との接触から解放することによりこのメカニズムを不活性化することによって、Ｖδ１＋ Ｔ細胞およびＤＮ γδ Ｔ細胞の際立った増幅が選択的に可能になり、一方で、皮膚中の他のＴ細胞は影響されない。 【０１５６】 接触媒介型阻害の解除は、皮膚Ｖδ１ Ｔ細胞による細胞傷害性ＴＨ１偏向性サイトカイン応答を促進する 混合型皮膚由来リンパ球を１４日間増幅させ、γδ Ｔ細胞からαβ Ｔ細胞を除去するために、蛍光結合型細胞ソーティング（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）を用い、それにより最大９０％の純度でγδ Ｔ細胞を取得することができた。・・・完全に予期せぬことに、増幅中のγδ Ｔ細胞（線維芽細胞からのその分離のみによって誘発された）は、多量のＩＦＮ－γ（１２，３８３．４６±１６，６１８．９０ｐｇ／ｍＬ）、ＧＭ－ＣＳＦ（４，３１６．７３±４，５３４．９６ｐｇ／ｍＬ）などのＴＨ１関連サイトカインならびに炎症性ケモカインＣＣＬ４（１４，８７７．３４±１０，９３５．６４ｐｇ／ｍＬ）およびＣＣＬ３（１，３０３．０７±７５７．２３ｐｇ／ｍＬ）を自発的に産生した（図５Ａ）。」（段落【０１４９】～【０１５６】） （本ス） 「【０１５８】 ヒト腸内の組織常在性γδ Ｔ細胞 本発明者らは、ヒト結腸由来のグリッド培養中でも、Ｖδ１ Ｔ細胞受容体を発現するγδ Ｔ細胞の非造血組織常在性集団を特定している（図６）。３名のドナーで、本発明者らは、４～５週間の期間にわたって、皮膚細胞に関して用いたのと同じ方法を用いて（１５）、これらの細胞を増幅することができた。増幅中、結腸由来Ｖδ１＋ Ｔ細胞およびＤＮ γδ Ｔ細胞は、線維芽細胞豊富な器官型細胞培養からのそれらの単離後に、類似のＫｉ－６７アップレギュレーションパターンを示した。・・・」（段落【０１５８】） イ 本願図面の記載事項 本願図面には、以下の事項が記載されている。 （本セ） 「 ［図：0001398663000001.jpg］ 」（図１２） （２）引用文献１の記載事項 原査定の拒絶の理由で引用文献１として引用された、本願の優先日前の１９９７年に頒布された刊行物である、ＩＮＡＧＡＫＩ－ＯＨＡＲＡ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １９９７年， ２７， ２８８５－２８９１（以下、引用文献１という。）には、以下の事項が記載されている。なお、原文は英語であるため、当審による翻訳文を示す。 ア 「インターロイキン－１５は、マウスにおけるγδ Ｔ細胞受容体を持つ腸管上皮内リンパ球の増殖を優先的に促進する。」（２８８５頁の題名） イ 「幹細胞因子（ＳＣＦ）やインターロイキン（ＩＬ）－７を含むいくつかのサイトカインが、マウスにおけるγδ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）腸管上皮内リンパ球（ｉ－ＩＥＬ）の発達に必要であることが知られている。我々はここで、ＩＬ－１５がインビトロにおけるマウスγδ ｉ－ＩＥＬの増殖と維持に及ぼす影響を示す。γδ ｉ－ＩＥＬはＩＬ－１５受容体αのｍＲＮＡを恒常的に高発現しており、αβ ｉ－ＩＥＬに比べ、ＩＬ－１５に応答してより活発に増殖した。Ｖγ／δレパートリー解析により、ＩＬ－１５は、ＩＬ－２のように、γδ ｉ－ＩＥＬのポリクローナルな増殖を誘導するのに対し、ＩＬ－７に応答したδγ ｉ－ＩＥＬでは、Ｖγ１／Ｖδ４、Ｖδ５に偏ったＶγ／δレパートリーを示すことが明らかになった。ＩＬ－１５は、成長因子の欠乏によって誘導されるγδ ｉ－ＩＥＬのアポトーシスを効率的に抑制した。このレスキューは、Ｂｃｌ－２の発現上昇を伴っていた。これらの結果は、ＩＬ－１５がγδ ｉ－ＩＥＬの増殖と維持に重要な役割を担っていることを示唆している。」（２８８５頁の要約） ウ 「１ 導入 腸管上皮内リンパ球（ｉ－ＩＥＬ）は、腸管上皮細胞（ｉ－ＥＣ）の基底側面に位置し、腸管上皮を介して多くの環境抗原に常時さらされている［１］。マウスのｉ－ｉＥＬには、ＴＣＲαβを有する集団（αβ ｉ－ＩＥＬ）とＴＣＲγδを有する集団（γδ ｉ－ｉＥＬ）がほぼ同数含まれる［２］。」（２８８５頁左欄１行～８行） エ 「我々は最近、マウスサルモネラ症の初期に出現するγδ Ｔ細胞が、ＩＬ－１５に応答して増殖し、様々なサイトカインを産生することを見いだした［１６］。我々の結果は、サルモネラ症の過程でαβ Ｔ細胞が活性化するよりもかなり早い段階で、感染したマクロファージに由来するＩＬ－１５がγδ Ｔ細胞の初期活性化に寄与し得ることを示唆している［１６］。活性化したマクロファージ以外にも、ＩＬ－１５は、上皮細胞、線維芽細胞、骨格筋、腎臓、胎盤細胞を含む様々な細胞および組織で産生されると考えられているのに対し、ＩＬ－２は専ら活性化したＴ細胞で産生される［１２，１７－２０］。最近、ヒトのｉ－ＥＣがＩＬ－１５を産生できることが報告された［２１］。ｉ－ＩＥＬのいくつかのサブセットがＩＬ－２非依存的に増殖することを示すいくつかの証拠がある［２２，２３］。これらを総合すると、ＩＬ－１５がｉ－ＩＥＬの増殖と活性化に関与するようである。」（２８８５頁左欄最下行～右欄１５行） オ 「この点を検討するために、我々は、ＩＬ－１５がマウスのｉ－ＩＥＬの増殖と活性化に及ぼす影響を調べた。我々は、ＩＬ－１５がγδ ｉ－ＩＥＬを刺激して増殖させることを見いだした。さらに、ＩＬ－１５は成長因子の欠乏によって誘導されるγδ ｉ－ＩＥＬのアポトーシスを効率的に抑制し、これは、アポトーシスを防ぐＢｃｌ－２の発現上昇を伴うものであった［２４］。これらの結果は、ＩＬ－１５がγδ ｉ－ＩＥＬの増殖と維持に役割を担っている可能性を示唆している。」（２８８５頁右欄１６行～２３行） カ 「２．２ ｉ－ＩＥＬおよびｉ－ＥＣの調製 ｉ－ＩＥＬとｉ－ＥＣは、既報［２５］の方法を改変して単離した。簡単に言えば、マウス小腸を５ｍｍ片に切断し、１０％胎児ウシ血清と１ｍＭ ＤＴＴを含む１９９培地（ギブコ， グランドアイランド， ＮＹ）中、室温で３０分間攪拌した。振盪後、細胞をガーゼに通し、破片を除去し、２５％／４０％／７５％不連続パーコール（登録商標）（ファーマシア， ウプサラ， スウェーデン）勾配で、２０℃で２０分間、６００×６にて遠心分離を行った。ｉ－ＥＣとｉ－ＩＥＬはそれぞれ、２５％／４０％および４０％／７５％の界面で得られた。αβおよびγδ ｉ－ＩＥＬは磁気セルソーティング（ＭＡＣＳ， ミルテニー， バイオテック，ベルギッシュ グラートバッハ， ドイツ）によって負に分離した。簡単に言うと、ｉ－ＩＥＬをビオチン結合抗ＴＣＲγδモノクローナル抗体（ＧＬ３， ファーミンジェン， サン ディエゴ， ＣＡ）または抗ＴＣＲαβモノクローナル抗体（Ｈ５７－５７９， ファーミンジェン）と４℃で１５分間インキュベートした。洗浄後、細胞をストレプトアビジン（ストレプトアビジン マイクロビーズ， ミルテニー バイオテック）でコートした免疫磁気ビーズと４℃で１５分間インキュベートした。磁気ビーズに結合していない細胞を結合した細胞から穏やかに分離し、αβ ｉ－ＩＥＬまたはγδ ｉ－ＩＥＬとして使用した。フローサイトメトリーによって評価したαβまたはγδ ｉ－ＩＥＬの純度は９５％以上だった。いくつかの実験では、ＦＩＴＣ標識抗ＴＣＲαβモノクローナル抗体（ファーミンジェン）とＰＥ標識抗ＴＣＲγδモノクローナル抗体（ファーミンジェン）で染色したｉ－ＩＥＬおよびＦＩＴＣ標識抗Ｉ－Ａｂモノクローナル抗体（ＡＦ６－１２０．１，ファーミンジェン）［２６］で染色したｉＥＣを、逆転写（ＲＴ）－ＰＣＲ解析のためにＥＰＩＣＳ ＥＬＩＴＥ（コルター， マイアミ， ＦＬ）で正に単離した。フローサイトメトリーによって評価した各細胞型の純度は９９．５％以上だった。」（２８８５頁右欄下から８行～２８８６頁左欄２２行） キ 「２．３ 細胞培養 αβとγδ ｉ－ＩＥＬ（２．５×１０５／ｍｌ）を、様々な用量のヒトｒＩＬ－２（武田薬品工業，大阪，日本）、ヒトｒＩＬ－１５（ジェンザイム コーポレーション， ケンブリッジ， ＭＡ）またはマウスｒＩＬ－７（ギブコＢＲＬ， ゲイザースバーグ， ＭＤ）の存在下、１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、５×１０－５Ｍ ２－ＭＥを添加したＲＰＭＩ１６４０で培養した。・・・」（２８８６頁左欄２３行～２９行） ク 「３．２ ＩＬ－１５はγδ ｉ－ＩＥＬの増殖と活性化を促す強力な刺激因子である γδ ｉ－ＩＥＬにおけるＩＬ－１５Ｒα ｍＲＮＡの発現は、γδ ｉ－ＩＥＬがＩＬ－１５に応答する可能性を示唆した。ＩＬ－１５がγδ ｉ－ＩＥＬの成長因子として働くかどうかを検証するために、ＢｒｄＵ取り込みアッセイを用いて単離したばかりのγδ ｉ－ＩＥＬに対するＩＬ－１５の増殖効果を調べた。図２に示すように、ｒＩＬ－１５は用量依存的にγδ ｉ－ＩＥＬへのＢｒｄＵの取り込みを増加させた。１ｎｇ／ｍｌ以上のｒＩＬ－１５において、αβ ｉ－ＩＥＬに比べてγδ ｉ－ＩＥＬへのＢｒｄＵ取り込みが２倍増加した（ｐ＜０．０１）。一方で、ｒＩＬ－２の増殖刺激活性は、αβとγδ ｉ－ＩＥＬの間でわずかな差があった。以前の報告［３１］と一致して、ｒＩＬ－７もγδ ｉ－ＩＥＬの増殖をある程度誘導した（図２）。これらの知見は、γδ ｉ－ＩＥＬがαβ ｉ－ＩＥＬよりも活発に外因性のｒＩＬ－１５に応答することを示している。」（２８８７頁右欄１５行～３２行） ケ 「ＩＬ－１５がγδ ｉ－ＩＥＬの機能を活性化できるかどうかを評価するために、我々は次にｒＩＬ－１５に応答したγδ ｉ－ＩＥＬの上清におけるサイトカインの産生を調べた。γδ ｉ－ＩＥＬは培地のみで培養した後、自発的に有意なレベルのＩＦＮ－γを産生した。ＩＦＮ－γの産生はｒＩ－１５又はｒＩＬ－７による刺激後にさらに増加したが、ｒＩＬ－２では増加しなかった。αβ ｉ－ＩＥＬはｒＩＬ－１５に応答してわずかなレベルのＩＦＮ－γのみを産生した。これらの条件下でαβまたはγδ ｉ－ＩＥＬのいずれの上清においてもＩＬ－４の産生は検出されなかった（図３）。したがって、ＩＬ－１５はＴｈ１型サイトカインを産生するγδ ｉ－ＩＥＬの増殖と活性化を支持することができる。」（２８８７頁右欄３３行～２８８８頁左欄５行） コ 「３．４ ＩＬ－１５によるγδ ｉ－ＩＥＬのポリクローナルな増殖 γδ ｉ－ＩＥＬは、γ鎖としてＶγ１またはＶγ７、δ鎖としてＶδ４、Ｖδ５、Ｖδ６またはＶδ７を優先的に使用するが、Ｖγ／δレパートリーはγδ ｉ－ＩＥＬにおいて多様である［３２－３４］。ＩＬ－２、ＩＬ－７またはＩＬ－１５に応答してγδ ｉ－ＩＥＬのサブセットに違いが出るどうかを評価するために、ｒＩＬ－２、ｒＩＬ－７またはｒＩＬ－１５で培養した後のγδ ｉ－ＩＥＬのＴＣＲ Ｖレパートリーを比較した。図５に示すように、ｒＩＬ－１５に応答したγδ ｉ－ＩＥＬは、ｒＩＬ－２に応答したものと同じＶγ／δレパートリーを発現していた。一方で、ｒＩＬ－７は、Ｖγ１／２、Ｖδ４およびＶδ５に偏ったＶγ／δレパートリーを発現するγδ ｉ－ＩＥＬを増幅した。これらの結果は、ＩＬ－１５が、ＩＬ－２と同様に、γδ ｉ－ＩＥＬのポリクローナルな増幅を誘導するのに対し、ＩＬ－７はγδ ｉ－ＩＥＬの限られた部分を刺激して増殖させる可能性があることを示唆している。」（２８８８頁右欄１６行～２８８９頁左欄３行） サ 「３．５ ＩＬ－１５は成長因子の欠乏によって誘導される細胞死からγδ ｉ－ＩＥＬをレスキューする ｉ－ＩＥＬは、３７℃の培地のみでインビトロ培養すると、アポトーシスによって急速なプログラム細胞死を起こすことが知られている［３５］。Ｔ細胞は、成長因子や繰り返しの抗原刺激の非存在下でアポトーシスを起こす［３６］。ＩＬ－２Ｒγからのシグナルは、ｂｃｌ－２のような生存遺伝子の上昇を介して、成長因子の欠乏に誘導されてＴ細胞がアポトーシスを起こすのを防ぐことができる[２４，３７，３８]。そこで、我々は、ＩＬ－２Ｒγを受容体の構成要素として共有するＩＬ－２、ＩＬ－７、またはＩＬ－１５が、インビトロ培養後のｉ－ＩＥＬの両サブセットの生存に与える影響を比較した。以前の報告［３５］と一致して、αβおよびγδ ｉ－ＩＥＬ両方の大部分が、３７℃の培地のみでインビトロ培養した後にアポトーシスを起こした（図６）。ゲル電気泳動によるＤＮＡ分析の結果、細胞死はＤＮＡの断片化を伴うことが明らかになった（データは示さず）。ｉ－ＩＥＬを１００ｎｇ／ｍｌのｒＩＬ－１５と４８時間培養したところ、ｒＩＬ－１５によりγδ ｉ－ＩＥＬにおける生存細胞の回復が増加した（図６）。ｒＩＬ－１５は、αβ ｉ－ＩＥＬの細胞死には限られた保護効果しか示さなかった。アポトーシスの頻度を定量的に分析するために、核ＤＮＡ量をプロピジウムヨードで染色して調べた。２４時間の培地のみでの培養後、低二倍体ＤＮＡを有するアポトーシス細胞の頻度が増加した（αβ， ３±１％から６９±４％；γδ， ２±１％から６２±３％）（図７）。ｒＩＬ－１５は、αβ ｉ－ＩＥＬ（５４±４％）よりもγδ ｉ－ＩＥＬ（４２±４％）のアポトーシスの防止に、より効果的であった。これらの結果は、γδ ｉ－ＩＥＬのかなりの部分がインビトロでの培養後に成長因子の欠乏によりアポトーシスを起こしていること、および、ＩＬ－１５はγδ ｉ－ＩＥＬをアポトーシスからレスキューできることを示唆している。」（２８８９頁左欄４行～右欄２２行） シ 「我々はここで、ＩＬ－１５がγδ ｉ－ＩＥＬの増殖を優先的に促進することを示した。単離したてのγδ ｉ－ＩＥＬは、ＩＬ－１５Ｒα ｍＲＮＡを恒常的に高発現しているのに対し、αβ ｉ－ＩＥＬはこのｍＲＮＡを低レベルでしか発現していなかった。γδ ｉ－ＩＥＬはＩＬ－１５に応答して活発に増殖し、かなりの量のＩＦＮ－γを産生した。ｒＩＬ－１５は、おそらくＢｃｌ－２の上昇を介して、αβ ｉ－ＩＥＬよりも効率的に、γδ ｉ－ＩＥＬが成長因子飢餓により誘導されるアポトーシスを起こすのを防いだ。これらを総合すると、我々の結果は、γδ ｉ－ＩＥＬがＩＬ－１５をその増殖および維持のための成長因子として利用し得ることを示唆している。」（２８９０頁左欄１２行～２２行） ス 「結論として、ＩＬ－１５はγδ ｉ－ＩＥＬの増殖と活性化を優先的に誘導し、これらの細胞が成長因子の欠乏によって誘導されるアポトーシスを起こすのを防ぐ。ＩＬ－１５の効果は、αβ ｉ－ＩＥＬよりもγδ ｉ－ＩＥＬでより顕著である。ＩＬ－１５は、γδ ｉ－ＩＥＬの発達と維持に重要であり得る。」（２８９１頁左欄８行～１２行） セ ２８８７頁の図２は、横軸を「サイトカイン濃度（ｎｇ／ｍｌ）」、縦軸を「ＢｒｄＵの取り込み（ＯＤ４５０）」として、ＩＬ－２、ＩＬ－７またはＩＬ－１５がｉ－ＩＥＬの増殖に及ぼす効果の比較を示した図であって、以下の図および説明が記載されている。 「 ［図：0001398663000002.jpg］ 図２．ＩＬ－２、ＩＬ－７またはＩＬ－１５がｉ－ＩＥＬの増殖に及ぼす効果の比較。選別されたαβ（白丸）またはγδ ｉ－ＩＥＬ（黒丸）を、様々な濃度のこれらのサイトカインと７２時間培養した。培養の最後の１８時間の間、ＢｒｄＵがｉ－ＩＥＬに添加された。数値は３つの独立した実験の平均値±標準偏差を表す。同じ用量のサイトカインでαβ ｉ－ＩＥＬに対して得られた値に対する差（＊ｐ＜０．０５， ＊＊ｐ＜０．０１）。」（２８８７頁の図２） （３）引用文献１に記載された発明 引用文献１は、「インターロイキン－１５は、マウスにおけるγδ Ｔ細胞受容体を持つ腸管上皮内リンパ球の増殖を優先的に促進する。」（上記（２）ア）と題する学術論文であって、マウスの小腸片から単離したγδ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）腸管上皮内リンパ球（γδ ｉ－ＩＥＬ）を、インターロイキン（ＩＬ）－２、ＩＬ－７またはＩＬ－１５の存在下でインビトロにて培養し、ＩＬ－１５がγδ ｉ－ＩＥＬの増殖と活性化を優先的に誘導することや、ＩＬ－１５がＩＬ－２と同様にγδ ｉ－ＩＥＬのポリクローナルな増殖を誘導することを実証し、それらの結果よりＩＬ－１５がγδ ｉ－ＩＥＬの増殖や維持に重要な役割を担う因子であることを報告するものである（上記（２）イ、オ～ク、コ、シ～セ）。そして、上記γδ ｉ－ＩＥＬを調製するにあたり、マウス小腸片を培地中で撹拌して細胞を回収し、不連続パーコール（登録商標）勾配遠心分離によってｉ－ＩＥＬを得た後に、抗ＴＣＲαβモノクローナル抗体を用いた磁気セルソーティングによってＴＣＲαβを発現する細胞を負に分離（すなわち、ＴＣＲαβを発現する細胞を除去）してγδ ｉ－ＩＥＬを単離したことが記載され、当該方法によって単離したγδ ｉ－ＩＥＬは、フローサイトメトリーで評価した純度が９５％以上であったことも記載されている（上記（２）カ）。 したがって、引用文献１には、次のとおりの発明が記載されていると認められる。 「ＩＬ－１５またはＩＬ－２の存在下で、マウスの小腸から単離されたγδ Ｔ細胞受容体を持つ腸管上皮内リンパ球（γδ ｉ－ＩＥＬ）をインビトロで培養して増殖させる方法。」（以下、「引用発明１」という。） （４）本願補正発明と引用発明１との対比 本願補正発明と引用発明１を対比する。 引用発明１の「ＩＬ－１５」、「ＩＬ－２」はそれぞれ、本願補正発明の「インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）」、「ＩＬ－２」に相当する。 引用発明１の「マウス」は、本願補正発明の「非ヒト動物」に相当する。 また、本願明細書において「好適なヒトまたは非ヒト動物非造血組織」の例として小腸が記載されていることから（上記（１）ア（本エ））、引用発明１の「小腸」は、本願補正発明の「非造血組織」に相当し、引用発明１のγδ ｉ－ＩＥＬはマウスの小腸から得られるリンパ球であるから、引用発明１の「マウスの小腸から単離されたγδ Ｔ細胞受容体を持つ腸管上皮内リンパ球（γδ ｉ－ＩＥＬ）」は、本願補正発明の「非ヒト動物の非造血組織から取得されるリンパ球」に相当する。 また、引用発明１の「γδ ｉ－ＩＥＬ」は、腸管上皮内に常時存在しているリンパ球であるから（上記（２）ウ）、本願補正発明でいう「非造血組織常在性」のリンパ球であると認められる。そして、引用発明１の「γδ ｉ－ＩＥＬ」は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）γδを発現するものであり（上記（２）ウ）、引用文献１において「γδ Ｔ細胞」と表示されるから（上記（２）エ）、引用発明１の「γδ ｉ－ＩＥＬ」は、本願補正発明に係る「非造血組織常在性γδ Ｔ細胞」に相当すると認めることができる。 さらに、引用文献１には、上記「γδ ｉ－ＩＥＬ」を培養するにあたり、１０％ＦＣＳ（すなわち、ウシ胎児血清）、ペニシリン、ストレプトマイシン、および２－ＭＥ（すなわち、２－メルカプトエタノール）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を使用したことが記載されているが（上記（２）キ）、当該基本培地および培地成分はいずれも、本願明細書の実施例において使用された培地にも含まれるものであり（上記（１）ア（本サ））、「Ｔ細胞受容体経路アゴニスト」（上記（１）ア（本カ））を含むものではない。 したがって、引用発明１のγδ ｉ－ＩＥＬは、「外因的に添加されるＴ細胞受容体経路アゴニストの非存在下で培養」されていると認められる。 そうすると、本願補正発明と引用発明１は、 「ヒトまたは非ヒト動物の非造血組織から取得されるリンパ球を培養するステップを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏで非造血組織常在性γδ Ｔ細胞を増幅するための方法であって、該リンパ球が外因的に添加されるＴ細胞受容体経路アゴニストの非存在下で培養される、上記方法。」である点で一致し、以下の点で相違する。 （相違点１） 本願補正発明は、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）およびＩＬ－２の存在下でリンパ球を培養しているのに対し、引用発明１は、ＩＬ－１５またはＩＬ－２の存在下でγδ ｉ－ＩＥＬを培養している点。 （相違点２） 本願補正発明は、リンパ球を、間質細胞または上皮細胞の非存在下で培養しているのに対し、引用発明１は、γδ ｉ－ＩＥＬが、間質細胞や上皮細胞の非存在下で培養されることについて特定されていない点。 （５）判断 ア 相違点１について 引用文献１には、単離されたγδ ｉ－ＩＥＬをＩＬ－１５の存在下で培養し、ＩＬ－１５が、γδ ｉ－ＩＥＬの増殖と活性化を優先的に誘導し、成長因子の欠乏によるアポトーシスを防ぎ、γδ ｉ－ＩＥＬのポリクローナルな増殖を誘導したことが示されている（上記（２）ク～セ）。また、ＩＬ－２についても、γδ ｉ－ＩＥＬの増殖を刺激する活性を有し、ＩＬ－１５と同様にγδ ｉ－ＩＥＬのポリクローナルな増殖を誘導したことが具体的に示されている（上記（２）ク、コ、セ）。そして、Ｔ細胞の増殖の促進においてＩＬ－２とＩＬ－１５を組み合わせる手法は本願の優先日当時、当業者に周知であったと認められる（ＤＯＮＧ Ｊｕｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ， ２０１０年， ｖｏｌ．１８ ｎｏ．６， ｐ．１５９０－１５９４（原査定の参考文献５）の要約、Ｃ Ａｇｏｓｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １９９６年， ｖｏｌ．１５７， ｐ．９１０－９１８（原査定の参考文献６）の図７、Ｋｙｌｅ Ｋ Ｐａｙｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒｅｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ．， ２０１３年， ｖｏｌ．１４２ ｎｏ．１， ｐ．４５－５７（原査定の参考文献７）の要約、「材料と方法」の「リンパ球のエクスビボリプログラミングと増殖」欄）。そうすると、引用発明１において、γδ ｉ－ｉＥＬをインビトロで培養して増殖させるにあたり、引用発明１において増殖刺激因子として使用されているＩＬ－１５とＩＬ－２を組み合わせて用いることに格別の困難性はなかったものといえる。 次に、ＩＬ－１５とＩＬ－２を組み合わせたことによる本願補正発明の効果について検討すると、本願明細書の段落【００７８】および【０１５３】には、ＩＬ－２と組み合わせてＩＬ－１５を添加することにより、ＩＬ－２単独の場合と比べて非造血組織常在性γδ Ｔ細胞の増幅の強化をもたらすことができると記載され（上記（１）ア（本オ）、（本シ））、段落【００５８】および図１２には、ＩＬ－２単独、ＩＬ－１５単独、およびＩＬ－２＋ＩＬ－１５中での皮膚由来Ｖδ１ Ｔ細胞の増殖をＫｉ－６７染色により検証した結果も記載されている（上記（１）ア（本ウ）の【図１２】の説明、イ（本セ））。しかしながら、これらの記載事項および本願明細書の他の記載を参酌しても、ＩＬ－２とＩＬ－１５を組み合わせたことによる効果が格別であるとは認められず、ＩＬ－２とＩＬ－１５を組み合わせて用いたことにより、本願補正発明が引用発明１および本願優先日当時の技術水準から予測し得ない顕著な効果を奏するとは認められない。 イ 相違点２について 引用文献１には、引用発明１のγδ ｉ－ＩＥＬをマウス小腸片から単離する方法として、マウス小腸片を培地中で撹拌し、振盪後、細胞をガーゼに通して破片を除去したこと、２５％／４０％／７５％不連続パーコール（登録商標）勾配で遠心分離を行って、それぞれ２５％／４０％および４０％／７５％の界面にｉ－ＥＣおよびｉ－ＩＥＬを分離したこと、および、そのようにして得られたｉ－ＩＥＬに対して抗ＴＣＲαβモノクローナル抗体を用いた磁気セルソーティングを行い、ＴＣＲαβを発現する細胞を除去してγδ ｉ－ＩＥＬを精製したことが記載され、当該方法によって単離したγδ ｉ－ＩＥＬは、フローサイトメトリーで評価した純度が９５％以上であったことが記載されている（上記（２）カ）。 このことから、引用発明１のγδ ｉ－ＩＥＬは、マウス小腸片に由来するγδ ｉ－ＩＥＬ以外のリンパ球ないしは他の細胞の混入が５％未満となる程度に精製されたものであると認められる。 一方、本願明細書の記載（上記（１）ア（本ウ）、（本エ）、（本キ）、（本サ）、（本シ））によると、本願の発明の詳細な説明には、皮膚外植片または腸サンプルを、Ｃｌａｒｋプロトコールを用いた三次元器官培養法によって培養して皮膚または腸常在性混合型リンパ球集団を単離したことが記載され、当該混合型リンパ球集団を、器官型培養中に存在する間質細胞および上皮細胞から分離してＩＬ－２などとともにさらに培養することによって、γδ Ｔ細胞を増幅させたことが具体的な実施形態として記載されていると認められる。 しかしながら、上記の実施形態において、器官型培養後に回収した組織常在性混合型リンパ球集団から残余の間質細胞や上皮細胞を分離するための除去手段が具体的に開示されていない。 また、本願の発明の詳細な説明の他の記載を参酌しても、間質細胞や上皮細胞の分離除去については、段落【００９８】において、Ｃｌａｒｋプロトコールを用いると、しっかりとピペッティングすることにより、皮膚線維芽細胞などの間質細胞から非造血組織常在性リンパ球を回収および分離できること、線維芽細胞凝集体を保持するために４０μｍナイロンメッシュを通してリンパ球回収物をさらに洗浄することができること、および、蛍光または磁性結合細胞ソーティングや前方および側方散乱特性を基準にしてリンパ球だけをソーティングすることもできることが記載されているにとどまっており、「間質細胞または上皮細胞の非存在」であるといえる間質細胞や上皮細胞の残存量も評価されていない。 これに対し、引用文献１では、パーコール（登録商標）を媒体とする密度勾配遠心分離法によって、密度の異なるｉ－ＥＣとｉ－ＩＥＬを異なる界面に分画した上で、抗ＴＣＲαβ抗体に結合するαβ ｉ－ＩＥＬを除去することでγδ ｉ－ＩＥＬの精製が行われており、他の細胞の残存量は極めて低いものになっているといえる。 そうすると、引用発明１の「γδ ｉ－ＩＥＬ」は本願補正発明でいうところの「間質細胞または上皮細胞の非存在」であると認められ、上記相違点２は、実質的な相違点とはいえない。 したがって、本願補正発明は、引用文献１に記載された発明及び周知技術に基いて当業者が容易に発明をすることができたものである。 よって、本件補正後の特許請求の範囲の請求項１に係る発明は、特許出願の際独立して特許を受けることができるものではない。 （６）審判請求人の主張について ア 審判請求人の主張 審判請求人は、令和３年９月１０日付けの審判請求書において、要するに以下の旨、主張している。 本願補正発明は、皮膚及び他の非造血組織に常在するγδ Ｔ細胞が、間質細胞及び上皮細胞との共培養によって特異的に抑制されるという知見に基づくものであり、容易に想到し得ない。間質細胞の非存在下での増殖効果はγδ Ｔ細胞に特異的なものであり、本願明細書では、間質細胞の非存在下では、γδ Ｔ細胞は１２７．１８倍に増殖したのに対し、αβ Ｔ細胞は５．２１倍にしか増殖しなかったことが示されている（図３のＡ）。 一方、引用文献１には、γδ ｉ－ＩＥＬの純度が９５％以上であったと記載されていることからみて、引用文献１のγδ ｉ－ＩＥＬの培養に含まれる５％未満の非リンパ球細胞には、本来、間質細胞や上皮細胞が含まれるはずであるから、引用文献１の記載内容に基づいて、ＩＬ－１５及びＩＬ－２の存在下で、間質細胞または上皮細胞の非存在下で、非造血組織から取得されるリンパ球を培養することを当業者は容易に想到し得ない。 イ 判断 上記（５）イで述べたように、本願明細書の実施例ないしは他の記載箇所を参照しても、リンパ球集団における間質細胞や上皮細胞の残存量を確認したことが記載されておらず、「間質細胞または上皮細胞の非存在」の範囲は明示されていない。 むしろ、本願明細書では、細胞などの「純度」について、「「実質的に純粋な」とは、個数、質量、または体積により９０％超の純度を意味する。「実質的に含まない」とは、個数、質量、または体積により５％未満の所定の構成要素を有することを意味する。」と記載され（上記（１）ア（本エ）の段落【００７３】）、９５％超の純度のものが「実質的に含まない」と定義されている。また、γδ Ｔ細胞から蛍光結合型細胞ソーティングによってαβ Ｔ細胞を分離することを開示した実施例についても「純粋なγδ Ｔ細胞が必要な場合には、細胞を、１ｍＬ ＦＡＣＳバッファー（・・・）中に再懸濁し、αβ Ｔ細胞受容体に関して（・・・）、暗所にて氷上で３０分間染色し、すべての陰性細胞を、ＤＩＶＡを実行するＡｒｉａソーター（・・・）を用いてソーティングした。」（上記（１）ア（本サ）の段落【０１４２】）および「混合型皮膚由来リンパ球を１４日間増幅させ、γδ Ｔ細胞からαβ Ｔ細胞を除去するために、蛍光結合型細胞ソーティング（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）を用い、それにより最大９０％の純度でγδ Ｔ細胞を取得することができた。」と記載され（上記（１）ア（本シ）の段落【０１５６】）、「純粋なγδ Ｔ細胞」を得るために、αβ Ｔ細胞をソーティングして除去して「最大９０％の純度」を有するγδ Ｔ細胞を取得したことが記載されている。これらの記載を総合すると、「間質細胞または上皮細胞の非存在」が０％のみを意味するとは解されない。 これに対して、引用発明１のγδ ｉ－ＩＥＬは、パーコール（登録商標）を媒体とする密度勾配遠心分離法を用いてｉ－ＩＥＬとｉ－ＥＣを異なる界面に分離させた後にｉ－ＩＥＬの画分を回収し、当該ｉ－ＩＥＬ画分に対してさらにＴＣＲαβ抗体による負のソーティングを行って、９５％以上の純度でγδ ｉ－ＩＥＬを精製したものであり、上記の密度勾配遠心による分離工程において、リンパ球以外の細胞は相当程度除去されているものと認められる。 そうすると、引用文献１のγδ ｉ－ＩＥＬの培養に含まれる５％未満の非リンパ球細胞には、本来、間質細胞や上皮細胞が含まれるはずであるという推論を前提にして、本願補正発明に係る「間質細胞または上皮細胞の非存在下」で培養される「ヒトまたは非ヒト動物の非造血組織から取得されるリンパ球」と、引用発明１で培養されるγδ ｉ－ＩＥＬは明確に区別し得るものとはいえず、非造血組織由来のリンパ球を「間質細胞または上皮細胞の非存在下」で培養する点（すなわち、上記（４）の「相違点２」）は、本願補正発明と引用発明１の実質的な相違点とはいえない。そして、たとえ、引用文献１に、γδ ｉ－ＩＥＬを間質成分から分離することによってγδ ｉ－ＩＥＬの選択的な増幅が促進されることが記載されていなかったとしても、そのことが相違点２についての上記判断を左右するものではない。 よって、上記審判請求人の主張は採用できない。 （７）むすび 以上のとおりであるから、本件補正は、特許法第１７条の２第６項で準用する同法第１２６条第７項の規定に違反するものであるから、同法第１５９条第１項において読み替えて準用する同法第５３条第１項の規定により却下されるべきものである。 よって、上記補正の却下の決定の結論のとおり決定する。 第３ 本願発明について １ 本願発明 令和３年９月１０日付けの手続補正は上記のとおり却下されたので、本願の請求項１に係る発明（以下、「本願発明」という。）は、令和３年１月２５日付け手続補正書の特許請求の範囲の請求項１に記載された事項により特定される、以下のとおりのものである。 「インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）およびＩＬ－２の存在下で、ヒトまたは非ヒト動物の非造血組織から取得されるリンパ球を培養するステップを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏで非造血組織常在性γδ Ｔ細胞を増幅するための方法であって、該リンパ球は、培養中に間質細胞または上皮細胞と直接的に接触しないものであり、該リンパ球が外因的に添加されるＴ細胞受容体経路アゴニストの非存在下で培養される、上記方法。」 ２ 原査定の拒絶の理由の概要 令和３年４月２２日付け拒絶査定は、この出願の請求項１に係る発明は、その優先日前に日本国内又は外国において頒布された又は電気通信回線を通じて公衆に利用可能となった引用文献１に記載された発明及び周知技術に基いて、その出願前にその発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない、との理由を含むものである。 ３ 引用文献およびその記載事項 原査定の拒絶の理由に引用された引用文献１およびその記載事項は、前記第２の２（２）に記載したとおりである。 ４ 対比・判断 本願発明は、「ヒトまたは非ヒト動物の非造血組織から取得されるリンパ球を培養するステップ」について、該リンパ球が「培養中に間質細胞または上皮細胞と直接的に接触しない」ことが特定されるものであり、当該発明特定事項は、本願補正発明が備える「間質細胞または上皮細胞の非存在下で培養される」態様に加えて、間質細胞または上皮細胞が存在するが、リンパ球と直接的に接触しない態様を包含するものである。 そうすると、本願発明の発明特定事項を含み、さらに「ヒトまたは非ヒト動物の非造血組織から取得されるリンパ球を培養するステップ」が「間質細胞または上皮細胞の非存在下で培養される」態様に限定された本願補正発明が、上記第２の２（１）～（７）のとおり、引用文献１に記載された発明及び周知技術に基いて当業者が容易に発明することができたものであるから、本願発明についても同様に、引用文献１に記載された発明及び周知技術に基いて当業者が容易に発明をすることができたものである。 第４ むすび 以上のとおり、本願発明は、特許法第２９条第２項に該当し、特許を受けることができないものであるから、他の請求項に係る発明について検討するまでもなく、本願は拒絶すべきものである。 よって、結論のとおり審決する。