2018-009351

特願２０１５－５３８４３３「直接核酸増幅キット、試薬及び方法」拒絶査定不服審判事件〔平成２６年　５月　１日国際公開、ＷＯ２０１４／０６４１６９、平成２７年１１月２６日国内公表、特表２０１５－５３３５０７〕について、次のとおり審決する。

【結　論】 本件審判の請求は、成り立たない。

【理　由】 第１　手続の経緯、本願発明 本願は、平成２５年１０月２３日（優先権主張　平成２４年１０月２４日　英国、平成２５年３月１３日、米国）を国際出願日とする出願であり、平成２９年９月１１日付けの拒絶理由通知に対して、同年１２月８日に意見書及び手続補正書が提出され、平成３０年２月１４日付けで拒絶査定がなされ、同年７月６日に拒絶査定不服の審判請求がなされたものである。 そして、本願の請求項１～１０に係る発明は、平成２９年１２月８日付け手続補正書により補正された特許請求の範囲の請求項１～１０に記載された事項により特定されるとおりのものであり、そのうち請求項１に係る発明（以下、「本願発明」という。）は、請求項１に記載される以下のとおりのものである。 「【請求項１】 核酸増幅方法であって、 ｉ）核酸を含有する溶液を、封鎖剤、ポリメラーゼ及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む凍結乾燥試薬組成物とともにインキュベートする工程と、 ｉｉ）核酸を増幅する工程と を含んでおり、核酸が固相支持体に固定化され、溶解試薬が固体支持体に組み込まれている、方法。」 第２　原査定の理由 平成３０年２月１４日付け拒絶査定は、この出願の請求項１～５に係る発明は、その優先日前に日本国内又は外国において頒布された下記１、４の刊行物に記載された発明に基いて、その出願前にその発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない、というものである。 １．特表２０１２－５１１３１７号公報 ４．特表２０１１－５２６７８８号公報 第３　当審の判断 １．引用例、引用発明 （１）引用例１ 本願の優先日前に頒布された刊行物である特表２０１２－５１１３１７号公報（以下「引用例１」）には、以下の事項が記載されている。 （１－ア） 「【請求項１】 サンプル中の標的核酸の増幅反応の収量、感度および／または特異性を改善する方法であって、少なくとも１種のシクロデキストリンを含んでなる反応混合物中で増幅反応を行う、方法。 【請求項２】 サンプル中の標的核酸の増幅反応の収量、感度および／または特異性を改善するための請求項１に記載の方法であって、次の工程： ａ）標的核酸を含有する、または標的核酸を含有することが疑われるサンプルを、少なくとも１種のシクロデキストリンを含有する増幅反応混合物と接触させる工程； ｂ）工程ａ）で得られた反応混合物に対して増幅反応を行う工程 を含んでなる、方法。 【請求項３】 サンプル中の標的核酸の増幅反応の収量、感度および／または特異性を改善するための請求項１に記載の方法であって、次の工程： ａ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、反応バッファー、ｄＮＴＰおよびプライマーから選択される少なくとも１つの要素をシクロデキストリンと接触させる工程； ｂ）標的核酸を含有する、または標的核酸を含有することが疑われるサンプルを、工程ａ）からの少なくとも１つの要素を含有する増幅反応混合物と接触させる工程； ｃ）工程ｂ）で得られた反応混合物に対して増幅反応を行う工程 を含んでなる、方法。」（特許請求の範囲） （１－イ） 「【００４８】 標的ヌクレオチド配列を含有する、または含有することが疑われる核酸は標識するか、またはビーズもしくは固相表面などの固相支持体と結合させることができる。オリゴヌクレオチドプライマーもまた標識するか、またはビーズを含む種々の支持体と結合させることができる。」 （１－ウ） 「【０１０３】 本発明はさらに、シクロデキストリンと核酸増幅のための少なくとも１つの試薬を含有する組成物に関する。本発明の組成物は、サンプルの添加時に反応を行う準備ができている増幅反応混合物であり得る。あるいは、本発明による組成物は濃縮保存溶液または酵素を含んでなる場合には濃縮貯蔵溶液の形態であり得る。 【０１０４】 本発明は、シクロデキストリンと、ＤＮＡポリメラーゼ、in vitro ＤＮＡ合成のための反応バッファー、ｄＮＴＰおよびプライマーからなる群から選択される少なくとも１つの成分を含んでなる、ＤＮＡポリメラーゼにより触媒されるin vitro ＤＮＡ合成のための組成物を提供する。 【０１０５】 本発明はまた、シクロデキストリンと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、核酸増幅のための反応バッファー、ｄＮＴＰおよびオリゴヌクレオチドプライマーからなる群から選択される少なくとも１つの成分を含んでなる、サンプル中の標的核酸を増幅するための組成物を包含する。 【０１０６】 好ましい態様では、本発明による組成物はシクロデキストリンと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含んでなる。 【０１０７】 好ましくは、本発明による組成物はシクロデキストリン、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよび貯蔵バッファーを含んでなる。貯蔵バッファーは４℃または－２０℃で耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを貯蔵するのに適合されている。 【０１０８】 一般的なこととして、核酸増幅の収量、感度および／または特異性を改善するためには、十分な濃度でシクロデキストリンを提供するのが好ましい。本発明はまた、シクロデキストリンと少なくとも１つのｄＮＴＰを含んでなる組成物に関する。好ましくは、組成物は、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰの平衡混合物を含んでなる。組成物は例えば、ｄＮＴＰの平衡プレミックスとシクロデキストリンを含んでなる濃縮保存溶液である。あるいは、組成物はｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰおよびシクロデキストリンを含んでいてもよい。 【０１０９】 さらに、本発明は、シクロデキストリンと核酸増幅のための反応バッファーを含んでなる組成物に関する。 【０１１０】 もう１つの態様では、組成物は、シクロデキストリンと少なくとも１つのプライマーを含んでなる。好ましくは、組成物は、シクロデキストリンと、反対側の鎖の、標的核酸の５’および３’末端とハイブリダイズする少なくとも２つのプライマーを含んでなる。 【０１１１】 好ましい態様では、組成物は、シクロデキストリン、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび核酸増幅のための反応バッファーを含んでなる。 【０１１２】 組成物はさらに、標的核酸を含有する、または標的核酸を含有することが疑われるサンプルをさらに含んでいてもよい。 【０１１３】 組成物では、より具体的には、サンプル、そして増幅反応混合物からなる最終反応混合物では、シクロデキストリンの濃度は好ましくは０．１～５０ｍＭの間、より好ましくは０．５～５０ｍＭの間である。好ましくは、０．１、０．５、１、２、４、５ｍＭ～１０、１５、２０、２５、３０、４０および５０ｍＭの間である。 【０１１４】 組成物では、より具体的には、サンプルと増幅反応混合物を含んでなる最終反応混合物では、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの量は好ましくは０．０１、０．０２、０．０３、０．０４単位／μｌ～０．０５、０．０７５、０．１および０．２単位／μｌの間である。 【０１１５】 もう１つの態様では、組成物は、サンプル中の標的核酸配列を増幅するキットの一部である。 【０１１６】 本発明のもう１つの対象は、同じまたは別の容器に、シクロデキストリンと、ＤＮＡポリメラーゼ、in vitro ＤＮＡ合成のための反応バッファー、ｄＮＴＰおよびプライマーからなる群から選択される少なくとも１つの成分を含んでなるキットである。好ましくは、キットは核酸の増幅のためのものである。 【０１１７】 好ましい態様では、本発明は、同じまたは別の容器に、シクロデキストリンと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、核酸増幅のための反応バッファー、ｄＮＴＰおよびオリゴヌクレオチドプライマーからなる群から選択される少なくとも１つの成分を含んでなるキットに関する。 【０１１８】 もう１つの好ましい態様では、本発明は、同じ容器に少なくともシクロデキストリンと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、核酸増幅のための反応バッファー、ｄＮＴＰおよびオリゴヌクレオチドプライマーからなる群から選択される少なくとも１つの成分とを含んでなる、サンプル中の標的核酸を増幅するためのキットを対象とする。 【０１１９】 本発明のキットでは、種々の試薬が別の容器で、またはいくつかの成分を含んでなるプレミックスとして提供される。これらの成分は、核酸増幅前に混合および希釈しなければならない濃縮保存溶液として提供してもよい。これらの成分はまた、水または適当なバッファー中に再懸濁させることを意図して、脱水、凍結乾燥または他のいずれかの固体形態で提供してもよい。」 （２）引用例２ 本願の優先日前に頒布された刊行物である特表２０１１－５２６７８８号公報（以下「引用例２」）には、以下の事項が記載されている。 （２－ア） 「【請求項１】 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う方法であって、該方法は： デオキシリボ核酸を含む粗製サンプルを提供する工程； 該粗製サンプルをＮａＯＨと必要に応じてインキュベートする工程； 該粗製サンプルを直接緩衝剤と混合して、核酸を含む溶液を形成する工程；および 該核酸を含む溶液に対してＰＣＲを行う工程を含み、該直接緩衝剤は、少なくとも０．２％～０．９％のポリソルベート、３％～８％のグリセロール、および１０００～３０００μｇ／ｍｌのＢＳＡ を含む、方法。」（特許請求の範囲） （２－イ） 「【実施例】 【００４８】 最初の実施例において、血液をＦＴＡ紙（Ｗｈａｔｍａｎ）にアプライし、そして空気乾燥した。０．５ｍｍのディスクパンチをＦＴＡ紙から作成し、そして市販で入手可能なＩｄｅｎｔｉｆｉｌｅｒ（登録商標） Ｈｕｍａｎ Ｉｄｅｎｔｉｔｙ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）由来のＰＣＲプライマーを含む直接緩衝剤中に置いた。次いでＰＣＲを行った。」 （３）引用発明 上記（１）より、引用例１には次の発明（以下、「引用発明」という。）が記載されていると認められる。 「サンプル中の標的核酸の増幅反応方法であって、 シクロデキストリン、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび核酸増幅のための反応バッファーを含む増幅反応成分のプレミックスであって、凍結乾燥した固体形態であるプレミックスを懸濁した反応混合物中で、固相支持体と結合させた標的核酸の増幅反応を行う、方法。」 ２．対比 本願発明と引用発明を対比する。 引用発明の「シクロデキストリン」は本願発明の「封鎖剤」に該当するから、引用発明の「シクロデキストリン、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび核酸増幅のための反応バッファーを含む増幅反応成分のプレミックスであって、凍結乾燥した固体形態であるプレミックス」は本願発明の「封鎖剤、ポリメラーゼ及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む凍結乾燥試薬組成物」に相当し、引用発明の「固相支持体と結合させた標的核酸」は、本願発明の「核酸が固相支持体に固定化され、溶解試薬が固体支持体に組み込まれている」と、「核酸が固相支持体に固定化され」たものである点で一致する。また、引用発明の「サンプル中の標的核酸の増幅反応方法」は、本願発明の「ｉ）核酸・・・を、・・・組成物とともにインキュベートする工程と、ｉｉ）核酸を増幅する工程とを含」む「核酸増幅方法」に相当すると認められる。 したがって、両者は、 「核酸増幅方法であって、 ｉ）核酸を、封鎖剤、ポリメラーゼ及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む凍結乾燥試薬組成物とともにインキュベートする工程と、 ｉｉ）核酸を増幅する工程と を含んでおり、核酸が固相支持体に固定化された、方法。」である点で一致し、以下の点で相違すると認められる。 （相違点１） 固体支持体について、本願発明では「溶解試薬が固体支持体に組み込まれている」ことが特定されているのに対して、引用発明では特定されていない点。 （相違点２） 本願発明では「核酸を含有する溶液を、封鎖剤、ポリメラーゼ及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む凍結乾燥試薬組成物とともにインキュベートする」と特定されており、まず核酸を反応液に添加し、次いで凍結乾燥試薬組成物を添加してインキュベートすることが特定されているのに対して、引用発明では「シクロデキストリン、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび核酸増幅のための反応バッファーを含む増幅反応成分のプレミックスであって、凍結乾燥した固体形態であるプレミックスを懸濁した反応混合物中で、固相支持体と結合させた標的核酸の増幅反応を行う」ものであり、まず増幅反応成分の凍結乾燥した固体形態のプレミックスを反応液に添加し、次いで固相支持体と結合させた標的核酸を添加して増幅反応を行う点。 ３．判断 （相違点１）について 引用例２には、血液をＦＴＡ紙にアプライし、乾燥し、ＦＴＡ紙をパンチしてディスクを作成したあと、ディスクを緩衝液中に入れてＰＣＲを行ったことが記載されており、ＦＴＡ紙を用いることで血液などの核酸を含む試料からＰＣＲに用いる核酸試料を調製することは、周知技術であると認められ（必要であれば、特表２００３－５１９４８２号公報【０００１】【０００２】も参照。）、ＦＴＡ紙には細胞を溶解するための試薬が担持されていると認められる。 したがって、引用発明の「固相支持体と結合させた標的核酸」として、引用例２に記載されるような周知のＦＴＡ紙を用いて調製した核酸試料を採用することは当業者が容易になし得ることであり、その場合、固体支持体は「溶解試薬が固体支持体に組み込まれている」ものとなると認められる。 よって、相違点１は当業者が容易になし得ることである。 （相違点２）について 核酸増幅反応が核酸と増幅反応成分とを含む反応液中で行われることは技術常識であり、その際に核酸や増幅反応成分の反応液への添加順序が増幅反応の成否に影響するとは考えられないから、引用発明において「固相支持体と結合させた標的核酸（以下「標的核酸」と省略する。）」と「凍結乾燥した固体形態であるプレミックス（以下「プレミックス」と省略する。）」とを用いて標的核酸の増幅反応を行う際に、反応液への「標的核酸」と「プレミックス」の添加順序を検討することは当業者が容易に行うことである。例えば、まず「プレミックス」を反応液に添加し、次いで「標的核酸」を添加して増幅反応を行うことに代えて、まず「標的核酸」を反応液に添加し、次いで「プレミックス」を添加して増幅反応を行うこと、すなわち、「核酸を含有する溶液を、封鎖剤、ポリメラーゼ及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む凍結乾燥試薬組成物とともにインキュベートする」ことは、当業者が容易になし得ることである。 したがって、相違点２は当業者が容易になし得ることである。 そして、本願発明において引用例１、４の記載から予測できない効果が奏されたとは認められない。 よって、本願発明は引用例１、４に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものである。 ４．審判請求人の主張について 審判請求人は審判請求書において、以下の事項を主張している。 「引用文献１の段落０１１９には、「本発明のキットでは、種々の試薬が別の容器で、またはいくつかの成分を含んでなるプレミックスとして提供される。これらの成分は、核酸増幅前に混合および希釈しなければならない濃縮保存溶液として提供してもよい。これらの成分はまた、水または適当なバッファー中に再懸濁させることを意図して、脱水、凍結乾燥または他のいずれかの固体形態で提供してもよい。」と記載されている（下線追加）。しかしながら、当該記載は、単に願望的形態を可能性として示唆しているだけである。現実に、「該出願中に、そのような凍結乾燥された、プレミックスされたキットの例、又は実際にそのようなキットを調製することのできた方法の例はない。」（本願段落０００７）。すなわち、引用文献１には、「凍結乾燥」と表記されている箇所があるものの、単に「凍結乾燥」の可能性があることからそのように述べたものと解される。」 しかし、本願優先日前において、生化学試薬など各種の試薬を凍結乾燥して保存性を高めようとすることは周知であること（必要であれば、蛋白質　核酸　酵素，１９９６年，Ｖｏｌ．４１，Ｎｏ．６，ｐ８１０－８１６の「はじめに」の項を参照。）や、安定化された核酸増幅用組成物の製造のために凍結乾燥が広く行われていたこと（必要であれば、特表平１０－５０３３８３号公報、特表２００８－５０４０４６号公報、特表２０１１－５２６４９２号公報、特表２０１１－５２２５３３号公報を参照。）などに照らすと、引用例１（引用文献１）には、凍結乾燥した固体形態であるプレミックスを用いる増幅反応方法の発明が実質的に記載されていると認められる。 したがって、審判請求人の主張は採用することができない。 第４　むすび 以上のとおり、この出願の請求項１に係る発明は特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであり、他の請求項に係る発明について言及するまでもなく、本願は拒絶すべきものである。 よって、結論のとおり審決する。