2022-011685

特願２０１８－５５８２８８「遺伝子操作された細胞および同細胞を作製する方法」拒絶査定不服審判事件〔平成２９年１１月 ９日国際公開、ＷＯ２０１７／１９３１０７、令和 １年 ６月２７日国内公表、特表２０１９－５１７７８８〕について、次のとおり審決する。

結 論 本件審判の請求は、成り立たない。

理 由 第１ 手続の経緯 本願は、２０１７年（平成２９年）５月６日（パリ条約による優先権主張 ２０１６年５月６日 米国、２０１６年５月６日 米国）を国際出願日とする出願であって、令和４年３月１６日付けで拒絶査定がなされ、同年７月２８日に拒絶査定不服審判の請求がなされると同時に手続補正がなされたものである。 第２ 令和４年７月２８日付け手続補正についての補正却下の決定 [結論] 令和４年７月２８日付け手続補正を却下する。 [理由] １．本件補正 令和４年７月２８日に提出された手続補正書による手続補正（以下、「本件補正」という。）は、特許請求の範囲の請求項１に、 （補正前） 「【請求項１】 Ｔ細胞を１つまたは複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体と接触させるステップを含んでなる、Ｔ細胞を改変する方法であって、前記１つまたは複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体中のｇＲＮＡ分子が、ＰＤＣＤ１遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含み、前記ｇＲＮＡ分子が、前記標的ドメインを少なくとも４０％の切断効率で切断するように前記Ｃａｓ９分子を誘導し、 前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号４８１～５０７、５０９～５５５、５６３～１５１６、１５１７～３７４８、１４６５７～１６６７０、および１６６７１～２１０３７のいずれかからのターゲティングドメインと同一の、または３ヌクレオチド以下が異なる、ターゲティングドメインを含んでなる、前記方法。」とあったものを、 （補正後） 「【請求項１】 Ｔ細胞を１つまたは複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体と接触させるステップを含んでなる、Ｔ細胞を改変する方法であって、前記１つまたは複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体中のｇＲＮＡ分子が、ＰＤＣＤ１遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含み、前記ｇＲＮＡ分子が、前記標的ドメインを少なくとも４０％の切断効率で切断するように前記Ｃａｓ９分子を誘導し、 前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号５１０、５１１、５１２、５１４、５７６、５７９、５８１、５８２、７６６、および７２３のいずれかからのターゲティングドメインと同一の、または３ヌクレオチド以下が異なる、ターゲティングドメインを含んでなる、前記方法。」とする補正を含むものである。 なお、下線は補正された部分である。 ２．本件補正の目的 本件補正により、補正前の請求項１におけるｇＲＮＡ分子が、「配列番号４８１～５０７、５０９～５５５、５６３～１５１６、１５１７～３７４８、１４６５７～１６６７０、および１６６７１～２１０３７のいずれかからのターゲティングドメインと同一の、または３ヌクレオチド以下が異なる、ターゲティングドメインを含んでなる」ものから、「配列番号５１０、５１１、５１２、５１４、５７６、５７９、５８１、５８２、７６６、および７２３のいずれかからのターゲティングドメインと同一の、または３ヌクレオチド以下が異なる、ターゲティングドメインを含んでなる」ものに限定された。 そうすると、本件補正は、特許法第１７条の２第５項第２号に掲げる特許請求の範囲の限定的減縮を目的とするものを含むと認められる。 そこで、本件補正により補正された特許請求の範囲の請求項１に記載された事項により特定される発明（以下、「補正発明」という。）が、特許出願の際独立して特許を受けることができるものであるか（特許法第１７条の２第６項において準用する同法第１２６条第７項の規定に適合するか）（以下、「独立特許要件」という。）について、以下で検討する。 ３．独立特許要件の検討 （１）引用文献１の記載 拒絶査定において引用文献１として引用された、本願の優先日（２０１６年５月６日）より前の２０１５年１０月２２日に公知となった国際公開第２０１５／１６１２７６号には、次の事項が記載されている。 なお、引用文献１は、英文であるから、引用文献１のパテントファミリーである特表２０１７－５１３４８５号公報の記載事項を翻訳文として使用する。また、下線は当審で付したものである。 ア 「【請求項１】 ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子に由来する標的ドメインと相補的な標的化ドメインを含んでなる、ｇＲＮＡ分子。 ・・・ 【請求項１２】 前記標的化ドメインが、表７Ａ～Ｈ、表１９Ａ～Ｊ、表３１または表３２のものから選択される、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。 ・・・ 【請求項５９】 （ｂ）Ｃａｓ９分子をコードする配列をさらに含んでなる、請求項３６～５８のいずれか一項に記載の核酸。 ・・・ 【請求項１３６】 細胞を （ａ）請求項１～３５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ； （ｂ）請求項５９～７３のいずれか一項に記載のＣａｓ９分子；および 任意選択的に、（ｃ）請求項７４～９６のいずれか一項に記載の第２のｇＲＮＡ分子に接触させるステップを含んでなる、細胞を改変する方法。 ・・・ 【請求項１４３】 前記細胞がＴ細胞である、請求項１３６～１４２のいずれか一項に記載の方法。 【請求項１４４】 前記Ｔ細胞が、遺伝子操作Ｔ細胞である、請求項１４３に記載の方法。 【請求項１４５】 前記遺伝子操作Ｔ細胞が、遺伝子操作キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞である、請求項１４４に記載の方法。」 イ 「【発明が解決しようとする課題】 【０００８】 したがって、養子性に移入された遺伝子操作Ｔ細胞の抗腫瘍有効性を改善する必要性がある。」 ウ 「【００１１】 遺伝子修飾されたＴ細胞のがん治療薬としての有効性を制限する要因としては、（１）例えば、養子免疫伝達に続くＴ細胞の限定的増殖などのＴ細胞増殖；（２）例えば、腫瘍環境内因子によるＴ細胞アポトーシス誘導などのＴ細胞生存；および（３）例えば、宿主免疫細胞およびがん細胞によって分泌される阻害因子による、細胞毒性Ｔ細胞機能の阻害などのＴ細胞機能が挙げられる。本明細書に記載される方法および組成物は、Ｔ細胞の増殖、生存および／または機能に影響を与える、Ｔ細胞発現遺伝子の発現を修飾することで、これらの制限に対処する。」 エ 「【１４８０】 ＶＩ．標的細胞 例えば、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体などのＣａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子を使用して、例えば、多種多様な細胞内で標的核酸を編集するなど、細胞が操作され得る。」 オ 「【１４８６】 ＶＩＩ．構成要素の標的細胞への生体外送達 例えば、Ｃａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子などの構成要素は、多様な送達方法および調合物を使用して、多様な形態で標的細胞内に導入され得て、例えば、表７００および８００を参照されたい。・・・ 【１４８７】 表７００は、構成要素が標的細胞に送達され得る形式の例を提供する。 ・・・ ［図：0001409602000001.jpg］ 」 カ 「【１５７３】 各ｇＲＮＡの切断効率は、Ｔ７Ｅ１タイプアッセイまたは配列決定によって、標的遺伝子座におけるＮＨＥＪ誘導インデル形成を測定することで、評価されてもよい。・・・」 キ 「【１５７９】 実施例３：２９３個（当審注：「２９３細胞」の誤訳と認められる。）の細胞内のｇＲＮＡのスクリーニング Ｔ細胞受容体β（ＴＲＢＣ）のｇＲＮＡのスクリーニング 標的ＮＨＥＪ効率が最大のｇＲＮＡを同定するために、４２個のＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）および２７個のＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｇＲＮＡが選択された（表２７）。Ｕ６プロモーター、ｇＲＮＡ標的領域、および適切なＴＲＡＣＲ配列（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））から構成されるＤＮＡテンプレートは、ＰＣＲ ＳＴＩＴＣＨＲ反応によって作成された。引き続いて、このＤＮＡテンプレートは、ＣＭＶプロモーター下流で、適切なＣａｓ９（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）をコードするＤＮＡプラスミドと共にリポフェクタミン３０００を使用して、２９３個の細胞（当審注：「２９３細胞」の誤訳と認められる。）に形質移入された。ゲノムＤＮＡは、形質移入の４８～７２時間後に細胞から単離された。Ｔ細胞受容体β遺伝子（ＴＲＢＣ）における修飾比率を判定するために、表２８に列挙されるプライマーによる遺伝子座ＰＣＲを使用して、標的領域が増幅された。ＰＣＲ増幅後、ＰＣＲ産物上でＴ７Ｅ１アッセイが実施された。簡単に述べると、このアッセイは、ＰＣＲ産物の融解と、それに続く再アニーリングステップを伴う。遺伝子修飾が起こった場合、挿入または欠失のいくらかの出現頻度のために、完全なマッチではない二本鎖生成物が存在する。これらの二本鎖生成物は、ミスマッチ部位におけるＴ７エンドヌクレアーゼ１酵素による切断に対して感受性である。したがって、Ｔ７Ｅ１切断の量を分析することで、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体による切断効率を判定することが可能である。Ｔ７Ｅ１切断から％ＮＨＥＪ測定値を提供するために使用される式は、次のとおりである：（１００＊（１－（（１－（切断割合））＾０．５）））。この分析の結果は、図１１および図１２に示される。 ・・・ 表２７（一部） ［図：0001409602000002.jpg］ 図１２ ［図：0001409602000003.jpg］ 」 ク 「【１５８４】 Ｔ細胞受容体α（ＴＲＡＣ）のｇＲＮＡのスクリーニング 標的ＮＨＥＪ効率が最大のｇＲＮＡを同定するために、１８個のＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）および１３個のＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｇＲＮＡが選択された（表２９）。Ｕ６プロモーター、ｇＲＮＡ標的領域、および適切なＴＲＡＣＲ配列（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））から構成されるＤＮＡテンプレートは、ＰＣＲ ＳＴＩＴＣＨＲ反応によって作成された。引き続いて、このＤＮＡテンプレートは、ＣＭＶプロモーター下流で、適切なＣａｓ９（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）をコードするＤＮＡプラスミドと共にリポフェクタミン３０００を使用して、２９３個の細胞（当審注：「２９３細胞」の誤訳と認められる。）に形質移入された。ゲノムＤＮＡは、形質移入の４８～７２時間後に細胞から単離された。Ｔ細胞受容体α遺伝子（ＴＲＡＣ）における修飾比率を判定するために、表３０に列挙されるプライマーによる遺伝子座ＰＣＲを使用して、標的領域が増幅された。ＰＣＲ増幅後、ＰＣＲ産物上でＴ７Ｅ１アッセイが実施された。簡単に述べると、このアッセイは、ＰＣＲ産物の融解と、それに続く再アニーリングステップを伴う。遺伝子修飾が起こった場合、挿入または欠失のいくらかの出現頻度のために、完全なマッチではない二本鎖生成物が存在する。これらの二本鎖生成物は、ミスマッチ部位におけるＴ７エンドヌクレアーゼ１酵素による切断に対して感受性である。したがって、Ｔ７Ｅ１切断の量を分析することで、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体による切断効率を判定することが可能である。Ｔ７Ｅ１切断から％ＮＨＥＪ測定値を提供するために使用される式は、次のとおりである：（１００＊（１－（（１－（切断割合））＾０．５）））。この分析の結果は、図１３および図１４に示される。 ・・・ 表２９（一部） ［図：0001409602000004.jpg］ ［図：0001409602000005.jpg］ 図１３ ［図：0001409602000006.jpg］ 図１４ ［図：0001409602000007.jpg］ 」 ケ 「【１５８７】 ＰＤ－１受容体のｇＲＮＡのスクリーニング 標的ＮＨＥＪ効率が最大のＲＮＡを同定するために、４８個のＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）および２７個のＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｇＲＮＡが選択された（表３１および３２を参照されたい）。Ｕ６プロモーター、ｇＲＮＡ標的領域、および適切なＴＲＡＣＲ配列（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））から構成されるＤＮＡテンプレートは、ＰＣＲ ＳＴＩＴＣＨＲ反応によって作成された。引き続いて、このＤＮＡテンプレートは、ＣＭＶプロモーター下流で、適切なＣａｓ９（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））をコードするＤＮＡプラスミドと共にリポフェクタミン３０００を使用して、２９３個の細胞（当審注：「２９３細胞」の誤訳と認められる。）に形質移入された。ゲノムＤＮＡは、形質移入の４８～７２時間後に細胞から単離された。ＰＤ－１遺伝子（ＰＤＣＤ１）における修飾比率を判定するために、表３３に列挙されるプライマーによる遺伝子座ＰＣＲを使用して標的領域が増幅された。ＰＣＲ増幅後、ＰＣＲ産物上でＴ７Ｅ１アッセイが実施された。簡単に述べると、このアッセイは、ＰＣＲ産物の融解と、それに続く再アニーリングステップを伴う。遺伝子修飾が起こった場合、挿入または欠失のいくらかの出現頻度のために、完全なマッチではない二本鎖生成物が存在する。これらの二本鎖生成物は、ミスマッチ部位におけるＴ７エンドヌクレアーゼ１酵素による切断に対して感受性である。したがって、Ｔ７Ｅ１切断の量を分析することで、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体による切断効率を判定することが可能である。Ｔ７Ｅ１切断から％ＮＨＥＪ測定値を提供するために使用される式は、次のとおりである：（１００＊（１－（（１－（切断割合））＾０．５）））。表３１に示されるこのｇＲＮＡの分析結果は、図１５および図１６に示される。同様の実験は、表３２で示されるものをはじめとする、本明細書に記載される（ｄｅｓｃｒｉｎｂｅｄ）その他のｇＲＮＡで実施され得る。 ・・・ 表３１（一部） ［図：0001409602000008.jpg］ 図１６ ［図：0001409602000009.jpg］ 」 コ 「【１５９３】 実施例４：酵素合成および初代Ｔ細胞へのｇＲＮＡの送達 ＲＮＡ分子としてのＣａｓ９ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡのＴ細胞への送達 初代ＣＤ４＋Ｔ細胞内のＣａｓ９媒介切断を実証するために、ＴＣＲβ鎖（ＴＲＢＣ－２１０（ＧＣＧＣＵＧＡＣＧＡＵＣＵＧＧＧＵＧＡＣ）（配列番号４１３））またはＴＣＲα鎖（ＴＲＡＣ－４（ＧＣＵＧＧＵＡＣＡＣＧＧＣＡＧＧＧＵＣＡ）（配列番号４５３））に対して設計された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９およびｇＲＮＡが、（当審注：「Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９およびＴＣＲβ鎖（ＴＲＢＣ－２１０（ＧＣＧＣＵＧＡＣＧＡＵＣＵＧＧＧＵＧＡＣ）（配列番号４１３））またはＴＣＲα鎖（ＴＲＡＣ－４（ＧＣＵＧＧＵＡＣＡＣＧＧＣＡＧＧＧＵＣＡ）（配列番号４５３））に対して設計されたｇＲＮＡが、」の誤訳であると認められる。）電気穿孔を通じてＲＮＡ分子としてＴ細胞に送達された。この実施形態では、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡの双方が、Ｔ７ポリメラーゼを使用して生体外転写された。５’ＡＲＣＡキャップが転写と同時に双方のＲＮＡ種に付加された一方で、ポリＡテールは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリＡポリメラーゼによって、転写後にＲＮＡ種の３’末端に付加された。ＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２遺伝子座にＣＤ４＋Ｔ細胞修飾を生成するために、１０μｇのＣａｓ９ｍＲＮＡおよび１０μｇのＴＲＢＣ－２１０（ＧＣＧＣＵＧＡＣＧＡＵＣＵＧＧＧＵＧＡＣ）（配列番号４１３）ｇＲＮＡが、電気穿孔によって細胞に導入された。同一実験において、本発明者らはまた、１０μｇのＴＲＡＣ－４（ＧＣＵＧＧＵＡＣＡＣＧＧＣＡＧＧＧＵＣＡ）（配列番号４５３）ｇＲＮＡと共に、１０μｇのＣａｓ９ｍＲＮＡを導入することで、ＴＲＡＣ遺伝子を標的化した。ＡＡＶＳ１（ＧＵＣＣＣＣＵＣＣＡＣＣＣＣＡＣＡＧＵＧ）（配列番号５１２０１）ゲノム部位を標的化するｇＲＮＡが、実験対照として使用された。電気穿孔に先だって、Ｔ細胞は、１０％ＦＢＳおよび組換え体ＩＬ－２が添加されたＲＰＭＩ １６４０中で培養された。細胞は、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを使用して活性化され、少なくとも３日間増殖された。活性化Ｔ細胞へのｍＲＮＡの導入に引き続いて、電気穿孔の２４、４８、および７２時間後に、ＣＤ３に対して特異的なフルオレセイン（ＡＰＣ）コンジュゲート抗体を使用したフローサイトメトリーによって、細胞上のＣＤ３発現がモニターされた。７２時間目に、ＣＤ３陰性細胞集団が観察された（図１７Ａおよび図１７Ｂ）。ＣＤ３陰性細胞の発生が、ＴＲＢＣ遺伝子座におけるゲノム編集の結果であることを確認するために、ＴゲノムＤＮＡが収集されてＴ７Ｅ１アッセイが実施された。確かに、データは、ＴＲＢＣ２遺伝子座およびＴＲＡＣ遺伝子座におけるＤＮＡ修飾の存在を確認する（図１７Ｃ）。 【１５９４】 Ｔ細胞へのＣａｓ９／ｇＲＮＡ ＲＮＰの送達 Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞内のＣａｓ９媒介切断を実証するために、ＴＣＲα鎖（ＴＲＡＣ－２３３（ＧＵＧＡＡＵＡＧＧＣＡＧＡＣＡＧＡＣＵＵＧＵＣＡ）（配列番号４７４））に対して設計されたＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９およびｇＲＮＡが、（当審注：「Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９およびＴＣＲα鎖に対して設計されたｇＲＮＡ（ＴＲＡＣ－２３３（ＧＵＧＡＡＵＡＧＧＣＡＧＡＣＡＧＡＣＵＵＧＵＣＡ）（配列番号４７４））が」の誤訳であると認められる。）電気穿孔によってリボ核酸タンパク質複合体（ＲＮＰ）として送達された。この実施形態では、Ｃａｓ９は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現され精製された。具体的には、Ｃａｓ９をコードするＨＪ２９プラスミドが、Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）２（ＤＥ３）化学コンピテント細胞（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃７１４００－４）に形質転換され、選択のための適切な抗生物質と共にＬＢプレート上に播種され、３７℃で一晩培養された。適切な抗生物質が添加された脳心臓浸出物ブロス（Ｔｅｋｎｏｖａ＃Ｂ９９９３）の１０ｍＬのスタータ培養に４つのコロニーが接種されて、２２０ｒｐｍで振盪しながら３７°Ｃで培養された。一晩の培養後、スタータ培養が、補給剤に加えて適切な抗生物質が添加された１ＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｔｅｋｎｏｖａ＃Ｔ７０６０）に添加されて、２２０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で培養された。温度が１８℃に徐々に低下されて、ＯＤ６００が２．０を超えたら、０．５ｍＭのＩＰＴＧの添加によって遺伝子の発現が誘導された。誘導は一晩継続され、遠心分離による細胞の収集と、ＴＧ３００（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロール、１ｍＭ ＴＣＥＰ、プロテアーゼ阻害剤錠剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃８８２６６））中への再懸濁がそれに続き、－８０℃で保存された。 【１５９４】 細胞は冷凍懸濁液の解凍によって溶解され、１８０００ｐｓｉに設定されたＬＭ１０ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（登録商標）の２回の通過がそれに続いた。抽出物は、遠心分離を通じて清澄化され、４℃でのＮｉ－ＮＴＡアガロース樹脂（Ｑｉａｇｅｎ＃３０２３０）とのバッチ培養を通じて、可溶性抽出物が捕捉された。スラリーを重力流カラム内に注ぎ入れ、ＴＧ３００＋３０ｍＭイミダゾールで洗浄し、次に、ＴＧ３００＋３００ｍＭイミダゾールで関心のあるタンパク質が溶出された。Ｎｉ溶出剤は、等容積のＨＧ１００（５０ｍＭ ＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ）で希釈されて、ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ＃１７－１１５２－０１）上に装入されて、３０カラム容積でＨＧ１００からＨＧ１０００（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５、１０００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ）への勾配で溶出された。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルでのアッセイ後、適切な画分が貯留され、ＨＧ１５０（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロール、１ｍＭ ＴＣＥＰ）で平衡化されたＳＲＴ１０ ＳＥＣ３００カラム（Ｓｅｐａｘ＃２２５３００－２１２３０）上への装入のために濃縮された。画分は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってアッセイされ、適切に貯留され、少なくとも５ｍｇ／ｍｌに濃縮された。 【１５９６】 ｇＲＮＡは、Ｔ７ポリメラーゼを使用した生体外転写によって生成された。５’ ＡＲＣＡキャップが転写と同時にＲＮＡに付加された一方で、ポリＡテールは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリＡポリメラーゼによって、転写後にＲＮＡ種の３’末端に付加された。細胞への導入前に、精製Ｃａｓ９とｇＲＮＡを混合して、１０分間にわたり複合体を形成させた。ＲＮＰ溶液は、引き続いて電気穿孔によってＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞内に導入された。電気穿孔の前後に、細胞は、１０％ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地中で培養された。細胞上のＣＤ３発現は、ＣＤ３に対して特異的なフルオレセインコンジュゲート抗体を使用したフローサイトメトリーによって、電気穿孔の２４、４８、および７２時間後にモニターされた。４８および７２時間目に、ＣＤ３陰性細胞集団が観察された（図１８Ａおよび図１８Ｂ）。ＣＤ３陰性細胞の発生が、ＴＲＡＣ遺伝子座におけるゲノム編集の結果であることを確認するために、ＴゲノムＤＮＡが収集されてＴ７Ｅ１アッセイが実施された。確かに、データは、ＴＲＡＣ遺伝子座におけるＤＮＡ修飾の存在を確認する（図１８Ｃ）。 図１８Ｂ ［図：0001409602000010.jpg］ 図１８Ｃ ［図：0001409602000011.jpg］ 」 サ 「【１５９８】 実施例６：未感作Ｔ細胞へのＣａｓ９／ｇＲＮＡ ＲＮＰの送達 未感作Ｔ細胞内のＣａｓ９媒介切断を実証するために、ＴＣＲα鎖に対して設計された、標的化ドメインＧＵＧＡＡＵＡＧＧＣＡＧＡＣＡＧＡＣＵＵＧＵＣＡ（配列番号４７４）があるＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９およびｇＲＮＡが、（当審注：「Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９および標的化ドメインＧＵＧＡＡＵＡＧＧＣＡＧＡＣＡＧＡＣＵＵＧＵＣＡ（配列番号４７４）があるＴＣＲα鎖に対して設計されたｇＲＮＡが、」の誤訳であると認められる。）電気穿孔によってリボ核酸タンパク質複合体（ＲＮＰ）として送達された。この実施形態では、Ｃａｓ９は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現され精製された。具体的には、Ｃａｓ９をコードするＨＪ２９プラスミドが、Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）２（ＤＥ３）化学コンピテント細胞（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃７１４００－４）に形質転換され、選択のための適切な抗生物質と共にＬＢプレート上に播種され、３７℃で一晩培養された。適切な抗生物質が添加された脳心臓浸出物ブロス（Ｔｅｋｎｏｖａ＃Ｂ９９９３）の１０ｍＬのスタータ培養に４つのコロニーが接種されて、２２０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で培養された。一晩の培養後、スタータ培養が、補給剤に加えて適切な抗生物質が添加された１ＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｔｅｋｎｏｖａ＃Ｔ７０６０）に添加されて、２２０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で培養された。温度が１８℃に徐々に低下されて、ＯＤ６００が２．０を超えたら、０．５ｍＭのＩＰＴＧの添加によって遺伝子の発現が誘導された。誘導は一晩継続され、遠心分離による細胞の収集と、ＴＧ３００（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロール、１ｍＭ ＴＣＥＰ、プロテアーゼ阻害剤錠剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃８８２６６））中への再懸濁がそれに続き、－８０℃で保存された。 【１５９９】 細胞は冷凍懸濁液の解凍によって溶解され、１８０００ｐｓｉに設定されたＬＭ１０ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（登録商標）の２回の通過がそれに続いた。抽出物は、遠心分離を通じて清澄化され、４℃でのＮｉ－ＮＴＡアガロース樹脂（Ｑｉａｇｅｎ＃３０２３０）とのバッチ培養を通じて、可溶性抽出物が捕捉された。スラリーを重力流カラム内に注ぎ入れ、ＴＧ３００＋３０ｍＭイミダゾールで洗浄し、次にＴＧ３００＋３００ｍＭイミダゾールで関心のあるタンパク質が溶出された。Ｎｉ溶出剤は、等容積のＨＧ１００（５０ｍＭ ＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ）で希釈されて、ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ＃１７－１１５２－０１）上に装入されて、３０カラム容積でＨＧ１００からＨＧ１０００（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５、１０００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ）への勾配で溶出された。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルでのアッセイ後、適切な画分が貯留され、ＨＧ１５０（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロール、１ｍＭ ＴＣＥＰ）で平衡化されたＳＲＴ１０ ＳＥＣ３００カラム（Ｓｅｐａｘ＃２２５３００－２１２３０）上への装入のために濃縮された。画分は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってアッセイされ、適切に貯留され、少なくとも５ｍｇ／ｍｌに濃縮された。 【１６００】 標的化ドメインＧＵＧＡＡＵＡＧＧＣＡＧＡＣＡＧＡＣＵＵＧＵＣＡ（配列番号４７４）があるｇＲＮＡは、Ｔ７ポリメラーゼを使用した生体外転写によって生成された。５’ＡＲＣＡキャップが転写と同時にＲＮＡに付加された一方で、ポリＡテールは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリＡポリメラーゼによって、転写後にＲＮＡ種の３’末端に付加された。この実施形態では、Ｔ細胞は、フィコール勾配と、それに続くＣＤ３磁性ビーズを使用した正の選択によって新鮮臍帯血から単離された。細胞は、引き続いて、１０％ＦＢＳ、ＩＬ－７（５ｎｇ／ｍｌ）、およびＩＬ－１５（５ｎｇ／ｍｌ）が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地中で培養された。単離の２４時間後、細胞は、精製Ｃａｓ９およびｇＲＮＡを室温で１０分間インキュベートすることで生成された、ＲＮＰ溶液で電気穿孔された。細胞上のＣＤ３発現は、電気穿孔の９６時間後に、ＣＤ３に対して特異的なＡＰＣコンジュゲート抗体を使用したフローサイトメトリーによってモニターされた。ＣＤ３陰性細胞集団が細胞内で観察され、その中では、ｇＲＮＡおよび非機能性Ｃａｓ９が投与された陰性対照と対比して、機能性ＲＮＰ複合体が提供された（図２１Ａおよび図２１Ｂ）。ＣＤ３陰性細胞の発生が、ＴＲＡＣ遺伝子座におけるゲノム編集の結果であることを確認するために、ＴゲノムＤＮＡが収集されてＴ７Ｅ１アッセイが実施された。確かに、データは、ＴＲＡＣ遺伝子座におけるＤＮＡ修飾の存在を確認する（図２１Ｃ）。 図２１Ｂ ［図：0001409602000012.jpg］ 図２１Ｃ ［図：0001409602000013.jpg］ 」 シ 「【１６０１】 実施例７：ＲＮＡ分子としてのまたはＣａｓ９／ｇＲＮＡ ＲＮＰとしてのＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡのＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞への送達によってＰＤＣＤ１遺伝子座を標的化する（当審注：「ＲＮＡ分子としての、Ｃａｓ９ｍＲＮＡとｇＲＮＡ、または、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ ＲＮＰとしてのＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞への送達によってＰＤＣＤ１遺伝子座を標的化する」の誤訳と認められる。） ＲＮＡ分子としてのＣａｓ９ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡのＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞への送達 Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞中のＰＤＣＤ１遺伝子座におけるＣａｓ９媒介切断を実証するために、ＰＤＣＤ１遺伝子座に対して設計された標的化ドメインＧＵＣＵＧＧＧＣＧＧＵＧＣＵＡＣＡＡＣＵ（配列番号５０８）があるＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９およびａｇＲＮＡ（当審注：「ＰＤＣＤ１遺伝子座に対して設計された標的化ドメインＧＵＣＵＧＧＧＣＧＧＵＧＣＵＡＣＡＡＣＵ（配列番号５０８）があるｇＲＮＡおよびＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９」の誤訳であると認められる。）が、電気穿孔を通じてＲＮＡ分子としてＴ細胞に送達された。この実施形態では、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡの双方が、Ｔ７ポリメラーゼを使用して生体外転写された。５’ＡＲＣＡキャップが転写と同時に双方のＲＮＡ種に付加された一方で、ポリＡテールは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリＡポリメラーゼによって、転写後にＲＮＡ種の３’末端に付加された。ＰＤＣＤ１遺伝子座におけるＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞修飾を生成するために、標的化ドメインＧＵＣＵＧＧＧＣＧＧＵＧＣＵＡＣＡＡＣＵ（配列番号５０８）がある１０μｇのＣａｓ９ｍＲＮＡおよび１０μｇのｇＲＮＡが、電気穿孔によって細胞に導入された。電気穿孔に先だって、Ｔ細胞は、１０％ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ １６４０中で培養された。２４、４８、および７２時間目に、ゲノムＤＮＡが単離されて、ＰＤＣＤ１遺伝子座においてＴ７Ｅ１アッセイが実施された。確かに、データは、ＰＤＣＤ１遺伝子座におけるＤＮＡ修飾の存在を確認する（図２２）。 【１６０２】 Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞へのＣａｓ９／ｇＲＮＡ ＲＮＰの送達 Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞内のＰＤＣＤ１遺伝子座におけるＣａｓ９媒介切断を実証するために、標的化ドメインＧＵＣＵＧＧＧＣＧＧＵＧＣＵＡＣＡＡＣＵ（配列番号５０８）があるＰＤＣＤ１遺伝子座に対してＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９およびｇＲＮＡが設計されて、（当審注：「Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９および標的化ドメインＧＵＣＵＧＧＧＣＧＧＵＧＣＵＡＣＡＡＣＵ（配列番号５０８）があるＰＤＣＤ１遺伝子座に対して設計されたｇＲＮＡを、」の誤訳であると認められる。）電気穿孔によってリボ核酸タンパク質複合体（ＲＮＰ）として送達された。この実施形態では、Ｃａｓ９は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現され精製された。具体的には、Ｃａｓ９をコードするＨＪ２９プラスミドが、Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）２（ＤＥ３）化学コンピテント細胞（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃７１４００－４）に形質転換され、選択のための適切な抗生物質と共にＬＢプレート上に播種され、３７℃で一晩培養された。適切な抗生物質が添加された脳心臓浸出物ブロス（Ｔｅｋｎｏｖａ＃Ｂ９９９３）の１０ｍＬのスタータ培養に４つのコロニーが接種されて、２２０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で培養された。一晩の培養後、スタータ培養が、補給剤に加えて適切な抗生物質が添加された１ＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｔｅｋｎｏｖａ＃Ｔ７０６０）に添加されて、２２０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で培養された。温度が１８℃に徐々に低下されて、ＯＤ６００が２．０を超えたら、０．５ｍＭのＩＰＴＧの添加によって遺伝子の発現が誘導された。誘導は一晩継続され、遠心分離による細胞の収集と、ＴＧ３００（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロール、１ｍＭ ＴＣＥＰ、プロテアーゼ阻害剤錠剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃８８２６６））中への再懸濁がそれに続き、－８０℃で保存された。 【１６０３】 細胞は冷凍懸濁液の解凍によって溶解され、１８０００ｐｓｉに設定されたＬＭ１０ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（登録商標）の２回の通過がそれに続いた。抽出物は、遠心分離を通じて清澄化され、４℃でのＮｉ－ＮＴＡアガロース樹脂（Ｑｉａｇｅｎ＃３０２３０）とのバッチ培養を通じて、可溶性抽出物が捕捉された。スラリーを重力流カラム内に注ぎ入れ、ＴＧ３００＋３０ｍＭイミダゾールで洗浄し、次にＴＧ３００＋３００ｍＭイミダゾールで関心のあるタンパク質が溶出された。Ｎｉ溶出剤は、等容積のＨＧ１００（５０ｍＭ ＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ）で希釈されて、ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ＃１７－１１５２－０１）上に装入されて、３０カラム容積でＨＧ１００からＨＧ１０００（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５、１０００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ）への勾配で溶出された。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルでのアッセイ後、適切な画分が貯留され、ＨＧ１５０（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロール、１ｍＭ ＴＣＥＰ）で平衡化されたＳＲＴ１０ ＳＥＣ３００カラム（Ｓｅｐａｘ＃２２５３００－２１２３０）上への装入のために濃縮された。画分は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってアッセイされ、適切に貯留され、少なくとも５ｍｇ／ｍｌに濃縮された。 【１６０４】 標的化ドメインＧＵＣＵＧＧＧＣＧＧＵＧＣＵＡＣＡＡＣＵ（配列番号５０８）があるｇＲＮＡは、Ｔ７ポリメラーゼを使用した生体外転写によって生成された。５’ＡＲＣＡキャップが転写と同時にＲＮＡに付加された一方で、ポリＡテールは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリＡポリメラーゼによって、転写後にＲＮＡ種の３’末端に付加された。細胞への導入前に、精製Ｃａｓ９とｇＲＮＡを混合して、１０分間にわたり複合体を形成させた。ＲＮＰ溶液は、引き続いて電気穿孔によってＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞内に導入された。電気穿孔の前後に、細胞は、１０％ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地中で培養された。２４、４８、および７２時間目に、ゲノムＤＮＡが単離されて、ＰＤＣＤ１遺伝子座においてＴ７Ｅ１アッセイが実施された。確かに、データは、ＰＤＣＤ１遺伝子座におけるＤＮＡ修飾の存在を確認する（図２２）。 図２２ ［図：0001409602000014.jpg］ 」 （２）引用発明 引用文献１の特許請求の範囲には、細胞を、ＰＤＣＤ１遺伝子に由来する標的ドメインと相補的な標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡ分子とＣａｓ９分子に接触させるステップを含んでなる、細胞を改変する方法が記載されている（上記ア）。 また、実施例３においては、２９３細胞においてＰＤＣＤ１のｇＲＮＡを評価したことが記載され、ｇＲＮＡのＤＮＡテンプレートが、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡプラスミドとともにリポフェクタミン３０００を使用して２９３細胞に形質移入され、その後、細胞からゲノムＤＮＡを単離し、標的領域における、ＮＨＥＪ誘導インデル形成をＴ７Ｅ１アッセイにより測定することで、切断効率を評価したことが記載されており（上記カ、ケ）、表３１、図１６によれば、ＰＤＣＤ１のｇＲＮＡである配列番号５１０、５１１又は５１２の標的化ドメインを含むｇＲＮＡを使用した場合に、ＮＨＥＪを示したことが記載されている（上記ケ）。 ここで、実施例３において、２９３細胞のゲノムＤＮＡにおいてＮＨＥＪが見出されたことは、ＤＮＡとして形質移入したＣａｓ９及びｇＲＮＡが２９３細胞内で発現し、ＰＤＣＤ１遺伝子由来の標的ドメインと相補的な標的化ドメインを含むｇＲＮＡがＰＤＣＤ１遺伝子由来の標的ドメインにＣａｓ９を誘導して、標的ドメインを切断したことを意味し、ゲノムの標的ドメインを切断することは、特許請求の範囲の請求項に記載された「細胞を改変する」ことに他ならないから、引用文献１には、次のとおりの発明（以下、「引用発明」という。）が記載されていると認められる。 「２９３細胞に、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡプラスミドと、ｇＲＮＡのＤＮＡテンプレートを形質移入するステップを含んでなる、２９３細胞を改変する方法であって、２９３細胞内で発現した前記ｇＲＮＡ分子がＰＤＣＤ１遺伝子由来の標的ドメインと相補的な標的化ドメインを含み、前記ｇＲＮＡ分子が、前記標的ドメインを切断するように、２９３細胞内で発現した前記Ｃａｓ９分子を誘導し、 前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号５１０、５１１、および５１２のいずれかからの標的化ドメインを含んでなる、前記方法。」 （３）対比 引用発明における「配列番号５１０、５１１、５１２」（上記ケ）は、それぞれ、補正発明における「配列番号５１０、５１１、５１２」と一致する。 また、引用発明における「標的化ドメイン」は、補正発明における「ターゲティングドメイン」に相当する。 したがって、補正発明と引用発明は、 「細胞にＣａｓ９分子及びｇＲＮＡ分子を作用させるステップを含んでなる、細胞を改変する方法であって、ｇＲＮＡ分子が、ＰＤＣＤ１遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含み、前記標的ドメインを切断するように前記Ｃａｓ９分子を誘導し、 前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号５１０、５１１、および５１２のいずれかからのターゲティングドメインと同一のターゲティングドメインを含んでなる、前記方法。」である点で一致し、以下の点で一応相違している。 （相違点）補正発明では、「Ｔ細胞を１つまたは複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体と接触させるステップ」を含み、「標的ドメインを少なくとも４０％の切断効率で切断する」のに対して、引用発明では、「２９３細胞に、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡプラスミドと、ｇＲＮＡのＤＮＡテンプレートを形質移入するステップ」を含み、切断効率は特定されていない点。 （４）判断 引用文献１は、養子移入に使用するＴ細胞における抗腫瘍有効性を改善するという課題を解決するために、Ｔ細胞の増殖、生存および／または機能に影響を与える遺伝子の発現を修飾することを趣旨とする文献である（上記イ、ウ）。 そして、実施例３では、２９３細胞において、Ｔ細胞受容体β（ＴＲＢＣ）のｇＲＮＡ、Ｔ細胞受容体α（ＴＲＡＣ）のｇＲＮＡ、ＰＤ－１受容体（ＰＤＣＤ１）のｇＲＮＡをスクリーニングしているが、実施例４、６～７では、２９３細胞において標的遺伝子の切断を誘導することができたｇＲＮＡの一部（ＴＲＢＣ－２１０（ＧＣＧＣＵＧＡＣＧＡＵＣＵＧＧＧＵＧＡＣ）（配列番号４１３）を有するＴＣＲβ鎖に対するｇＲＮＡ、ＴＲＡＣ－４（ＧＣＵＧＧＵＡＣＡＣＧＧＣＡＧＧＧＵＣＡ）（配列番号４５３）又はＴＲＡＣ－２３３（ＧＵＧＡＡＵＡＧＧＣＡＧＡＣＡＧＡＣＵＵＧＵＣＡ）（配列番号４７４）を有するＴＣＲα鎖に対するｇＲＮＡ、ＰＤＣＤ１ー１０８（ＧＵＣＵＧＧＧＣＧＧＵＧＣＵＡＣＡＡＣＵ（配列番号５０８）を有するＰＤＣＤ１に対するｇＲＮＡ）を用いて、初代Ｔ細胞において、その標的遺伝子の切断活性を検証している（上記キ～シ）。即ち、実施例３においては、２９３細胞でｇＲＮＡのスクリーニングを行っているが、引用文献１の上記課題及び趣旨に照らすと、結局はＴ細胞で用いることに向けられたものであるといえる。そうすると、引用発明は、養子移入に使用するＴ細胞における抗腫瘍有効性を改善することを目的として、Ｃａｓ９分子とｇＲＮＡ分子を用いて専らＴ細胞を改変することを予定しているものであるといえる。 さらに、細胞にＣａｓ９分子及びｇＲＮＡ分子を作用させる方法について、引用文献１には、Ｃａｓ９分子はタンパク質として提供され、ｇＲＮＡ分子は、転写または合成ＲＮＡとして提供されること（上記オ）、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を使用すること（上記エ）も記載されている。また、実施例３で２９３細胞においてスクリーニングされたｇＲＮＡの一部（ＴＲＡＣ－２３３（ＧＵＧＡＡＵＡＧＧＣＡＧＡＣＡＧＡＣＵＵＧＵＣＡ）（配列番号４７４）を有するＴＣＲα鎖に対するｇＲＮＡ、ＰＤＣＤ１ー１０８（ＧＵＣＵＧＧＧＣＧＧＵＧＣＵＡＣＡＡＣＵ）（配列番号５０８）を有するＰＤＣＤ１に対するｇＲＮＡ）を用いて、実施例４、６～７で、初代Ｔ細胞において標的遺伝子切断活性を検証するにあたっては、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を初代Ｔ細胞に接触させることにより行っていることから（上記キ～シ）、Ｔ細胞へのＣａｓ９分子及びｇＲＮＡ分子の作用方法として、「Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ分子複合体と接触させる」ことも、引用文献１に記載されているに等しい事項であるといえる。 そして、引用発明におけるｇＲＮＡ分子は、補正発明と全く同一のｇＲＮＡ分子を使用するものであるから、そのようなｇＲＮＡ分子を、Ｃａｓ９分子/ｇＲＮＡ分子複合体としてＴ細胞に接触させれば、自ずと、「標的ドメインを少なくとも４０％の切断効率で切断する」ものであるといえる。 （なお、引用文献１は、本願出願人による特許出願の国際公開であって、配列番号５１０、５１１、５１２のｇＲＮＡ分子を用いた唯一の実施例である実施例３は２９３細胞を用いたものであり、本願明細書における、配列番号５１０、５１１、５１２のｇＲＮＡ分子を用いた唯一の実施例である実施例３と同一である。このとおり、引用文献１においても本願明細書においても、Ｔ細胞での切断効率は具体的に示されていないことに照らすと、こう判断するよりほかない。） よって、上記相違点は、実質的な相違点とはいえない。 また、上記相違点が実質的な相違点であったとしても、引用文献１の記載によれば、相違点について、補正発明の発明特定事項に至ることは当業者が容易になし得ることであり、補正発明の発明特定事項により、有利な効果が奏されるとは認められない。 以上のとおり、補正発明は、引用発明、すなわち、引用文献１に記載された発明であるか、引用文献１に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものである。 ４．審判請求人の主張について 審判請求人は、審判請求書において、引用文献１は、実施例７において、「Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞内のＰＤＣＤ１遺伝子座におけるＣａｓ９媒介切断を実証するために、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９および標的化ドメインＧＵＣＵＧＧＧＣＧＧＵＧＣＵＡＣＡＡＣＵ（配列番号５０８）を有するＰＤＣＤ１遺伝子座に対して設計されたｇＲＮＡ」を用いたことを開示するが、本願請求項記載の発明においては、「ＰＤＣＤ１遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含み」、かつ、「配列番号５１０、５１１、５１２、５１４、５７６、５７９、５８１、５８２、７６６、および７２３のいずれかからのターゲティングドメインと同一の、または３ヌクレオチド以下が異なる、ターゲティングドメインを含んでなる」ｇＲＮＡを用いるものであり、さらに、引用文献１は、「前記標的ドメインを少なくとも４０％の切断効率で切断するように前記Ｃａｓ９分子を誘導」することについて、記載も示唆もないことから、本願請求項記載の発明は、引用文献１記載の発明と大きく異なる発明であると主張している。 しかしながら、引用文献１には、配列番号５１０、５１１、５１２のいずれかのターゲティングドメインと同一のターゲティングドメインを含んでなるｇＲＮＡについて、２９３細胞に、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡプラスミドと、ｇＲＮＡのＤＮＡテンプレートを形質移入することにより、２９３細胞においてＰＤＣＤ１遺伝子が切断されたことが具体的に記載され（上記ケ）、これは、養子移入に使用するＴ細胞における抗腫瘍有効性を改善することを目的として、Ｔ細胞への適用を予定したものであること、さらに、「Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ分子複合体と接触させる」ことも、引用文献１に記載されているに等しい事項であることから、補正発明が引用文献１に記載された発明であるか、引用文献１に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるといえることは、上記第２の３（４）で述べたとおりである。 また、上記第２の３（４）で述べたとおり、配列番号５１０、５１１、５１２のいずれかのターゲティングドメインと同一のターゲティングドメインを含んでなるｇＲＮＡについての本願明細書における開示は、引用文献１における開示と同一であるから、「少なくとも４０％の切断効率で切断する」点においても、補正発明が引用発明と実質的に相違するものであるとは認められない。 したがって、審判請求人の主張は、理由がない。 ５．小活 以上のとおり、本件補正は、特許法第１７条の２第６項において準用する同法第１２６条第７項の規定に適合しないから、同法第１５９条第１項において読み替えて準用する同法第５３条第１項の規定により却下されるべきものである。 第３ 本願発明について １．本願に係る発明 本件補正は上記のとおり却下されたので、本願の請求項１～１５に係る発明は、令和３年１２月２３日に提出された特許請求の範囲の請求項１～１５に記載の事項により特定されるものであると認める。 ２．原査定の理由 令和４年３月１６日付け拒絶査定は、この出願の請求項１に係る発明は、その優先日前に日本国内又は外国において頒布された又は電気通信回線を通じて公衆に利用可能となった引用文献１に記載された発明であるから、特許法第２９条第１項第３号に該当し、または、引用文献１に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、同法同条第２項の規定により、特許を受けることができない、との理由を含むものである。 ３．当審の判断 本願の請求項１に係る発明は、上記第２の１．に（補正前）として記載したものであり、本願の請求項１に係る発明は、上記第２の３（３）において記載した相違点を含むものと認められる。 そうすると、本願の請求項１に係る発明は、補正発明について述べた上記第２の３（４）と同様の理由により、引用文献１に記載された発明であるか、引用文献１に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものである。 第４ むすび 以上のとおり、本願の請求項１に係る発明は、特許法第２９条第１項第３号に該当し、または、同法同条第２項の規定により、特許を受けることができないものであるであるから、他の請求項に係る発明について言及するまでもなく、本願は拒絶すべきものである。 よって、結論のとおり審決する。