2022-020213

特願２０２１－５５８３９６「細胞構造体及びその製造方法並びに被験物質の肝毒性の評価方法」拒絶査定不服審判事件〔令和 ３年 ５月２７日国際公開、ＷＯ２０２１／１００７０９〕について、次のとおり審決する。

結 論 本件審判の請求は、成り立たない。

理 由 第１ 手続の経緯 本願は、令和２年１１月１７日（優先権主張 令和 １年１１月１９日）を出願日とする出願であって、令和４年 ９月 ６日付けで拒絶査定がなされ、同年１２月１３日に拒絶査定不服審判請求がなされるとともに手続補正がなされたものである。以後の主な手続の経緯は、次のとおりである。 令和６年 ７月１６日付け 拒絶理由通知書 令和６年 ９月２４日 意見書、手続補正書の提出 第２ 本願発明 本願の請求項１に係る発明（以下、【本願発明】ともいう。）は、令和６年 ９月２４日付け手続補正書により補正された特許請求の範囲の請求項１に記載された事項により特定される、次のとおりのものである。 【本願発明】 「肝細胞と血管内皮細胞とを少なくとも含む細胞と、細胞外マトリックス成分とを含み、 前記細胞の間に前記細胞外マトリックス成分が配置された細胞構造体であって、 前記細胞の間に肝類洞網を有し、 前記肝細胞が非がん性細胞であり、 前記肝細胞が人工多能性幹細胞から分化誘導された細胞を含まず、 前記細胞の総数に対する、前記血管内皮細胞の数の比率が５％以上３５％以下であり、 前記細胞の総数に対する、前記肝細胞の数の比率が６０％以上であり、 前記細胞構造体の培養開始から７日間経過時点において血管構造が維持されている、細胞構造体。」 第３ 当審で通知した拒絶の理由の概要 令和６年 ７月１６日付けで当審が通知した拒絶理由は、下記の新規性欠如及び進歩性欠如の拒絶理由を含むものである。 １．（新規性）補正前の請求項１に係る発明は、その出願前に日本国内又は外国において、頒布された下記の引用文献２に記載された発明であるから、特許法第２９条第１項第３号に該当し、特許を受けることができない。 ２．（進歩性）補正前の請求項１に係る発明は、その出願前に日本国内又は外国において、頒布された下記の引用文献２に記載された発明に基いて、その出願前にその発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。 【引用文献２】 Nat. Commun.、その他、2013.08.19発行、Vol.4, No.2353、pp.1-8 第４ 当審の判断 １ 引用文献２の記載事項（引用文献２は英文であるため翻訳文で示す。下線は当審による。） ア 「高分子電解質ハイドロゲル繊維の組み立てによるパターン化された血管形成した（ｐｒｅｖａｓｃｕｌａｒｉｓｅｄ）組織構造体」（題名） イ 「生体内における操作された組織構造体の有効性は、主に宿主血管系との統合に依存する。血管形成は、前もって形成された微小血管網の吻合を介して構造体の統合を促進することが知られている。ここでは、個別に調整された細胞を含んだ高分子電解質ハイドロゲル繊維を組み立てることによって、整列し空間的に定義された血管形成した組織構造を内皮血管とともに製造する技術を報告する。安定した整列した内皮血管は試験管内で２４時間以内にこれらの構造体内で血管が形成され、マウス皮下モデルでこれらの血管が宿主の循環と吻合する。それぞれの細胞タイプを事前に形成された内皮血管と共パターン化することで、血管形成した脂肪組織と肝臓組織を作成する。我々の研究は、ハイドロゲル内で整列した内皮血管を形成することが、組織構造体のエンジニアリングにおける効率的な血管形成アプローチであることを示す。」（要約） ウ 「結果 細胞を含む高分子電解質繊維の組み立て。個々の繊維は、テンプレート上に配置されたポリイオン液滴から平行に引き出され、その後、高次構造に組み立てられた（図１ａ）。これらの繊維の融合は二次複合体形成によって達成され、連続的でありながら不均質なマトリックス（補足図Ｓ１）が得られ、簡単に取り扱うことができた（補足動画１）。３Ｄ環境で高解像度で個々のニッチを作成できることの重要性が認識されている１５，１６。我々は、ポリイオン溶液に生物製剤を組み込んでから繊維に引き込むことでこれを実現した（図１ｂ、ｃ）。この技術を使用してカプセル化された細胞の生存率は一般的に高く、細胞は繊維内で移動して増殖することができる（補足図Ｓ２及び補足動画２及び３を参照）。 繊維構造における細胞の配列。ハイドロゲル内に組織化された内皮血管網を作製するために、まず、繊維内にチューブを形成するための細胞整列と自己組織化のプロセスを調べた。繊維を使用して細胞を整列させる方法を実証するために、水溶性キチン（ＷＳＣ）とラットメチル化コラーゲン（ＲＭＣ）をアルギン酸ナトリウムと複合させてＩＰＣ繊維構造を組み立て、繊維状の特徴と均一なＲＭＣ分布を持つ連続ハイドロゲルを形成した（補足図Ｓ３ａ、ｂ）。繊維軸に沿ったＥＣの整列を示した。同様の観察が、他のいくつかの細胞タイプでも行なわれた（補足図Ｓ３ｂ～ｅ及び補足動画３）。」（２頁右欄１―２７行） エ 「 ［図：0001418501000001.jpg］ 図１｜繊維組み立てによる階層的組織構造体の操作（ａ）各ステップで階層的な組織構造体を実現するプロセスフローの概略図。生物製剤を含むポリイオン溶液は、まずテンプレート上に局在させる。ＩＰＣ繊維は平行に引き出され、テンプレートの回転によって１点で融合される。ポリイオン溶液（ポリカチオン又はポリアニオン）の沈着液滴による融合と結合した連続的な上向きの引き込みにより、二次構造（ｓｓ）が形成される。その後、二次構造は、二次ポリ電解質複合体を巻き取って層状にすることで三次構造に組み立てられる。（ｂ）マイクロパターン化されたニッチ環境は、異なる細胞タイプを含む一次生体構造単位を組み立てることで作成できる。各二次構造は、１つの中心繊維とそれを取り囲む他の繊維で構成される。このマイクロパターンは、最終的な三次構造で繰り返される。（ｃ）生体構造単位の共焦点顕微鏡画像。標識細胞はキチン－アルギン酸高分子電解質繊維に高密度で封入されており、一次、二次、三次構造が示される。スケールバー：１００μｍ。」（図１） オ 「血管新生した肝組織の操作。肝組織は血管新生を必要とするもう一つの組織タイプである８。試験管内で内皮血管網を利用して肝機能を支えていることを実証するために、ラットの初代肝細胞とＥＣを高細胞密度にパターン化し、天然肝類洞に類似する二次構造を形成し（図４ａ）、細胞形態と機能維持を、対照肝細胞単培養システムと比較した。肝細胞繊維にガラクトシル化ＷＳＣを組み込むことで、肝細胞のためのニッチな微小環境が作られた。ガラクトースは、受容体を介したメカニズムにより肝細胞機能を高めることが知られている１９～２１。単培養システムでは肝細胞は繊維構造体全体に均一に分布していた（図４ｂ）。対照的に、共培養システムでは肝細胞はＥＣの周りに凝集しており（図４ｂ）、これは内皮血管構造による肝細胞の動員を示す以前の報告と一致している１１。アルブミンとＣＹＰ３Ａ４アッセイでは、ガラクトシル化ニッチでＥＣと共培養すると分化肝細胞機能の維持が改善されることが示された（図４ｃ）。ガラクトースを含まない対照群では、試験管内で肝細胞の機能は維持されなかった（補足図Ｓ９）。これらの結果は、試験管内で内皮血管網の存在が肝細胞培養を支えていることを示唆する。 また、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）由来の肝細胞前駆細胞（ＨＰＣ）をＥＣとパターン化し、血管形成した肝組織を作成した。５日間培養した後、共培養構造体を、１４日間、部分肝切除したＳＣＩＤマウスの肝臓に移植した。ヒトアルブミンに対する免疫染色によりｈＥＳＣ由来ＨＰＣの存在を観察し、ｈＣＤ３１染色により血管形成を示した（図４ｄ）。」（４頁左欄８行－右欄最下行） カ 「 ［図：0001418501000002.jpg］ 図４｜血管新生した肝組織の操作（ａ）高い細胞密度を示す肝細胞を含む繊維構造体の明視野顕微鏡画像（ｂ）繊維構造体の２４ｈ後の肝細胞単独培養（左）とＨＵＶＥＣとの共培養（右）の免疫染色。共培養では、整列した洞様構造の領域が観察された。肝細胞とＨＵＶＥＣは、それぞれラット血清アルブミン（ｒＡｌｂ）とｈＶＷＦで陽性染色された。（ｃ）肝細胞培養の機能特性。共培養構造体では、アルブミン分泌機能の維持がより良好で、ＣＹＰ３Ａ４活性も高かった。両構造体の尿素合成機能は７日間にわたって比較的安定していた。＊は、特定の時点（ｎ＝３、平均±ｓ．ｄ．）のグループ間の有意差（Ｐ＜０．０１）を示す。（ｄ）摘出されたヒトＥＳ細胞由来肝細胞構造体のＨ＆Ｅ染色及び免疫染色画像。免疫染色は、ヒト血清アルブミン（ｈＡｌｂ）陽性細胞がｈＣＤ３１陽性内皮細胞と密接に関連していることを示す。組織スキャフォールド境界を白い点線で示す。スケールバー：１００μｍ。」 キ 「肝臓の洞様構造は、このように肝臓組織の工学における有用な構成要素となる。本研究では脂肪細胞と肝細胞が実質細胞として選択されたが、他のさまざまな細胞タイプも私たちの組織構造内で良好な生存率で培養することができ（補足図Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４を参照）、血管床と組み合わせて使用することができる。 我々は、微細な特徴を持つマクロな組織構造を作製するためのシンプルでスケーラブルな技術を開発した。このシンプルな技術は特殊な微細加工装置を必要とせず、ほとんどの研究者が容易に適応できる。パターン構造は、繰り返し単位（二次構造）を巻き取るだけで得られる。繊維の直径によって決まる構造の解像度は、繊維の引張速度、液滴サイズ、溶液濃度などの処理パラメータを変えることで調整できる１３。さらに、少量の細胞懸濁液から、デッドボリュームをほとんど残さず、短時間で、かなり大きな構造体を得ることができる。本研究では、５０μｌのポリイオン溶液で典型的には＜１５分で、単一の細胞構造体（１０×１×０．５ｍｍ３）の生成が行なわれた。いくつかの三次構造体を融合することで、より大きな構造体が得られた（補足図Ｓ１ｅ）。この研究ではキチンとアルギン酸が高分子電解質のペアとして使用されたが、他の高分子電解質の組み合わせも可能であり、組織の機能性が向上する可能性がある。」（６頁左欄５行－右欄最下行） ク 「ＩＰＣ繊維への細胞のカプセル化と生物製剤の組み込み。細胞含有繊維の場合、細胞をまずトリプシン処理し、５００ｒｐｍで３分間遠心分離して細胞ペレットを得た。細胞をペレットから取り出し、細胞ペレット／ＷＳＣ溶液の体積比３：７でＷＳＣ溶液に混合して、作業用ポリカチオン溶液を形成した。この作業溶液を使用してＩＰＣ細胞含有繊維を形成し、得られた構造体を適切な培養培地でインキュベートした。生物製剤は、ＷＳＣまたはアルギン酸溶液のいずれかに混合して組み入れた。細胞の整列が必要な場合は、ＲＭＣ（０．２５ｗ／ｖ％）をＷＳＣ溶液に加えた（補足方法）。」（７頁左欄３２－４０行） ケ 「ｉｎ ｖｉｔｒｏ初代肝細胞構造体の評価。ＨＵＶＥＣ（５回継代）は、ラットの初代肝細胞を含んだ８本の繊維に囲まれた中央繊維に封入された。肝細胞単培養構造体（コントロール）は、同様に細胞を含まない中央繊維で作製された。肝細胞を含む繊維は、ＷＳＣ（１ｗ／ｖ％）、ガラクトシル化ＷＳＣ（０．２５ｗ／ｖ％）、及びＲＭＣ（０．２５ｗ／ｖ％）を含むポリカチオン溶液から形成された。構造体は、ＥｎｄｏＧｒｏ－ＬＳ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）及びｈｅｐａｔｏｚｙｍｅ－ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（１：１混合物）で７日間維持された。培地は毎日収集され、アルブミンと尿素が生成された。尿素の生成は、１ｍＭの塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）が補充された培地で２時間インキュベートし、その後、補充した培地を除去し、新鮮な培地と交換することで誘導された。肝細胞の機能維持は、７日間にわたってアルブミンと尿素の分泌を測定することによって評価した。（ｎ＝３）各構造体のデータは、アルブミンと尿素の維持プロファイルを得るために、１日目の値で正規化された。正規化されたパーセンテージを平均して最終値を得た。肝細胞を含む繊維にガラクトシル化ＷＳＣが含まれていない別の実験も実施した。」（７頁右欄３２－４７行） ２ 引用発明の認定 引用文献２には、高分子電解質ハイドロゲル繊維の組み立てによるパターン化された血管形成した組織構造体について記載され（上記１ ア、イ）、水溶性キチン－アルギン酸ＷＳＣ、ガラクトシル化ＷＳＣ、及びラットメチル化コラーゲンＲＭＣを含むポリカチオン溶液から形成された初代肝細胞の繊維８本、ＨＵＶＥＣの繊維１本から３次元的に組み立て、肝類洞に類似した内皮血管網を有する肝細胞構造体を製造したこと（上記１ イ－ケ）、アルブミン分泌機能の維持が良好で、ＣＹＰ３Ａ４活性も高く、尿素合成機能は７日間にわたって比較的安定していたこと（上記１ オ、カ、ケ）が記載されている。 したがって、引用文献２に記載された発明（以下、【引用発明】ともいう。）は、次のとおりと認められる。 【引用発明】 「肝細胞、ＨＵＶＥＣと、水溶性キチン－アルギン酸ＷＳＣ、ガラクトシル化ＷＳＣ、及びラットメチル化コラーゲンＲＭＣを含むポリイオン溶液とを含み、 肝細胞の繊維とＨＵＶＥＣの繊維は、ポリイオン溶液から形成され、 肝類洞に類似した血管形成を有し、 肝細胞が、初代肝細胞であり、 初代肝細胞の繊維８本、ＨＵＶＥＣの繊維１本の割合で組み立てられ、 アルブミン分泌機能の維持が良好で、ＣＹＰ３Ａ４活性も高く、尿素合成機能は７日間にわたって比較的安定している、 肝細胞構造体」 ３ 対比 引用発明の「ＨＵＶＥＣ」は、本願明細書に「血管内皮細胞は、例えば、類洞内皮細胞、ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）であってよい。」（［００２１］）と記載されていることから、本願発明の「血管内皮細胞」に相当する。 引用発明の「水溶性キチン－アルギン酸ＷＳＣ、ガラクトシル化ＷＳＣ、及びラットメチル化コラーゲンＲＭＣを含むポリイオン溶液」は、細胞外マトリックスであるラットメチル化コラーゲンを含むことから、本願発明の「細胞外マトリックス成分」に相当する。 引用発明の「肝細胞の繊維とＨＵＶＥＣの繊維は、ポリイオン溶液から形成され」は、上記１ エ（特に、引用文献２の図１ｂ）から、本願発明の「細胞の間に細胞外マトリックス成分が配置され」に相当する。 引用発明の「肝類洞に類似した内皮血管網」は、本願明細書に「細胞構造体の肝類洞網（血管網）」（［０１１５］）と記載されているように、本願発明の「肝類洞網」に相当する。 引用発明の「肝細胞が、初代肝細胞であり」は、一般に、初代細胞は、組織から直接採取された細胞を意味するから、本願発明の「肝細胞が非がん性細胞であり、肝細胞が人工多能性幹細胞から分化誘導された細胞を含まず」に相当する。 引用発明の「肝細胞構造体」は、本願発明の「細胞構造体」に相当する。 そうすると、本願発明と引用発明とは、 「肝細胞と血管内皮細胞とを少なくとも含む細胞と、細胞外マトリックス成分とを含み、 前記細胞の間に前記細胞外マトリックス成分が配置され、 前記細胞の間に肝類洞網を有し、 前記肝細胞が非がん性細胞であり、 前記肝細胞が人工多能性幹細胞から分化誘導された細胞を含まない、細胞構造体。」である点で一致し、 本願発明と引用発明とは、次の２つの点（以下、【一応の相違点１】、【一応の相違点２】ともいう。）において一応相違している。 【一応の相違点１】 本願発明は、「前記細胞の総数に対する、前記血管内皮細胞の数の比率が５％以上３５％以下であり、前記細胞の総数に対する、前記肝細胞の数の比率が６０％以上であ」るのに対し、引用発明は、「初代肝細胞の繊維８本、ＨＵＶＥＣの繊維１本の割合であ」る点 【一応の相違点２】 本願発明は、「前記細胞構造体の培養開始から７日間経過時点において血管構造が維持されている」のに対し、引用発明は、「アルブミン分泌機能の維持が良好で、ＣＹＰ３Ａ４活性も高く、尿素合成機能は７日間にわたって比較的安定している」点 ４ 判断 ア 一応の相違点１について 引用文献２には、「ＩＰＣ繊維への細胞のカプセル化と生物製剤の組み込み。細胞含有繊維の場合・・・細胞ペレット／ＷＳＣ溶液の体積比３：７でＷＳＣ溶液に混合して・・・」（上記（１）ケ）と記載されているから、各繊維の細胞ペレットの体積（細胞の体積）は同程度であると認められる。 そして、次の図（上記１ カの図４ｂ右図） ［図：0001418501000003.jpg］ より、１個当たりのＨＵＶＥＣ（赤色）のサイズは、１個当たりの肝細胞（緑色）のサイズと同程度か、わずかに小さい程度であるから、１個当たりのＨＵＶＥＣ（赤色）の体積も、１個当たりの肝細胞（緑色）の体積と、同程度か、わずかに小さい程度であると認められる。 そうすると、引用発明の肝細胞構造体は、「初代肝細胞の繊維８本、ＨＵＶＥＣの繊維１本の割合で組み立てられた」ものであるから、ＨＵＶＥＣの体積が肝細胞の体積と同程度であるとすると、本願発明でいう「前記細胞の総数に対する、前記血管内皮細胞の数の比率」は、１／（８＋１）×１００＝１１％程度であり、本願発明でいう「前記細胞の総数に対する、前記肝細胞の数の比率」は、８／（８＋１）×１００＝８９％程度であると算出できる。仮に、ＨＵＶＥＣの体積が肝細胞の体積の半分程度であるとしても、本願発明でいう「前記細胞の総数に対する、前記血管内皮細胞の数の比率」は、１×２／（８＋１×２）×１００＝２０％程度であり、本願発明でいう「前記細胞の総数に対する、前記肝細胞の数の比率」は、８／（８＋１×２）×１００＝８０％程度であると算出でき、いずれの場合も本願発明で特定された各細胞の数の比率の範囲内に相当する。 このことは、次の図（上記１ カの図４ｂ右図の中の右上図） ［図：0001418501000004.jpg］ のＨＵＶＥＣ（赤色）及び肝細胞（緑色）の割合から視認しても、「前記細胞の総数に対する、前記血管内皮細胞の数の比率が５％以上３５％以下であり、前記細胞の総数に対する、前記肝細胞の数の比率が６０％以上」の範囲に含まれることは明らかであると認められる。 よって、一応の相違点１は、実質的な相違点であるとは認められない。 イ 一応の相違点２について 引用発明の「アルブミン分泌機能の維持が良好で、ＣＹＰ３Ａ４活性も高く、尿素合成機能は７日間にわたって比較的安定している」点（上記１ オ、カ、ケ）について、引用文献２には、「図４｜血管新生した肝組織の操作・・・（ｃ）肝細胞培養の機能特性。共培養構造体では、アルブミン分泌機能の維持がより良好で、ＣＹＰ３Ａ４活性も高かった。両構造体の尿素合成機能は７日間にわたって比較的安定していた。」（上記１ カ）と図４ｃにその根拠となる結果が示されており、図４ｃの結果について、「アルブミンとＣＹＰ３Ａ４アッセイでは、ガラクトシル化ニッチでＥＣと共培養すると分化肝細胞機能の維持が改善されることが示された（図４ｃ）。ガラクトースを含まない対照群では、試験管内で肝細胞の機能は維持されなかった（補足図Ｓ９）。これらの結果は、試験管内で内皮血管網の存在が肝細胞培養を支えていることを示唆する。」（上記１ オ）と説明されているように、図４ｃで使用された「３Ｄ共培養（３Ｄ ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ）」の肝細胞構造体は、培養から７日間にわたって内皮血管網が存在していることが示唆されている。 そうすると、引用発明の「アルブミン分泌機能の維持が良好で、ＣＹＰ３Ａ４活性も高く、尿素合成機能は７日間にわたって比較的安定している」肝細胞構造体は、上記示唆から、肝細胞構造体の培養開始から７日間経過時点において血管構造が維持されている蓋然性が高いといえるから、一応の相違点２は、実質的な相違点であるとは認められない。 ５ 審判請求人の主張 ア 審判請求人は、令和 ６年 ９月２４日に提出された意見書において、「また、引用文献２Ｆｉｇｕｒｅ ４ｃは、アルブミン分泌機能の維持、ＣＹＰ３Ａ４活性、及び尿素合成機能の評価結果であり、血管構造が維持されていることを示す結果ではありません。引用文献２には、肝細胞の数の比率が所定値以上でありながら、組織形成後の培養開始から７日間経過時点において血管構造が維持されている組織（細胞構造体）について記載も示唆もありません。」と主張している。 しかし、上記４ アで判断したとおり、引用発明の肝細胞構造体は、本願発明でいう「前記細胞の総数に対する、前記肝細胞の数の比率が６０％以上であ」るものに該当するものである。 また、上記４ イで述べたとおり、引用発明の肝細胞構造体は、アルブミン分泌機能の維持が良好で、ＣＹＰ３Ａ４活性も高く、尿素合成機能は７日間にわたって比較的安定していること（上記１ オ、カ、ケ）、及び、ガラクトースを含まない対照群では、試験管内で肝細胞の機能は維持されなかったこと（補足図Ｓ９）から、「これらの結果は、試験管内で内皮血管網の存在が肝細胞培養を支えていることを示唆する。」（上記１ オ）と培養から７日間にわたって内皮血管網が存在していることが示唆されている。 そして、この「これらの結果は、試験管内で内皮血管網の存在が肝細胞培養を支えていることを示唆する。」という示唆は、引用文献２の図４ｃ（上記１ カ）をみても、本願発明に相当する「３Ｄ共培養（３Ｄ ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ）」肝細胞構造体は、７日間にわたってアルブミン分泌能がほとんど低下せず安定していること、及び、本願優先日当時の技術常識として、血管構造が存在することで、組織構造の内部まで栄養を供給でき、組織構造の機能を維持できることを考慮しても、至極妥当なものである。 よって、引用文献２には、「肝細胞の数の比率が所定値以上でありながら、組織形成後の培養開始から７日間経過時点において血管構造が維持されている組織（細胞構造体）について記載」されていると認められるから、審判請求人の上記主張に理由はない。 イ 審判請求人は、上記意見書において、「引用文献２Ｆｉｇｕｒｅ ４ｂに示される初代肝細胞を用いた肝細胞構造体は、血管構造を安定化するための壁細胞が使用されておらず、Ｆｉｇｕｒｅ ２に記載される結果は、少なくとも肝細胞及び壁細胞の使用の有無等が異なる条件で作製されたものですので、引用文献２Ｆｉｇｕｒｅ ２等の結果をもって、Ｆｉｇｕｒｅ ４ｂに示される初代肝細胞を用いた肝細胞構造体が、培養開始から７日間経過時点において血管構造が維持されていると判断することはできません。」と主張している。 しかしながら、引用文献２には、「図４｜血管新生した肝組織の操作（ａ）高い細胞密度を示す肝細胞を含む繊維構造体の明視野顕微鏡画像（ｂ）繊維構造体の２４ｈ後の肝細胞単独培養（左）とＨＵＶＥＣとの共培養（右）の免疫染色。共培養では、整列した洞様構造の領域が観察された。」（上記１ カ）と、引用発明の肝細胞構造体は、壁細胞を持たずしても、図４ｂの結果から洞様構造、即ち血管構造を有することが明らかにされている。 さらに、引用発明の肝細胞構造体の培養７日目の血管構造の存在についても、引用文献２に「ラットの初代肝細胞とＥＣを高細胞密度にパターン化し、天然肝類洞に類似する二次構造を形成し（図４ａ）、細胞形態と機能維持を、対照肝細胞単培養システムと比較した。肝細胞繊維にガラクトシル化ＷＳＣを組み込むことで、肝細胞のためのニッチな微小環境が作られた。ガラクトースは、受容体を介したメカニズムにより肝細胞機能を高めることが知られている１９～２１。単培養システムでは肝細胞は繊維構造体全体に均一に分布していた（図４ｂ）。対照的に、共培養システムでは肝細胞はＥＣの周りに凝集しており（図４ｂ）、これは内皮血管構造による肝細胞の動員を示す以前の報告と一致している１１。アルブミンとＣＹＰ３Ａ４アッセイでは、ガラクトシル化ニッチでＥＣと共培養すると分化肝細胞機能の維持が改善されることが示された（図４ｃ）。ガラクトースを含まない対照群では、試験管内で肝細胞の機能は維持されなかった（補足図Ｓ９）。これらの結果は、試験管内で内皮血管網の存在が肝細胞培養を支えていることを示唆する。」（上記１ オ）と図４ａ～ｃと補足図Ｓ９の結果から示唆されている。 したがって、引用発明の肝細胞構造体が、培養開始から７日間にわたって血管構造が維持されることは、壁細胞を用いない図４の結果から直接的に判断されているものであって、壁細胞を用いた図２の結果から判断されたものではないから、「引用文献２Ｆｉｇｕｒｅ ２等の結果をもって、Ｆｉｇｕｒｅ ４ｂに示される初代肝細胞を用いた肝細胞構造体が、培養開始から７日間経過時点において血管構造が維持されていると判断することはできません。」という上記主張に理由はない。 ウ 審判請求人は、上記意見書において、「更に、高濃度（例えば、細胞の総数に対する肝細胞の数の比率が６０％以上）の肝細胞(上皮細胞)がまざっている場合、肝細胞同士は相互に密着してタイトジャンクションを形成し、血管網形成のために必要な血管内皮細胞の進展や遊走を物理的に阻害することが予想されますので、血管内皮細胞とＭＳＣとの比率を最適化した系で、当該比率を維持して肝細胞を組み込んだとしても、引用文献２に記載の組織化法で、培養開始から７日後まで血管構造が維持される保証はありません。以下の参考図１はこのような事情を補足するものです。参考図１では、本実施例７に倣い、フィブリンゲルに下記の以下のそれぞれの組成で細胞を包埋して肝臓モデルを作成した事例です。右の組織は、本実施例７と同様に1ウェルあたりの総細胞量を３０，０００ Ｃｅｌｌｓとした上で、細胞組成を、肝臓の血管である類洞内皮細胞（ＳＥＣ）と、類洞内皮細胞のネットワーク化を支持する肝星細胞（ＬＸ２）とを、ＳＥＣ：ＬＸ２＝７：３となるように混合し、その他の工程は本実施例７と同様にして作製したもので、肝細胞が無いため血管網が良くできています。このＳＥＣとＬＸ２との細胞数の比（ＳＥＣ：ＬＸ２）をほぼ維持して、全体の６５％を肝細胞にしたのが左図であり、こちらは本実施例７に開示した肝臓モデルと同一手順により作製したものであります。本系では、本発明で主張する血管毒性の評価が可能な程度の血管網構造ができていますが、右図と比べればその緻密さに顕著な差があります。よって、内皮細胞及びその網化を支持する細胞を、その二者のみで最適化した比率でもって維持しつつそこに肝細胞を組み込んだとしても、肝細胞の存在が内皮細胞の網化を阻害することから、同様の血管網形成が行われることを約束するものではありません。」と主張している。 しかしながら、上記イで述べたとおり、引用発明の肝細胞構造体が、培養開始から７日間にわたって血管構造を有することは、図４の結果から直接的に判断したものであって、このことに技術的にも矛盾がないことは上記４ イで判断したとおりである。 一方、上記参考図１で示された肝臓モデルについても、「本系では、本発明で主張する血管毒性の評価が可能な程度の血管網構造ができています」と血管構造を有することは、審判請求人自身が認めているところである。 そうであるにもかかわらず、引用発明の製造方法とは全く異なる条件で製造され、かつ、血管構造を有する上記参考図１の肝臓モデルの結果から、引用発明の肝細胞構造体に対して「同様の血管網形成が行われることを約束するものではありません。」という主張については、これを的確に裏付ける証拠はなく、採用することはできない。 ６ 小括 上記１－５のとおり、本願発明は、引用発明、すなわち引用文献２に記載された発明であるか、引用文献２に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたものである。 第５ むすび 以上のとおり、本願発明は、特許法第２９条第１項第３号に該当し、又は、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであるから、他の請求項について検討するまでもなく、本願は拒絶すべきものである。 よって、結論のとおり審決する。