2019-008088

特願２０１６－５０３２１６「細胞培養培地及び抗体を産生する方法」拒絶査定不服審判事件〔平成２６年　９月１８日国際公開、ＷＯ２０１４／１４５０９１、平成２８年　５月１６日国内公表、特表２０１６－５１３４７８〕について、次のとおり審決する。

【結　論】 本件審判の請求は、成り立たない。

【理　由】 第１　手続の経緯、本願発明 本願は、平成２６年３月１４日（パリ条約による優先権主張　２０１３年３月１５日、米国）を国際出願日とする出願であって、平成３１年２月１２日付けで拒絶査定がなされ、令和１年６月１８日に拒絶査定不服の審判請求がなされると同時に手続補正がなされ、令和２年６月１６日付けで当審より拒絶理由が通知され、同年１０月２３日に手続補正書及び意見書が提出されたものである。 そして、本願の請求項１～４４に係る発明は、令和２年１０月２３日付け手続補正書の特許請求の範囲の請求項１～４４に記載されたものであり、そのうち請求項１８に係る発明（以下、「本願発明１８」という。）は次のとおりのものと認める。 「【請求項１８】 ベバシズマブもしくはその抗原結合性断片をコードする核酸を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培養する際に使用するための細胞培養培地であって、（ｉ）約１０．０ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌのインスリン；（ｉｉ）約３００ｎＭ～約４００ｎＭの銅；及び（ｉｉｉ）約１．３ｍＭのシスチンを含む、細胞培養培地。」 第２　当審の拒絶理由について 令和２年６月１６日付けの当審の拒絶理由は、この出願の請求項１～４９に係る発明は、その出願前に日本国内又は外国において頒布された又は電気通信回線を通じて公衆に利用可能となった下記の引用文献１に記載された発明に基いて、その出願前にその発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない、というものである。 引用文献１．特表２０１１－５０７５５１号公報 第３　当審の判断 １　引用文献の記載事項 引用文献１（特表２０１１－５０７５５１号公報）には次の事項が記載されている。 （１－１） 「【請求項１】 細胞培養上清中で異種タンパク質を分泌する哺乳動物細胞を培養する方法であって、ここでは、該細胞培養上清は、Ｘ±０．９℃に設定される温度で維持され、ここでは、Ｘは３５．１から３６．５までの値を有し、ただし該温度は３７℃未満に設定される、方法。 ・・・ 【請求項４６】 前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞またはＢＨＫ細胞のような齧歯類の細胞である、請求項１～４５のいずれかに記載の方法。」 （１－２） 「【０００２】 発明の分野 本発明は、哺乳動物細胞、具体的には、異種タンパク質および／または組み換え体タンパク質を分泌する哺乳動物細胞、そしてさらに具体的には、血液凝固第ＶＩＩＩ因子（本明細書中以後、「第ＶＩＩＩ因子」または単に「ＦＶＩＩＩ」）、ＡＤＡＭＴＳ－１３、フューリン、あるいは凝固第ＶＩＩ因子（本明細書中以後、「第ＶＩＩ因子」または単に「ＦＶＩＩ」のような血中タンパク質を分泌する哺乳動物細胞を培養するためのプロセスに関する。」 （１－３） 「【００３６】 組み換え体タンパク質を発現する安定なＣＨＯ細胞クローンを調製する好ましい方法は以下のとおりである。ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞株ＤＵＫＸ－ＢＩＩは、原則として米国特許第５，２５０，４２１号（Ｋａｕｆｍａｎら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．）に記載されているように、関連する組み換え体タンパク質の発現が可能なＤＨＦＲ発現ベクターでトランスフェクトされる。トランスフェクションは、メトトレキセートについて選択される。組み換え体タンパク質の発現をコードする関連領域とＤＨＦＲ遺伝子の増幅は、漸増濃度のメトトレキセートの中での細胞の増殖によって行われる。適切である場合には、ＣＨＯ細胞株は、原則として米国特許第６，１００，０６１号（Ｒｅｉｔｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ）に記載されているとおりに、血清および／またはタンパク質を含まない培地の中での増殖に適応させられ得る。」 （１－４） 「【００３７】 宿主細胞株を培養するために選択される基底培地は本発明については重要ではなく、哺乳動物細胞を培養するために適している当該分野で公知のもののうちの任意の１つ、またはそれらの組み合わせであり得る。ダルベッコ改変イーグル培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ最小必須培地、およびＲＰＭＩ－１６４０培地などの培地が市販されている。組み換え体インシュリンのような増殖因子の添加は随意である。 ・・・ 【００３９】 好ましい培地としては、米国特許第６，１７１，８２５号（Ｂａｙｅｒ，Ｉｎｃ）および米国特許第６，９３６，４４１号（Ｂａｘｔｅｒ ＡＧ）に開示されているものが挙げられる。 【００４０】 米国特許第６，１７１，８２５号の培地は、組み換え体インシュリン、鉄、ポリオール、銅、および状況に応じた他の微量金属が補充された、改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ最少必須培地とＨａｍ’ｓ Ｆ－１２培地（重量で５０：５０）からなる。 【００４１】 インシュリンは組み換え体でなければならず、「Ｎｕｃｅｌｌｉｎ」インシュリンとしてＥｌｉ Ｌｉｌｌｙから入手することができる。これは、０．１μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ（好ましくは、５μｇ／ｍｌ～１５μｇ／ｍｌ、または約１０μｇ／ｍｌ）で添加することができる。鉄は、好ましくは、Ｆｅ２＋イオンの形態（例えば、ＦｅＳＯ４・ＥＤＴＡとして提供される）であり、５μＭ～１００μＭ（好ましくは、約５０μｍ）で存在し得る。適切なポリオールとしては、約１０００～約１６０００までの範囲の分子量を有しているポリ（オキシエチレン）とポリ（オキシプロピレン）の非イオン性ブロックコポリマーが挙げられる。特に好ましいポリオールはＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８（ＢＡＳＦ Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ）であり、これは、８４００の平均分子量を有し、ポリ（オキシプロピレン）（２０重量％）のセンターブロックと、両方の末端にあるポリ（オキシエチレン）のブロックからなる。これは、Ｕｎｉｃｈｅｍａ Ｃｈｅｍｉｅ ＢＶからＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ Ｆ－６８として入手することもできる。他のものとしては、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ Ｆ－６１、Ｆ－７１、およびＦ－１０８が挙げられる。銅（Ｃｕ２＋）は、５０ｎＭ～８００ｎＭのＣｕＳＯ４、好ましくは１００ｎＭ～４００ｎＭ、便宜的には約２５０ｎＭ等量で添加され得る。微量金属（例えば、マンガン、モリブデン、ケイ素、リチウム、およびクロム）のパネルを含めることにより、第ＶＩＩＩ因子の生産のさらなる増大を誘導することができる。ＢＨＫ細胞は、このタンパク質を含まない基本培地の中ではかなり増殖する。」 （１－５） 「【００４２】 米国特許第６，９３６，４４１号の培地もまた、ＤＭＥＭとＨａｍ’ｓ Ｆ１２との５０／５０混合物をベースとするが、これには、０．１ｇ／ｌから１００ｇ／ｌの間、好ましくは１ｇ／ｌから５ｇ／ｌの間で大豆ペプトンまたは酵母抽出物も含まれる。特に好ましい実施形態では、大豆抽出物（例えば、大豆ペプトン）が使用され得る。大豆ペプトンの分子量は５０ｋＤ未満、好ましくは１０ｋＤ未満であり得る。３５０ダルトンの平均分子量を有している限外濾過された大豆ペプトンの添加は、組み換え体である細胞株の生産性に特に有効であることが証明されている。これは、全部で約９．５％の窒素含有量と、約１３％または約７％～１０％の遊離のアミノ酸の含有量を有している大豆単離物である。」 （１－６） 「【００４５】 別の好ましい実施形態では、以下のアミノ酸混合物が、上記培地にさらに添加される：Ｌ－アスパラギン（０．００１ｇ／ｌ～１ｇ／ｌ；好ましくは、０．０１ｇ／ｌ～０．０５ｇ／ｌ；特に好ましくは、０．０１５ｇ／ｌ～０．０３ｇ／ｌ）、Ｌ－システイン（０．００１ｇ／ｌ～１ｇ／ｌ；好ましくは、０．００５ｇ／ｌ～０．０５ｇ／ｌ；特に好ましくは、０．０１ｇ／ｌ～０．０３ｇ／ｌ）、Ｌ－シスチン（０．００１ｇ／ｌ～１ｇ／ｌ；好ましくは、０．０１ｇ／ｌ～０．０５ｇ／ｌ；特に好ましくは、０．０１５ｇ／ｌ～０．０３ｇ／ｌ）、Ｌ－プロリン（０．００１ｇ／ｌ～１．５ｇ／ｌ；好ましくは、０．０１ｇ／ｌ～０．０７ｇ／ｌ；特に好ましくは、０．０２ｇ／ｌ～０．０５ｇ／ｌ）、Ｌ－トリプトファン（０．００１ｇ／ｌ～１ｇ／ｌ；好ましくは、０．０１ｇ／ｌ～０．０５ｇ／ｌ；特に好ましくは、０．０１５ｇ／ｌ～０．０３ｇ／ｌ）、およびＬ－グルタミン（０．０５ｇ／ｌ～１０ｇ／ｌ；好ましくは、０．１ｇ／ｌ～１ｇ／ｌ）。これらのアミノ酸は、個別に、または組み合わせて培地に添加され得る。上記アミノ酸を全て含むアミノ酸混合物の組み合わせた添加が特に好ましい。」 （１－７） 「【００６５】 本発明の最初の３つの態様のいずれかの方法によって生産された異種タンパク質または組み換え体タンパク質は、好ましくは、血中タンパク質である。「血中タンパク質」には、本発明者らは、ヒトまたは動物の血液中に存在するか、または存在する可能性がある任意のタンパクを含め、これには、静脈内使用のために操作されたタンパク質が含まれる。適している血中タンパク質としては、血清アルブミン、血液凝固第Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、およびＸＩＩＩ因子、フューリン、フォン・ヴィレブランド因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、インターロイキン、インターフェロン、メタロプロテアーゼ（例えば、ＡＤＡＭＴＳプロテアーゼ（例えば、ＡＤＡＭＴＳ－１３））、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、またはＩｇＥ）および免疫グロブリン断片が挙げられる。適している抗体または免疫グロブリン断片としては、Ｆａｂ様分子（Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０、１０４１）；Ｆｖ分子（Ｓｋｅｒｒａら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０、１０３８）：ＶＨおよびＶＬパートナードメインが可撓性オリゴペプチドを介して連結させられた単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子（Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２、４２３：Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，５８７９）、および単離されたＶ領域を含む単一ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）（Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１、５４４）が挙げられる。免疫グロブリンおよびそれらの断片は「ヒト化」することができる。言い換えると、齧歯類起源の可変ドメインを、ヒト起源の定常ドメインに融合させることができる。その結果、得られる抗体は、齧歯類のもとの抗体の抗原特異性を保持する（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１，６８５１－６８５５）。」 （１－８） 「【０１０６】 （実施例１） 基本的な細胞培養 ＦＶＩＩＩの生産 典型的な培養物は、Ｋａｕｆｍａｎら（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：１２３３－１２４２および米国特許第５，２５０，４２１号に記載されている、第ＶＩＩＩ因子とフォン・ヴィレブランド因子とを同時に発現するように形質転換された１０Ａ１Ｃ６ ＣＨＯ細胞株のサブクローンを使用して、バイオリアクターの中で確立される。特定のサブクローンを、動物に由来する生成物を含まない標準的な培地への適応と、マイクロプレートの中でのサブクローニングによって得た。 【０１０７】 標準的な培養培地は以下のとおりである： ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２ ５０／５０ １１．７６ｇ／ｋｇ これには以下を添加した： Ｌ－グルタミン ０．６ｇ／ｋｇ エタノールアミン １．５３ｍｇ／ｋｇ Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ Ｆ６８ ０．２５ｇ／ｋｇ ＮａＨＣＯ３　２ｇ／ｋｇ 大豆ペプトン ４ｇ／ｋｇ ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ １７．０２ｍｇ／ｋｇ 。 【０１０８】 基本のＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２ ５０／５０培地には、４．３ｐｐｂのＣｕ２＋を完全培地に含めるために十分な１．３ｍｇ／ｋｇのＣｕ２＋が含まれる。 【０１０９】 ＡＤＡＭＴＳ－１３の生産 ＣＨＯ ＤＵＫＸ－Ｂ１１細胞を、ＡＤＡＭＴＳ－１３遺伝子を導入するためにリン酸カルシウム共沈法を使用してトランスフェクトした。細胞をネオマイシン選択条件下で培養し、メトトレキセートとＧ４１８での処理の後で選択した。無血清への適応後、細胞をサブクローニングし、サブクローン６４０－２を生産用クローン（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｃｌｏｎｅ）として選択した。 【０１１０】 標準的な培養培地は、ＵＳ２００７／０２１２７７０（Ｇｒｉｌｌｂｅｒｇｅｒら；Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．，Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｓ．Ａ．）に開示されている培地をベースとする、血清を含まない、インシュリンを含まない、オリゴペプチドを含まない培地である。 【０１１１】 フューリンの生産 ＣＨＯ ＤＵＫＸ－Ｂ１１細胞を、フューリン遺伝子を導入するために、リン酸カルシウム共沈法を使用してトランスフェクトした。細胞を、ヒポキサンチン、チミジン、およびグリシンを含まないＤＨＦＲ培地で選択した。生産用クローン４８８－３は、サブクローニングと１００ｎＭのメトトレキセートを含む培地中での選択によって同定し、その後、無血清に適応させた。 【０１１２】 標準的な培養培地は、ＵＳ２００７／０２１２７７０（Ｇｒｉｌｌｂｅｒｇｅｒら；Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．，Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｓ．Ａ．）に開示されている培地をベースとする、血清を含まない、インシュリンを含まない、オリゴペプチドを含まない培地である。 【０１１３】 ＦＶＩＩの生産 ＣＨＯ ＤＵＫＸ－Ｂ１１細胞を、ＦＶＩＩとＶＫＯＲＣ（ビタミンＫエポキシドレダクターゼ複合体）を同時発現することができる２シストロン性のベクターでトランスフェクトした。遺伝子発現はＣＭＶプロモーターによって駆動され、内部リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）はＦＶＩＩ遺伝子とＶＫＯＲＣ遺伝子との間に配置されている。細胞を、リン酸カルシウム共沈法を使用してトランスフェクトした。選択培地には、２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含めた。細胞を無血清条件下でサブクローニングし、高発現サブクローン１Ｅ９を生産用クローンとして選択した。１Ｅ９を、連続培養条件下での増殖、生産性、および安定性に関して有利な特性を有しているとして選択した。安定性は、ケモスタット様式で２ヶ月間評価した。 【０１１４】 標準的な培養培地は、米国特許第６，９３６，４４１号（Ｂａｘｔｅｒ ＡＧ）に開示されている培養培地をベースとし、特に、２．５ｇ／Ｌのダイズペプトンと５ｍｇ／Ｌのインシュリン（Ｎｕｃｅｌｌｉｎ（登録商標）；Ｅｌｉ ＬｉｌｌｙまたはＮｏｖｏｌｉｎ（登録商標）、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）とを含めた。」 ２　引用発明の認定 引用文献１は、培養上清中に異種タンパク質を分泌するＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞を培養する方法を開示する文献であって（上記（１－１）、（１－２）、（１－８））、異種タンパク質として免疫グロブリンやその断片を採用すること（上記（１－７））、適した培地として米国特許第６，１７１，８２５号に記載されたもの（１－４）が例示されている。そして、異種タンパク質を分泌する哺乳動物細胞は、当該タンパク質の発現が可能な発現ベクターでトランスフェクトして作成するのが通常であるから（上記（１－３））、引用文献１には、次の発明が記載されていると認められる。 「免疫グロブリン及び免疫グロブリン断片の発現が可能な発現ベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を培養する際に使用するための細胞培養培地であって、５０ｎＭ～８００ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ～４００ｎＭ、便宜的には約２５０ｎＭの濃度の銅、及び０．１μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、好ましくは５μｇ／ｍｌ～１５μｇ／ｍｌ、又は約１０μｇ／ｍｌの濃度のインシュリンを含む、細胞培養培地。」 ３　対比 本願発明１８と引用発明とを対比すると、引用発明の「免疫グロブリン及び免疫グロブリン断片の発現が可能な発現ベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を培養する際に使用するための細胞培養培地」は、本願発明１８の「ベバシズマブもしくはその抗原結合性断片をコードする核酸を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培養する際に使用するための細胞培養培地」に対応する。そして、ベバシズマブは組換え型ヒト化モノクローナル抗体であることから（本願明細書段落【０００４】）、引用発明の免疫グロブリンと本願発明１８のベバシズマブは抗体である点で共通している。さらに、発現ベクターは発現させるタンパク質をコードする核酸を含み、トランスフェクトにより細胞に含まれるようになるものである。また、引用発明の「インシュリン」は本願発明１８の「インスリン」に相当する。したがって、本願発明１８と引用発明との間には、次の一致点及び相違点があるといえる。 （一致点） 「抗体及びその抗原結合性断片をコードする核酸を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培養する際に使用するための細胞培養培地であって、銅及びインスリンを含む、細胞培養培地。」 （相違点） （相違点１） 抗体が、本願発明１８は、「ベバシズマブ」であるのに対して、引用発明は、「免疫グロブリン」との特定に留まるものである点 （相違点２） 細胞培養培地が、本願発明１８は「約１．３ｍＭのシスチン」を含むものであるのに対して、引用発明はシスチンを含むことが特定されていない点 （相違点３） 培地中の銅の濃度について、本願発明１８は、「約３００ｎＭ～約４００ｎＭ」と特定されているのに対して、引用発明は、「５０ｎＭ～８００ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ～４００ｎＭ、便宜的には約２５０ｎＭ」である点 （相違点４） 培地中のインスリンの濃度について、本願発明１８は、「約１０．０ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ」と特定されているのに対して、引用発明は、「０．１μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、好ましくは５μｇ／ｍｌ～１５μｇ／ｍｌ、又は約１０μｇ／ｍｌ」（すなわち０．１ｍｇ／Ｌ～２０ｍｇ／Ｌ、好ましくは５ｍｇ／Ｌ～１５ｍｇ／Ｌ、又は約１０ｍｇ／Ｌ）である点 ４　判断 ア　相違点１について 引用発明の培地を使用する培養方法において、免疫グロブリン又は免疫グロブリン断片として、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞発現系で生成されることが周知のベバシズマブ（必要であれば、特表２００１－５０９８１７号公報　特許請求の範囲、第３２頁第９～２３行等を参照されたい。）を採用することは、当業者が適宜成し得たことである。 イ　相違点２について 引用文献１には、好ましい実施形態として、培地にさらにＬ－シスチン（０．００１ｇ／ｌ～１ｇ／ｌ）等のアミノ酸を添加することが記載されている（上記（１－６）。Ｌ－シスチンの分子量を２４０．３ｇ／ｍоｌとして計算すると、Ｌ－シスチンの濃度は約４．２μＭ～約４．２ｍＭである。）。ここで、組み換えタンパク質の収率を改善する目的で培地の組成を最適化することは当業者が通常行うことであるから、引用発明の培地にＬ－シスチンを約４．２μＭ～約４．２ｍＭ程度の濃度で添加することや、さらにその最適な濃度範囲を検討し、約１．３ｍＭなどの濃度とすることは当業者が容易に想到できたことである。 ウ　相違点３、４について 相違点３の銅の濃度及び相違点４のインスリンの濃度は、いずれも本願発明１８の濃度範囲と引用発明の濃度範囲とで相当部分重複するものである。そして、組み換えタンパク質の収率を改善する目的で培地の組成を最適化しようとして、引用発明の培地において、銅及びインスリンの濃度範囲をさらに検討することは当業者が容易に想到できたことである。 エ　効果について 本願明細書の実施例１－４に記載されているように、３３９ｎＭの濃度の銅や、１％の動物由来加水分解物及び０．２５％の植物由来加水分解物等を含む基底細胞培養培地を使用する条件で、かつ特定の培養温度シフトを含む培養手順で培養する条件において、インスリンやシスチン等の添加の効果が確認されている。しかしながら、当該効果は、引用文献１に記載された発明と比較して顕著なものとは認められない。 以上ア～エからみて、本願発明１８は、引用発明及び引用文献１の記載に基づいて、当業者が容易に想到し得たものである。 第４　むすび 以上のとおり、この出願の請求項１８に係る発明は特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであり、他の請求項に係る発明について言及するまでもなく、本願は拒絶すべきものである。 よって、結論のとおり審決する。