2015-012653

特願２０１２－５１４１６９「リプログラミングＴ細胞および造血細胞」拒絶査定不服審判事件〔平成２２年１２月　９日国際公開、ＷＯ２０１０／１４１８０１、平成２４年１１月１５日国内公表、特表２０１２－５２８５９９〕について、次のとおり審決する。

【結　論】 本件審判の請求は、成り立たない。

【理　由】 １．手続の経緯・本願発明 本願は、平成２２年６月４日（パリ条約による優先権主張　２００９年６月５日、２００９年９月４日、いずれも米国）を国際出願日とする出願であって、その請求項１～１８に係る発明は、平成２９年３月１７日付けの手続補正書により補正された特許請求の範囲の請求項１～１８に記載されたとおりのものであるところ、その請求項１に係る発明は、次のとおりのものと認める（以下、「本願発明」という。）。 「【請求項１】ＣＤ３４＋造血始原細胞から人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を作製する方法であって、 （ａ）ＣＤ３４＋造血始原細胞の増大を可能にする１つ以上のサイトカインと共にｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養して、その中で前記ＣＤ３４＋造血始原細胞の集団を増大させている精製されたＣＤ３４＋造血始原細胞を含む細胞集団を入手する工程であって、前記ＣＤ３４＋造血始原細胞が、ヒト被験体の末梢血サンプルから精製されたものであり、前記ヒト被験体の細胞が、外的に加えられる因子で動員されていない、工程と、 （ｂ）Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２、ならびにｃＭｙｃ、Ｋｌｆ４、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８から選択されるリプログラミング因子の少なくとも２つをコードする１つ以上の発現カセットを含む１つ以上のエピソーム複製ベクターの導入を介して前記細胞集団の前記ＣＤ３４＋造血始原細胞からｉＰＳ細胞を産生させて、組み込まれた外来性ウイルス要素を本質的に含まないｉＰＳ細胞集団を提供する工程であって、前記１つ以上の発現カセットは、少なくとも２つのリプログラミング因子を含むポリシストロニック転写単位を少なくとも含む、工程、 を含む、方法。」 ２．当審における拒絶理由 一方、当審において平成２８年９月１６日付けで通知した拒絶理由の概要は、請求項１～１８に係る発明は、本願優先日前に頒布された刊行物である引用文献１～１０に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない、というものである。 ３．本願の優先権主張について 本願の請求項１～１８に係る発明は、ＣＤ３４＋造血始原細胞からｉＰＳ細胞を作製する方法に係る発明であるが、ＣＤ３４＋造血始原細胞からｉＰＳ細胞を作製することについては、本願の第１の優先権主張の基礎となる米国出願第１８４５４６号（２００９年６月５日出願）の明細書には記載されておらず、本願の第２の優先権主張の基礎となる米国出願第２４０１１６号（２００９年９月４日出願）の明細書においてはじめて記載されているので、本願の請求項１～１８に係る発明については、本願の第２の優先権主張日（以下、単に「優先日」という。）である２００９年９月４日を進歩性の基準日として判断を行う。 ４．引用文献の記載事項 当審の拒絶理由で引用文献１として引用した、本願優先日前に頒布された刊行物であるＢｌｏｏｄ（２００９．Ｍａｙ）Ｖｏｌ．１１３，Ｎｏ．２２，ｐ．５４７６－５４７９（以下、「引用文献１」という。）には、以下の事項が記載されている（英語で記載されているため、日本語訳で摘記する。下線は合議体による。）。 ア．「ヒト血液からの人工多能性幹細胞の作製」（表題） イ．「皮膚生検によって得られたヒト真皮線維芽細胞は、限定された転写因子の異所性発現によって多能性へと直接リプログラムすることができる。ここでは、ＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＫＬＦ４／ＭＹＣのレトロウイルス形質導入を用いた、ＣＤ３４＋動員ヒト末梢血細胞からの人工多能性幹細胞の誘導について記述する。血液由来のヒト誘導多能性幹細胞は、形態学、表面抗原の発現、多能性関連転写因子、多能性細胞特異的遺伝子におけるＤＮＡメチル化状態、及びｉｎ　ｖｉｔｒｏや奇形腫における分化能力に関してヒト胚性幹細胞と区別できない。ヒト血液から細胞のリプログラムが可能になれば、疾患を起こす体細胞突然変異が造血系細胞に限定される疾患患者特有の幹細胞の生成が可能になる。」（要約） ウ．「方法 詳細な方法は、ドキュメントＳ１（Ｂｌｏｏｄウェブサイトで入手可能、オンライン記事の上部にある補足資料のリンクを参照）に含まれている。簡潔には、Ａｌｌｃｅｌｌｓ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）から入手した動員された末梢血細胞は、２６歳の男性ドナーから収集され、ＣＤ３４＋細胞（ｍＰＢ０１４Ｆ）を単離した。以前に公表された方法９から改変されたプロトコルを使用して、ＣＤ３４　ｉＰＳ細胞の作製を行った。」（第５４７６頁右欄第１行～第７行） エ．「結果及び考察 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・骨髄採取に関連するリスクを回避するため１０に、末梢血から単離した動員されたＣＤ３４＋造血幹細胞／前駆細胞を得た１１。レトロウイルス構築物の組み込み及び発現は、標的細胞の有糸分裂を必要とするので、我々はまず、ＣＤ３４＋細胞をｈＳＣＦ、ｈＦ１ｔ３Ｌ及びＩＬ－３サイトカインの組み合わせと共にｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養して１２、ＣＤ３４＋細胞を数桁のオーダーで増殖及び増大させた（図１Ａ、Ｂ、Ｓ１Ａ）。６日間の培養期間の過程にわたるフローサイトメトリー分析により、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８－造血前駆細胞のパーセンテージの漸進的減少及び分化した表現型（ＣＤ１４、ＣＤ１５；図Ｓ１Ｂ、Ｃ）を有する細胞のパーセンテージの同時的な増加を示した。分化細胞又は成熟細胞の割合が高いと、造血前駆細胞の増大能に対して強い抑制効果が生じる１３。したがって、我々は、大部分の細胞が依然としてＣＤ３４を発現しており、活発に増殖していた培養の４日目に、ＣＤ３４＋細胞のウイルス形質導入を行った（図Ｓ１）。形質導入の３日後、細胞を回収し、フィーダーＭＥＦ細胞上にプレーティングした（図１Ａ）。１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞成長因子を補充したヒトＥＳ（ｈＥＳ）細胞培地を５日目に添加した（図１Ａ）。我々は、形質導入の約１４日後に初めてコロニーを検出した。ほとんどがｈＥＳ細胞特性を有さない顆粒化細胞クラスターに発達し（図１Ｃ）、その他の細胞はｈＥＳ細胞に特徴的な明瞭な丸いエッジを有する平坦でコンパクトな形態を示した（図１Ｄ）。我々は、５×１０４個のＣＤ３４＋細胞から、常に約５～１０個のｈＥＳ細胞様コロニーを観察した（３回の独立した実験からのデータ）。・・・・・・・・・・・・・・・・・・全部で、８個の独立したＧｆｐ－コロ二ーを選んで増大し、２つの系統、ＣＤ３４　ｉＰＳ１及びＣＤ３４　ｉＰＳ２について十分に特性解析した。」（第５４７６頁右欄第８行～第５４７７頁右欄第４行） オ．「細胞培養。動員された末梢血ＣＤ３４＋細胞（Ａｌｌｃｅｌｌｓ、ｍＰＢ０１４Ｆ）を、ｈＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ｈＦｌｔ３Ｌ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びインターロイキン－３（２０ｎｇ／ｍｌ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充した、１５％ウシ胎仔血清（ＳｔｅｍＣｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で維持した。４日間培養で増殖させたＣＤ３４＋細胞を、レトロウイルス形質導入に使用した。胚様体を形成するために、コンフルエントな未分化ＣＤ３４　ｉＰＳ細胞を、ストリップに機械的にこすり付け、２０％ウシ胎仔血清（ＳｔｅｍＣｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍＭ　Ｌ－グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）、２ｍｇ／ｍｌヒトホロトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ）及び０．１ｍＭ　ｂ－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）を補充した、ノックアウトＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からなる分化培地中で６ウェル低接触プレートに移した。 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ＣＤ３４＋細胞採取。供給者（Ａｌｌｃｅｌｌｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）に従い、動員された末梢血から以下のように入手した。ドナーを、Ａｍｇｅｎで製造されたＮｅｕｐｏｇｅｎ（Ｇ－ＣＳＦ）で３日間５μ／ｋｇ／日の容量で注射した。４日目に、７血液容量のアフェレーシスを、Ｃｏｂｅアフェレーシス装置で実施し、３００ｍｌの血液を採取した。この採取物の総細胞数は、３．４×１０１０であり、ＣＤ３４＋細胞の収量は～１％であった。リプログラミング実験は、リプログラミング因子を保有するウイルスで感染させる前に４日間培養で増殖させた、５×１０４のＣＤ３４＋細胞で行った。 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・ レトロウイルス作製及びヒトｉＰＳ細胞誘導。ヒトＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びＭＹＣレトロウイルスベクターは、線維芽細胞のリプログラミングのために以前使用された１。１５ｃｍプレート中の２９３Ｔ細胞に、６．２５μｇのレトロウイルスベクター、０．７５μｇのＶＳＶ－Ｇベクター及び５．６２５μｇのＧａｇ－ＰｏｌベクターをＦＵＧＥＮＥ６試薬を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、上清を０．４５μｍ酢酸セルロースフィルターで濾過し、２３，０００ｒｐｍで９０分間の遠心分離により濃縮し、使用するまで－８０℃で保存した。形質導入は、記載されているように２フィブロネクチンフラグメントＣＨ－２９６（レトロネクチン；タカラ酒造、大津、日本）でコーティングされた６マルチウェルプレート中のＣＤ３４＋細胞上で行った。ＭＯＩ（感染多重度）５でウイルスを加え、１２時間後に感染を繰り返した。各感染の間、細胞を１，３００ｒｐｍで１．５時間遠心分離した。感染の３日後、細胞をマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）で予め播種したプレートに分割した。感染の５日後に培地をヒトＥＳ培地に交換した。 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・ フローサイトメトリー。動員された末梢血ＣＤ３４＋細胞は、２０分間氷上でＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で異なる抗体で染色して２、４、及び６日間培養した後で採取した。ＢＤバイオサイエンス（Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ、ＣＡ）からの抗体は、ＰＥコンジュゲートＣＤ３４（クローン５６３）、ＡＰＣコンジュゲートＣＤ４５（クローンＨＩ３０）、ＦＩＴＣコンジュゲートＣＤ３８（クローンＨＢ７）、及びＦＩＴＣコンジュゲートＣＤ１５（クローンＨＩ９８）を含み、Ｃａｌｔａｇ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）からの抗体は、ＦＩＴＣコンジュゲートＣＤ１４（クローンＴＵＫ４）を含んだ。細胞は、５レーザーＬＳＲ－ＩＩ（ＢＤバイオサイエンス、Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で分析し、死んだ細胞は、ヨウ化プロピジウム染色で除いた。 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・」（「補足資料」の項） 当審の拒絶理由で引用文献２として引用した、本願優先日前に頒布された刊行物であるＮａｔ．Ｇｅｎｅｔ．（２００９．Ａｕｇ．）Ｖｏｌ．４１，Ｎｏ．９，ｐ．９６８－９７６（以下、「引用文献２」という。）には、以下の事項が記載されている（英語で記載されているため、日本語訳で摘記する。）。 カ．「ヒト造血前駆細胞が等しくｉＰＳ細胞にリプログラミングすることができるかをためすために、我々は、ｒｔＴＡを発現するレンチウイルス構築物（捕捉の図６）と同様にドキシサイクリン制御下でＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃＭｙｃを発現するヒトポリシストロニックベクターに、ＣＤ３４＋臍帯血前駆細胞を感染させた。・・・・・・・・・・・・・・・・・・この実験は、ヒト造血前駆細胞からｉＰＳ細胞を誘導する原理の証明を提供する。」（第９７３頁右欄第２０行～第３２行） キ．「ＣＤ３４＋臍帯血前駆細胞からのヒトｉＰＳ細胞の誘導 ヒトＣＤ３４＋臍帯血細胞は、ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入し、ＳｔｅｍＳｐａｎ　ＣＣ１００サイトカインカクテル（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で補充したＳｔｅｍＳｐａｎ血清不含増大培地（ＳＦＥＭ）で（解凍後）２４時間培養した。我々は、最近記述されたマウスポリシストロニックレンチウイルスベクターと同じく、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃＭｙｃのヒトｃＤＮＡを発現するポリシストロニックレンチウイルスに、１×１０５細胞を丸底９６穴プレートで感染させた。」（「オンライン方法」の項） 当審の拒絶理由で引用文献３として引用した、本願優先日前に頒布された刊行物であるＳｃｉｅｎｃｅ（２００９．Ｍａｙ）Ｖｏｌ．３２４，Ｎｏ．５９２８，ｐ．７９７－８０１（以下、「引用文献３」という。）には、以下の事項が記載されている（英語で記載されているため、日本語訳で摘記する。下線は合議体による。）。 ク．「ベクター及び導入遺伝子配列を含まないヒト人工多能性幹細胞」（表題） ケ．「分化したヒト細胞を人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞にリプログラミングすることは、基礎生物学、薬剤開発、及び移植に応用されている。ヒトｉＰＳ細胞誘導には、以前はゲノムに組み込まれるベクターが必要であり、これは変異を作出し、研究及び臨床応用の両方において細胞の有効性を制限し得る。我々は、非組み込みエピソームベクターの使用によるヒトｉＰＳ細胞の誘導を記載する。エピソームの除去後、増殖及び発生能においてヒト胚性幹（ＥＳ）細胞に類似した、ベクター及び導入遺伝子配列を完全に含まないｉＰＳ細胞が誘導される。これらの結果は、ヒト体細胞のリプログラミングが、外因性リプログラミング因子のゲノムへの組み込み又は継続的な存在を必要とせず、ヒトｉＰＳ細胞の臨床応用への障害の一つを除去することを実証する。」（要約） コ．「ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８は、ヒトの胚性、新生児及び成人の線維芽細胞をｉＰＳ細胞にリプログラミングするのに十分であるが（２、１６）、リプログラミング効率は低い（新生児包皮線維芽細胞について０．０１％未満）（２）。安定なトランスフェクション効率は、我々のレンチウイルスベクターよりもほぼ二桁低いため、このように低い効率ではｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１によるベクターを用いたリプログラミングを困難にする（２）。そのため、我々はまず、レンチウイルスベクターを使用してリプログラミング効率を向上させた。ＯＣＴ４及びＳＯＸ２を共発現するために異なるリンカーを試験することにより、我々は、内部リボソーム進入部位２（ＩＲＥＳ２）がより高いリプログラミング効率を維持することを見出した（図Ｓ１、Ａ及びＢ）。リンカーは、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８を共発現させるために使用した場合、リプログラミング効率に対する影響が小さいので（図Ｓ１Ｂ）、リプログラミング因子を共発現させるためにＩＲＥＳ２を選択した。ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８のＩＲＥＳ２媒介性発現を使用して、我々は、ヒト包皮線維芽細胞についてのリプログラミング効率を、我々が以前に報告したものよりも約１０倍（～約０．１％）向上させた（図Ｓ１Ｃ）。ｃ－Ｍｙｃ及びＫＬＦ４を追加することで、リプログラミング効率は、これらの細胞について我々が達成した最高の効率である１％超へと、さらに向上した（図Ｓ１Ｃ）（１７）。そのため、我々は、共発現のためにＩＲＥＳ２を使用して、６個全てのリプログラミング因子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ｃ－Ｍｙｃ及びＫＬＦ４）をｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１ベクターにクローニングした。・・・・・・・・・・・・・・・・・・ エピソームベクター中の６個のリプログラミング遺伝子を用いた最初の試験では、ヒトｉＰＳ細胞コロニーは得られなかった（表Ｓ２）。この遺伝子の組合せでは、おそらく高いｃ－Ｍｙｃ発現の毒性効果のために、トランスフェクション後の１週間の間に実質的な細胞死が観察された（１８）。ｃ－Ｍｙｃ発現の毒性効果を打ち消すために、我々は、いくつかの組合せにＳＶ４０ラージＴ遺伝子（ＳＶ４０ＬＴ）を含ませた（１９）。これらの組合せは全てＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ｃ－Ｍｙｃ、ＫＬＦ４及びＳＶ４０ＬＴを含み、その組合せのうち３つが、ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１によるベクターを用いてヒト包皮線維芽細胞からｉＰＳ細胞を作製することに成功した（図１Ａ、図Ｓ２Ｄ及び表Ｓ２）。それぞれの成功した組合せの中の少なくとも２つのプラスミドはＯＣＴ４及びＳＯＸ２を発現し、このことは、これらの導入遺伝子の高い発現がリプログラミングを向上させるという観察と一致する。これらの組合せのうち２つに由来するクローン（実験３から１９、実験４から６及び表Ｓ２）を増大及び分析のために選択した。これらのｉＰＳ細胞コロニーは、典型的なヒトＥＳ細胞形態（例えば、小型のコロニー、高い核対細胞質比、及び顕著な核）を示し（図１Ｂ）、ヒトＥＳ細胞株と非常に類似した遺伝子発現プロフィールを示したが、親の線維芽細胞とは類似していなかった（図ｌＣ及び表Ｓ３）。これらのｉＰＳ細胞は、免疫減弱化マウスに注射した場合に、ヒトＥＳ細胞と同様に、３つ全ての一次胚葉の分化派生物からなる奇形種を形成した（図１Ｄ）。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析では、ゲノム中のエピソームベクターの組み込みは検出されなかったが、ベクターはエピソーム画分中に残ることが検出された（図１Ｅ）。エピソームベクターの持続性は、長期の導入遺伝子発現がリプログラミングの成功に必要なことを示唆する。 」（第７９８頁左欄下から第９行～第８００頁左欄第７行） サ．「 」（図１Ａ） 当審の拒絶理由で引用文献４として引用した、本願優先日前に頒布された刊行物である国際公開第２００９／０３２４５６号（以下、「引用文献４」という。）には、以下の事項が記載されている（英語で記載されているため、日本語訳で摘記する。下線は合議体による。）。 シ．「１．リプログラムされた細胞を産生する方法であって、 被験体から細胞を単離し、 少なくとも１つの多能性因子をウイルスを使用しないで細胞に導入し、リプログラムされた細胞を産生し、 リプログラムされた細胞の５％以上の細胞が、Ｏｃｔ－４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ１－６０、Ｓｔｅｌｌａ、アルカリフォスファターゼ、ＶＡＳＡ、ｃＲＥＴ及びＲｅｘ－１からなる群から選択される少なくとも１つの胚性幹細胞マーカーを発現しているかを決定する、ステップを含む方法。 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ７．前記細胞が、体細胞、生殖細胞及び生後幹細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。」（特許請求の範囲） ス．「本方法に有用な成人体細胞の代表例は、繊維芽細胞、上皮細胞のような外胚葉細胞、骨髄細胞、ＣＤ３４＋末梢血幹細胞、心筋細胞、筋細胞、血管平滑筋細胞、肝細胞、腎細胞のような中胚葉組織細胞、血管内皮細胞のような内胚葉上皮細胞を含む。」（［００１０５］） 当審の拒絶理由で引用文献５として引用した、本願優先日前に頒布された刊行物であるＮａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．（２００６）Ｖｏｌ．１，Ｎｏ．４，ｐ．２１７８－２１８３（以下、「引用文献５」という。）には、以下の事項が記載されている（英語で記載されているため、日本語訳で摘記する。下線は合議体による。）。 セ．「本プロトコルは、幹細胞動員処置を使用せずに、正常ドナー由来の末梢血細胞から相当数のヒト肥満細胞を得るための方法を詳述する。磁気セル・ソーティング・システムを用いることによって、健常ドナーから１００ｍ１の血液を採取した場合に、１０４－１０５細胞がＣＤ３４＋画分に回収される。これらの細胞を、幹細胞因子及びインターロイキン６を補充したメチルセルロース培地を使用して培養する場合、１０３－１０４の肥満細胞コロニーが６週間で形成される。培養６週間での総肥満細胞数は、１０６－１０７である。」（要約） ソ．「手順 １日目 １　１００ｍｌのヒト末梢血を、各々がＰＢＳ中に５ｍｌの１００ｍＭ　ＥＤＴＡを含む２つの５０ｍｌシリンジに回収する。 重要工程　本プロトコルには、新しい（４時間以内）試料が必要である。 注意　本研究の被験体は、本研究所の倫理検査評議会により承認された書面のインフォームドコンセントを提出するべきである。 ２　２容量（１００ｍｌ）のＰＢＳで細胞を希釈する。 ３　５０ｍｌコニカルチューブ中で１３ｍｌのリンパ球分離培地（１．０７７密度）上に３３ｍｌの希釈した細胞懸濁液を重ね、ブレーキをかけずにスイングバケットローター中で室温（２４℃）で４００ｇで３０分遠心分離する。 ４　界面の細胞（単核細胞画分）を回収し、６つの新しい５０ｍｌコニカルチューブに移す。 ５　６つのコニカルチューブをＰＢＳで満たし、室温で４００ｇで１０分遠心分離する。 ６　上清を捨て、各細胞ペレットを５ｍｌのＰＢＳに再懸濁する。６つのチューブから細胞懸濁液を回収し、１つの５０ｍｌコニカルチューブに移し、４℃で４００ｇで１０分遠心分離する。 ７　細胞ペレットを２０ｍｌの溶血性溶液中に再懸濁し、赤血球を破壊する。３分後、チューブを製造業者のＭＡＣＳリンス緩衝液（２ｍＭ　ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）で満たし、室温で４００ｇで１０分遠心分離する。 ８　細胞ペレットを４０ｍｌのＭＡＣＳリンス緩衝液に再懸濁し、細胞数を計数し、４℃で５００ｇで４分遠心分離する。 ９　細胞ペレットを１０８の総細胞あたり３００μｌのＭＡＣＳリンス緩衝液の最終容量に再懸濁する。我々は、通常、１００ｍｌの血液から１０８の末梢血単核細胞を得る。 １０　１０８の総細胞あたり１００μｌのＦｃＲブロッキング試薬を細胞懸濁液に添加し、非標的細胞へのＣＤ３４　ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓの非特異的またはＦｃレセプター媒介性結合を阻害する。 ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓでの細胞の標識 １１　ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓでの細胞の標識には、２つのオプション（細胞のポジティブ選択またはネガティブ選択）が利用可能である。 （Ａ）ＣＤ３４＋細胞のポジティブ選択 （ｉ）１０８の総細胞あたり１００μｌのＣＤ３４　ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓを添加し、ウェルを混合し（１０分ごとに指でチューブをたたく）、４℃で３０分インキュベートすることにより細胞を標識する。 （Ｂ）系統陰性細胞のネガティブ選択 （ｉ）ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６及びＣＤ１９のＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（１０８の総細胞あたり各々１００μｌ）を添加し、ウェルを混合し（１０分ごとに指でチューブをたたく）、４℃で３０分インキュベートすることにより細胞を標識する。 １２　４℃で５００ｇで４分遠心分離することにより、４０ｍｌのＭＡＣＳランニング緩衝液で細胞を２回洗浄する。 １３　１×１０８の総細胞あたり５ｍｌのＭＡＣＳランニング緩衝液で細胞を再懸濁する。 １４　細胞を３０μｍナイロンメッシュに通し、凝集塊を除去する。使用前にＭＡＣＳ緩衝液でメッシュを湿らせる。 前駆細胞の分離 １５　前駆細胞を、ａｕｔｏＭＡＣＳを使用してポジティブ選択（オプションＡ）若しくはネガティブ選択（オプションＢ）、又はＬＳカラムを用いたＳｕｐｅｒＭＡＣＳ　ＩＩを使用するポジティブ選択（オプションＣ）若しくはＣＳカラムを用いたＳｕｐｅｒＭＡＣＳ　ＩＩを使用するネガティブ選択（オプションＤ）のいずれかにより、細胞懸濁液から単離し得る。 （Ａ）ａｕｔｏＭＡＣＳセパレーターを使用するＣＤ３４＋細胞のポジティブ選択 （ｉ）ポジティブ選択のためにＰｏｓｓｅｌ－Ｄ２プログラムを選択することにより、細胞をａｕｔｏＭＡＣＳカラムにアプライし、細胞をカラムに通過させ、緩衝液で洗浄する。 （Ｂ）ａｕｔｏＭＡＣＳセパレーターを使用する系統陰性細胞ネガティブ選択 （ｉ）Ｄｅｐｌ－０５プログラムを選択することにより、細胞をａｕｔｏＭＡＣＳカラムにアプライし、細胞をカラムに通過させ、緩衝液で洗浄する。 （Ｃ）ＬＳカラムを用いたＳｕｐｅｒＭＡＣＳ　ＩＩを使用するポジティブ選択 （ｉ）１×１０８細胞をＭＡＣＳ　ＬＳカラムにアプライし、細胞をカラムに通過させ、緩衝液で洗浄する（詳細なプロトコルについては、製造業者のウェブページ：ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ．ｃｏｍ／を参照）。簡単に、磁力での反応の後、セパレーターからカラムを取り外し、カラムを適切なチューブに配置し、カラムの上部に緩衝液をピペットする。カラムを供給したプランジャーを使用することにより圧力で残存細胞を確実に洗い出すことによりＣＤ３４＋細胞を回収する。 （Ｄ）ＣＳカラムを用いたＳｕｐｅｒＭＡＣＳ　ＩＩを使用するネガティブ選択 （ｉ）ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６及びＣＤ１９のＭｉｃｒｏＢｅａｄｓで標識した最大１０８細胞をＣＳカラム（ネガティブ選択のために指定される）にアプライする。セパレークーからカラムを取り外す前に、系統陰性細胞を、カラムの上部に緩衝液を繰り返しアプライすることにより完全に回収するべきである。 重要工程　多すぎる細胞をアプライすると標的細胞の回収に影響するので、ＭＡＣＳカラムにアプライする細胞数は重要である。本プロトコルにおける最適細胞数は、１０８～２×１０８である。また、カラムの使用期限の確認も必要である。 １６　ＣＤ３４＋細胞または系統陰性細胞を回収し、４℃で５００ｇで４分で２回基本培養培地で洗浄する。」（第２１７９頁下から第２５行～第２１８０頁第２９行） 当審の拒絶理由で引用文献６として引用した、本願優先日前に頒布された刊行物であるＢｌｏｏｄ（１９９５）Ｖｏｌ．８６，Ｎｏ．１，ｐ．１４１－１４６（以下、「引用文献６」という。）には、以下の事項が記載されている（英語で記載されているため、日本語訳で摘記する。）。 タ．「我々は、臨床的に許容できるレトロウイルス上清形質導入プロトコルを用いて、ゴーシェ病患者由来の非動員末梢血（ＰＢ）ＣＤ３４＋細胞に高効率遺伝子導入を達成した。」（要約左欄第１行～第４行） チ．「ＣＤ３４＋細胞の単離 形質導入実験は、インフォームドコンセント及び研究所審査会の承認後の、正常志願者又はゴーシェ病患者から得られたＰＢ又はＢＭ細胞を用いて行われた。ＰＢ細胞は、Ｆｅｎｗａｌｌ　ＣＳ３０００血液細胞分離装置（バクスター　ヘルスケア、Ｉｎｃ、ディアフィールド、ＩＬ）を用いて、８～１０Ｌのアフェレーシスにより、動員せずに集められた。・・・・・・・・・ ＰＢ又はＢＭからの単核（ＭＮ）細胞は、製造者の使用説明書に従って、研究室規模のＣｅｐｒａｔｅ　ＬＣ細胞分離システム又は臨床規模のＣｅｐｒａｔｅ幹細胞濃縮装置（ＣｅｌｌＰｒｏ　Ｉｎｃ、ボセル、ＷＡ）を用いて、ＣＤ３４＋細胞を濃縮した。」（第１４２頁左欄第１０行～第２２行） 当審の拒絶理由で引用文献７として引用した、本願優先日前に頒布された刊行物であるＳｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ（２００６）Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．２，ｐ．３３３－３３６（以下、「引用文献７」という。）には、以下の事項が記載されている（英語で記載されているため、日本語訳で摘記する。）。 ツ．「そこで、我々は、６人のＡＭＩ患者において動員せずに末梢血ＣＤ３４＋細胞の単離をこころみた。大容量細胞吸着及びＣＤ３４＋細胞のポジティブ選択後、３６０～２７６０万個のＣＤ３４＋細胞が得られた。」（要約左欄第４行～第８行） テ．「ＣＤ３４＋細胞濃縮 自己末梢血ＨＳＣは、Ｃｏｂｅ　Ｓｐｅｃｔｒａ細胞分離装置で実施される大容量（１５～２０Ｌ）細胞吸着後に得られた。ＣＤ３４＋細胞のポジティブ選択は、バクスターＩｓｏｌｅｘ　３００ｉ医療機器で実施した。選択した細胞は、約２０時間４℃で維持した後、標識した。」（第３３４頁左欄第３０行～第３５行） 当審の拒絶理由で引用文献８として引用した、本願優先日前に頒布された刊行物であるＢｏｎｅ　Ｍａｒｒｏｗ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．（２００７）Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．１０，ｐ．５７７－５８８（以下、「引用文献８」という。）には、以下の事項が記載されている（英語で記載されているため、日本語訳で摘記する。）。 ト．「しかし、Ｇ－ＣＳＦ動員には、いくつかの重大な副作用が伴うことがあり、数日の投与レジメンが要求される。」（要約第５行～第７行） 当審の拒絶理由で引用文献９として引用した、本願優先日前に頒布された刊行物である特開２００６－３４２１３１号公報（以下、「引用文献９」という。）には、以下の事項が記載されている。 ナ．「Ｇ－ＣＳＦ製剤はタンパク質製剤であるため、経済的に負担が大きい。また、造血幹・前駆細胞の骨髄から末梢血への動員剤としてＧ－ＣＳＦ製剤を使用する場合、入院で連日最低４日間の投与が必要であり、骨痛、発熱、頭痛等の副作用が報告されている。また、健常人ドナーの約１０％で造血幹・前駆細胞の動員効果が低いといわれており、移植に十分な造血幹・前駆細胞を採取するのは困難である。さらに、白血球増加剤としての使用は、頻回投与が必要であり、患者及び医師は苦痛と負担を強いられてきた。」（【０００５】） 当審の拒絶理由で引用文献１０として引用した、本願優先日前に頒布された刊行物である特開２００６－６７８５８号公報（以下、「引用文献１０」という。）には、以下の事項が記載されている。 ニ．「最近、骨髄に代わる造血幹細胞源として末梢血がしばしば用いられている。造血幹細胞を含むＣＤ３４陽性細胞は、健常人の末梢血にはごく少数しか存在していないが、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）を連続投与すると骨髄から末梢血に動員される。このＧ－ＣＳＦの連続投与によって造血幹細胞を動員した末梢血から、血液成分分離装置を用いて末梢血造血幹細胞／造血前駆細胞が採取され、移植に用いられている。しかし、この末梢血幹細胞移植は、Ｇ－ＣＳＦをドナーに投与する必要があり、それに伴う副作用などドナーへの負担が大きい。また、Ｇ－ＣＳＦ投与により骨髄から末梢血への造血幹細胞の動員が増えるとはいえ、その効率は低い。」（【０００３】） 上記記載事項オ．の記載中、「ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びＭＹＣレトロウイルスベクター」は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びＭＹＣのリプログラミング因子を発現させるためのベクターであるから、該ベクターがＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びＭＹＣのリプログラミング因子をコードする発現カセットを含むものであることは明らかである。 よって、上記記載事項ア．～オ．によると、引用文献１には、「ＣＤ３４＋造血前駆細胞から人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を作製する方法であって、 ＣＤ３４＋造血前駆細胞をｈＳＣＦ、ｈＦ１ｔ３ＬおよびＩＬ－３サイトカインの組み合わせと共にｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養して、前記ＣＤ３４＋造血前駆細胞の集団を増大させている単離されたＣＤ３４＋造血前駆細胞を含む細胞集団を入手する工程であって、前記ＣＤ３４＋造血前駆細胞が、ヒト被験体の末梢血サンプルから単離されたものであり、前記ヒト被験体の細胞が、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）で動員されたものである、工程と、 Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃＭｙｃおよびＫｌｆ４のリプログラミング因子をコードする発現カセットを含むレトロウイルスベクターの導入を介して前記細胞集団の前記ＣＤ３４＋造血前駆細胞からｉＰＳ細胞を産生させる工程、 を含む、方法。」の発明（以下、「引用発明」という。）が記載されていると認められる。 ５．対比 本願発明と引用発明とを対比すると、引用発明の「造血前駆細胞」は、本願発明の「造血始原細胞」に相当し、引用発明の「単離」は、本願発明の「精製」に相当する。 また、上記記載事項エ．には、「ＣＤ３４＋細胞をｈＳＣＦ、ｈＦ１ｔ３Ｌ及びＩＬ－３サイトカインの組み合わせと共にｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養して１２、ＣＤ３４＋細胞を数桁のオーダーで増殖及び増大させた」と記載されているから、上記記載事項エ．の記載中、「ｈＳＣＦ、ｈＦ１ｔ３Ｌ及びＩＬ－３サイトカインの組み合わせ」が、「ＣＤ３４＋造血前駆細胞の増大を可能にする１つ以上のサイトカイン」に該当することは明らかである。 そうすると、本願発明と引用発明とは、「ＣＤ３４＋造血始原細胞から人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を作製する方法であって、 （ａ）ＣＤ３４＋造血始原細胞の増大を可能にする１つ以上のサイトカインと共にｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養して、その中で前記ＣＤ３４＋造血始原細胞の集団を増大させている精製されたＣＤ３４＋造血始原細胞を含む細胞集団を入手する工程であって、前記ＣＤ３４＋造血始原細胞が、ヒト被験体の末梢血サンプルから精製されたものである、工程と、 （ｂ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃＭｙｃおよびＫｌｆ４のリプログラミング因子をコードする発現カセットを含むウイルスベクターの導入を介して前記細胞集団の前記ＣＤ３４＋造血始原細胞からｉＰＳ細胞を産生させる工程、 を含む、方法。」である点で一致し、両者は以下の点で相違する。 相違点１：ヒト被験体の細胞が、本願発明は、「外的に加えられる因子で動員されていない」のに対し、引用発明は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）で動員されたものである点。 相違点２：本願発明は、ウイルスベクターがリプログラミング因子をコードする１つ以上の発現カセットを含む１つ以上のエピソーム複製ベクターであり、前記１つ以上の発現カセットは、少なくとも２つのリプログラミング因子を含むポリシストロニック転写単位を少なくとも含むものであり、組み込まれた外来性ウイルス要素を本質的に含まないｉＰＳ細胞集団を提供するのに対し、引用発明は、ウイルスベクターがレトロウイルスベクターであり、発現カセットがポリシストロニック転写単位を含むものであることは特定がされておらず、組み込まれた外来性ウイルス要素を本質的に含まないｉＰＳ細胞集団を提供することは特定がされていない点。 ６．当審の判断 そこで、上記相違点について検討する。 相違点１について 引用文献２には、ＣＤ３４＋臍帯血始原細胞からｉＰＳ細胞を作製することができたことが記載されており（上記記載事項カ．～キ．）、「外的に加えられる因子で動員されていない」ＣＤ３４＋造血始原細胞からｉＰＳ細胞を作製することができたことを実証しており、また、引用文献４には、ＣＤ３４＋末梢血幹細胞からｉＰＳ細胞を作製することが記載されている（上記記載事項シ．～ス．）が、ｉＰＳ細胞の作製に使用するＣＤ３４＋末梢血幹細胞として、Ｇ－ＣＳＦで動員された末梢血から精製されたものを使用することは記載されていない。 一方、引用文献５～７に記載されているように、Ｇ－ＣＳＦなどの因子で動員されていない末梢血からＣＤ３４＋造血始原細胞を単離する方法は、本願優先日前周知の技術である（上記記載事項セ．～テ．）。 また、引用文献８～１０に記載されているように、Ｇ－ＣＳＦを動員に使用する場合、副作用が報告されており、また、動員に日数を要する問題があることは本願優先日前周知の事項である（上記記載事項ト．～ニ．）。 そうすると、引用発明のｉＰＳ細胞の作製方法において、Ｇ－ＣＳＦを動員に使用する場合の副作用などの問題を避けるために、Ｇ－ＣＳＦで動員された細胞の代わりに、引用文献５～７に記載されているような本願優先日前周知技術を用いて、外的に加えられる因子で動員されていない末梢血から精製されたＣＤ３４＋造血始原細胞を使用することは、当業者が容易に想到し得ることである。 相違点２について 上記記載事項ク．～コ．から、引用文献３に記載されているエピソームベクターは、リプログラミング因子をコードする１つ以上の発現カセットを含む１つ以上のエピソーム複製ベクターであり、組み込まれた外来性ウイルス要素を本質的に含まないｉＰＳ細胞集団を提供することができるものと認められる。 また、本願明細書には、「具体的な実施形態では、１つ以上の発現カセットは、１つ以上のポリシストロニック転写単位を含み得る。ポリシストロニック単位は、例えば、（ｉ）少なくとも２つのリプログラミング遺伝子、例えば、Ｓｏｘ－Ｏｃｔ、ｃ－Ｍｙｃ－Ｋｌｆ、またはＮａｎｏｇ－Ｌｉｎ２８；あるいは、（ｉｉ）選択可能なまたはスクリーニング可能なマーカーに連結されたリプログラミング遺伝子などの作動可能に連結されたコード領域の異なる組み合わせを含み得る。」（【００１７】）と記載されており、本願発明の「ポリシストロニック転写単位」は、２つのリプログラミング遺伝子の転写単位を含むものを示すものと認められ、上記記載事項サ．から、引用文献３に記載されているエピソームベクターは、「少なくとも２つのリプログラミング因子を含むポリシストロニック転写単位を少なくとも含む」ものに該当するといえる。 そして、引用文献３に記載されているエピソームベクターは、レトロウイルスベクターと異なり、ベクター及び導入遺伝子配列を含まないｉＰＳ細胞を作製できるという利点がある（上記記載事項ケ．）から、引用発明のｉＰＳ細胞の作製方法において、ウイルスベクターとして引用文献３に記載されているエピソーム複製ベクターを用いることは、当業者が容易になし得ることである。 ７．審判請求人の主張 審判請求人は、平成２９年３月１７日付け意見書において、以下のア．～ウ．の点を主張しているので、以下この点について検討する。 ア．甲第６号証には、「Ｇ－ＣＳＦ動員ＣＤ３４＋末梢血幹細胞が、刺激されていない末梢血ＣＤ３４＋細胞よりもアポトーシス性が有意に低い：Ｇ－ＣＳＦの生存因子としての役割」、「Ｇ－ＣＳＦは、動員された細胞の生存能力を有意に変化させる」と記載されており、末梢血由来のＧ－ＣＳＦ動員ＣＤ３４＋細胞と非動員ＣＤ３４＋細胞との間で、アポトーシスすなわち生存能力との関係で有意な相違が存在することが説明されている。 甲第７号証には、「Ｐｈｉｌｐｏｔｔ文献（甲第６号証）は、Ｇ－ＣＳＦがＣＤ３４＋細胞集団においてインビボでアポトーシスを抑制し、それゆえその生存を延長したことを示した。」と記載されており、甲第６、７号証は、本願優先日当時、非動員末梢血を用いるとアポトーシスが抑制できず、質的に十分な出発細胞を準備できないと当業者が考える基礎になった。 このような知見を有する本願優先日当時の当業者は、Ｇ－ＣＳＦ動員された細胞と非動員末梢血の細胞との相違は質的に「有意に」異なるもの、すなわち相互に類推や外挿ができない程度に異なるものであると理解したはずであり、動員末梢血由来の細胞でｉＰＳ細胞の初期化を成功したとしても、非動員末梢血由来の細胞で同様に成功するとは当業者が予測できなかったといえる。むしろ、アポトーシスの観点から質的に細胞が異なると理解した当業者は、非動員末梢血由来の細胞を用いてもｉＰＳ細胞の初期化は成功するとはいえず、むしろ困難であり失敗するであろうと考えた。 甲第１７号証には、アポトーシスを抑制することが効率的なｉＰＳ細胞の作製に重要であることが記載され、ｉＰＳ細胞生産の成功のためにはｐ５３を抑制してアポトーシスを阻害することが重要である旨記載されており、アポトーシスを回避または抑制することがｉＰＳ細胞生産にとって重要であったとの認識があったことが窺える。すなわち、アポトーシスはｉＰＳ細胞の製造には避けるべき形質であり、アポトーシスをしやすい細胞や老化した細胞はｉＰＳ細胞生産に不向きであるというのが当業者の認識であったことが窺える。 甲第１８号証には、「我々のデータは、体細胞のｉＰＳ細胞への初期化がｐ５３経路の活性化に関連すること、そしてこれが初期化にとって障害との働きをすることを示す。ｐ５３が初期化と拮抗するメカニズムは、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤ｐ２１の誘導を通じた細胞周期を制限する能力およびアポトーシスを誘導する能力に両方に関与するようである。このことは、アポトーシスカスケードの直接的な化学的阻害が、腫瘍サプレッサーの直接の遺伝的操作なしに初期化効率を増強するための有用なツールを提供し得る」と記載されており、アポトーシスを抑制させることがｉＰＳ細胞生産において極めて重要であるとの認識が当業者にあったことが窺える。 以上に鑑み、当業者はｉＰＳ細胞の作製には出発細胞のアポトーシスの抑制が重要であると認識しており、アポトーシス性が高い非動員の末梢血ＣＤ３４＋細胞を使用することには阻害要因があったか、少なくとも動機づけまたは示唆があるとはいえない状況であった。 イ．本願優先日後に発行された甲第１４号証は、本願優先日直後の技術水準を示す、ｉＰＳ細胞技術に関する総説文献であり、甲第１４号証には、「十分な量のＣＤ３４＋細胞の単離は、高価なＧ－ＣＳＦおよび大量のアフェレーシス（血漿交換）を必要とする」と記載されているから、この文献は、本願優先日当時、Ｇ－ＣＳＦ動員されていない末梢血細胞がｉＰＳ細胞の出発物質としては考慮されていなかったことの証拠である。 甲第１３号証では、甲第８～１０号証の３文献に言及し、末梢血を用いたｉＰＳ細胞の作製は、この号（２０１０年）で初めて可能になったことと、このことが画期的であること、それ以前は困難と思われていたことを紹介している。なお、甲第１３号証では、引用文献１を評価しており、高価で副作用の可能性もあったため、あまり普及していなかったこと、「したがって、非前処理ドナーから収集された少量の末梢血からのｉＰＳＣの生成は、ｉＰＳＣの種々の上述した適用における使用を容易にするために重要なステップである。」と記載しており、２０１０年までは、ｉＰＳ細胞の作製のために、「外的に加えられる因子で動員されていない」ヒト被験体の末梢血からの細胞を用いることは挑戦的な課題であり、容易には実現し得なかったと考えられていたことの裏返しである。 引用文献１と同じ著者による論文である甲第８号証には、「previous studies demonstratingsuccessful reprogramming of blood cells into IPSCs have relied on specializedblood cell sources with high proliferative potential」と記載しており、ｉＰＳ細胞の作製は、この文献の開示までは、動員細胞の他、優先日後の文献（甲第１１号証）を引用して、特殊な血液細胞でしか実現できていなかったことに言及しつつ、自身の成果を評価しており、引用文献１の著者自身が、末梢血を材料にする場合、動員がなければｉＰＳ細胞の作製は困難であると考えており、優先日後の論文を考慮しても、特殊な血液細胞源が必要であるとの評価につながっていたものと思われる。 第二優先日後に発表された臍帯血からのｉＰＳ細胞の作製に関する論文（甲第１２号証）では、「the reprogramming of predominantly nonadherent and slow-cycling humanperipheral blood cell types has been unsuccessful to date（非接着性の割合が高く、分裂速度が遅いヒト末梢血の細胞タイプのリプログラミングは、現在まで成功していない）」と記載しており、まさに、末梢血の利用が優先日後の２００９年１０月の時点でも利用可能ではなかったとの認識があったことを読み取ることができる。さらに、引用文献１については、これを孫引きして「very recent reportdescribed the successful reprogramming of human CD34+ cellsisolated frommobilized peripheral blood.（非常に最近になって、末梢血から動員され単離されたヒトＣＤ３４＋細胞のリプログラミングの成功が記載された）」との評価をしているので、本願発明より前には、末梢血からのサンプルを用いてｉＰＳ細胞の作製を成功させるためには、動員化したものしか使用できなかったとの認識であり、実質的に非動員末梢血からの細胞をｉＰＳ細胞作製に用いることについて阻害要因があったと評価することができる。 甲第１５号証は、末梢血ＣＤ３４＋細胞の現状をまとめており、引用文献１（Ｌｏｈ文献）や甲第１１号証（Ｙｅ文献）を引用しているが、甲第１１号証（Ｙｅ文献）については効率や速度が報告されていないと懐疑的、批判的に論じており、初期化の効率や速度などが論じられていない甲第１１号証の時点では、初期化を「実現していた」とまでは言い得ないことを示すものである。 甲第１６号証は、「非動員末梢血（ＰＢ）はそのアクセス可能性と比較的容易な取り扱いからｉＰＳＣ生成の重要な候補であるが、この組織を用いた方法が機能することは、いまだ確立していない」と評価しており、本願発明のような非動員末梢血由来のＣＤ３４＋造血始原細胞を用いてｉＰＳ細胞を製造することについて否定的であり、むしろ困難であったと考えていたということになり、非動員末梢血由来のＣＤ３４＋造血始原細胞を用いてｉＰＳ細胞を製造することには克服しがたい困難性が伴うと考えていた。 ウ．本願優先日当時の状況を見ると、山中先生がｉＰＳ細胞の業績を発表してからまだ３年ほどしかたっておらず、ｉＰＳ作製技術は、その黎明期にあったということができ、ｉＰＳ細胞の初期化技術に関して、何を出発材料として用いることができるかについては、技術常識が固まっていたということはできず、他の技術（例えば、引用文献５～７のような形質導入やマスト細胞作製等）における技術的事項をそのまま応用することができるという技術水準にあったということもできないから、動員された細胞の事項を非動員の細胞にそのまま当てはめることができるとは理解されていなかった。 すなわち、本願発明のような黎明期にある技術について、単にＣＤ３４＋造血始原細胞を単離したからと言って、単純な数の計算として量を増やせばｉＰＳ細胞作製を実施できるかどうかについて、ｉＰＳ細胞とは無関係の文献である引用文献５～７には記載も示唆もなく、他の引用文献１～４、８～１１を見ても当業者は理解できない。むしろ、甲第８～１８号証として提出した証拠を見ると、非動員末梢血はｉＰＳ細胞の製造には適していないと本願優先日当時の当業者は認識していたといえるので、ｉＰＳ細胞の製造とは無関係の技術に関してＣＤ３４＋造血始原細胞の単離方法が記載されているからと言って、その細胞供給源が直ちにｉＰＳ細胞の製造に使用できるとは、当業者は認識しなかった。 主張ア．について 甲第７号証は、甲第６号証を引用して記載しているだけなので、非動員末梢血ＣＤ３４＋細胞とアポトーシスに関する文献は、実質上、甲第６号証だけであるが、甲第６号証は、ｉＰＳ細胞の製造に関する文献ではなく、しかも、その記載内容は、アポトーシスの観点から、非動員末梢血ＣＤ３４＋細胞をｉＰＳ細胞の製造やその他の用途に使用できないことを教示する文献ではないので、甲第６号証という１文献の記載だけから、「本願優先日当時、非動員末梢血を用いるとアポトーシスが抑制できず、質的に十分な出発細胞を準備できないと当業者が考える」ということはできず、甲第６号証（及びそれを引用する甲第７号証）の記載が、動員されていない末梢血から得られるＣＤ３４＋細胞からｉＰＳ細胞を作製することを妨げる程の阻害要因になったとはいえない。 実際、引用文献１には、「骨髄採取に関連するリスクを回避するために、末梢血から単離した動員されたＣＤ３４＋造血幹細胞／前駆細胞を得た。」と記載されており（上記記載事項エ．）、アポトーシスの観点から、非動員末梢血を用いずに動員末梢血を使用したとは記載されていない。同様に、非動員末梢血から得られたＣＤ３４＋細胞を用いた実験を行っている引用文献５～７にも、アポトーシスの観点から、非動員末梢血ＣＤ３４＋細胞を使用できないことは全く記載されていない。さらに、審判請求人が提出した非動員末梢血を使用するｉＰＳ細胞の製造に関する甲第８～１０号証にも、アポトーシスの問題について全く記載されていない。 また、甲第１７号証は、本願優先日後に発表された文献であって、その記載内容を参酌することはできないが、また、仮に参酌するとしても、甲第１７、１８号証に記載されている「アポトーシス」は、ｐ５３と関連して記載されているだけで、甲第１７、１８号証には、「アポトーシス」と「非動員末梢血」との関連性に関する記載は全くないから、甲第１７、１８号証の記載から、「当業者はｉＰＳ細胞の作製には出発細胞のアポトーシスの抑制が重要であると認識しており、アポトーシス性が高い非動員の末梢血ＣＤ３４＋細胞を使用することには阻害要因があった」ということはできない。 したがって、審判請求人の上記主張ア．は採用できない。 主張イ．について 甲第８～１６号証は、いずれも本願優先日後に発表された文献であって、その記載内容を参酌することはできないが、仮に参酌すると以下のとおりである。 審判請求人は、甲第１３号証を提示して、甲第８～１０号証の「３文献に言及し、末梢血を用いたｉＰＳ細胞の作製は、この号（２０１０年）で初めて可能になったことと、このことが画期的であること、それ以前は困難と思われていたことを紹介してい」ると主張しているが、甲第１３号証をみても、「末梢血を用いたｉＰＳ細胞の作製は、この号（２０１０年）で初めて可能になったことと、このことが画期的であること、それ以前は困難と思われていたこと」という記載はなく、また、甲第９、１０号証は、非動員末梢血由来のＴ細胞を使用してｉＰＳ細胞を作製した文献であり、非動員末梢血由来のＣＤ３４＋細胞を使用するものではない。また、引用文献１についての記載は、「２０１０年までは、ｉＰＳ細胞の作製のために、「外的に加えられる因子で動員されていない」ヒト被験体の末梢血からの細胞を用いることは挑戦的な課題であり、容易には実現し得なかったと考えられていた」ことの証拠であるとはいえず、むしろ、甲第１３号証の記載は、引用文献８～１０において示した事項と同様の記載であって、非動員末梢血を使用することの動機付けとなる記載であるといえる。 甲第１１号証には、Ｇ－ＣＳＦで動員されていない骨髄増殖性障害（ＭＰＤ）の患者の末梢血から単離されたＣＤ３４＋細胞からｉＰＳ細胞を作製することが記載されており（第５４７５頁右欄第１２行～第１４行）、審判請求人は、これを「特殊な血液細胞」と称しているが、そもそも本願発明の「ヒト被験体」に疾患に罹患している患者が含まれないことは何ら特定されておらず、甲第１１号証の記載は、「引用文献１の著者自身が、末梢血を材料にする場合、動員がなければｉＰＳ細胞の作製は困難であると考えて」いた証拠とはいえず、むしろ、引用文献１の著者自身も、Ｇ－ＣＳＦで動員されていない「ヒト被験体」の末梢血から単離されたＣＤ３４＋細胞からｉＰＳ細胞を作製することを考えていた証拠であるといえる。 審判請求人は、甲第１２号証を正しく引用しておらず、甲第１２号証は、正しくは「However,the reprogramming of predominantly nonadherent and slow-cycling human peripheral blood cell types has been unsuccessful to date.A very recent report described the successful reprogramming of human CD34+ hematopoietic stem cells(Loh et al.,2009)（しかしながら、非接着性の割合が高く、分裂速度が遅いヒト末梢血の細胞タイプのリプログラミングは、現在まで成功していない。非常に最近の報告は、ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞のリプログラミングの成功を記載した（Ｌｏｈ　ｅｔ　ａｌ．，２００９）。）」と記載しており、引用文献１（Ｌｏｈ　ｅｔ　ａｌ．，２００９）を、ヒト末梢血由来のヒトＣＤ３４＋造血幹細胞のリプログラミングの成功例として記載しているのであって、この記載から、「末梢血の利用が優先日後の２００９年１０月の時点でも利用可能ではなかったとの認識があった」ことを読み取ることはできないし、ましてや、「本願発明より前には、末梢血からのサンプルを用いてｉＰＳ細胞の作製を成功させるためには、動員化したものしか使用できなかったとの認識」があったとはいえない。 また、審判請求人は、甲第１５号証を提示して、「甲第１１号証（Ｙｅ文献）については効率や速度が報告されていないと懐疑的、批判的に論じており、初期化の効率や速度などが論じられていない甲第１１号証の時点では、初期化を「実現していた」とまでは言い得ないことを示すものである。」と主張しているが、そもそも甲第１１号証は、拒絶理由の引用文献として引用した文献ではないので、その記載内容は本願発明の進歩性の判断に全く関係なく、また、甲第１５号証において、「効率や速度が報告されていない」と記載しているのは甲第１１号証（Ｙｅ文献）だけであって、引用文献１（Ｌｏｈ文献）については効率や速度は記載されている（表１参照；「参考文献１１」として記載。）から、「初期化の効率や速度などが論じられていない甲第１１号証の時点では、初期化を「実現していた」とまでは言い得ないことを示すもの」との審判請求人の主張は失当である。 また、甲第１４号証の「十分な量のＣＤ３４＋細胞の単離は、高価なＧ－ＣＳＦおよび大量のアフェレーシス（血漿交換）を必要とする」との記載、甲第１６号証の「非動員末梢血（ＰＢ）はそのアクセス可能性と比較的容易な取り扱いからｉＰＳＣ生成の重要な候補であるが、この組織を用いた方法が機能することは、いまだ確立していない」との記載が、「本願優先日当時、Ｇ－ＣＳＦ動員されていない末梢血細胞がｉＰＳ細胞の出発物質としては考慮されていなかった」、「非動員末梢血由来のＣＤ３４＋造血始原細胞を用いてｉＰＳ細胞を製造することには克服しがたい困難性が伴うと考えていた」証拠になるとはいえず、むしろ、甲第１４、１６号証の記載は、引用文献８～１０において示した事項と同様の記載であって、非動員末梢血を使用することの動機付けとなる記載であるといえる。 したがって、審判請求人の上記主張イ．は採用できない。 主張ウ．について 引用文献１では、５×１０４個のＣＤ３４＋細胞からｉＰＳ細胞を作製することができたこと（上記記載事項エ．）、引用文献２では、１×１０５細胞のＣＤ３４＋細胞からｉＰＳ細胞を作製することができたこと（上記記載事項キ．）が示されているが、引用文献５には、１００ｍ１の末梢血から１０４～１０５のＣＤ３４＋細胞を得ることができることが記載されている（上記記載事項セ．）から、ＣＤ３４＋細胞からｉＰＳ細胞を作製することができるＣＤ３４＋細胞の細胞数を取得することに困難性があったとは認められない。 そもそも、本願発明は、「ＣＤ３４＋造血始原細胞が、ヒト被験体の末梢血サンプルから精製されたものであり、前記ヒト被験体の細胞が、外的に加えられる因子で動員されていない、」と記載されているだけで、「ヒト被験体の末梢血サンプル」の量について特定されていないから、ヒト被験体から採取する血液量を増やせば（採血１回分の量を増やす、あるいは、同一人から複数回採血する、等）、得られるＣＤ３４＋細胞の細胞数を増やすことが可能であり、また、Ｇ－ＣＳＦなどの因子で動員されていない末梢血からＣＤ３４＋造血始原細胞を単離する方法を含む点で本願発明と共通する技術である、引用文献５～７に記載の周知技術を適用して、ｉＰＳ細胞を作製することができるＣＤ３４＋細胞の細胞数を取得することは、当業者であれば十分に可能であったと認められる。 また、審判請求人は、「甲第８～１８号証として提出した証拠を見ると、非動員末梢血はｉＰＳ細胞の製造には適していないと本願優先日当時の当業者は認識していたといえるので、ｉＰＳ細胞の製造とは無関係の技術に関してＣＤ３４＋造血始原細胞の単離方法が記載されているからと言って、その細胞供給源が直ちにｉＰＳ細胞の製造に使用できるとは、当業者は認識しなかった。」と主張しているが、上述の如く、審判請求人が提示した甲第１１号証（２００９年４月２４日投稿）には、Ｇ－ＣＳＦで動員されていない末梢血から単離されたＣＤ３４＋細胞からｉＰＳ細胞を作製することが記載されており、また、特願２０１１－５１３３９２号（国際公開第２０１０／１３１７４７号）の明細書（２００９年１２月２日を優先日とする優先権主張の出願の明細書）にも、Ｇ－ＣＳＦで動員されていない末梢血から単離されたＣＤ３４＋細胞からｉＰＳ細胞を作製することが記載されている（実施例４）から、「非動員末梢血はｉＰＳ細胞の製造には適していないと本願優先日当時の当業者は認識していた」との審判請求人の主張は失当である。 したがって、審判請求人の上記主張ウ．は採用できない。 ８．むすび 以上のとおりであるから、本願請求項１に係る発明は、引用文献１～１０に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないので、本願は、その余の請求項について論及するまでもなく、拒絶すべきものである。 よって、結論のとおり審決する。