2024-700773

特許第７４７１０６９号発明「移植片の活性を高める方法」の特許異議申立事件について、次のとおり決定する。

結 論 特許第７４７１０６９号の請求項１～５に係る特許を維持する。

理 由 第１ 手続の経緯 特許第７４７１０６９号の請求項１～５に係る特許についての出願は、令和１年９月３０日に出願され、令和６年４年１１日に特許の設定登録がされ、同年４月１９日に特許掲載公報が発行された。本件は、その特許に対し、令和６年８月１５日に特許異議申立人 鈴木 敏明（以下、「申立人Ａ」という。）により特許異議の申立て（以下、「申立てＡ」という。）がされ、令和６年１０月１８日に特許異議申立人 大川 尊司（以下、「申立人Ｂ」という。）により特許異議の申立て（以下、「申立てＢ」という。）がされたものである。 第２ 本件発明 特許第７４７１０６９号の請求項１～５に係る発明は、その特許請求の範囲の請求項１～５に記載された事項により特定される、次のとおりのものである。 「【請求項１】 ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞を含有するシート状細胞培養物のサイトカイン産生能および増殖能からなる群から選択される活性を高める方法であって、 ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞を含有するシート状細胞培養物を培養基材上に提供するステップ、 培養基材からシート状細胞培養物を剥離するステップ、および、 培養基材から剥離後に、シート状細胞培養物を２５℃～３９℃で２４時間～７２時間インキュベートするステップを含む前記方法。 【請求項２】 シート状細胞培養物がスキャフォールドを有する、請求項１に記載の方法。 【請求項３】 スキャフォールドが、フィブリン、ゼラチンまたはコラーゲンを含むゲルである、請求項２に記載の方法。 【請求項４】 請求項１～３のいずれか一項に記載の方法を含むシート状細胞培養物の製造方法。 【請求項５】 ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞を含有するシート状細胞培養物のサイトカイン産生能および増殖能からなる群から選択される活性を高める方法であって、 ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞を含有するシート状細胞培養物を培養基材上に提供するステップ、 培養基材からシート状細胞培養物を剥離するステップ、および、 培養基材から剥離後に、シート状細胞培養物を２５℃～３９℃で７２時間インキュベートするステップを含む前記方法。」 （以下、上記請求項１～５に係る発明を「本件発明１」～「本件発明５」という。まとめて「本件発明」ということもある。） 第３ 特許異議申立理由 各申立人が主張する申立ての理由は、概略、次のとおりのものである。 １ 申立人Ａが主張する申立てＡの理由（甲第１号証に基づく新規性・進歩性欠如） 本件発明１、４は、甲第１号証に記載された発明であり、特許法第２９第１項第３号に該当し特許を受けることができず、本件発明１～５は、甲第１号証に記載された発明に基づき、当業者が容易に発明をすることができたものであり、特許法第２９第２項の規定により特許を受けることができないから、それらの発明に係る特許は、同法第１１３条第２号に該当し、取り消されるべきものである。 ［証拠方法］ 甲第１号証：国際公開第２０１６／０７６３６８号 （以下、上記「甲第１号証」を「甲Ａ１」と略す。） ２ 申立人Ｂが主張する申立てＢの理由（甲第１号証を主引例、甲第２号証～甲第７号証を副引例とした進歩性欠如） 本件発明１～５は、甲第１号証～甲第７号証に記載された発明に基づき、当業者が容易に発明をすることができたものであり、特許法第２９第２項の規定により特許を受けることができないから、それらの発明に係る特許は、同法第１１３条第２号に該当し、取り消されるべきものである。 ［証拠方法］ 甲第１号証：Stem Cells, 2012, Vol.30, p.1196-1205, Supplemental Experimental Procedures 甲第２号証：European Heart Journal, 2013, Vol.34, p.1147-1156 甲第３号証：国際公開第２０１６／０７６３６８号 甲第４号証：特開２０１９－０４７８１９号公報 甲第５号証：特開２０１９－１２９７７５号公報 甲第６号証：特表２０１２－５１２６３２号公報 甲第７号証：Data in Brief, 2016, Vol.8, p.45-48 （以下、上記「甲第１号証」～「甲第７号証」を「甲Ｂ１」～「甲Ｂ７」と略す。） 第４ 当審の判断 １ 申立人Ａが提出した甲号証の記載事項 （１）甲Ａ１（国際公開第２０１６／０７６３６８号）の記載事項 甲Ａ１には、次の事項が記載されている。下線は、当審が付したものである（以下同様）。 ア 発明の名称 「心筋細胞シート」 イ 請求の範囲 「【請求項１】多能性幹細胞由来の心筋細胞を含む細胞集団を培養して得られるシート状細胞培養物であって、前記細胞集団の全細胞数に対する多能性幹細胞由来の心筋細胞数の割合が、５０％～７０％である、前記シート状細胞培養物。 ・・・ 【請求項４】（１）多能性幹細胞を心筋細胞誘導処理に供し、心筋細胞を含む第１の細胞集団を得るステップ、 （２）ステップ（１）で得た第１の細胞集団に由来する心筋細胞を含む第２の細胞集団を得るステップ、および （３）ステップ（２）で得た第２の細胞集団を培養してシート状細胞培養物を形成するステップ を含み、第２の細胞集団の全細胞数に対する心筋細胞数の割合が５０％～７０％である、請求項１～３のいずれか一項に記載のシート状細胞培養物の製造方法。 ・・・ 【請求項８】（１）多能性幹細胞を心筋細胞誘導処理に供し、心筋細胞を含む第１の細胞集団を得るステップ、 （２）ステップ（１）で得た第１の細胞集団に由来する心筋細胞を含む第２の細胞集団を得るステップ、および （３）ステップ（２）で得た第２の細胞集団を培養してシート状細胞培養物を形成するステップ を含み、第２の細胞集団の全細胞数に対する心筋細胞数の割合が５０％～７０％である、多能性幹細胞由来の心筋細胞を含むシート状細胞培養物のサイトカイン産生能を高める方法。」 ウ 発明の概要 「[0005] 本発明は、有用な機能的特性を有する、多能性幹細胞由来の心筋細胞を含むシート状細胞培養物、その製造方法、当該シート状細胞培養物を含む移植片、および、当該シート状細胞培養物を用いた疾患の処置方法等の提供を目的とする。」 「[0006] 本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を進める中、シート状細胞培養物の形成に用いる細胞集団の全細胞数に対する多能性幹細胞由来の心筋細胞数の割合を５０％～７０％の範囲に調節することで、疾患の治療に有用なサイトカインの産生能が高まることを見出し、本発明を完成させた。」 「[0041] シート状細胞培養物から放出されるサイトカインの量は、限定されずに、例えば、シート状細胞培養物を所定の期間培養液中で培養した後、当該培養液（培養上清）に含まれるサイトカインの量（例えば、サイトカインの濃度など）を測定することなどにより得ることができる。シート状細胞培養物に含まれるサイトカインの量は、限定されずに、例えば、シート状細胞培養物を所定の期間培養液中で培養した後、シート状細胞培養物を破砕または溶解し、得られた破砕液または溶解液中に含まれるサイトカインの量（例えば、サイトカインの濃度など）を測定することなどにより得ることができる。シート状細胞培養物を構成する細胞が発現するサイトカイン遺伝子の量は、限定されずに、例えば、シート状細胞培養物から全ＲＮＡを抽出し、これに含まれるサイトカイン遺伝子の量を定量することなどにより得ることができる。」 「[0049] 本発明の製造方法は、シート状細胞培養物を形成するステップの後に、形成されたシート状細胞培養物を回収するステップをさらに含んでもよい。シート状細胞培養物の回収は、シート状細胞培養物が少なくとも部分的に、シート構造を保ったまま、足場となっている培養基材から遊離（剥離）できれば特に限定されず、例えば、タンパク質分解酵素（例えばトリプシンなど）による酵素処理および／またはピペッティングなどの機械的処理によって行うことができる。また、細胞を、刺激、例えば、温度や光に応答して物性が変化する材料で表面を被覆した培養基材上で培養してシート状細胞培養物を形成した場合には、所定の刺激を加えることで、非酵素的に遊離することもできる。例えば、細胞を温度応答性培養皿で培養して細胞培養物を形成した場合には、温度を温度応答性材料の水に対する下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）以下または上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）以上とすることにより、シート状細胞培養物を非酵素的に遊離することができる。」 エ 実施例 「[0064] 例１ ヒトｉＰＳ細胞からの心筋細胞の誘導 ヒトｉＰＳ細胞（253G1株）を理化学研究所バイオリソースセンターから購入し、直径１０ｃｍの培養皿内で、５ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（basic fibroblast growth factor、リプロセル社製、以下同様）を添加したPrimate ES Cell Medium（リプロセル社製）中、マイトマイシンＣ処理を施したマウス胎児線維芽細胞（MEF、リプロセル社製）上で維持した。細胞の継代は、３～４日ごとに、コロニーを維持したまま（単細胞懸濁液にせずに）、細胞剥離液（CTK溶液、リプロセル社製、以下同様）を用いて行った。 [0065] 心筋細胞の誘導は、浮遊培養下の胚様体（ＥＢ）に所定の添加物を所定の時期に作用させることにより行った。１０枚の培養皿から細胞剥離液で剥離したヒトｉＰＳ細胞の凝集塊（約２×１０７細胞）を、１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤（Y-27632、和光純薬社製）を添加した１００ｍＬのmTeSRTM1（STEMCELL Technologies社製）に再懸濁し、撹拌機能付培養装置（Bio Jr. 8、エイブル社製）に導入した。培養中、撹拌速度を４０ｒｐｍ、溶解酸素濃度を４０％、ｐＨを７．２、温度を３７℃にそれぞれ維持した。溶解酸素濃度の調節は空気、酸素または窒素により、ｐＨの調節はＣＯ２の添加によりそれぞれ行った。 [0066] 培養装置内での培養開始（０日目）の１日後（１日目）に、培地を、０．５ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４（R&D Systems社製、以下同様）を添加した心筋細胞誘導用基本培地（５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸（Sigma-Aldrich社製）、２ｍＭのＬ－グルタミンおよび４００μＭの１－チオグリセロール（Sigma-Aldrich社製）を含むStemPro(R)-34 SFM（Life Technologies社製））に置換した。その後、以下の時期に、培地を、以下の添加物を含む心筋細胞誘導用基本培地に置換した。２日目：１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、５ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦおよび３ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（R&D Systems社製）、５日目：４μＭのＷｎｔシグナル阻害剤（IWR-1-endo、和光純薬社製）、７日目：５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ（R&D Systems社製）および１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ。その後、９、１１、１３および１５日目に、７日目と同じ培地（すなわち、５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦおよび１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加した心筋細胞誘導用基本培地）で培地交換を行った。こうしてヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞を含む細胞集団（細胞塊）を得た。当該細胞集団は、０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡで解離後、残存する細胞凝集物をストレイナー（BD Bioscience社製）で除去し、その後の実験に供した。」 「[0067] 例２ 非心筋細胞の構成比の解析 例１で得た解離した細胞集団の一部を用いて、当該細胞集団における非心筋細胞の構成比を調べた。まず、細胞集団を、非心筋細胞マーカー（血管内皮細胞等のマーカーであるＣＤ３１、平滑筋細胞等のマーカーであるαＳＭＡまたは線維芽細胞等のマーカーであるＴＥ－７抗原）と心筋細胞マーカーであるｃ－ＴＮＴの両方について二重標識した。 [0068] ＣＤ３１発現細胞の標識は、細胞集団を、ＰＥ結合抗ヒトＣＤ３１抗体（clone WM59、マウスIｇG1、BD社製）と反応させた後、細胞を固定・透過処理剤（BD Cytofix/CytopermTM Fixation/Permeabilization Solution Kit、BD社製、以下同様）で固定、透過処理し、処理後の細胞を、抗ｃ－ＴＮＴ抗体（Troponin T-C Antibody (CT3)、マウスIgG2a、Santa Cruz Biotechnology社製、以下同様）、次いで、蛍光標識二次抗体（Alexa Fluor(R) 647結合抗マウスIgG2a抗体、Life Technologies社製）と反応させることにより行った。 [0069] αＳＭＡ発現細胞の標識は、細胞を固定・透過処理剤で固定、透過処理し、処理後の細胞を、抗ｃ－ＴＮＴ抗体と、抗αＳＭＡ抗体（clone E184、ウサギIgG、Abcam社製）とに反応させ、次いで、上記一次抗体に結合する蛍光標識二次抗体（Alexa Fluor(R) 647結合抗マウスIgG2a抗体およびAlexa Fluor(R) 488結合抗ウサギ抗体、いずれもLife Technologies社製）と反応させることにより行った。 [0070] ＴＥ－７抗原発現細胞の標識は、細胞を固定・透過処理剤で固定、透過処理し、処理後の細胞を、抗ｃ－ＴＮＴ抗体と、抗ヒト線維芽細胞抗体（clone TE-7、マウスIgG1、Merck Millipore社製）とに反応させ、次いで、上記一次抗体に結合する蛍光標識二次抗体（Alexa Fluor(R) 647結合抗マウスIgG2a抗体およびAlexa Fluor(R) 488結合抗マウスIgG1抗体、いずれもLife Technologies社製）と反応させることにより行った。 [0071] 標識した細胞を、BD FACSCantoTM II フローサイトメーターおよびBD FACSDivaTM ソフトウェア（いずれもBD社製）を用いて解析した。非心筋細胞集団の全細胞数に対する各非心筋細胞マーカー陽性細胞数の割合は、ｃ－ＴＮＴ陰性画分の細胞集団（非心筋細胞集団）の全細胞数に対する各非心筋細胞マーカー陽性細胞数の割合として算出した。結果を下表１に示す。 ［図：0001420339000001.jpg］ 」 「[0072] 例３ 心筋細胞の分離 例１で得た解離した細胞集団の一部を、心筋細胞マーカーであるＣＤ１７２に特異的に結合する、ＰＥ（フィコエリスリン）結合抗ヒトＣＤ１７２ａ／ｂ抗体（clone SE5A5、BioLegend社製）で標識した。標識した細胞に抗ＰＥマイクロビーズ（Miltenyi Biotec社製）を負荷し、細胞とビーズの混合物をMidiMACSTM Separator（Miltenyi Biotec社製）に設置したLS Columns（Miltenyi Biotec社製）に通して、ＣＤ１７２陽性の心筋細胞を含む心筋細胞集団と、ＣＤ１７２陰性の非心筋細胞を含む非心筋細胞集団とに分離した。 [0073] 分離した心筋細胞集団の一部を用いて、別の心筋細胞マーカーであるｃ－ＴＮＴを発現する細胞数の、分離した心筋細胞集団の全細胞数に対する割合をフローサイトメトリーで解析した。すなわち、分離した心筋細胞集団を固定・透過処理剤で固定、透過処理し、処理後の細胞を、抗ｃ－ＴＮＴ抗体、次いで、蛍光標識二次抗体（Alexa Fluor(R) 647結合抗マウスIgG2a抗体、Life Technologies社製）と反応させた後、標識した細胞を、BD FACSCantoTM II フローサイトメーターおよびBD FACSDivaTM ソフトウェア（いずれもBD社製）を用いて解析した。解析の結果、上記で分離した心筋細胞集団の全細胞数に対するｃ－ＴＮＴ陽性細胞数の割合は９０％超であった。」 「[0074] 例４ シート状細胞培養物の作製 例３で分離した心筋細胞集団と非心筋細胞集団とを下表２の比率で混合し、シート状細胞培養物形成用の細胞集団Ａ～Ｄを調製した。 ［図：0001420339000002.jpg］ なお、表中の割合（％）は、細胞集団の全細胞数に対する各種細胞集団の細胞数の割合を意味する。また、例２で算出した非心筋細胞集団における各非心筋細胞マーカー陽性細胞の割合は、心筋細胞集団と非心筋細胞集団の分離ステップの前後で実質的に変化しないと考えられるため、分離後の非心筋細胞集団についても適用可能である。 [0075] 細胞集団Ａ～Ｄを、それぞれ２．１×１０５個／ｃｍ２の密度で、温度応答性培養皿（UpCell(R)、セルシード社製）に播種し、ＲＯＣＫ阻害剤を含まない１０％ＦＢＳ加ＤＭＥＭ中、３７℃、５％ＣＯ２にて５日間増殖培養してシート状細胞培養物を形成し、温度処理（室温での１０～３０分程度の静置）により培養皿からシート状細胞培養物を剥離した（図１）。以下では、細胞集団Ａ～Ｄで形成したシート状細胞培養物を、それぞれシート状細胞培養物Ａ～Ｄと記す。」 「[0076] 例５ シート状細胞培養物の評価 （１）外観 心筋細胞集団の割合が５０％以上の細胞集団で形成したシート状細胞培養物Ｂ～Ｄは、自発的な同期拍動を示した。また、シート状細胞培養物Ａ～Ｃは、移植に適した白色円形の形状を形成することができたが、シート状細胞培養物Ｄは安定したシート状の構造を形成することができなかった（図１）。 [0077]（２）サイトカインの産生 シート状細胞培養物Ａ～Ｄを、１０％ＦＢＳ加ＤＭＥＭ中、３７℃、５％ＣＯ２にて２日間培養して得た培養上清に含まれるＶＥＧＦおよびＳＣＦの濃度を、Bio-Plex(R) Suspension Array System（Bio-Rad Laboratories社製）を用い、製品マニュアルに従って測定した（ｎ＝４）。ＶＥＧＦの定量にはBio-Plex ProTM ヒトサイトカイン 28-Plex アッセイを、ＳＣＦの定量にはBio-Plex ProTM ヒトサイトカイン 21-Plex アッセイをそれぞれ用いた。各群間の統計学的有意差の評価には、Non-repeated Measures ANOVAを用いた。 図２に示す結果から、シート状細胞培養物を形成する細胞集団における心筋細胞集団の割合を５０％～７０％とすることで、高いサイトカイン産生量が得られることが分かる。ＶＥＧＦは血管新生作用を有し、移植片の生存率を高めることなどが知られており（例えば、Suzuki et al., Circulation. 2001 Sep 18;104(12 Suppl 1):I207-12など）、ＳＣＦは、心筋細胞に分化し得る骨髄幹細胞を動員し得ることなどが知られている（例えば、Lutz et al., Cardiovasc Res. 2008 Jan;77(1):143-50など）。したがって、これらのサイトカインの産生量が高い本発明のシート状細胞培養物は、高い治療効果を有することが予測される。」 オ 図面 「[0010] ・・・図２は、シート状細胞培養物Ａ～Ｄが産生したサイトカインの定量結果を示したグラフである。なお、縦軸は培養上清中の各サイトカインの濃度を示し、*はｐ＜０．０５、**はｐ＜０．０１をそれぞれ表す。 ［図：0001420339000003.jpg］ 」 ２ 申立人Ｂが提出した主な甲号証の記載事項 （１）甲Ｂ１（Stem Cells, 2012, Vol.30, p.1196-1205, Supplemental Experimental Procedures）の記載事項 甲Ｂ１には、次の事項が記載されている。なお、英語で記載されているので、当審による翻訳文で示す。 ア 表題 「多能性幹細胞から作製され、特定の心血管細胞集団で再構成された細胞シートは、心筋細胞を介した血管新生によって、梗塞心筋の機能軽減を改善する」 イ 要約 「幹細胞療法は心臓の修復に有望な戦略であるが、移植細胞の不均一性が細胞及び分子メカニズムの正確な理解を妨げている。以前、我々はマウス多能性幹細胞から心血管細胞分化システムを確立し、心筋細胞（CM）、内皮細胞（EC）、壁細胞（MC）を系統的に誘導及び精製することができる。これを細胞シート技術と組み合わせて、特定の心血管集団で再構成された心臓組織シートを生成した。ここでは、心筋梗塞（MI）後の心機能における心臓組織シート移植の可能性とメカニズムを示す。」（第１１９６頁左欄第１～１３行） ウ 材料と方法 「マウスES細胞由来組織シート形成 EStTA-ROSA細胞から誘導されたFlk1+細胞を、VEGF165（50 ng/ml）及び8bromo-cAMP（0.5 mmol/l）を含むDM 1mlとともに、ゼラチンコーティングされた12マルチウェルUｐCellに2.5-4.0×104細胞で播種され、UpCell上でEC及びMCを選択的に誘導した。３日間培養した後、精製細胞懸濁液［5.0×105 CM及び5.0×105バルクFlk1-d3（EC及びMC）］がUpCell上の血管細胞に播種された（つまり、精製C+E+M細胞がE+M細胞に対して播種された）（補足情報図Ｓ１Ｄ、Ｓ１Ｅ）。４日間培養した後、細胞を室温に戻した。１５～３０分以内に、細胞は自然に剥離し、単層細胞シート（C+E+Mシート）（C：CM、E：EC、M：MC）として培地中に浮遊した。」（第１１９７頁右欄「Mouse ESC-Derived Tissue Sheet Formation」） エ 結果 「心臓組織シートの移植後の血管新生 ・・・ 次に、血管新生の分子メカニズムを解明するために、心臓組織シートの培養上清中の腫瘍壊死因子α、インスリン様成長因子１、VEGF、インターロイキン６、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）などの血管新生因子のタンパク質分泌を調べた。その中でもVEGFの産生は他の因子よりもはるかに顕著であり、VEGFが重要な役割を果たしていることを示唆している（補足情報図Ｓ４Ｃ）。VEGF産生を担う細胞集団を同定するために、心臓組織シートの免疫蛍光染色を行った。VEGF染色はcTnT+ CMに非常に限定され（図４Ｅ）、シートを構成する細胞タイプの中では CM がVEGF の主な供給源であることを示している。」（第１２０１頁左欄～第１２０２頁左欄「Neovascularization Following Cardiac Tissue Sheet Transplantation」） 「細胞タイプ制御シートによるCMの機能的役割の前向き試験 我々のESCシステムは、様々な組合せの心血管細胞を含む細胞タイプ制御シートによって各細胞集団の機能的役割を前向きに評価できるという、これまでの細胞移植研究とは異なる利点を備えている。C+E+Mシートからのin vitro VEGF分泌は、E+Mシート（EC及びMC）よりも13.3倍高く（図５Ａ）、in vitro Vegf164遺伝子発現は、E+Mシート（EC及びMC）よりも21.5倍高かった（図５Ｂ）（補足情報図Ｓ５Ａ）。これらの結果は、VEGFの免疫染色の結果を裏付けている（図４Ｅ）。・・・」（第１２０２頁左欄～右欄「Prospective Examination of Functional Roles of CMs with Cell type-Controlled Tissue Sheets」） 「図５ ［図：0001420339000004.jpg］ 細胞タイプ制御シートの分析 （Ａ）：C+E+MシートとE+Mシートの培養上清におけるVEGF分泌（104細胞あたりのピゴグラム）に対するELISA。（Ｂ）：C+E+MシートとE+MシートからのVEGF mRNAに対する定量PCR。・・・」 オ 補足情報 「酵素免疫測定法（ELISA） 細胞培養の上清を２つの条件で収集し、検査した。条件１（共培養中の分泌）：・・・条件２（３層シートからの分泌）：シートを収集し、上記のように３層にした。60 mm培養皿に移し、αMEMで２回洗浄した後、上清をαMEM（1.8 ml/皿）に置換した。３時間後、上清を収集し、検査した。TNFα、IGF-1、VEGF、IL-6、bFGF、IGFγ、EGF、レプチン及びHGFの相対的増加を、マウス血管新生ELISA strip（Signosis、サニーベール、カリフォルニア）又はマウスHGF EIA kit（特殊免疫研究所、東京、日本）を用いて同時に評価した。・・・」（Supplemental Experimental Procedures、第１４～１５頁「Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)」） （２）甲Ｂ３（国際公開第２０１６／０７６３６８号）の記載事項 甲Ｂ３は、甲Ａ１と同一の文献であり、その記載事項については、前記１（１）を参照のこと。 ３ 申立てＡの理由（甲Ａ１に基づく新規性・進歩性欠如）についての判断 （１）甲Ａ１に記載された発明の認定 甲Ａ１の請求の範囲の請求項８には、「（１）多能性幹細胞を心筋細胞誘導処理に供し、心筋細胞を含む第１の細胞集団を得るステップ、（２）ステップ（１）で得た第１の細胞集団に由来する心筋細胞を含む第２の細胞集団を得るステップ、および（３）ステップ（２）で得た第２の細胞集団を培養してシート状細胞培養物を形成するステップを含み、第２の細胞集団の全細胞数に対する心筋細胞数の割合が５０％～７０％である、多能性幹細胞由来の心筋細胞を含むシート状細胞培養物のサイトカイン産生能を高める方法。」（前記１（１）イ）が記載されている。そして、実施例には、ヒトｉＰＳ細胞を浮遊培養して得られる胚様体に、所定の添加物を所定の時期に作用させて、心筋細胞を含む細胞集団を誘導したこと（前記１（１）エ、例１）、当該細胞集団から、心筋細胞マーカーであるＣＤ１７２に特異的に結合する抗体を用いて、ＣＤ１７２陽性の心筋細胞を含む心筋細胞集団と、ＣＤ１７２陰性の非心筋細胞を含む非心筋細胞集団とに分離したこと（前記１（１）エ、例３）、分離した心筋細胞集団と非心筋細胞集団を様々な比率で混合した後、各細胞集団を温度応答性培養皿に播種して培養することでシート状細胞培養物を形成し、温度処理により当該培養物を培養皿から剥離したこと（前記１（１）エ、例４）、形成したシート状細胞培養物を３７℃、５％ＣＯ２にて２日間培養した後、培養上清に含まれるサイトカインであるＶＥＧＦ及びＳＣＦの濃度を測定し、シート状細胞培養物を形成する細胞集団における心筋細胞集団の割合を５０％～７０％とすることで、高いサイトカイン産生量が得られることが明らかとなったこと（前記１（１）エ、例５、前記１（１）オ、図２）が記載されている。 以上より、甲Ａ１には、シート状細胞培養物を形成する細胞集団における心筋細胞集団の割合を５０％～７０％とすることを主な特徴として、当該シート状細胞培養物のサイトカイン産生量を高めることが記載されており、このことを、シート状細胞培養物を３７℃、５％ＣＯ２にて２日間培養した後、培養上清に含まれるサイトカインであるＶＥＧＦ及びＳＣＦの濃度を測定することにより確認したことが記載されていると認められる。 そうすると、甲Ａ１には、次のとおりの発明が記載されていると認定できる。 「ヒトｉＰＳ細胞から心筋細胞を含む細胞集団を誘導するステップ、当該細胞集団から、ＣＤ１７２陽性の心筋細胞を含む心筋細胞集団と、ＣＤ１７２陰性の非心筋細胞を含む非心筋細胞集団とに分離するステップ、分離した心筋細胞集団の割合が５０％～７０％となるように、分離した心筋細胞集団と非心筋細胞集団を混合した細胞集団を得るステップ、当該細胞集団を温度応答性培養皿に播種して培養することでシート状細胞培養物を形成するステップを含む、ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞を含むシート状細胞培養物のサイトカイン産生能を高める方法であって、前記サイトカイン産生能は、シート上細胞培養物を培養皿から剥離し、３７℃、５％ＣＯ２にて２日間培養して得た培養上清に含まれるサイトカイン産生量を測定することにより確認する、前記方法。」（以下、「甲Ａ１発明」という。） （２）本件発明１について ア 対比 本件発明１と甲Ａ１発明とを対比する。 甲Ａ１発明の「培養皿」は、本件発明１の「培養基材」に相当するから、甲Ａ１発明の「ヒトｉＰＳ細胞から心筋細胞を含む細胞集団を誘導するステップ、当該細胞集団から・・・分離した心筋細胞集団と非心筋細胞集団を混合した細胞集団を得るステップ、当該細胞集団を温度応答性培養皿に播種して培養することでシート状細胞培養物を形成するステップ」は、本件発明１の「ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞を含有するシート状細胞培養物を培養基材上に提供するステップ」に相当する。 また、甲Ａ１発明の「シート上細胞培養物を培養皿から剥離し、３７℃、５％ＣＯ２にて２日間培養」する工程は、本件発明１の「培養基材からシート状細胞培養物を剥離するステップ」、及び「培養基材から剥離後に、シート状細胞培養物を２５℃～３９℃で ２４時間～７２時間インキュベートするステップ」に相当する工程を含むものである。 そうすると、両者の一致点と相違点は、以下のとおりである。 ＜一致点＞ ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞を含有するシート状細胞培養物を培養基材上に提供するステップ、培養基材からシート状細胞培養物を剥離するステップ、及び、培養基材から剥離後に、シート状細胞培養物を２５℃～３９℃で２４時間～７２時間インキュベートするステップを含む方法である点。 ＜相違点＞ 「培養基材からシート状細胞培養物を剥離するステップ、及び、培養基材から剥離後に、シート状細胞培養物を２５℃～３９℃で２４時間～７２時間インキュベートするステップ」が、本願発明では「ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞を含有するシート状細胞培養物のサイトカイン産生能および増殖能からなる群から選択される活性を高める方法」のステップであるのに対して、甲Ａ１発明では「培養上清のサイトカイン産生量を測定してサイトカイン産生能を確認する」ためのステップである点。 イ 相違点の検討 甲Ａ１は、その請求項８にも記載されたとおり、シート状細胞培養物を形成する細胞集団における心筋細胞集団の割合を５０％～７０％とすることで、当該割合をこの範囲外とした場合に比較してサイトカイン産生量が高まることを特徴とする発明が記載されており、このことは実施例において実証されている（前記１（１）エ、例５、前記１（１）オ、図２）。 しかし、上記相違点のとおり、甲Ａ１発明の「培養基材からシート状細胞培養物を剥離するステップ、及び、培養基材から剥離後に、シート状細胞培養物を２５℃～３９℃で２４時間～７２時間インキュベートするステップ」は、実施例において、シート状細胞培養物のサイトカイン産生能を確認するために行ったステップにすぎない。この認定は、実施例の記載に加え[0041]や[0049]を含めた明細書の他の記載をみても、甲Ａ１には、上記の「サイトカイン産生能を確認するためのステップ」を、「シート状細胞培養物の製造方法」の一貫として実施するとか、「シート状細胞培養物」を製造後、それを対象に適用する前に実施することを示唆する記載がないことからも妥当する。 そして、甲Ａ１には、シート状細胞培養物を培養又はインキュベーションする温度・時間に係る条件で比較するサイトカイン産生量の違いについては記載がない。また、培養基材から剥離したシート状細胞培養物をインキュベートする温度と時間を変更することにより当該シート状細胞培養物のサイトカイン産生能を変更できることが本件出願時の技術常識であったとも認められない。 したがって、当業者といえども、甲Ａ１に基づいて「培養基材からシート状細胞培養物を剥離するステップ、及び、培養基材から剥離後に、シート状細胞培養物を２５℃～３９℃で２４時間～７２時間インキュベートするステップ」によりシート状細胞培養物のサイトカイン産生能を高めるという技術思想を導き出すことはできず、上記相違点を当業者が容易に想到し得たものとはいえない。 ウ 小括 以上からすると、本件発明１は、甲Ａ１に記載された発明であるとはいえないし、同発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえない。 （３）本件発明２～５について 本件発明２～４は、本件発明１を直接又は間接的に引用するものであり、本件発明５は、本件発明１に対して温度条件が「２４時間～７２時間」から「７２時間」に限定されたものであるから、本件発明１と同様の理由により、甲Ａ１に記載された発明であるとはいえないし、同発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえない。 （４）申立人Ａの主張について 申立人Ａは、特許異議申立書において、甲Ａ１の実施例における、シート状細胞培養物を３７℃で２日間培養し、培養上清に含まれるＶＥＧＦ及びＳＣＦの濃度を測定した部分の開示内容（前記１（１）エ、例５、前記１（１）オ、図２）に基づき、３７℃で２日間の培養によって、培養前や４℃で保存した場合に比べてサイトカイン産生能が高まっていることは明らかであること等の理由から、甲Ａ１には、本件発明の全ての構成要件を満たす発明が記載されている旨主張する。 しかしながら、前記（１）に示すとおり、甲Ａ１には、シート状細胞培養物を形成する細胞集団における心筋細胞集団の割合を５０％～７０％とすることを主な特徴として、当該シート状細胞培養物のサイトカイン産生量を高めることが記載されており、このことを、実施例において、シート状細胞培養物を３７℃、５％ＣＯ２にて２日間培養した後、培養上清に含まれるサイトカインであるＶＥＧＦ及びＳＣＦの濃度を測定することにより確認したことが記載されていると認められるところ、前記（１）～（２）イに示すとおり、本件発明１に対して相違点を有する甲Ａ１発明が認定されるから、申立人Ａの上記主張は採用できない。 （５）小括 以上のとおりであるから、申立てＡの理由は、理由がない。 ４ 申立てＢの理由（甲Ｂ１～甲Ｂ７に基づく進歩性欠如）についての判断 （１）甲Ｂ１に記載された発明の認定 甲Ｂ１には、心臓の機能を回復させるために用いる心臓組織シートを作製し、その有効性と治療機構を示すために（前記２（１）イ）、マウスＥＳ細胞から誘導されたＦｌｋ１＋細胞をゼラチンコーティングされた培養基材に播種して、内皮細胞、及び壁細胞を選択的に誘導した後、ＥＳ細胞から誘導された心筋細胞を含む細胞懸濁液をさらに播種して培養することにより、心筋細胞、内皮細胞、及び壁細胞を含む細胞シートが自然に培養基材から剥離したこと（前記２（１）ウ）、血管新生の分子機構を解明するために、当該心臓組織シートの培養上清から、ＶＥＧＦ等の血管新生因子の分泌量を調べたこと（前記２（１）エ、第１２０１頁左欄～第１２０２頁左欄「Neovascularization Following Cardiac Tissue Sheet Transplantation」）、そしてこの際には、細胞シートを培養基材で３時間培養した後の培養上清を用い、相対的な分泌量増加が確認されたこと（前記２（１）オ）が記載されている。 そうすると、甲Ｂ１には、次のとおりの発明が記載されていると認定できる。 「マウスＥＳ細胞由来の心筋細胞、内皮細胞、及び壁細胞を含む細胞を培養基材で培養することにより、培養基材から剥離した心臓組織シートを得るステップ、及び当該心臓組織シートを３時間培養するステップを含む方法。」（以下、「甲Ｂ１発明」という。） （２）本件発明１について ア 対比 本件発明１と甲Ｂ１発明とを対比する。 甲Ｂ１発明の「マウスＥＳ細胞由来の心筋細胞、内皮細胞、及び壁細胞を含む細胞を培養基材で培養することにより、培養基材から剥離した心臓組織シートを得るステップ」は、培養基材上で心臓組織シートが形成された後、これが剥離している工程といえるから、本件発明における「心筋細胞を含有するシート状細胞培養物を培養基材上に提供するステップ」及び「培養基材からシート状細胞培養物を剥離するステップ」に相当する工程を含むものである。また、甲Ｂ１発明の「培養」は本件発明１の「インキュベート」に該当する。 そして、甲Ｂ１発明における「ＥＳ細胞」は、本件発明１における「ｉＰＳ細胞」と多能性幹細胞である点で共通する。 そうすると、両者の一致点と相違点は、以下のとおりである。 ＜一致点＞ 多能性幹細胞由来の心筋細胞を含有するシート状細胞培養物を培養基材上に提供するステップ、培養基材からシート状細胞培養物を剥離するステップ、及び、培養基材から剥離後にシート状培養物をインキュベートするステップを含む方法である点。 ＜相違点１＞ 本件発明１は、「ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞を含有するシート状細胞培養物のサイトカイン産生能および増殖能からなる群から選択される活性を高める方法」であることが特定されているのに対し、甲Ｂ１発明ではその特定がない点。 ＜相違点２＞ シート状細胞培養物を構成する心筋細胞について、本件発明１ではｉＰＳ細胞由来であるのに対し、甲Ｂ１発明ではＥＳ細胞由来である点。 ＜相違点３＞ 培養基材から剥離後のインキュベートの条件が、本件発明１では、「２５℃～３９℃で ２４時間～ ７２時間」であるのに対し、甲Ｂ１発明では、「３時間」と特定されるだけで、温度は不明である点。 イ 相違点１の検討 甲Ｂ１には、心臓組織シートを３時間培養した後、培養上清に分泌したＶＥＧＦ等の相対的な分泌量増加を評価したことが記載されている（前記２（１）オ））ものの、この相対的な分泌量増加は、甲Ｂ１の図５において、心筋細胞、内皮細胞、及び壁細胞を含むC+E+MシートからのVEGF分泌量を内皮細胞及び壁細胞を含むE+MシートからのVEGF分泌量と比較して相当に高い結果が示されていること（前記２（１）エ、第１２０２頁左欄～右欄「Prospective Examination of Functional Roles of CMs with Cell type-Controlled Tissue Sheets」、図５）等を参酌すると、心筋細胞、内皮細胞、及び壁細胞を含むように細胞シートを作製した場合と、構成する細胞を変えて細胞シートを作製した場合で比較した相対的な分泌量増加であると認められるところ、甲Ｂ１には、心臓組織シートを培養又はインキュベーションする温度・時間に係る条件を変化させてサイトカイン産生量を高める技術思想は開示されていない。 当該技術思想は、甲Ａ１と同一文献である甲Ｂ３においても、前記３（２）イに示すように開示されておらず、その他の甲Ｂ２、甲Ｂ４～甲Ｂ７においても開示されていないから、前記相違点１を甲Ｂ１～甲Ｂ７の記載事項に基づき当業者が容易に想到し得たものとはいえない。 ウ 小括 以上からすると、本件発明１は、前記アの相違点２、３を検討するまでもなく、甲Ｂ１～甲Ｂ７に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえない。 （３）本件発明２～５について 本件発明２～４は、本件発明１を直接又は間接的に引用するものであり、本件発明５は、本件発明１に対して温度条件が「２４時間～７２時間」から「７２時間」に限定されたものであるから、本件発明１と同様の理由により、甲Ｂ１～甲Ｂ７に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえない。 （４）申立人Ｂの主張について 申立人Ｂは、特許異議申立書において、甲Ｂ１における、心臓組織シートを３時間インキュベートした後にＶＥＧＦ等のサイトカインの産生を測定した部分の記載事項（前記２（１）オ）から、本件発明における「心筋細胞を含有するシート状細胞培養物のサイトカイン産生能」「を高める方法」という構成要件を満たす発明が記載されている旨主張する。 しかしながら、前記イに示すとおり、甲Ｂ１には、シート状細胞培養物の温度・時間に係る培養条件で特定される方法によって「心筋細胞を含有するシート状細胞培養物のサイトカイン産生能」「を高める方法」開示されているとは認められないから、申立人Ｂの上記主張は採用できない。 （５）小括 以上のとおりであるから、申立てＢの理由は、理由がない。 第５ むすび 以上のとおり、特許異議申立てＡにおいて申立人Ａが主張する理由、特許異議申立てＢにおいて申立人Ｂが主張する理由によっては、本件発明１～５に係る特許を取り消すことはできない。 また、他に本件発明１～５に係る特許を取り消すべき理由を発見しない。 よって、結論のとおり決定する。