2016-001704

特願２０１１－１３４８４８「細胞の製造方法」拒絶査定不服審判事件〔平成２４年　２月１６日出願公開、特開２０１２－　２９６８４〕について、次のとおり審決する。

【結　論】 本件審判の請求は、成り立たない。

【理　由】 第１　手続の経緯 本願は、平成２３年６月１７日（国内優先権主張　平成２２年６月３０日）を出願日とする出願であって、平成２７年１０月２８日付けで拒絶査定され、平成２８年２月４日に拒絶査定不服審判の請求がなされたものである。 第２　本願発明の認定 この出願の請求項１～２１に係る発明は、平成２７年６月２３日付け手続補正書の特許請求の範囲の請求項１～２１に記載された事項により特定されるとおりのものと認められ、その請求項１に係る発明（以下、「本願発明」という。）は、次のとおりである。 【請求項１】 ヒト皮膚から採取された細胞を含む組織を、タンパク質分解酵素を含む酵素溶液中に浸漬する酵素溶液浸漬工程： 前記酵素溶液浸漬工程で得られた組織を、タンパク質分解酵素阻害剤を含む阻害剤溶液に浸漬する阻害剤溶液浸漬工程及び： 以上の工程で得られた細胞を培養して治療用培養細胞を得る培養工程： により得られる神経系疾患を治療するための細胞の製造方法であって、 前記阻害剤溶液浸漬工程では、酵素溶液浸漬工程における酵素溶液中のタンパク質分解酵素を阻害するのに必要とされるよりも過剰のタンパク質分解酵素阻害剤を含む阻害剤溶液を用い、 前記培養工程では、動物由来血清、脳由来物質、牛由来タンパク質、及び動植物由来アレルゲン物質を実質的に含まず、無血清培地を用い、また、栄養支持細胞を用いることなく、更に培養中に培地交換を行い、その培地交換は、培養に用いられている培地に新しい培地を添加してからその一部を除去して行うこと、 を特徴とする脊髄損傷を治療するための細胞の製造方法。 第３　原査定で引用された刊行物に記載された事項 平成２７年１０月２８日付け拒絶査定で引用された下記の刊行物について、以下「引用文献Ａ」、「引用文献Ｂ」という。 引用文献Ａ：仁科博道ら，「ヒト皮膚幹細胞の無血清培養法開発とラット脊髄損傷モデルへの移植適応」，移植，２０１０年　６月１０日，Ｖｏｌ．４５，Ｎｏ．３，ｐ．３０１（原査定における引用文献１） 引用文献Ｂ：特開２０１０－４６０５８号公報（原査定における引用文献８） １　引用文献Ａ：移植，２０１０年　６月１０日，Ｖｏｌ．４５，Ｎｏ．３，ｐ．３０１ 引用文献Ａには以下の記載がある。なお、下線は当審で付したものである。 （ａ－１）われわれは、ヒト皮膚からの細胞分離法ならびに新規無血清培地培養法を開発した。さらに、この方法で得られた細胞の幹細胞性および神経幹細胞への分化転換能を検討した。次に、この細胞をラット脊髄損傷モデルに移植して、その再生能を検討した。（第５－９行） （ａ－２）培養されたＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅの上にコロニーが出現し、Ｋｅｒａｔｉｎ１５陽性の皮膚幹細胞であった。次に、神経系への誘導培地に移し培養するとＮｅｓｔｉｎ陽性の神経幹細胞に変換した。（第１０－１３行） （ａ－３）神経細胞に誘導する前の細胞をラット脊髄損傷モデルに移植した結果、培地のみの対照に比較して移植３日からＢＢＢ　ｓｃｏｒｅが有意差を持って改善された。（第１３－１６行） ２　引用文献Ｂ：特開２０１０－４６０５８号公報 引用文献Ｂには、以下の記載がある。 （ｂ－１） 治療用培養細胞の製造方法であって； 哺乳動物から細胞を含む組織を採取する組織採取工程： 前記工程で得られた組織を、タンパク質分解酵素を含む酵素溶液中に浸漬する酵素溶液浸漬工程： 前記酵素溶液浸漬工程で得られた組織を、タンパク質分解酵素阻害剤を含む阻害剤溶液に浸漬する阻害剤溶液浸漬工程及び： 以上の工程で得られた細胞を培養して治療用培養細胞を得る培養工程： を含み、さらに、 前記阻害剤溶液浸漬工程では、酵素溶液浸漬工程における酵素溶液中のタンパク質分解酵素を阻害するのに必要とされるよりも過剰のタンパク質分解酵素阻害剤を含む阻害剤溶液を用い、 前記培養工程では、動物由来血清、脳由来物質、牛由来タンパク質、及び動植物由来アレルゲン物質を実質的に含まず、かつ、カルシウムイオン濃度０．０３～０．１mEq/Lの培地を用い、また、栄養支持細胞を用いることなく、更に培養中に培地交換を行い、その培地交換は、培養に用いられている培地に新しい培地を添加してからその一部を除去して行うことを特徴とする治療用培養細胞の製造方法。（請求項１） （ｂ－２）［実施例１］ （組織の採取） 美容整形手術時に顔部から切除されたヒト皮膚組織の全層部分を採取し、毛根が存在する箇所を残して皮下及び真皮結合組織を可及的に滅菌した鋏とピンセットで除去し、更に鋏で１×１０mm2程度に細切して細切組織を得た。得られた細切組織をペニシリン１０００u/ml及びストレプトマイシン１mg/mlを含むCaイオン及びMgイオン不含等張燐酸緩衝液(PBS(-))に３回浸漬して除菌した。 （酵素処理） 次いで予め４℃に冷却したトリプシン溶液〔0.125%Trypsin/0.01%EDTA/PBS(-)〕１０ml中に浸漬し、４℃に維持して一昼夜静置し、採取組織の酵素処理を行った。 （阻害剤処理） 酵素処理後の組織を遠心分離してトリプシン溶液を除いた後、直ちにトリプシン阻害剤溶液〔0.25%Trypsin Inhibitor (Soy bean)/MCDB153; Trypsinの2.4倍モル濃度〕２０ml中に入れ、磁石回転子を用いて室温下に３０分間撹拌し、トリプシンの酵素活性を失活させると共に、組織から培養に用いる細胞を遊離させた。（【００３４】～【００３６】） （ｂ－３）（培養） 培養皿としてType I-collagenを塗布した細胞培養用皿（100mm）（BD Falcon社製）を用い、また、培地として下記の組成の細胞培養培地１０mlを用い、得られた細胞を１～２×１０４～5/cm2の密度で播種して３７℃で培養を開始した。 細胞培養培地は以下のとおり調製された。すなわち、基本培地のMCDB 153培地（Sigma社製商品名：StemlineTM Keratinocyte Basal Medium）中に、インシュリン（10mg/L）、トランスフェリン(5.5mg/L）、セレニウム（6.7μg/L）、Ethanolamine(2mg/L)、ビタミンＣ(L-Ascorbic acid 2-phosphate semimagnesium salt)（50μg/L）、ＫＧＦ（Keratinocyte Growth Factor:10ng/L）、脂質（脂肪酸混合物、Arachidonic acid:20μg/L; Cholesterol:2.2mg/L; DL-a-Tocopherol-acetate:700μg/L; Linoleic acid:100μg/L; Linolenic acid:100μg/L; Myristic acid:100μg/L; Oleic acid:100μg/L; Palmitoleic acid:100μg/L; Palmitic acid:100μg/L; Stearic acid:100μg/L; Tween:80 22mg/L; Pluronic F-68:1000 mg/L)を添加して調製した。 培養開始に際しては、７日目までは培地交換をすることなく３ml/3dayの割合で培地を添加しつつ馴化培養を行い、その後に３日毎に培地を半交換しながら培養を行った。70%コンフルエンスに達するまで１４日間を要した。 なお、MCDB 153培地の組成は以下の通りである。なお、3.33mg/Lの無水塩化カルシウムは0.03mEqに相当する。（【００３８】） （ｂ－４）図５に培養後期（培養1４日目）の状態を示す。球状(Spheroid様)の表皮幹細胞（Spheroid塊）の出現が観察された。一層の表皮細胞によって満たされた培養面上にSpheroid様の表皮幹細胞が出現した。このSpheroid細胞群は酵素を用いないでも物理的にピッペティングで剥離され、その剥離細胞は他の培養皿や細胞培養シートに移すと再度図２から図５のように変化し細胞が増えていった。（【００４１】） （ｂ－５）[実施例７] （組織採取） 実施例１と同様に行った。ただし、本実施例では、６０歳代のヒト由来の顔部皮膚組織を用いた。 （酵素処理） 実施例１と同様に行った。 （阻害剤処理） 実施例１と同様に行った。 （未消化組織からの細胞の調製） 阻害剤処理後の処理溶液をポアサイズ１００μmのメッシュで濾過し、未消化組織をメッシュ上に得た。この未消化組織を直ぐに0.5% collagenase type Iと2.5mM CaCl2を終濃度で加えた基本培地に組織を移し、室温で磁石回転子を用いて1時間撹拌した。この消化物をピペットでサスペンドして組織を可及的にほぐし、再度メッシュ(100 μm pore size)で濾過して余分な組織を除いたろ液を得た。ろ過溶液を遠心分離により除き、ペレット状態で細胞を得た。 （培養） 上記のトリプシンとコラーゲナーゼの両方から得た細胞を１：１の割合で混合し、１５～１×１０４　ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞密度で１００ｍｍの培養皿に播種して培養を開始した。 （サイトケラチン１５発現細胞の調製） 培養細胞が１００％コンフルエンスに達して、ｓｐｈｅｒｏｉｄ細胞集団が多数発現し始めた段階で、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ（－）液に２０分以上細胞を室温で浸漬して細胞固定を行った。この時、２枚のｄｉｓｈを用意した。 （サイトケラチン１５発現細胞の同定＝ｓｋｉｎ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌの同定） 近年表皮に幹細胞（表皮幹細胞）が存在することが報告され、表皮幹細胞は毛嚢のバルジ領域に存在し、サイトケラチン１５を発現していることが明らかにされている(非特許文献１３)。この幹細胞は表皮の角化細胞、毛嚢の脂腺細胞、そして毛の細胞に分化する能力を有している。もし、この幹細胞を同時に培養できれば、この移植体は従来の表皮のみならず毛や脂腺の形成が起こすことが可能となる。そこで本実施例では、上記実施例で得られた細胞中の、表皮幹細胞の有無を同定するために、サイトケラチン１５の発現を、抗体染色によって観察した。（【００５７】～【００６０】） （ｂ－６）図１１にＡｎｔｉ－Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ１５抗体染色した結果を示す。Ｓｈｅｒｏｉｄ　細胞のみが染色され、これらがヒトケラチン１５陽性であり、表皮幹細胞であることが分かる。 なお、１次抗体を加えたｄｉｓｈにおいては、陽性を示す細胞は、シート状に培養されたケラチノサイトではなく、ｓｐｈｅｒｏｉｄ状になる細胞のみに観察された。以上より、この培養法で出現するｓｐｈｅｒｏｉｄ細胞はｓｋｉｎ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌであることが証明された。 本実施例では、阻害剤溶液浸漬工程で得られる細胞と、第二酵素溶液浸漬工程で得られる細胞とを混合して培養することに細胞を得た。さらに、抗体染色により、本培養で得られる細胞が、ｓｋｉｎ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌを含むことが分かった。（【００６０】～【００６１】） 第４　当審の判断 １　引用文献Ａに記載された発明 （ａ－１）の記載からみて、（ａ－２）における「培養されたＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ」の上に出現した「Ｋｅｒａｔｉｎ１５陽性の皮膚幹細胞」は、「ヒト皮膚からの細胞分離法ならびに新規無血清培地培養法」により得られた細胞であると認められる。また、（ａ－３）の「神経細胞に誘導する前の細胞」も、（ａ－２）の記載からみて、神経細胞に誘導する前の「Ｋｅｒａｔｉｎ１５陽性の皮膚幹細胞」であると認められる。 よって、引用文献Ａには、「ヒト皮膚からの細胞分離法及び新規無血清培地培養法による脊髄損傷を治療するためのサイトケラチン１５陽性皮膚幹細胞の製造方法」の発明（以下、「引用発明」という。）が記載されていると認められる。 ２　本願発明と引用発明の対比 培養により細胞を調製するためにはヒト皮膚を採取する必要があり、また、ヒト皮膚は当然に細胞を含む組織であるから、引用発明の「ヒト皮膚」は、本願発明の「ヒト皮膚から採取された細胞を含む組織」に相当する。また、脊髄損傷は神経系疾患の一つともいえるから、引用発明の「脊髄損傷」は、本願発明の「神経系疾患」「脊髄損傷」に相当する。 よって、本願発明と引用発明を対比すると、両者は「ヒト皮膚から採取された細胞を含む組織より得られる神経系疾患を治療するための細胞の製造方法であって、脊髄損傷を治療するための細胞の製造方法。」である点で一致し、一方、以下の点で相違する。 （相違点） 本願発明が「ヒト皮膚から採取された細胞を含む組織を、タンパク質分解酵素を含む酵素溶液中に浸漬する酵素溶液浸漬工程：　前記酵素溶液浸漬工程で得られた組織を、タンパク質分解酵素阻害剤を含む阻害剤溶液に浸漬する阻害剤溶液浸漬工程及び： 以上の工程で得られた細胞を培養して治療用培養細胞を得る培養工程：により、また前記阻害剤溶液浸漬工程では、酵素溶液浸漬工程における酵素溶液中のタンパク質分解酵素を阻害するのに必要とされるよりも過剰のタンパク質分解酵素阻害剤を含む阻害剤溶液を用い、前記培養工程では、動物由来血清、脳由来物質、牛由来タンパク質、及び動植物由来アレルゲン物質を実質的に含まず、無血清培地を用い、また、栄養支持細胞を用いることなく、更に培養中に培地交換を行い、その培地交換は、培養に用いられている培地に新しい培地を添加してからその一部を除去して行うこと、を特徴とする」のに対し、引用発明には、酵素溶液浸漬工程及び阻害剤溶液浸漬工程により得られた細胞を培養すること、及び、酵素溶液浸漬工程における酵素溶液中のタンパク質分解酵素を阻害するのに必要とされるよりも過剰のタンパク質分解酵素阻害剤を含む阻害剤溶液を用い、培養工程では、動物由来血清、脳由来物質、牛由来タンパク質、及び動植物由来アレルゲン物質を実質的に含まず、無血清培地を用い、また、栄養支持細胞を用いることなく、更に培養中に培地交換を行い、その培地交換は、培養に用いられている培地に新しい培地を添加してからその一部を除去して行うことについては具体的な開示がない点。 ３　相違点について 上記相違点について検討する。引用文献Ｂには、（ｂ－１）～（ｂ－６）に記載の通り、ヒト皮膚から採取された細胞を含む組織を、タンパク質分解酵素を含む酵素溶液中に浸漬する酵素溶液浸漬工程、前記酵素溶液浸漬工程で得られた組織を、タンパク質分解酵素阻害剤を含む阻害剤溶液に浸漬する阻害剤溶液浸漬工程、及び、以上の工程で得られた細胞を培養して治療用培養細胞を得る培養工程により得られるサイトケラチン１５陽性表皮幹細胞の製造方法であって、前記阻害剤溶液浸漬工程では、酵素溶液浸漬工程における酵素溶液中のタンパク質分解酵素を阻害するのに必要とされるよりも過剰のタンパク質分解酵素阻害剤を含む阻害剤溶液を用い、前記培養工程では、動物由来血清、脳由来物質、牛由来タンパク質、及び動植物由来アレルゲン物質を実質的に含まず、無血清培地を用い、また、栄養支持細胞を用いることなく、更に培養中に培地交換を行い、その培地交換は、培養に用いられている培地に新しい培地を添加してからその一部を除去して行うことを特徴とするサイトケラチン１５陽性表皮幹細胞の製造方法が記載されている。 サイトケラチンはケラチンとも呼ばれるものであるから（必要ならば、東京化学同人「生化学辞典」（第３版）、１９９８年、第５６７頁「サイトケラチン」の項等参照）、引用文献Ａ及びＢはいずれもヒト皮膚から採取された細胞を含む組織から無血清培地を用いた培養工程を経てケラチン１５陽性皮膚幹細胞を製造する方法に関する点で課題が共通し、また、技術分野が密接に関連するものである。 よって、引用文献Ａに記載された発明の、脊髄損傷を治療するためのサイトケラチン１５陽性皮膚幹細胞を調製するにあたり、引用文献Ｂに記載された具体的な方法を採用することは当業者が容易に想到し得ることである。 ４　本願発明の効果について 本願明細書、特に実施例１、５の記載を参酌しても、本願発明の方法により得られた細胞をラットの脊髄損傷モデルに移植したところ、投与後３日以降に、培地のみを移植した対照と比較してＢＢＢスコアに有意差を持って有意な効果が得られたことが理解できるのみであり、この点が引用発明と比較して格別顕著なものとはいえない。 したがって、本願発明が引用文献に記載された発明との比較において格別顕著な効果を奏するものであるとは認められない。 ５　請求人の主張について 請求人は審判請求書において、引用文献Ａ及びＢの文献発表時においては細胞の発がん性について何ら知見がなく、本願発明の製造方法により製造される細胞に発がん性がないということは、顕著な効果として認められるべきものと主張する。 しかしながら、引用文献Ａにおいて、皮膚幹細胞が移植されたラット脊髄損傷モデルにおいてＢＢＢ ｓｃｏｒｅが有意差を持って改善されたこと、すなわち脊髄損傷の治療が成功していることが記載されていることから、引用発明の脊髄損傷を治療するためのサイトケラチン１５陽性皮膚幹細胞は発がん性を有しないものと解するのが自然である。 よって、本願発明の製造方法により製造される細胞に発がん性がないということが、引用文献Ａ、Ｂに記載された発明と比較して当業者の予測を超える格別顕著な効果であったとまではいえない。 したがって、請求人の主張は採用できない。 ６　まとめ したがって、本願発明は、引用文献Ａ及びＢに記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものである。 第５　むすび 以上のとおりであるから、請求項１に係る発明は、引用文献Ａ及びＢに記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。 したがって、その他の請求項に係る発明についての判断を示すまでもなく本願は拒絶すべきものである。 よって、結論のとおり審決する。