2021-006812

本願は、平成２９年６月８日（パリ条約による優先権主張 ２０１６年６月８日（ＣＮ）中華人民共和国）を国際出願日とする出願であって、令和３年１月２１日付けで拒絶査定がなされ、これに対し同年５月２６日に拒絶査定不服審判の請求がされると同時に手続補正がなされ、令和５年３月１日付けで当審より拒絶理由（以下、「当審拒絶理由」という。）が通知され、同年９月１４日付けで意見書及び手続補正書が提出され、令和６年１月１５日付けで上申書が提出されたものである。

当審の拒絶の理由で引用された、本願優先日前に頒布された刊行物である引用文献１には、次の事項が記載されている。なお、引用文献１は英文のため当審による翻訳文で示す。下線は当審で付与した。

（ア）

「【請求項１】

修飾された重鎖定常領域を含む抗体であって、該修飾された重鎖定常領域が、Ｎ末端からＣ末端の順にＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、該ヒンジがＩｇＧ２アイソタイプのものであり、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの少なくとも１つが、ＩｇＧ２アイソタイプのものではない、抗体。

【請求項２】

該ヒンジが野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジであるか、または野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。 」

（イ）

「【請求項１１７】

修飾された重鎖定常領域を含む抗体の製造方法であって、該抗体が、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを、Ｎ末端からＣ末端の順に含み、以下の工程：

（ａ）ＩｇＧ２ヒンジおよび／またはＩｇＧ２ＣＨ１ドメインではない、ヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインを含む抗体を提供し；

（ｂ）該ヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインを、それぞれＩｇＧ２ヒンジおよび／またはＩｇＧ２ＣＨ１ドメインで置換する工程

続きを表示（全28行）

を含む、方法。

【請求項１１８】

細胞による抗体の内在化を増大させる方法であって、

（ａ）ＩｇＧ２ヒンジおよび／またはＩｇＧ２ＣＨ１ドメインではない、ヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインを含む抗体を提供する工程；

（ｂ）該ヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインを、それぞれＩｇＧ２ヒンジおよび／またはＩｇＧ２ＣＨ１ドメインで置換する工程

を含む、方法。

【請求項１１９】

抗体の内在化が、非ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジを含む同じ抗体、例えばＩｇＧ１定常領域を含む抗体の内在化と比べて増大される、請求項１１８に記載の方法。

【請求項１２０】

抗体のアゴニスト活性を増大させる方法であって、

（ａ）ＩｇＧ２ヒンジおよび／またはＩｇＧ２ＣＨ１ドメインではない、ヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインを含む抗体を提供する工程；

（ｂ）該ヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインを、それぞれＩｇＧ２ヒンジおよび／またはＩｇＧ２ＣＨ１ドメインで置換する工程

を含む、方法。

【請求項１２１】

アゴニスト活性が、非ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジを含む同じ抗体、例えばＩｇＧ１定常領域を含む抗体のアゴニスト活性と比べて増強される、請求項１２０に記載の方法。

【請求項１２２】

ＩｇＧ２ヒンジが、野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジであるか、または野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１７から１２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項１２３】

ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインの少なくとも１つを、それぞれ異なるアイソタイプのＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインで置換する工程を含む、請求項１１７から１２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項１２４】

（ａ）ＣＨ１ドメインをＩｇＧ２ＣＨ１ドメインで置換する工程；

（ｂ）ＣＨ２ドメインをＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインで置換する工程；および／または

（ｃ）ＣＨ３ドメインをＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインで置換する工程

を含む、請求項１１７から１２３のいずれか一項に記載の方法。」

（ウ）

「特定の態様において、抗体は、修飾された重鎖定常領域を含み、ここで、（ａ）ＣＨ１ドメインは、さらなる修飾を含むか、もしくは含まない、野生型ヒトＩｇＧ２ＣＨ１ドメインまたは野生型ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインであり、（ｂ）ヒンジは、Ｃ２１９Ｓ置換を含むか、もしくは含まない野生型ＩｇＧ２ヒンジであり、（ｃ）ＣＨ２ドメインは、さらなる修飾を含むか、もしくは含まない、野生型ヒトＩｇＧ１ＣＨ２ドメインまたは野生型ＩｇＧ２ ＣＨ２ドメインであり、そして（ｄ）ＣＨ３ドメインは、位置３５６にアミノ酸Ｅおよび位置３５８にアミノ酸Ｍを含むか、もしくは含まない、野生型ヒトＩｇＧ１ＣＨ３ドメインまたは野生型ヒトＩｇＧ２ ＣＨ３ドメインである。特定の態様において、修飾された重鎖定常領域は、例えば、配列番号２６～３７および７８～９３のいずれか１つに記載された、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む。」（第３頁１２～２０行）

（エ）

「修飾された重鎖定常領域を含む抗体を作製するための方法もまた、提供される。本明細書で提供されるすべての方法には、非ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジを含む同じ抗体と比較して、細胞による抗体の内在化を増加させる方法、および抗体のアゴニスト活性を増加させる方法が含まれる。そのような方法は、ＩｇＧ２ヒンジではないヒンジを有する抗体を提供する工程、および該ヒンジをＩｇＧ２ヒンジ（例えば、野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジであるヒンジ、野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するヒンジ、またはジスルフィド結合の形成を減少させる修飾を有するヒンジ、例えば、アミノ酸置換Ｃ２１９Ｓを有するヒンジ）で置換する工程を含む。一態様において、抗体の内在化は、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上増強または増加され、結果として、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上のＴ１／２の減少がもたらされる。ある態様において、アゴニスト活性は、エフェクターＴ細胞における増加したサイトカイン放出または増加した増殖；Ｔｒｅｇの関与がＴｒｅｇの機能を低下させる場合、低下したＴ調節細胞活性；または、増加したＴｒｅｇの枯渇、により定義されるように、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上増加または増大される。」（第４頁３～１７行）

（オ）

「本明細書で用いる用語、抗体の“抗原結合部分”は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数の断片を意味する。抗体の抗原結合部分は、“ヒンジ含有抗原結合部分”であり得る。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって実行可能であることが示されている。用語、本明細書に記載の抗体の“抗原結合部分”に包含される結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなる、ｄＡｂ断片（Ward et al., (1989) Nature 341:544－546）；および、（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）または必要に応じて合成リンカーによって連結され得る２つ以上の単離されたＣＤＲの組み合わせ、が含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２個のドメインであるＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によりコードされているが、それらは、組換え法を用いて、一本のタンパク質鎖として作製できる合成リンカーにより連結でき、ここで、ＶＬおよびＶＨ領域は対となって、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知の一価の分子を形成する；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423－426;および、 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879－5883を参照のこと。このような一本鎖抗体もまた、抗体の“抗原結合部分”に包含されることが意図される。これらの、および他の可能性のある構築物は、Chan ＆ Carter (2010) Nat. Rev. Immunol. 10:301に記載されている。これらの抗体断片は、当業者に公知の常套法を用いて入手可能であり、該断片は、無傷の抗体と同様の方法で有用性についてスクリーニングされる。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術により、または無傷の免疫グロブリンの酵素的切断または化学的切断により、産生され得る。」（第１９頁２２行～第２０頁１３行）

（カ）

「本明細書で用いる用語“モノクローナル抗体”は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す抗体、または全ての抗体が特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す複数の抗体組成物を意味する。一般的に、かかるモノクローナル抗体は、単一の細胞または抗体をコードする核酸から誘導され、意図的に配列変化を導入することなく伝播され得る。従って、用語“ヒトモノクローナル抗体”は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列由来の可変および任意の定常領域を有するモノクローナル抗体を意味する。一態様において、ヒトモノクローナル抗体は、例えば、トランスジェニックまたは染色体導入（transchromosomal）非ヒト動物（例えば、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックマウス）から得られたＢ細胞を、不死化細胞と融合させて得られる、ハイブリドーマにより産生される。」（第２７頁１行～第２８頁７行）

（キ）

「ある態様において、修飾された重鎖定常ドメインを含む抗体は、細胞表面分子に結合し、細胞表面分子、例えば、免疫細胞、例えばＴ細胞、Ｔｅｆｆ細胞、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、樹状細胞、マクロファージ、単球、ランゲルハンス細胞、ＮＫ細胞、骨髄由来サプレッサー細胞、Ｂ細胞または任意の他の免疫細胞上の細胞表面分子の生物学的活性をアゴナイズまたはアンタゴナイズする。細胞表面分子は、阻害性分子、例えば、共刺激性分子（例えば、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ４０、ＩＣＯＳおよび他のＴＮＦＲファミリーメンバー）であってよく、抗体は、活性をさらに刺激し得る（アゴニスト抗体）か、または抗体は、活性を阻害し得る（アンタゴニスト抗体）。細胞表面分子は、阻害分子（例えば、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３）であってよく、抗体は、活性をさらに刺激する（アゴニスト抗体）か、または抗体は、活性を阻害してよい（アンタゴニスト抗体）。

ある態様において、修飾された重鎖定常ドメインを含む抗体は、例えばＴ細胞からのＩＬ－２および／またはＩＦＮ－γ分泌を誘導することにより、例えば、対象の免疫系を高める刺激性（または共刺激性）分子のアゴニスト抗体（例えば、抗ＧＩＴＲ抗体）である。他のアゴニスト抗体は、ＡＰＣを活性化し、抗腫瘍Ｔ細胞応答を促進し、および／またはＴ細胞免疫のない状態で癌を制御する可能性を有する細胞傷害性骨髄細胞を促進することが示されている。刺激性分子のアゴニスト抗体は、抗ＣＴＬＡ－４または抗ＰＤ－１などの負の免疫チェックポイントを阻止する阻害性分子のアンタゴニスト抗体とは異なる。Ｔ細胞増殖などのアゴニスト活性は、当技術分野で公知の種々の方法を用いて測定することができる。

ある態様において、修飾された重鎖定常ドメインを含む抗体は、抗ＣＴＬＡ－４または抗ＰＤ－１抗体などの負の免疫チェックポイントを阻止または阻害することにより、例えば、活性化Ｔ細胞上に発現する阻害性受容体を標的とすることにより、対象の免疫応答を増強する、チェックポイント阻害剤のアンタゴニスト抗体である。Ｔ細胞増殖の阻害などのアンタゴニスト活性は、当技術分野で公知の種々の方法を用いて測定することができる。

一態様において、抗体は、（ｉ）共刺激受容体のアゴニスト、または（ｉｉ）例えば、Ｔ細胞に対する阻害シグナルのアンタゴニストであり、両方とも、抗原特異的Ｔ細胞応答（免疫チェックポイント調節因子）の増強をもたらし得る。ある態様において、抗体は、（ｉ）共刺激受容体のアンタゴニスト、または（ｉｉ）例えばＴ細胞に対する阻害シグナルのアゴニストである。ほとんどの共刺激分子および共阻害分子は、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）のメンバーであり、修飾された重鎖定常領域を有する抗体は、それらのいずれかに結合し得る。共刺激受容体または共阻害受容体に結合する膜結合リガンドの１つの重要なファミリーは、Ｂ７ファミリーであり、Ｂ７－１、Ｂ７－２、Ｂ７－Ｈ１（ＰＤ－Ｌ１）、Ｂ７－ＤＣ（ＰＤ－Ｌ２）、Ｂ７－Ｈ２（ＩＣＯＳ－Ｌ）、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ５（ＶＩＳＴＡ）、およびＢ７－Ｈ６が含まれ、そして修飾された重鎖定常領域を有する抗体は、それらの何れかに結合し得る。共刺激受容体または共阻害受容体に結合する膜結合リガンドの別のファミリーは、同族のＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーメンバーに結合する分子のＴＮＦファミリーであり、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ、ＯＸ－４０、ＯＸ－４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ１３７、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２－Ｌ、ＴＲＡＩＬＲ１／ＤＲ４、ＴＲＡＩＬＲ２／ＤＲ５、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＯＰＧ、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫＲ／Ｆｎ１４、ＴＷＥＡＫ、ＢＡＦＦＲ、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＡＣＩ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＬＴβＲ、ＬＩＧＨＴ、ＤｃＲ３、ＨＶＥＭ、ＶＥＧＩ／ＴＬ１Ａ、ＴＲＡＭＰ／ＤＲ３、ＥＤＡＲ、ＥＤＡ１、ＸＥＤＡＲ、ＥＤＡ２、ＴＮＦＲ１、リンホトキシンα／ＴＮＦβ、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＬＴα、ＬＴβ、ＬＴβＲ、リンホトキシンα １β２、ＦＡＳ、ＦＡＳＬ（ＣＤ１７８）、ＤＲ３（ＴＮＦＲＳＦ２５）、ＲＥＬＴ、ＤＲ６、ＴＲＯＹ、ＮＧＦＲ（例えば、Tansey (2009) Drug Discovery Today 00:1を参照のこと）が含まれる。従って、本明細書に記載の抗体は、これらの表面分子のいずれかに結合することができ、それらは、例えば、（ｉ）Ｔ細胞活性化を阻害するＩｇＳＦファミリーもしくはＢ７ファミリーもしくはＮＦＲファミリーのタンパク質のアゴニストまたはアンタゴニスト（または、阻害剤もしくは阻止剤）、またはＴ細胞活性化を阻害するサイトカイン（例えば、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、ＶＥＧＦ；“免疫抑制サイトカイン”）のアンタゴニスト、および／または（ｉｉ）例えば癌などの増殖性疾患を処置するための、免疫応答を調節する、例えば刺激するための、Ｔ細胞活性化を刺激する、ＩｇＳＦファミリー、Ｂ７ファミリーもしくはＴＮＦファミリーの刺激性受容体、またはサイトカインの刺激性受容体の、アゴニストまたはアンタゴニストであり得る。」（第５７頁１行～第５８頁２１行）

（ク）

「Ｖ．非抗体タンパク質および抗体誘導体

本明細書に記載の発明はまた、全長抗体ではない分子にも適用され得る。ただし、それらはヒンジを含む。例えば、増強された生物学的活性を有するＩｇＧ融合タンパク質を作製することができる。従って、本発明は、ＩｇＧ２ヒンジおよび要すれば、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインまたはその部分を含む、ＩｇＧ定常領域、例えばＦｃ領域に結合された、例えば共有結合された活性部分を含む融合タンパク質を提供する。Ｆｃは、表５および６に示される修飾された重鎖定常領域のＦｃ部分のような、本明細書に記載の修飾された重鎖定常領域の任意のＦｃであり得る。

本明細書に記載の抗体はまた、二重特異性分子を形成するためにも使用され得る。抗体またはその抗原結合部分は、別の機能的分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質（例えば、受容体に対する別の抗体またはリガンド）に誘導体化または連結されて、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を生成し得る。本明細書に記載の抗体は、２以上の他の機能的分子に誘導体化または連結されて、２以上の異なる結合部位および／または標的分子に結合する多重特異性分子を生成してもよい；かかる多重特異性分子はまた、本明細書で用いる用語“二重特異性分子”に包含されることが意図される。二重特異性分子を作製するために、本明細書に記載の抗体は、二重特異性分子が得られるように、別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合模倣物などの１つまたは複数の他の結合分子に、（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合または他の方法によって）機能的に連結され得る。」（第７６頁４行～２３行）

（ケ）

「治療的有効用量は、早期または予備的な疾患の徴候が存在するとき、所望され得るような癌の発症を予防または遅延させ得る。癌の診断に利用される実験室検査には、化学、血液学、血清学および放射線学が含まれる。従って、上記のいずれかをモニターする臨床的または生化学的アッセイを、特定の処置が癌を処置するのに治療的に有効な用量であるかどうかを決定するのに用いることができる。当業者は、対象のサイズ、対象の症状の重症度、および選択される特定の組成物または投与経路などの要因に基づいて、かかる量を決定することができる。」（第８２頁６～１３行）

（コ）

「ある態様において、修飾された重鎖定常領域を含む抗体は、刺激性分子に結合し、その活性を阻害する、すなわち、刺激性分子のアンタゴニストであるか、または抗体は、阻害性分子に結合し、その活性を刺激する、すなわち、阻害性分子のアゴニストである。かかる抗体は、免疫系または免疫応答が下方制御されるべき疾患、例えば、自己免疫疾患を処置するため、または移植片拒絶を予防するために使用され得る。

本発明は、対象が処置されるように、例えば、癌性腫瘍の増殖が阻害または低減されるように、および／または腫瘍が退行するように、癌を有する対象を処置する方法であって、本明細書に記載の抗体を対象に投与することを含む方法を提供する。例えば、抗ＧＩＴＲ抗体によるＧＩＴＲの活性化は、患者の癌細胞に対する免疫応答を増強することができる。抗体は、癌性腫瘍の増殖を阻害するために単独で使用可能である。あるいは、抗体は、以下に記載の通り、別の薬剤、例えば、他の免疫原性薬剤、標準的な癌処置剤、または他の抗体と組み合わせて使用されてよい。」（第８５頁３～１６行）

（サ）

「実施例８：遺伝子操作された定常ドメインを有する抗体のＦｃ受容体結合

本実施例は、ＩｇＧ２のＣＨ１およびヒンジを含む修飾重鎖定常領域を有する抗体は、それらがＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含有する場合、ＦｃγＲに結合することを実証する。

可変ドメインによる抗原結合に加えて、抗体は、定常ドメインとの相互作用を介してＦｃ－γ受容体（ＦｃｇＲ）に結合し得る。これらの相互作用は、抗体依存性の細胞性細胞傷害性抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および抗体依存性の細胞貪食（ＡＤＣＰ）などのエフェクター機能を仲介する。エフェクター機能活性は、ＩｇＧ１アイソタイプでは高いが、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４では、これらのアイソタイプがＦｃｇＲに対してより低い親和性を有するため、非常に低いかまたは存在しない。加えて、ＩｇＧ１のエフェクター機能は、ＦｃｇＲ親和性および選択性を変化させるために、定常領域内のアミノ酸残基の変異によって改変され得る。

Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲまたはＦｃｇＲ）に対する抗体の結合は、Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）およびＦｏｒｔｅｂｉｏ社のバイオレイヤー干渉（ＢＬＩ）法を含むバイオセンサー技術を用いて、試験した。ＳＰＲ試験は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００装置（GE Healthcare）にて、２５℃で行った。マウス抗６ｘＨｉｓ抗体由来のＦａｂ断片を、～３０００ＲＵの密度まで、ＥＤＣ／ＮＨＳを用いてＣＭ５センサーチップ上に固定化した。種々のｈｉｓタグを付したＦｃｇＲ（７ｕｇ／ｍｌ）を、１０ｕｌ／分で３０秒間の接触時間を用いてＣ末端ｈｉｓタグを介して捕捉し、１．０ｕＭの抗体の結合を、１０ｍＭ ＮａＰＯ４、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ ｐ２０（ＰＢＳ－Ｔ） ｐＨ７．１の泳動緩衝液で評価した。これらの試験に用いたＦｃｇＲには、ＣＤ６４（ＦｃｇＲＩ）、ＣＤ３２ａ－Ｈ１３１（ＦｃｇＲＩＩａ－Ｈ１３１）、ＣＤ３２ａ－Ｒ１３１（ＦｃｇＲＩＩａ－Ｒ１３１）、ＣＤ３２ｂ（ＦｃｇＲＩＩｂ）、ＣＤ１６ａ－Ｖ１５８（ＦｃｇＲＩＩＩａ－Ｖ１５８）、ＣＤ１６ｂ－ＮＡ１（ＦｃｇＲＩＩＩｂ－ＮＡ１）、およびＣＤ１６Ｂ－ＮＡ２（ＦｃｇＲＩＩＩｂ－ＮＡ２）が含まれた。ＢＬＩ実験を、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ装置（Ｐａｌｌ、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）にて、２５℃で、１０ｍＭ ＮａＰＯ４、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ ｐ２０（ＰＢＳ－Ｔ） ｐＨ７．１中で行った。プロテインＡでコーティングしたセンサー上に、希釈されていない発現上清から抗体を捕捉し、次いで、１ｕＭ ｈＣＤ３２ａ－Ｈ１３１、ｈＣＤ３２ａ－Ｒ１３１、ｈＣＤ３２ｂ、ｈＣＤ１６ａ－Ｖ１５８、または０．１ｕＭ ｈＣＤ６４分析物を結合させた。

初めに、種々の標的に結合する抗体を、置換Ｓ２６７Ｅ（ＳＥ）およびＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ（ＳＥＬＦ）、ならびに変異Ｐ２３８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、Ｈ２６８Ｄ、Ａ３３０Ｒ、Ｇ２３７Ｄ、Ｅ２３３Ｄの種々の組合せを含む修飾されたＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含んで作製し、それらをＶ４、Ｖ７、Ｖ８、Ｖ９およびＶ１２と称した。これらの抗体の結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ ＳＰＲによって、ＩｇＧ１ｆ、ＩｇＧ２．３（ＩｇＧ２－Ｃ２１９Ｓ）およびＩｇＧ４．１（ＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐ）抗体、ならびに全てのＦｃｇＲに対して結合を減少させるように遺伝子操作されたＩｇＧ１．１ｆ抗体と比較して、試験した。図１２に示される結果は、ＳＥおよびＳＥＬＦに対する増加したＣＤ３２ａ－Ｈ１３１、ＣＤ３２ａ－Ｒ１３１およびＣＤ３２ｂ結合、ならびにＣＤ３２ａ－Ｈ１３１およびＣＤ３２ａ－Ｒ１３１よりもＣＤ３２ｂに対してＶ４、Ｖ７、Ｖ８、Ｖ９およびＶ１２変異体の増加した選択性（図１２）を含む、ＩｇＧ１ｆ、ＩｇＧ２．３およびＩｇＧ４．１ならびに変異型ＩｇＧ１抗体に対して予期されるＦｃｇＲ結合特性を示す。

構築物の次のセットを、エフェクター機能を他のエフェクター機能が陰性のＩｇＧ２アイソタイプ中に操作するために使用した。この試験のために、上記の変異を、ＩｇＧ２．３定常領域、またはＩｇＧ２．３Ｇ１－ＡＹと称するＩｇＧ２．３／ＩｇＧ１ｆハイブリッドに導入した（表１９）。抗体を上清として小スケールで発現させ、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔバイオレイヤー干渉法バイオセンサー技術を用いてＦｃｇＲに対する結合を試験した。抗体は上清中に低濃度で存在しているため、プロテインＡでコーティングしたセンサーを用いて上清から抗体を捕捉し、ついで溶液中でＦｃｇＲ分析物に結合させることにより、実験を行った。精製され、かつ上清の、野生型ＩｇＧ１、ＳＥ、Ｐ２３８Ｄ、Ｖ４およびＶ１２抗体を含む対照ＩｇＧ１ｆもまた比較のために含められ、これらの対照抗体のそれぞれは予期されるＦｃｇＲ結合特性を示した（図１３）。ＩｇＧ２．３抗体はまた、予期される結合プロファイルを示し、ＣＤ３２ａ－Ｈ１３１のみに対してかなりの結合が見られた。しかしながら、Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ｐ２３８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、Ｈ２６８Ｄ、Ａ３３０Ｒ、Ｇ２３７ＤまたはＥ２３３Ｄ変異をＩｇＧ２．３に導入する全ての変異は、対応する操作されたＩｇＧ１ ｍＡｂのＦｃｇＲ親和性を再現できなかった（図１３）。対照的に、ＩｇＧ２．３Ｇ１－ＡＹ構築物は、ＩｇＧ２．３のＣＨ１およびヒンジ領域を保持しながら、野生型ＩｇＧ１のＦｃｇＲ結合特性を完全に保存することができた。加えて、Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ｐ２３８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、Ｈ２６８Ｄ、Ａ３３０Ｒ、Ｇ２３７ＤおよびＥ２３３Ｄを含む全てのＩｇＧ２．３Ｇ１－ＡＹ変異体は、同じ変異を含むＩｇＧ１バージョンｍＡｂに匹敵するＦｃｇＲ結合特性を示した（図１３）。このことは、野生型または変異型ＩｇＧ１のエフェクター機能と組み合わされたＩｇＧ２のＣＨ１およびヒンジ領域を有する抗体の成功裏の産生を実証する。

［図：0001412518000001.jpg］

このエンジニアリング戦略は、ＩｇＧ２．３Ｇ１－ＡＹ、ＩｇＧ２．３Ｇ１－ＡＹ－Ｓ２６７Ｅ（ＩｇＧ２．３Ｇ１－ＡＹ－Ｖ２７）、ならびにＩｇＧ２－Ｂ型変異体（ＩｇＧ２．５Ｇ１－ＡＹおよびＩｇＧ２．５Ｇ１－ＡＹ－Ｖ２７）、およびＩｇＧ１およびＩｇＧ２定常ドメインの異なる組合せを含む他のハイブリッド抗体を用いてフォーマットされた他の抗体を産生し、そしてＳＰＲ技術を用いて、抗ｈｉｓ Ｆａｂにより捕捉されたｈｉｓタグを付したＦｃｇＲに対するこれらの抗体の結合を試験することにより、さらに調査された。Ｏｃｔｅｔの上清データと一致して、ＳＰＲデータは、ＩｇＧ２．３Ｇ１－ＡＹおよびＩｇＧ２．３Ｇ１－ＡＹ－Ｖ２７抗体が、ＩｇＧ１ｆおよびＩｇＧ１ｆ－Ｓ２６７Ｅ Ａ型ＩｇＧ２抗体（ＩｇＧ２．３）のＣＨ１およびヒンジ領域を含むにもかかわらず、それぞれＩｇＧ１ｆおよびＩｇＧ１ｆ－Ｓ２６７Ｅに匹敵するＦｃｇＲ結合特性を有することを示した（図１４ＡおよびＢならびに表２０）。同様のデータはまた、ＩｇＧ２．５Ｇ１－ＡＹおよびＩｇＧ２．５Ｇ１－ＡＹ－Ｖ２７抗体を用いても得られ、ＩｇＧ１ｆまたは修飾されたＩｇＧ１ｆ様エフェクター機能を有するＢ型ＩｇＧ２抗体（ＩｇＧ２．５と呼ばれるＣ１３１Ｓ変異を含む）の成功裏の産生を実証している。ＩｇＧ２．３Ｇ１－ＡＹ、ＩｇＧ２．３Ｇ１－ＡＹ－Ｖ２７、ＩｇＧ２．５Ｇ１－ＡＹまたはＩｇＧ２．５Ｇ１－ＡＹ－Ｖ２７定常領域を有するが、異なる可変領域を有するいくつかの他の抗体のデータは、エンジニアリング戦略が、可変ドメインとは無関係の他の抗体に広く適用可能であることを示す（図１４ＡおよびＢならびに表２０）。ＩｇＧ１ｆ様ＦｃｇＲ結合特性を示す他の構築物は、ＩｇＧ１－Ｇ２．３Ｇ１－ＡＹ、およびＩｇＧ１ΔＴＨＴであるが、ＩｇＧ２．３Ｇ１－ＫＨ、ＩｇＧ２．５Ｇ１－ＫＨ、ＩｇＧ２．３プラスＴＨＴ、ＩｇＧ２．５プラスＴＨＴおよびＩｇＧ２．３プラスＧＧＧ構築物を含む、修飾された定常領域構築物のいくつかは、ＩｇＧ１ｆ様ＦｃｇＲ結合特性を保持できなかった（図１４ＡおよびＢならびに表２０）。

表２０（略）

まとめると、これらのデータは、ヒンジ領域中の保存されたＣＰＰＣＰＡＰモチーフへのＣ末端直後の配列がＦｃｇＲ介在性エフェクター機能を付与し、一方で、抗体のＣＨ１およびヒンジの上部部分は、ＩｇＧ２または修飾されたＩｇＧ２配列で置換されて、ＩｇＧ１および修飾されたＩｇＧ１のエフェクター機能を、ＩｇＧ２ＣＨ１および／またはヒンジ領域を含む抗体の優れた内在化またはシグナル伝達特性と共に組み合わせて有する可能性を示す。（第１１１頁１行～第１１６頁３行）

（シ）配列表

［図：0001412518000002.jpg］

［図：0001412518000003.jpg］

（ス）図１３

［図：0001412518000004.jpg］

（ア）本願発明が構造／機能の相関関係における発見に基づく重鎖の特定の改変スキームに基づくものである点について

引用文献には、本願発明におけるアゴニスト活性を増強するための重鎖定常領域の特定の改変スキームを開示しておらず、引用文献に記載の発明に基づいて、当業者は重鎖定常領域の改変を行うために本願発明における重鎖の特定の改変スキームを使用する動機付けはなく、本願発明における重鎖定常領域に対する特定の改変スキームの効果を期待することができない。

本願出願人は、本願発明に記載されるアゴニズムを増強するための思想（ＩｇＧ２ ＣＨ１ヒンジと、ＦｃγＲＩＩＢに対する結合親和性が増加し、（ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＩＡを含む活性化ＦｃγＲと比較して）Ｉ／Ａ比によって定義され得るＦｃγＲＩＩＢに対する結合傾向性が増加したＦｃとの組み合わせ）が新規であると考えている。

この技術的解決策は、本願の開示以前には、引用文献１を含む他の研究によって示唆されていなかった。これまでの研究では、ＦｃγＲＩＩＢに対する結合親和性が増加し、ＦｃγＲＩＩＢに対する結合傾向性が増加したＩｇＧ２ ＣＨ１ヒンジ及びＦｃ変異体がアゴニズムを相乗的に増強できるという技術的解決策を支持したものはなく、これが本願発明の主要な発見である。

アゴニズムを増強するために本願発明で提案される解決策は、ＩｇＧ２ヒンジと、ＦｃγＲＩＩＢに対する結合親和性が増加し、（ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＩＡを含む活性化ＦｃγＲと比較して）ＦｃγＲＩＩＢに対する結合傾向性（Ｉ／Ａ比によって定義される）が増加したＦｃ（すなわち、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン）との組み合わせを必要とする。

本願出願人は、アゴニズムを増強するための抗体をどのように入手するかはまったく予測できないと考えており、引用文献１は何のヒントも与えていないと考える。

（イ）ヒンジ部分の相違について

引用文献１の表１９における変異体２５、２６、１９、１７、及び１５はすべて、ヒンジ領域にＣ２１９Ｓ変異を含んでいる。Ｃ２１９Ｓ変異は、非常に異なる構造特性を導入し、ＦｃγＲ非依存性アゴニズムを駆動することが示されており（Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ．２０１５ Ｊａｎ １２；２７（１）：１３８－４８）、これは、配列のアゴニスト活性がＦｃγＲ結合に依存する本願発明とは大きく異なる（本願の図１６、１９、４及び５）。したがって、ヒンジのＣ２１９Ｓ変異は抗体の構造に影響を与え、ＦｃγＲ関連の抗体の機能に影響を与えるものであると考える。

Ｃ２１９Ｓの構造への影響がＦｃγＲ結合に影響を及ぼすかどうかは明らかではないにもかかわらず、ヒンジはＦｃ受容体に対するヒトＩｇＧの結合親和性を調節することが以前に報告されている。

したがって、本願出願人は、ＩｇＧ－ＦｃγＲ結合に対するＣ２１９Ｓ変異の影響が不明瞭であることを考慮すると、本願発明におけるＪＡＣ３（請求項１ｃ）のＦｃγＲ結合特性は引用文献１のＩｇＧ２．３－Ｖ１９から直接推論することはできないと考える。

引用文献１に記載の発明において、ＩｇＧ２ヒンジ（優先的にＣ２１９Ｓヒンジ変異体）のみが強調され、Ｆｃ（及びそのＦｃγＲ結合親和性）の影響は無視されている。本願発明に記載の配列は、引用文献１における変異体と比較して重要な配列の差異があり、これらの差異の影響が不明確であるため、そのＦｃγＲ結合特性を引用文献１から直接予測することはできないと考える。また、引用文献１または他の従来技術に基づいて、本願発明に記載される配列の優れたアゴニズムを予測することも不可能であると考える。

（ウ）引用文献１には対応する操作されたＩｇＧ１ｍＡｂ、図１３のＦｃγＲ親和性を再現できなかったと記載されていることについて

引用文献１には、引用文献１の１１２ページで「しかしながら、Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ｐ２３８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、Ｈ２６８Ｄ、Ａ３３０Ｒ、Ｇ２３７Ｄ、またはＥ２３３Ｄ変異をＩｇＧ２．３（Ｃ２１９Ｓ変異を持つＩｇＧ２）に導入するすべての変異体は、対応する操作されたＩｇＧ１ｍＡｂ、図１３のＦｃγＲ親和性を再現できなかった」と明確に述べられている（以下参照）。これはＩｇＧ２とＩｇＧ１との間の不適合性、またはＣ２１９Ｓ変異のいずれかが原因である可能性がある。

したがって、さまざまな変異が与えられた、ＩｇＧ２．３－Ｖ１５（Ｐ２３８Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ）及びＩｇＧ２．３－Ｖ１７（Ｐ２３８Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ）（引用文献１）から、本願発明におけるＪＡＣ４（請求項１ｄ）（Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ）のＦｃγＲ結合特性を推測することはできないと考える。