2020-011276

本願は、平成２４年 ８月２３日（パリ条約による優先権主張 ２０１１年 ８月２６日 （ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１１年 ９月 ９日 （ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年 ８月２３日 （ＵＳ）アメリカ合衆国）を国際出願日とする特願２０１４－５２７２９１号の一部を平成２９年 ３月 １日に新たに特許出願されたものであって、主な手続の経緯は、以下のとおりである。

平成３０年１２月１７日付け 拒絶理由通知書

令和 １年 ７月 ８日 意見書、手続補正書

令和 １年 ９月２４日付け 拒絶理由通知書

令和 ２年 ３月３１日 意見書

令和 ２年 ４月 ９日付け 拒絶査定

令和 ２年 ８月１３日 審判請求書

令和 ２年 ９月２４日 審判請求書の手続補正書

原査定の拒絶理由で引用文献１として引用した、本願優先日前に頒布された刊行物である特表２００８－５２３７８６号公報（以下、「引用文献１」という。）には、以下の事項が記載されている（下線は合議体による。）。

ア．「高忠実度合成ポリヌクレオチドのアセンブリ方法」（発明の名称）

イ．「【請求項１】

予め特定された配列を有する長いポリヌクレオチド構造物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）のアセンブル方法であり、下記ステップを含む方法：

（ａ）構造体（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）オリゴヌクレオチドのプールを用意するステップ；

（ｂ）下記（ｉ）、（ｉｉ）、又は（ｉ）及び（ｉｉ）を順番に又は同時に行うステップ：

（ｉ）構造体オリゴヌクレオチドを増幅する；

（ｉｉ）構造体オリゴヌクレオチドをエラー減少プロセスで処理する；並びに

（ｃ）構造体オリゴヌクレオチドのプールをハイブリダイゼーション条件並びに１以上の下記（ｉ）～（ｉｉｉ）条件下に曝し：（ｉ）ライゲーション条件、（ｉｉ）鎖伸長条件、又は（ｉｉｉ）鎖伸長及びライゲーション条件、上記構造体オリゴヌクレオチドよりも長い少なくとも１の二本鎖サブアセンブリ構造物の複数のコピーを形成するステップ；

（ｄ）下記（ｉ）、（ｉｉ）、又は（ｉ）及び（ｉｉ）を順番に又は同時に行うステップ：

（ｉ）上記サブアセンブリ構造物を増幅する；

（ｉｉ）そのサブアセンブリ構造物をエラー減少プロセスにかける；並びに

（ｅ）２以上のサブアセンブリ構造物をハイブリダイゼーション条件及び１以上の下記条件下でインキュベートし：（ｉ）ライゲーション条件、（ｉｉ）鎖伸長条件、又は（ｉｉｉ）鎖伸長及びライゲーション条件、長いポリヌクレオチド構造物の複数のコピーを形成するステップ。

・・・・・・・・・・・・

【請求項４６】

上記プールは複数の二本鎖サブアセンブリ構造物を形成する請求項１に記載の方法。

【請求項４７】

２以上のサブアセンブリ構造物が別反応でアセンブルされる請求項１に記載の方法。

【請求項４８】

２以上のサブアセンブリ構造物が同一の反応でアセンブルされる請求項１に記載の方法。

【請求項４９】

複数のサブアセンブリ構造物がハイブリダイゼーション条件下並びに少なくとも１の下記（ｉ）～（ｉｉｉ）条件下でインキュベートされ：（ｉ）ライゲーション条件、（ｉｉ）鎖伸長条件、（ｉｉｉ）鎖伸長及びライゲーション条件、複数の長いポリヌクレオチド構造物を形成する請求項１に記載の方法。

・・・・・・・・・・・・

【請求項５１】

構造体オリゴヌクレオチドは約２０～約１５０ヌクレオチド長である請求項１に記載の方法。

【請求項５２】

サブアセンブリ構造物は少なくとも約２００～約７５０ヌクレオチド長である請求項１に記載の方法。

【請求項５３】

サブアセンブリ構造物は構造体オリゴヌクレオチドの少なくとも約５倍である請求項１に記載の方法。

・・・・・・・・・・・・

【請求項６２】

オリゴヌクレオチド固体サポート上で合成される請求項１又は３に記載の方法。

・・・・・・・・・・・・

【請求項６８】

オリゴヌクレオチドは、増幅前に固体サポートから切り離される請求項６２に記載の方法。

【請求項６９】

オリゴヌクレオチドは、上記オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分へフランキングし、少なくとも１のサブセットの上記オリゴヌクレオチドに共通する少なくとも１対のプライマーハイブリダイゼーション部位を有する請求項１又は３に記載の方法。

【請求項７０】

全てのオリゴヌクレオチドは、共通する少なくとも１対のプライマーハイブリダイゼーション部位を有する請求項６９に記載の方法。

【請求項７１】

オリゴヌクレオチドは、プライマーハイブリダイゼーション部位の少なくとも一部分及びオリゴヌクレオチド間の切断部位を有する請求項６９に記載の方法。

【請求項７２】

切断部位は制限エンドヌクレアーゼ部位である請求項７１に記載の方法。

【請求項７３】

制限エンドヌクレアーゼはタイプＩＩＳエンドヌクレアーゼである請求項７２に記載の方法。

【請求項７４】

サブアセンブリ構造物は、上記サブアセンブリ構造物の少なくとも一部分へフランキングし、上記サブアセンブリ構造物の少なくとも１のサブセットに共通する少なくとも１対のプライマーハイブリダイゼーション部位を有する請求項１又は４６に記載の方法。

【請求項７５】

サブアセンブリ構造物は、プライマーハイブリダイゼーション部位の少なくとも１及びサブアセンブリ構造物間の切断部位を有する請求項７４に記載の方法。」（【請求項１】～【請求項７５】）

ウ．「【００３６】

用語「構造体オリゴヌクレオチド」は、構造体オリゴヌクレオチド自身より長い核酸分子をアセンブルするために使用される一本鎖オリゴヌクレオチドを言う。例えば、構造体オリゴヌクレオチドは、構造体オリゴヌクレオチドより約３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍以上長い核酸分子をアセンブルするために使用される。一般的に、予め決定された配列を有する一組の異なる構造体オリゴヌクレオチドは、目的の配列を有する、より大きな核酸分子へアセンブリするために使用される。例えば、構造体オリゴヌクレオチドは、約２５～約２００、約５０～約１５０、約５０～約１００、又は約５０～約７５ヌクレオチド長である。構造体オリゴヌクレオチドのアセンブリは種々の方法により実施され、例えば、ＰＡＭ、ＰＣＲアセンブリ、ライゲーション連鎖反応、ライゲーション／融合ＰＣＲ、デュアル非対称ＰＣＲ、オーバーラップ伸長ＰＣＲ、及びそれらの組み合わせが挙げられる。構造体オリゴヌクレオチドは、一本鎖オリゴヌクレオチド又は二本鎖オリゴヌクレオチドである。本発明の例示では、構造体オリゴヌクレオチドは、基質上で並行して合成された合成オリゴヌクレオチドである。・・・・・・・・・・・・」（【００３６】）

エ．「【００４８】

用語「リガーゼ」は、近接したオリゴヌクレオチド中にホスホジエステル結合を形成する機能を有する酵素の一種を言う。これらオリゴヌクレオチドは、同一のオリゴヌクレオチドへアニールされ、又は付着又は相補末端を使用して互いにアニールされる。又別の例では、これらオリゴヌクレオチドは平滑末端化されるが近接した位置にある。１のオリゴヌクレオチドの末端ホスファート及び近接した第２のオリゴヌクレオチドの末端水酸基が、二重らせん内でそれらの相補的配列を横切って一緒にアニールされる場合、即ちライゲーションプロセスがライゲート可能なニック部位で「ニック」をライゲートし、相補的デュプレックスを形成する場合に、特に有効なライゲーションが起きる（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ、Ｍ．及びＧａｉｔ、Ｍ．（１９９６）「化学及び生物学における核酸」オックスフォード大学出版、オックスフォード、ｐｐ．１３２－３３、４８１－２）。近接したオリゴヌクレオチド間の部位は、「ライゲート可能なニック部位」、「ニック部位」、又は「ニック」と称し、それによりホスホジエステル結合は存在せず、又は切断される。」（【００４８】）

オ．「【００８５】

用語「タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼ」は、非パリンドローム認識配列及び認識部位の外側（例えば認識部位から０～約２０ヌクレオチド遠位）で発生する切断部位を有する制限エンドヌクレアーゼを言う。タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼは、１の二本鎖核酸分子中に１のニックを生じるか、平滑又は付着末端のいずれかを生じる１の二本鎖破断を生じる（例えば５’又は３’オーバーハングのいずれか）。タイプＩＩエンドヌクレアーゼの例として、３’オーバーハングを生じる酵素、例えばＢｓｒＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｔＦ５Ｉ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｓＩ、ＭｎｌＩ、ＢｃｉＶＩ、ＨｐｈＩ、ＭｂｏＩＩ、ＥｃｉＩ、ＡｃｕＩ、ＢｐｍＩ、ＭｍｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｃｇＩ、ＢａｅＩ、ＢｆｉＩ、ＴｓｐＤＴＩ、ＴｓｐＧＷＩ、ＴａｑＩＩ、Ｅｃｏ５７Ｉ、Ｅｃｏ５７ＭＩ、ＧｓｕＩ、ＰｐｉＩ及びＰｓｒＩ等；５’オーバーハングを生じる酵素、例えばＢｓｍＡＩ、ＰｌｅＩ、ＦａｕＩ、ＳａｐＩ、ＢｓｐＭＩ、ＳｆａＮＩ、ＨｇａＩ、ＢｖｂＩ、ＦｏｋＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＦＩ、Ｋｓｐ６３２Ｉ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＡａｒＩ等；及び平滑末端を生じる酵素、例えばＭｌｙＩ及びＢｔｒＩが挙げられる。タイプＩＩエンドヌクレアーゼは、市販品を入手可能であり公知である（ニューイングランドＢｉｏｌａｂｓ社、ベバリー、ＭＡ）。認識部位、切断部位及びタイプＩＩエンドヌクレアーゼを使用して消化する条件に関する情報は、例えばｗｗｗアドレスｎｅｂ．ｃｏｍ／ｎｅｂｅｃｏｍｍ／ｅｎｚｙｍｅｆｉｎｄｅｒｓｅａｒｃｈｂｙｔｙｐｅＩＩｓ．ａｓｐに記載されている。

【００８６】

用語「ユニバーサルタグ」は、５’及び／又は３’末端上の多数の核酸配列へフランキングするヌクレオチド配列を言い、例えばユニバーサルタグは更に１以上の核酸配列に共通する。ユニバーサルタグには１以上の下記が含まれる：プライマーハイブリダイゼーション配列、ミスマッチ修復酵素切断部位、制限酵素認識部位、制限酵素切断部位（又は半分部位、例えば、部位の半分はユニバーサルタグ中に含まれ部位の半分は核酸配列中に含まれる）、アプタマー、１以上のウラシル残基、１以上の修飾された核酸残基、又は検出及び／又は固定化を促進する薬剤（例えば、ビオチン、フルオレセイン、検出用マーカー等）。本発明の例示では、ユニバーサルタグは、例えばｍｕｔＨエンドヌクレアーゼ又はｍｕｔＨＬＳ複合体により切断される配列ＧＡＴＣ等のミスマッチ修復酵素切断部位を含有する。例えば、ユニバーサルタグは、ユニバーサルプライマー用結合部位を含有する。

【００８７】

用語「ユニバーサルプライマー」は、多数の核酸配列の鎖伸長／増幅に使用される一組のプライマー（例えば、フォワード及びリバースプライマー）、例えば多数の核酸配列に共通する部位へハイブリダイズするプライマーを言う。例えば、ユニバーサルプライマーは、１のプール中の全ての、又は本質的に全ての核酸の増幅に使用され、プールとして例えば構造体オリゴヌクレオチドのプール、選択オリゴヌクレオチドのプール、サブアセンブリのプール、及び／又はポリヌクレオチド構造物のプール等が挙げられる。例えば、単一のプライマーが、１のプール中の多数の核酸のフォワード及びリバースストランド両方を増幅するために使用されてもよい。例えばユニバーサルプライマーは、増幅後に酵素的又は化学的切断により除去される一時的プライマーでもよい。他の例として、ユニバーサルプライマーは、鎖伸長において核酸分子へ組み込まれる修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含んでいても良い。例示的な修飾として、例えば３’又は５’末端キャップ、又は核酸の検出、固定化又は単離を促進する薬剤（例えば、フルオレセイン又はビオチン等）が挙げられる。」（【００８５】～【００８７】）

カ．「【００９０】

２．高忠実度の長い核酸分子のアセンブリ：

例えば、本発明は高忠実度を有する合成核酸を提供する。合成核酸は、少なくとも約５００塩基；又は少なくとも約１、２、３、４、５、８、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、又は１００キロベース（ｋｂ）；又は少なくとも約１メガベース（ｍｂ）；又はそれ以上である。例えば合成核酸組成物は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上のエラーフリーなコピーを有する（例えば予め決定された配列からの逸脱のない配列を有する。）。エラーフリーコピーの割合は、正しい、例えば予め特定された配列を有することを目的とされた組成物中の核酸のコピー数全てと比較された、その組成物中のエラーフリーコピー数に基づく。例えば合成核酸の組成物は、組成物中に少なくとも約１０フェムトモル、１００フェムトモル、１ナノモル、１０ナノモル、１００ナノモル、１マイクロモル、１０マイクロモル以上の核酸を含む。他の例として、組成物は１以上の大量の核酸、例えば、少なくとも約１ミリグラム、１グラム、１０グラム、１００グラム、１キログラム以上を有する。これら大スケール製剤も有用であり、例えばワクチン、遺伝子治療法構造物、他の市販用途品の製造のために使用できる。例えば、合成核酸は、細胞フリー環境中で構築され、そのためｉｎ ｖｉｖｏで製造される核酸には必ず含まれる１以上の細胞質不純物及び／又は修飾を含まない。例えば、合成核酸は、１以上の下記からフリー又は本質的にフリーである：膜成分（例えば、脂質）、リポ多糖類（ＬＰＳ）、炭水化物、発熱物質、蛋白質（例えばＤＮＡ結合蛋白質、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ等）、又はＤＮＡ結合分子、及び／又はメチル化等の修飾。本発明の例示では、合成核酸の組成物は、核酸製造プロセスの間に組成物へ意図して添加される蛋白質、例えばポリメラーゼ、ミスマッチ結合蛋白質、制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、エキソヌクレアーゼ、及び／若しくは抗体等以外の蛋白質を含まない。又別の例では、合成核酸の組成物は、核酸製造プロセスの間に組成物へ意図して添加される小分子、例えばｄＮＴＰ、ビオチン、及び／又化学的架橋薬剤等以外の小分子を含まない。本発明の例示では、合成核酸は、２以上の構造体オリゴヌクレオチド及び／又はサブアセンブリからアセンブルされたポリヌクレオチド構造物である。

【００９１】

又、本発明、ポリヌクレオチド構造物の複合アセンブリ方法、例えば異なる予め決定された配列を有する２以上のポリヌクレオチド構造物のアセンブリを提供する。図２に、本発明の複合アセンブリ方法の一例を示す。予め決定された配列を有する２以上のポリヌクレオチド構造物を製造するために、一組の構造体オリゴヌクレオチドが、それぞれのポリヌクレオチド構造物の完全配列を一緒にカバーするように設計された。構造体オリゴヌクレオチドは、オーバーラップする相補的領域を有するように設計され、その領域は相補的領域間のハイブリダイゼーションを可能として、ハイブリダイゼーション条件下で一緒に混合された場合に構造体オリゴヌクレオチドの正確に配列された鎖を生じる（例えば図２Ｃ中のａｂｃ、ｄｅｆ、及びｇｈｉ）。アセンブリ混合物は次に、ライゲーション又は重合及びライゲーションされてサブアセンブリ又はポリヌクレオチド構造物を形成する（図２Ｄ）。例えば、構造体オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチド構造物の完全長さをカバーするために、一緒に混合された場合にはオリゴは単純に一緒にライゲートされてサブアセンブリ／ポリヌクレオチド構造物を形成する（例えば、図３Ａ）。あるいは、構造体オリゴヌクレオチドは完全にオーバーラップせず、その代わりオリゴヌクレオチドセグメントのライゲーション前にポリメラーゼにより補完された一本鎖領域のギャップを残し、サブアセンブリ／ポリヌクレオチド構造物となる（図３Ｃ）。又、オーバーラップするフラグメントは連続的に、複数の一連の変性／ハイブリダイゼーション及び鎖伸長を通して、完全長産物が形成されるまで伸長される（参照、例えば、図３Ｂ）。例えば、種々の構造体オリゴヌクレオチドのサブアセンブリは、更にアセンブルされてより一層長いポリヌクレオチド構造物となる。例えば、二本鎖サブアセンブリは融解され、リアニールされて、２以上のサブアセンブリの相補的領域間のハイブリダイゼーションが可能となる。サブアセンブリは、次にライゲーション又は鎖伸長され、更に次にライゲーションされて一組のサブアセンブリからなるポリヌクレオチド構造物を形成する。又、サブアセンブリは、目的の配列で種々のサブアセンブリの結合を可能とする配列特異的付着末端を含んでもよい（例えば、３’又は５’オーバーハング）。付着末端は構造体オリゴヌクレオチドの設計（例えば、５’及び／又は３’最末端構造体オリゴヌクレオチドは、一本鎖オーバーハングを有するように設計できる）により形成されてもよく、サブアセンブリが１以上の制限エンドヌクレアーゼで消化され付着末端を形成することもできる。付着末端を通したサブアセンブリの結合後に、ポリヌクレオチド構造物は、ライゲーション及び／又は鎖伸長により形成できる。一組のサブアセンブリから形成されるポリヌクレオチド構造物は、任意で更に一連のアセンブリが行われ、より一層長いポリヌクレオチド構造物が製造される（参照、例えば、図４）。

【００９２】

同様に、本発明は、ユニバーサルプライマーを使用する１以上のステップで核酸を増幅することを含むポリヌクレオチド構造物のアセンブル方法を提供する。例えば図５に示されるように、構造体オリゴヌクレオチド（例えば、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆ）は、ユニバーサルプライマーのための結合部位（例えば、白及び黒の四角で表される）を囲むように設計されてもよい。基質からの構造体オリゴヌクレオチドの除去の前後で、完全プールはただ一組のユニバーサルプライマーを使用して増幅される。本発明の例示では、ユニバーサルプライマーは、増幅後に酵素的又は化学的切断により除去される。増幅された構造体オリゴヌクレオチドのプールは、次に融解され、アニールされ、ライゲーション及び／又は鎖伸長されてサブアセンブリを形成する（例えば図５中のａｂｃ又はｄｅｆ）。例えばサブアセンブリ自体が、第２のユニバーサルプライマーセット（図示せず）を使用して増幅されてもよい。例えば５’及び３’最末端構造体オリゴヌクレオチド（例えばそれぞれ図５中のａ及びｄ及びｃ及びｆ）は、第２のユニバーサルプライマーセット結合部位を囲むように設計されてもよい（参照図６）。第２のユニバーサルプライマーセットのサブアセンブリプールへの添加において、複数のサブアセンブリが増幅される。本発明の例示では、第２のユニバーサルプライマーセットは、次に化学的又は酵素的切断により除去される。サブアセンブリは、次に、相補鎖のハイブリダイゼーション又は付着末端による結合（上記記載の通り）それに続くライゲーション及び／又は鎖伸長によりアセンブルされて更により長いポリヌクレオチド構造物となる。このプロセスは、複数回、例えばユニバーサルプライマーを使用した増幅（例えば、第３のセット、第４のセット、第５のセット等を使用して）、プライマーの切断、及びアセンブリを、目的のポリヌクレオチド構造物が形成されるまで連続的に繰り返してもよい。例えば複数のアセンブリは、混合物中で単一の反応を実施してもよい。しかし、例えば非常に大きな数のポリヌクレオチド構造物をアセンブルする場合、一組の高度に相同なポリヌクレオチド構造物をアセンブルする場合、又は１以上の領域の内部の相同性を含むポリヌクレオチド構造物をアセンブルする場合、階層化されたアセンブリ方法を使用することが望ましい。様々な階層化されたアセンブリ方法を下記に記載する。」（【００９０】～【００９２】）

キ．「【００９４】

３．オリゴヌクレオチド設計及び合成：

・・・・・・・・・・・・

【００９５】

例えば、構造体オリゴヌクレオチドは、目的のポリヌクレオチド構造物のセンス及びアンチセンスストランドの本質的に完全な相補物を提供するように設計される。例えば、構造体オリゴヌクレオチドは、完全なポリヌクレオチド構造物を形成するためには、単に一緒にハイブリダイズされ、ライゲーションされるだけでよい。他の例として、構造体オリゴヌクレオチドの相補物は、完全配列をカバーするが、ライゲーション前の鎖伸長により埋め込まれる一本鎖ギャップを保存するように設計される。この場合、それがより少ない及び／又はより短い構造体オリゴヌクレオチド及び／又は選択オリゴヌクレオチドの合成を必要とするために、ポリヌクレオチド構造物の製造が促進される。

【００９６】

例えば、構造体及び／又は選択オリゴヌクレオチドは、ユニバーサルタグを含む。ユニバーサルタグは、５’末端若しくは３’末端のいずれか又は両方上の構造体オリゴヌクレオチドにフランキングし、かつプール中の少なくとも一部分の構造体及び／又は選択オリゴヌクレオチドと共通する配列である。例示的なユニバーサルタグは例えば１以上の下記を含む：ユニバーサルプライマー結合部位、ミスマッチ修復酵素切断部位、オリゴヌクレオチドの検出／単離／固定化を促進する薬剤、及び接合部ユニバーサルタグ及び構造体オリゴヌクレオチド間の制限エンドヌクレアーゼ切断部位。

【００９７】

本発明の例示では、構造体及び／又は選択オリゴヌクレオチドは、１セットの又は数セットのプライマーを使用する核酸のプールの増殖に使用されるユニバーサルプライマーのための１以上のセットの結合部位を含む。ユニバーサルプライマー結合部位の配列は、有効なプライマーハイブリダイゼーション及び鎖伸長を効率的に行うことを可能とする適切な長さ及び配列を有するように選択される。更に、ユニバーサルプライマー結合部位の配列は、核酸プール中の目的とされない領域への非特異的結合を最小化するために最適化される。ユニバーサルプライマー及びユニバーサルプライマーへの結合部位の設計は、例えば商品名ＤＮＡワークス（ｓｕｐｒａ）、商品名ジーン２オリゴ（ｓｕｐｒａ）、又は更に下記記載の実施システム及び方法等のコンピュータプログラムを使用して容易化される。例えば、ポリヌクレオチド構造体の異なる段階での核酸の増幅を可能とする、幾つかのユニバーサルプライマー／プライマー結合部位セットを設計することが望ましい（図６）。例えば、一組のユニバーサルプライマーが、一組の構造体及び／又は選択オリゴヌクレオチドを増幅するために使用される。一組の構造体オリゴヌクレオチドをサブアセンブリへアセンブリした後、サブアセンブリは同一又は異なるセットのユニバーサルプライマーを使用して増幅されてもよい。例えば、サブアセンブリへ組み込まれた３’及び５’最末端構造体オリゴヌクレオチド（一本鎖に関して）は、２以上の入れ子状態のユニバーサルプライマー結合部位セット、構造体オリゴの最初の増幅に使用される最も外側のセット、及びサブアセンブリの増幅に使用される第２のセットを含む。アセンブリのそれぞれの段階での増幅用のユニバーサルプライマー（例えば、構造体及び／又は選択オリゴヌクレオチド、サブアセンブリ、及び／又はポリヌクレオチド構造物）の複数のセットを、組み込むこともできる。

【００９８】

例えば、化学的又は酵素的切断により核酸分子から除去されるプライマー等のユニバーサルプライマーは、一時的プライマーとして設計されてもよい。核酸の化学的、熱的、光による、又は酵素的な切断方法は、下記に詳細に記載される。本発明の例示では、ユニバーサルプライマーは、タイプＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼ又はＤＮＡグリコシラーゼを使用して除去される。」（【００９４】～【００９８】）

ク．「【０１２２】

４．核酸の増幅：

様々な態様において、本発明の方法は、構造体オリゴヌクレオチド、選択オリゴヌクレオチド、サブアセンブリ及び／又はポリヌクレオチド構造物等の核酸の増幅ステップを含む。増幅は、アセンブリ法中１以上の段階で実施されても、及び／又はアセンブリ中の所定の段階で１回以上実施されてもよい。増幅方法は、核酸と、ハイブリダイゼーション及び鎖伸長を促進する条件下で核酸と特異的にハイブリダイズする１以上のプライマーとを接触させるステップを含む。例示的な核酸増幅方法として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）・・・・・・・・・・・・又は当業者に公知である技術を使用した他の核酸増幅方法が挙げられる。例えば本発明の方法はＰＣＲ増幅法を使用する。

【０１２３】

例えば核酸配列に特異的なプライマーセットが、単離される特定の核酸配列を増幅するため、又は核酸配列のプールの一部である特定の核酸配列を増幅するために使用される。

又別の例では、複数のプライマーセットが単一の反応混合物中に一緒に任意でプールされてもよい多数の特定の核酸配列を増幅するために使用される。本発明の例示では、一組のユニバーサルプライマーは、１のプール中にあるか又は複数のプールへ分離されている多数の核酸配列を増幅するために使用できる（図５）。アセンブリ中の異なる段階で核酸を増幅する場合、増幅を目的とするそれぞれの段階用に異なるセットのユニバーサルプライマーを使用することが望ましい（図６）。例えば第１のセットのユニバーサルプライマーは構造体及び／又は選択オリゴヌクレオチドを増幅するために使用され、第２のユニバーサルプライマーセットは、サブアセンブリ又はポリヌクレオチド構造物を増幅するために使用される（図６）。上記記載の通り、構造体オリゴヌクレオチド及び／又は選択オリゴヌクレオチドは、１以上のユニバーサルプライマーセット用のプライマー結合部位を有するように設計されてもよい。あるいは、プライマー結合部位は、合成後に、目標核酸に相補的な領域及び非相補的領域を含むキメラ性プライマーを使用して、増幅プロセス中に組み込まれて、核酸に追加されてもよい（参照：例えば国際公開ＷＯ９９／５８７２１）。

【０１２４】

例えば、プライマー／プライマー結合部位は、一時的な、例えばプライマー／プライマー結合部位の除去をアセンブリ中の目的の段階で可能とするものとして設計される。一時的プライマーは、化学薬品、熱的、光ベースの、又は酵素的切断により除去可能なように設計される。・・・・・・・・・・・・

【０１２６】

他の例として、一時的プライマー／プライマー結合部位は酵素的切断を使用して除去される。例えば、プライマー／プライマー結合部位は制限エンドヌクレアーゼ切断部位を有するように設計される。増幅後、核酸のプールは１以上のエンドヌクレアーゼと接触して二本鎖破断を生じ、プライマー／プライマー結合部位が除去される。例えばフォワード及びリバースプライマーは、同一又は異なる制限エンドヌクレアーゼにより除去される。いずれの種類の制限エンドヌクレアーゼも核酸配列からプライマー／プライマー結合部位を除去するために使用できる。特異的結合及び／又は切断部位を有する様々な種類の制限エンドヌクレアーゼが市販品として、例えばニューイングランドバイオラボ社（ベバリー、ＭＡ）から入手できる。様々な態様において、３’オーバーハング、５’オーバーハング又は平滑末端を生成する制限エンドヌクレアーゼが使用される。オーバーハングを生じる制限エンドヌクレアーゼを使用する場合、エキソヌクレアーゼ（例えばＲｅｃＪｆ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＴ、Ｓ１ヌクレアーゼ、Ｐ１ヌクレアーゼ、大豆ヌクレアーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＣＥＬＩヌクレアーゼ等）が平滑末端を生成するために使用される。あるいは、特異的制限エンドヌクレアーゼにより形成された付着末端が、目的の配置中のサブアセンブリのアセンブリを促進するために使用される（参照、例えば、図４Ａ）。本発明の例示では、タイプＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼ用の結合及び／又は切断部位を含有するプライマー／プライマー結合部位が、一時的プライマーを除去するために使用される。」（【０１２２】～【０１２６】）

ケ．「【０１３１】

５．アセンブリ方法：

様々な態様において、本発明の方法は、短オリゴヌクレオチドから長いポリヌクレオチド構造物へのアセンブル方法を使用し、例えば、ＰＣＲ型アセンブリ方法（ＰＡＭ又はポリメラーゼアセンブリ複合化を含む）及びライゲーション型アセンブリ方法（例えば、相補的又は平滑末端を有する核酸セグメントの結合）が挙げられる。本発明の例示では、複数のポリヌクレオチド構造物は、単一の反応混合物中でアセンブルされる。他の例として、例えば大きな数のポリヌクレオチド構造物、内部相同性領域を有するポリヌクレオチド構造物を合成する際、又は高度に相同であるか、相同性領域を含む２以上のポリヌクレオチド構造物を合成する際には、階層化型アセンブリ方法も使用できる。本発明の核酸プールを含む組成物及び方法では、サポートへ結合された及び結合されていない核酸両方、並びにそれらの組み合わせを含むものである。

【０１３２】

例えば、ポリヌクレオチド構造物は、形成を目的とするポリヌクレオチド構造物の配列を部分的に又は完全に有する相補的にオーバーラップする領域を有する複数の短オリゴヌクレオチドと共に混合することによりアセンブルされる。例えば図３Ｂ及び３Ｃに図示されるように、短オリゴヌクレオチドは部分的に二本鎖になった核酸を形成し、鎖伸長又は鎖伸長及びライゲーションの組み合わせを使用して短オリゴヌクレオチド間に残されたギャップを埋め込み、アセンブルされてポリヌクレオチド構造物となる。あるいは図３Ａに図示されたように、短オリゴヌクレオチドは、それらはアセンブリにおいて、産物を形成するために短オリゴヌクレオチド間のライゲーションのみを必要として（例えば、ギャップは、アセンブリプロセス中に短オリゴヌクレオチド間に埋め込まれる必要がない）互いに接触してポリヌクレオチド構造物を形成するように設計される。例えば図３Ａに図示されるように、ポリヌクレオチド構造物の形成は、より効率的にエラー減少を行うことにより、特異性を制御し、忠実度を増加することを助ける。

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【０１４２】

本発明の別の例では、階層化されたアセンブリが制限エンドヌクレアーゼを使用して実施され、目的の順序で一緒に結合される相補末端を形成する。構造体オリゴヌクレオチドは、特定の順序での結合を促進する部位に、１以上の制限エンドヌクレアーゼが認識及び切断部位を有するように設計され合成される。ＤＮＡデュプレックス形成後、オリゴヌクレオチドのプールは１以上の制限エンドヌクレアーゼと接触し、相補末端を形成する。プールは次にハイブリダイゼーション条件及びライゲーション条件へ曝されて、デュプレックスを一緒に結合する。結合の順番は、相補的相補末端のハイブリダイゼーションにより決定される。制限エンドヌクレアーゼは、一度に１のみのサブセットの相補末端が形成するように時差を設けて添加される。次にこれら末端は互いに結合され、続いて別の一連のエンドヌクレアーゼ消化、ハイブリダイゼーション、ライゲーションが次々と続く。本発明の例示では、タイプＩＩＳエンドヌクレアーゼ認識部位が構造体オリゴヌクレオチドの末端へ組み込まれ、タイプＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼによる切断を可能とする。」（【０１３１】～【０１４２】）

コ．「【０１６９】

７．エラー減少：

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【０１９３】

長いＤＮＡ分子中のエラーを減少させる簡単な方法は、ＤＮＡ主鎖の両ストランドを、短い一本鎖オーバーハングを切断部位に生成する部位特異的エンドヌクレアーゼ等により、複数の部位で切断することである。得られるセグメントでは、ミスマッチをいくらか含むことが予測される。これらは、ミスマッチ結合蛋白質の作用及びその次のミスマッチ結合蛋白質の除去により、図２０に記載されたように除去できる。セグメントの残存プールは、完全長配列へ再ライゲートできる。図２６の手法に関して、この手法は下記幾つかの利点を有する：１）完全完全長ＤＮＡデュプレックスの除去は、エラーを除去するために必要ではない；２）ＤＮＡデュプレックスの全体的解離及び再アニールは、必要ではない；３）エラー遊離ＤＮＡ分子がどの成分もエラー遊離ＤＮＡ分子ではない出発プールから構築できる。

【０１９４】

制限エンドヌクレアーゼの最も共通するタイプがこの手法に使用される場合、全てのＤＮＡ切断部位は同一のオーバーハングを生じる。従って、セグメントは、ランダムな順序で結合及びライゲートする。しかし部位特異的「外側カッター」エンドヌクレアーゼ（ＨｇａＩ、ＦｏｋＩ、又はＢｓｐＭＩ等）の使用は、（非オーバーラップする）ＤＮＡ認識部位へ近接した切断部位を生じる。従って、それぞれのオーバーハングは他の部位のそれから識別できるＤＮＡ部分に特異的な配列を有する。これら特異的に相補的な相補末端の再結合は、次にセグメントを適切な順序で組み合わせる。生成した相補末端は、５個までの塩基長となり、４５＝１０２４種までの異なる組み合わせを可能とする。たぶん、この多くの識別性のある制限部位が、相補末端間でのニアマッチを避ける必要性からこの数字は少なくなるにしても使用できる。」（【０１６９】～【０１９４】）

サ．「

［図：0001386529000001.jpg］

」（図２）

シ．「

［図：0001386529000002.jpg］

」（図３）

ス．「

［図：0001386529000003.jpg］

」（図４）

セ．「

［図：0001386529000004.jpg］

」（図５）

ソ．「

［図：0001386529000005.jpg］

」（図６）