2023-009945

特願２０１８－２４８９２４「マイクロＲＮＡを含む体液抽出物」拒絶査定不服審判事件〔令和 ２年 ６月１８日出願公開、特開２０２０－ ９２６８８〕について、次のとおり審決する。

結 論 本件審判の請求は、成り立たない。

理 由 第１ 手続の経緯 本願は、特許法第３０条第２項（発明の新規性の喪失の例外）の規定の適用を受けようとする旨を願書に記載して平成３０年１２月１２日にされた特許出願であって、その主な手続の経緯は次のとおりである。 平成３１年 １月１１日 ：新規性の喪失の例外の規定の適用を受けるための証明書１～１３４の提出 令和 ４年１０月２７日付け：拒絶理由通知書 令和 ５年 ２月２７日 ：意見書の提出 令和 ５年 ３月１３日付け：拒絶査定 令和 ５年 ６月１５日 ：審判請求書の提出 令和 ５年 ７月２１日 ：審判請求書を対象とする手続補正書の提出 第２ 本願発明 本願の請求項１～３２に係る発明は、願書に最初に添付した特許請求の範囲の請求項１～３２に記載された事項により特定されるとおりのものと認めるところ、その請求項１に係る発明（以下、「本願発明」という。）は、次のとおりのものである。 「【請求項１】 データＳ１または表２に記載のいずれかのマイクロＲＮＡを含む、尿の抽出物。」 第３ 原査定の拒絶の理由 原査定の拒絶の理由の概要は次のとおりである。 １．（発明の単一性）この出願は、下記の点で特許法第３７条に規定する要件を満たしていない。 ２．（新規性）この出願の請求項１－５，７，２４－２７，２９，３１に係る発明は、その出願前に日本国内又は外国において、頒布された下記の刊行物１に記載された発明又は電気通信回線を通じて公衆に利用可能となった発明であるから、特許法第２９条第１項第３号に該当し、特許を受けることができない。 ３．（進歩性）この出願の請求項１－５，７，２４－２７，２９，３１に係る発明は、その出願前に日本国内又は外国において、頒布された下記の引用文献１に記載された発明又は電気通信回線を通じて公衆に利用可能となった発明に基いて、その出願前にその発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。 引用文献１：Science Advances, 2017.12.15, Vol. 3, e1701133, pp.1-19 第４ 当審の判断 １ 引用文献１の記載事項 引用文献１には、以下の事項が記載されている。（引用文献１は英語で記載されているので、当審による翻訳文で示す。また、下線は当審にて付加したものである。以下、同様である。） （１） 「ナノワイヤを介して大量のがん関連尿中マイクロＲＮＡ候補を発見」（表題） （２） 「尿中の細胞外小胞（ＥＶ）内のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を分析することは、ｍｉＲＮＡに基づいたシンプルで非侵襲的な早期疾患診断やタイムリーな健康診断を実現するために重要である。しかし、尿から希薄濃度のＥＶ（<0.01体積%）を収集することの本質的な難しさが、これらの診断や健康診断の開発を妨げてきた。我々は、マイクロ流体基板に固定されたナノワイヤで構成されたデバイスを提案する。このデバイスは、高効率ＥＶ収集と、従来の超遠心分離法で抽出される種の数を大幅に上回る、異なる配列のさまざまなｍｉＲＮＡ（約1000種類）のｉｎ ｓｉｔｕ抽出を可能にする。緩衝液の流れ中の基板に固定されたナノワイヤの機械的安定性とナノワイヤへのＥＶの静電収集は、提案されたデバイスの成功を保証する2つの重要なメカニズムである。さらに、我々はこの方法論を使用して、泌尿器系の悪性腫瘍（膀胱や前立腺）だけでなく、非泌尿器系の悪性腫瘍（肺、膵臓、肝臓）のバイオマーカーとして役立つ可能性のある尿中のｍｉＲＮＡを特定する。現在のデバイス コンセプトは、尿に基づくがんの早期診断と健康診断という長期目標に向けた研究の基盤を提供する。」（要約） （３） 「序 エクソソーム、マイクロベシクル、及びアポトーシス小体を含む（一部の著者は、前記の３つの型の小胞とマイクロソームとを含む全ての膜小胞をさらに網羅してＥＶの語を用いる（4,5））、直径４０－５０００ｎｍの細胞外小胞（ＥＶ）に含まれるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は（1－4）、健康な対象と悪性疾患の患者の両方の様々な体液中に見いだされている（6－20）。２つのグループ間でのＥＶ内包ｍｉＲＮＡの差は、さまざまな疾患シナリオの警告サインを表している可能性がある (20)。ｍｉＲＮＡのＥＶ内包には、ＲＮＡ分解に対するリボヌクレアーゼ効果を低下させることができるという利点があるため (21)、ＥＶ内のｍｉＲＮＡは自由浮遊ＲＮＡよりもはるかに安定している。これにより、自由浮遊ｍｉＲＮＡ分析からＥＶ内包ｍｉＲＮＡ分析への切り替えが促進される。 従来、ＥＶ収集には、超遠心分離法又は分画遠心分離法、免疫親和性に基づく捕捉法、及びサイズ排除クロマトグラフィーという３つの主要な方法が使用されてきた（4）。有望な代替法として、ポリマー沈殿法（22）、マイクロ流体ベースのプラットフォーム（23－26）、及びサイズベースの濾過（27）を含むいくつかの新しい手法が報告されている。しかし、ＥＶ内包ｍｉＲＮＡを収集する既存の方法は、シンプルで非侵襲的な尿に基づいた早期疾患診断やタイムリーな健康診断のための要件を満たさない。これは、尿中のＥＶ濃度がきわめて低い（＜0.01体積％）ためである（28）。例えば、最も一般的に使用されている方法である超遠心分離法によって、研究者は、尿中ＥＶを収集し、ＥＶ内包ｍｉＲＮＡを抽出し（29、30）、２００から３００の尿ｍｉＲＮＡを同定した（31）。２０００を超えるヒトｍｉＲＮＡが発見されているが、ｍｉＲＮＡ種の他の９０％が組織特異的な機能のため尿に存在しないのか、それとも単に存在量が少ないために超遠心分離法によって検出できないのかは不明である。同定された尿中ｍｉＲＮＡの数が少なく、考えられる疾患の多様性を反映できないため、２つめの仮定は、研究者が尿に基づいた早期疾患診断やタイムリーな健康診断を実現する動機となる。代替法が必要とされている。 ここで、我々は、尿ＥＶ内包ｍｉＲＮＡを収集するナノワイヤに基づく方法論を提案する。この方法論では、異なる配列の膨大な数の尿ｍｉＲＮＡが明らかになる。この方法論は、尿からのｍｉＲＮＡに基づいた非侵襲的でシンプルな早期疾患診断やタイムリーな健康診断というゴールに、研究者を近づける。ナノワイヤは細胞や細胞内成分の性質の分析に大きな可能性を示しているが（32－39）、これまでの研究はＥＶ収集への応用を扱っていない。我々は、マイクロチャネル中のナノワイヤの表面電荷、比較的大きな表面積、及び機械的安定性を検討する。この方法論は、基本的に、少量のサンプルと短い処理時間でのＥＶ内包ｍｉＲＮＡ分析を行うことを可能にし、ＥＶの収集は１ｍｌの尿と２０分しか必要としない。溶解緩衝液の流れの間のポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）に固定化したナノワイヤの機械的安定性は、２０分で尿ＥＶ内包ｍｉＲＮＡをｉｎ ｓｉｔｕ抽出するのに効率的であり、従来法より多くの異なる種類のｍｉＲＮＡ（約１０００種類）が収集されたＥＶから抽出される。」（第１頁左欄第１行－右欄最下段） （４） 「結果 尿ＥＶ内包ｍｉＲＮＡの収集のための方法論を実現するために、我々は、マイクロ流体基板に固定化されたナノワイヤを開発した。これらのナノワイヤは、ＥＶを静電的に収集し、その後にＥＶ内包ｍｉＲＮＡをｉｎ ｓｉｔｕで抽出するための固相として重要な役割を果たすことができる（図１及び動画Ｓ１）。」（第２頁左欄第１行－第６行） （５） 「ナノワイヤが組み込まれたＰＤＭＳ基板 我々は４つの工程でナノワイヤが組み込まれたＰＤＭＳ基板を作製した（40）（図Ｓ１）。第１の工程で、Ｓｉ基板上の熱酸化処理したクロム層からナノワイヤを成長させた。第２の工程で、成長したナノワイヤの上に硬化していないＰＤＭＳを注いだ。第３の工程で、ＰＤＭＳを硬化させてナノワイヤと共に剥がすことにより、ナノワイヤをＰＤＭＳに埋め込み（図１Ｂ）、第４の工程で、埋め込まれたナノワイヤからナノワイヤを成長させ、これをナノワイヤ組み込みＰＤＭＳ基板と名付けた（図１Ｃ）。埋め込まれたナノワイヤの鉛直断面の電界放出型走査型電子顕微鏡（ＦＥＳＥＭ）像は、ナノワイヤが均一かつ深くＰＤＭＳに埋め込まれ、その頭部がわずかに露出していることを示し（図１Ｂ）、その頭部が二次的ナノワイヤ成長の成長点となっていることを示した（図１Ｃ及び図Ｓ２）。ナノワイヤのないＰＤＭＳとナノワイヤ埋め込みＰＤＭＳの断面ＦＥＳＥＭ像のエネルギー分散型Ｘ線分析（ＥＤＳ）元素マッピングを比較し、ＺｎＯナノワイヤがＰＤＭＳに埋め込まれていることを確認した（図Ｓ３）。加えて、鉛直断面及び全体ＦＥＳＥＭ像及び断面ＦＥＳＥＭ像のＥＤＳ元素マッピングは、二次的ナノワイヤ成長が埋め込まれたナノワイヤ上で生じたことが示され、このようにして、我々はナノワイヤ埋め込みＰＤＭＳ基板の作製に成功した。ナノワイヤとＥＶとの接触を促進し、圧力降下を防ぐために、ナノワイヤ組み込みＰＤＭＳ基板のカバーとしてナノワイヤ長（２μｍ）より大きなチャンネル高（５０μｍ）を備えたマイクロ流体ヘリングボーン構造（41）を有するＰＤＭＳ基板を用い、当該ヘリングボーン構造は溶液の良好な対流と分散を保証する（図１Ｄ）。尿中のＥＶ内包ｍｉＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕ抽出のためのナノワイヤ組み込みマイクロ流体デバイスは、ナノワイヤ組み込みＰＤＭＳ基板をマイクロ流体ヘリングボーン構造を有するＰＤＭＳ基板に接着させ、尿サンプルを導入し、および回収するためのポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）チューブに接続することによって完成させた（図１Ｄ）。ＰＤＭＳに組み込まれたナノワイヤは、溶解緩衝液への暴露に対して機械的安定性を示し、ＰＤＭＳに組み込まれていないナノワイヤに対して生じるような基板からのナノワイヤの剥離を防いだ（図１Ｅ及びＦ、及び図Ｓ４）。」（第２頁左欄第７行－第３頁左欄第１１行） （６） ［図：0001421814000001.jpg］ 図１ 尿中ＥＶのナノワイヤによる静電的回収とそれに続くＥＶ内包ｍｉＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕ抽出 （Ａ）ナノワイヤ組み込みマイクロ流体デバイスを用いた尿中のＥＶの回収（捕捉）とＥＶ内包ｍｉＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕ抽出に関する模式図。（Ｂ）ＰＤＭＳの注ぎ込み、硬化および剥離の後の埋め込まれたナノワイヤと、埋め込まれたナノワイヤの鉛直断面ＦＥＳＥＭ像の模式図（灰色のロッドで示されるナノワイヤ、透明なシアンの領域で示されるＰＤＭＳ）と切断面像を示す左下の模式的挿入図を示す。黄色がナノワイヤを示し、青がＰＤＭＳを示し、白の点線はＰＤＭＳの縁を示す。スケールバーは、１μｍを示す。（Ｃ）埋め込まれたナノワイヤ（ナノワイヤ組み込みＰＤＭＳ）からのナノワイヤの成長に関する切断面像を示す模式図と左下の模式的挿入図およびナノワイヤ組み込みＰＤＭＳの鉛直切断面像。スケールバーは、１μｍを示す。（Ｄ）ナノワイヤ組み込みＰＤＭＳのマイクロ流体へリングボーン構造を有するＰＤＭＳ基板に接着することに関する切断面像模式図と左下の模式的挿入図と、導入口と導出口のためのＰＥＥＫチューブを備えたナノワイヤ組み込みマイクロ流体デバイス（ナノワイヤ組み込みＰＤＭＳとマイクロ流体へリングボーン構造のＰＤＭＳ基板とを接着したもの）の写真と、ＰＤＭＳ基板上のマイクロ流体へリングボーン構造のレーザー顕微鏡像。スケールバーは、１μｍを示す。（Ｅ）溶解緩衝液への暴露後のナノワイヤ組み込みデバイスの模式図（灰色のロッドで示されるナノワイヤ、透明なシアンの領域で示されるＰＤＭＳ）とナノワイヤ組み込みＰＤＭＳの上面からのＦＥＳＥＭ像。スケールバーは、１μｍを示す。（Ｆ）Ｓｉ基板上のナノワイヤの模式図と（灰色のロッドで示されるナノワイヤ、濃いシアンの領域で示されるＳｉ基板、薄いシアンの領域で示されるＣｒ層）、溶解緩衝液への暴露後のＳｉ基板上のナノワイヤの上面からのＦＥＳＥＭ像。 （７） 「ｍｉＲＮＡ発現のマイクロアレイ分析 ｍｉＲＮＡ発現のマイクロアレイ分析（２５６５種類）は、本デバイスによる抽出が、従来の超遠心法や市販のキット（エクソクイック－ＴＣ、ポリマー沈殿法）による抽出と比較して大きな多様性を有するｍｉＲＮＡ種（約１，０００種）の抽出を可能とすることが明らかとなった（図２および図Ｓ５Ａ）。４０分間（回収に２０分間、および抽出に２０分間）以内の尿中のＥＶ内包ｍｉＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕ抽出が、本デバイスに尿サンプル（１ｍｌ）を導入してから溶解緩衝液（１ｍｌ）を導入することによって実証された。これに対して、２０ｍｌの尿の超遠心法によるＥＶからのｍｉＲＮＡの抽出では、１ｍｌの溶解緩衝液へのＥＶの懸濁によることが示され、かつ、回収と抽出に５時間以上を要することが明らかとなった。本研究で用いた市販のキットは小分子ＲＮＡの収率に関して他のＥＶ単離方法よりも優れていることが報告されている（図Ｓ５のＢ及びＣ）（22）ため、上記キットを用いて１ｍｌの尿から回収したＥＶを１ｍｌの溶解緩衝液で懸濁することによってｍｉＲＮＡの抽出を行ったところ、この作業には、回収と抽出に１４時間以上が必要とされることが明らかとなった。超遠心法によるｍｉＲＮＡの抽出よりも２０倍以下の尿の消費量であったにもかかわらず、本デバイスで抽出されたｍｉＲＮＡの発現レベルは、超遠心法により得られるｍｉＲＮＡよりもはるかに高いことが散布図およびヒストグラムから明らかとなった（図２Ａ及びＢ）。普通に考えれば、２０倍量以上の尿を用いたのであるから、超遠心法で得られたｍｉＲＮＡの量は、本デバイスで得られるｍｉＲＮＡの量よりも高くなるはずであるが、結果は逆であった。超遠心法と比較して、本デバイスは、５倍高いｍｉＲＮＡ量をもたらし（図２Ａ）、かつ、抽出可能なｍｉＲＮＡの種類も多様であった（本デバイスによるｍｉＲＮＡの抽出量：７４９，８２２、種類：１，１１１種類；遠心法によるｍｉＲＮＡの抽出量：１７１ ，２６１、種類：３５２種類）（図２Ｂ）。加えて、散布図とヒストグラムによれば、本デバイスを用いて抽出されるｍｉＲＮＡの量は、消費した尿サンプルの容量は同じであったにもかかわらず、キットによって得られるｍｉＲＮＡの量よりもはるかに高かった（図２Ｃ及びＤ）。キットと比較して、本デバイスは、４倍高いｍｉＲＮＡ量をもたらし（図２Ｃ）、かつ、抽出可能なｍｉＲＮＡの種類も多様であった（本デバイスによるｍｉＲＮＡの抽出量：７４９，８２２、種類：１，１１１種類；キットによるｍｉＲＮＡの抽出量：３３７，３５５、種類：４９１種類）（図２Ｄ）。従って、我々の方法論は、他の方法論と比較して、ｍｉＲＮＡの抽出効率（図２）、抽出時間（図Ｓ５Ａ及びＢ）、および小分子ＲＮＡの抽出効率（図１０Ｃ）に関して優れていることが結論付けられた。」（第３頁左欄第１２行－第４頁左欄第２行） （８） ［図：0001421814000002.jpg］ 図２ ナノワイヤ組み込みマイクロ流体デバイスを用いたｍｉＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕ抽出 （Ａ）ナノワイヤ組み込みデバイスと超遠心法によって回収したＥＶから抽出されたｍｉＲＮＡの正規化した強度の散布図。各ポイントは異なるｍｉＲＮＡタイプ（すなわち、種）に対応する。ピンクとシアンの境界は２つのアプローチでｍｉＲＮＡの発現レベルが同じであることを意味する。（Ｂ）ナノワイヤ組み込みデバイスを用いた方法（ピンク）と超遠心法（シアン）により抽出できたｍｉＲＮＡ種のヒストグラム。エラーバーは一連の測定値のＳＤを示す（ｎ＝３）。（Ｃ）ナノワイヤ組み込みデバイスと市販のキットによって回収したＥＶから抽出されたｍｉＲＮＡの正規化した強度の散布図。各ポイントは異なるｍｉＲＮＡタイプ（すなわち、種）に対応する。ピンクと灰色の境界は２つのアプローチでｍｉＲＮＡの発現レベルが同じであることを意味する。（Ｄ）ナノワイヤ組み込みデバイスを用いた方法（ピンク）と市販のキット（灰色）により抽出できたｍｉＲＮＡ種のヒストグラムを示す。エラーバーは、測定（ｎ＝３）のＳＤを示す。「ａ．ｕ．」は、任意単位（ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｕｎｉｔ）を示す。 （９） 「ＥＶ回収能力 本デバイスを用いたｉｎ ｓｉｔｕ抽出が多様な種類のｍｉＲＮＡを提供できることを明らかにするために、本デバイスがＥＶを回収する能力を確認すると、本デバイスは効率良くＥＶを回収することができることを示した（図３）。未処理の尿において、本開示のデバイスで処理された尿のフロースルー分画（投入量：１ｍｌ）において、および超遠心法で処理された尿（投入量：２０ｍｌ）において、尿の遊離浮遊物の総量が、それぞれ３．４μｌ、８．８ｎｌ、および１１．１ｎｌであることを考慮すると、本開示のデバイスによる浮遊物の回収効率は９９％以上であると見積もられ、超遠心法により得られる用量よりも大きな容量を回収することができた（回収されたＥＶの容量は、未処理の尿の容量から処理された尿の容量を控除することによって計算された）（図３Ａ～３Ｃ）。蛍光標識ＥＶを観察した後で、マイクロ流体ヘリングボーン構造を有するＰＤＭＳ基板からナノワイヤ組み込みＰＤＭＳを剥離してそのＦＥＳＥＭ像を取得した。これにより、ナノワイヤによって回収される遊離浮遊物がＥＶを含むことが明らかとなった（図３Ｃ及び３Ｄ）。ナノワイヤによって回収される遊離浮遊物がＥＶを含むことをさらに確認するために、ＥＶ上に発現する膜タンパク質であり、エクソソームの膜上に発現することが知られるＣＤ６３およびＣＤ８１を検出した（2,42－44）。ナノワイヤ上（または９６穴プレートのウェル）に回収された尿中のＥＶ（濃度：１．４×１０８ｍｌ－１）の蛍光強度は、ナノワイヤだけがこれらの膜タンパク質を回収することができることを示した（図３Ｅ）。このことは、本開示のデバイスにおいてナノワイヤ上でＥＶが効率的に回収できることを示す。次に、ＺｎＯナノワイヤが１０ｎｍ厚のＡｌ２Ｏ３層によって完全に被覆されたＺｎＯ－Ａｌ２Ｏ３のコア－シェルナノワイヤを調製した（図Ｓ６）。ＺｎＯ－Ａｌ２Ｏ３のコア－シェルナノワイヤは、Ａｌ２Ｏ３の等電点が約７．５であることから、ｐＨ６～８において電荷的にほぼ中性（若干陽性または若干陰性であり得る）の表面を有することとなる（45、46）。ＥＶの回収に対してナノワイヤの表面の荷電状態が優勢な効果を有するのかを概算するために、ＺｎＯ－Ａｌ２Ｏ３のコア－シェルナノワイヤを用いた（図Ｓ７）。尿中のＥＶはｐＨ６～８では負に荷電した表面を有すること（図Ｓ８）、相対的に大きい表面積を有し、ＺｎＯの等電点が約９．５であることから（47、48）ｐＨ６～８では正に荷電した表面を有するＺｎＯナノワイヤが、高効率のＥＶの回収を可能とすることが理解できる。これらの結果から、ＺｎＯナノワイヤがＥＶなどの２００ｎｍまでの直径を有する尿の遊離浮遊物を９９％以上の回収効率で回収することができることが一層明らかになった。」（第４頁左欄第３行－右欄最下行） （１０） ［図：0001421814000003.jpg］ 図３ ナノワイヤ上へのＥＶの回収 （Ａ）実験工程と回収効率の算出に関する模式図。（Ｂ）未処理の尿中における尿の遊離浮遊物のサイズ分布。エラーバーは、一連の測定値のＳＤを示す（ｎ＝３）。（Ｃ）ナノワイヤ組み込みデバイスによって処理された尿のフロースルー分画（ピンク）と超遠心された尿（シアン）における、尿の遊離浮遊物のサイズ分布。エラーバーは、一連の測定値のＳＤを示す（ｎ＝３）。（Ｄ）ナノワイヤで回収された、蛍光（ＲＫＨ２６）標識されたＥＶ。赤はナノワイヤ上のＲＫＨ２６標識されたＥＶを示す。スケールバーは、５００μｍを示す。（Ｅ）ＰＫＨ２６標識ＥＶの導入後のナノワイヤのＦＥＳＥＭ像。白い矢印は、回収されたＥＶを示す。スケールバーは、２００ｎｍを示す。（Ｆ）ＣＤ６３またはＣＤ８１に対する抗体を用いたナノワイヤ上（ピンク）および９６穴プレート上（シアン）の尿中のＥＶの検出。尿中の遊離浮遊物の測定濃度は、１．４×１０８ｍｌ－１であった。「Ｎ．Ｄ．」は、蛍光が観察されなかったことを示す。黒い点線は、バックグラウンドの上の３ＳＤのシグナルレベルを示す。エラーバーは、一連の測定値のＳＤを示す（ナノワイヤでｎ＝２４；９６穴プレートでｎ＝３）。 （１１） 「ナノワイヤによるＥＶの回収のメリット 本デバイスを用いたｉｎ ｓｉｔｕ抽出が、なぜ超遠心抽出やキットを用いた抽出よりも優れているのかを考慮するために、我々は２つの可能なシナリオを検討した。第１のシナリオは、本デバイスはエクソソーム及びマイクロ小胞を回収することができるというもので、第２のシナリオは、本デバイスのみがＥＶフリーのｍｉＲＮＡを回収できるというものである。超遠心法により回収できた物、すなわちエクソソーム（９．０ｎｌ；図Ｓ９Ａ））の量を、回収されなかった物（１１．１ｎｌ；図３Ｃ）に加算して得られる測定された濃度及び体積は、計算された濃度及び体積と一致しない（３．４μｌ、図３Ｂ）。このことは、超遠心法では主にエクソソームが回収されていることを示唆するが（4、5、29）、現在の精製方法では未だエクソソームとマイクロベシクルとは完全に区別することが容易ではない（1）。超遠心法は多くのマイクロベシクルは超遠心チューブの内壁に対して押しつけ、融合および崩壊する可能性があり、この過程でマイクロベシクルに内包されたｍｉＲＮＡが周辺に放出されてしまう可能性がある。超遠心によるＥＶの回収の仕組みは、負荷される力と回収される物の密度のバランスに基づくものであるため、超遠心の実験的条件は、放出されたｍｉＲＮＡの回収には適しないと考えられる。他方で、ナノワイヤによるＥＶ回収の仕組みは、正に荷電したナノワイヤと負に荷電した物との静電的相互作用に基づくものであると考えられ、これによりナノワイヤは、エクソソームおよびマイクロベシクルを回収することができると考えられる。さらに、ｍｉＲＮＡなどの核酸は、ｐＨ６～８では負に荷電する表面特性を有するので、ナノワイヤはＥＶ－フリーのｍｉＲＮＡを回収できると考えられる。しかし、遊離ｍｉＲＮＡの回収は、超遠心法やポリマー沈降法では不可能であると考えられる。ナノワイヤ上のｍｉＲＮＡの回収効率は充分ではないものの、溶解緩衝液を導入することによる回収効率はほぼ１００％であった（図Ｓ９Ｂ参照）。正に荷電した表面を有するナノワイヤは、エクソソーム、マイクロベシクル、及び遊離ｍｉＲＮＡなどの尿中の負に荷電した物質を回収する際に顕著な利益をもたらすであろう。 回収効率、得られる試料の選択性、及び尿中ｍｉＲＮＡを回収できる能力などの特性（表１参照）を考慮し、本デバイスは、高い回収効率、低い試料選択性（エクソソーム、マイクロベシクル、及び遊離ｍｉＲＮＡ）、及び高い回収能力を有し、超遠心法は回収効率が低く、得られる物の選択性が高く（エクソソームのみ）、かつ回収能力が低く、キットは、これらの特性において中間的であると我々は結論づける。プロタミン／ポリエチレングリコールを用いて４℃で一晩インキュベートする（エクソクイックと同様である）ことによって達成されるＥＶのプロタミン沈降法による、ＥＶの電荷に基づく単離手法（49）と比較して、本デバイスによる尿ＥＶ内包ｍｉＲＮＡの抽出においては、室温で４０分（回収または吸着に２０分および抽出に２０分）が必要されるのみであるとの利点がある。加えて、ｐＨ６．３以下で正に荷電した表面を生じるアミン基を有するキトサンポリマーを用いる遊離核酸のための荷電に基づく単離手法（50）と比較して、本デバイスによるＥＶ内包ｍｉＲＮＡの抽出においては、ｐＨ６～８の尿においてナノワイヤが正に荷電することが保証されているという利点を有する。本研究におけるナノワイヤによるＥＶの回収機構は複雑であるが、我々の知見は、溶解緩衝液のアプライ中におけるＰＤＭＳに組み込まれたナノワイヤの機械的安定性と、ＺｎＯナノワイヤへのＥＶ（及び、さらに、ＥＶフリーｍｉＲＮＡ）の静電相互作用による回収は、２つの重要な機構であり、尿のｍｉＲＮＡの分析に基づいて疾患の早期診断や適時の健康診断が可能となると期待される。」（第５頁左欄第１行－第６頁右欄最下行、第１４頁左欄第１行－第１６行） （１２） ［図：0001421814000004.jpg］ 表１ ３つの方法論の間の比較 （１３） ［図：0001421814000005.jpg］ 図４ ナノワイヤ組み込みマイクロ流体デバイスを用いたがん関連ｍｉＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕ抽出。非がんのドナー、肺がんのドナー、膵がんのドナー、肝がんのドナー、膀胱がんのドナーおよび前立腺がんのドナーの尿サンプルそれぞれに対するｍｉＲＮＡ発現アレイのヒートマップ（ｎ＝３）。 各ｍｉＲＮＡの発現や各群間の比較を直観的に理解するためにシグナル強度に基づいて色のグラデーションが用いられている。対数シグナル強度が５である場合が黒；２以下が青；８以上が黄色である。ヒートマップの各カラムは、各ｍｉＲＮＡの対数シグナル強度を表す。 （１４） ［図：0001421814000006.jpg］ 図５ 非がんのドナーと各種がんのドナーとの間での図４から抽出されたｍｉＲＮＡの下方制御と過剰発現 抽出されたｍｉＲＮＡは、一方の群の２番目に大きい対数シグナル強度よりも、他方の群の３つのパルスの２番目に小さい対数シグナル強度が大きいものとした。記号「－」および「＋」はそれぞれ、非がんのドナーおよびがんのドナーを示す。ピンクの線は、一方の最も小さな対数シグナル強度が他方の３つのパルスの最大の対数シグナル強度よりも大きかったことを示し、強調表示されたｍｉＲＮＡが他のｍｉＲＮＡよりも優れていることがわかる。緑とオレンジの線は、それぞれ、がん特異的に下方制御されたｍｉＲＮＡと過剰発現されたｍｉＲＮＡを示す。 （１５） ［図：0001421814000007.jpg］ ［図：0001421814000008.jpg］ ［図：0001421814000009.jpg］ ［図：0001421814000010.jpg］ ［図：0001421814000011.jpg］ ［図：0001421814000012.jpg］ ［図：0001421814000013.jpg］ 表２には、図５で示されたがんに関連する可能性のある尿中のｍｉＲＮＡが挙げられており、第７頁の表の下から４段目には、肺がんで過剰発現しているｍｉＲＮＡの一つとしてｍｉＲ－３１６３が記載され、その生物学的機能として非小細胞肺がんの細胞成長を阻害することが挙げられている。 （１６） 「様々ながん患者ドナーの尿サンプルからの未発見のｍｉＲＮＡの同定 最後に、デバイスを用いた尿ＥＶ内包ｍｉＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕ抽出が、様々ながん患者ドナーの尿サンプルから未だ発見されたことのないｍｉＲＮＡを同定することができるという可能性を示した（図４参照）。デバイスは１ｍｌの尿サンプルから多くの種類のｍｉＲＮＡを分析することができるため、がん患者ドナーと健常者（非がんドナー）の尿サンプルにおけるｍｉＲＮＡ発現をヒートマップ上で比較した。我々の知る限り、１ｍｌの尿サンプルにおいて異なる配列のがんに関連する可能性のある大量のｍｉＲＮＡを明らかにしたことを報告する最初の例である。尿サンプルからのｍｉＲＮＡは異なる発現レベルを有していた。がん患者ドナーと非がんドナーとの尿の比較により、減少しているｍｉＲＮＡと増加しているｍｉＲＮＡとが明らかになった（図５および表２参照）。ヒートマップにより、減少しているｍｉＲＮＡと増加しているｍｉＲＮＡの組み合わせががんの新しい指標の候補となることが示唆され、これは単一のｍｉＲＮＡバイオマーカーに頼るという既成概念に反するものである。 公表された結果（52－59）との比較に基づいて、統計学的に有意に下方制御された又は過剰発現したｍｉＲＮＡを明確に認識するためには、さらに多くの試験を行う必要があるが、本デバイスは、主に、生理学的機能が不明なｍｉＲＮＡ及び生理学的機能が報告されているｍｉＲＮＡという２つのタイプのｍｉＲＮＡの群を明らかにするといえる。さらに、生理学的機能が不明なｍｉＲＮＡの群は、潜在的ながんに関連するｍｉＲＮＡの群及び遊離ｍｉＲＮＡに由来するアーティファクトの群という２つのサブグループに分けられる。生理学的機能が報告されているｍｉＲＮＡの群も、ｍｉＲ－５２０ｃ－３ｐ（がん抑制因子であり、全てのがん患者由来の尿中で減少していたｍｉＲＮＡ）などの疾患の転帰と正に相関するｍｉＲＮＡの群（53－57）及びｍｉＲ－１６－１－３ｐ（胃がん細胞の浸潤と転移を抑制するｍｉＲＮＡであり、肝がん患者および膀胱がん患者由来の尿において過剰発現していたｍｉＲＮＡ）などの機能と疾患との反直感的な相関を示すｍｉＲＮＡの群という２つのサブグループに分けられる（60）。反直感的な事例においては、以下の３つの可能性が考えられた：第１に、患者が潜在的に対応するリスクを有する可能性；第２に、ｍｉＲＮＡの機能と疾患のリスクとの関係についての現在の研究が、関係するｍｉＲＮＡとがんのタイプとの間の関係をカバーできていない可能性；第３に、ｍｉＲＮＡがアーティファクトに帰される可能性。尿サンプルを採取する前の徹底した健康診断、相関関係に関するさらなる研究、及びより多くの試験が、これらの可能性に対する答えを提供するだろう。我々は、過剰発現していたｍｉＲＮＡを、これまでに報告された、膀胱がん患者由来の４ｍｌの尿から市販のキットで抽出した尿のｍｉＲＮＡ（細胞フリーおよびエクソソーム由来の増加したｍｉＲＮＡの上位２５個として示された）（96）と比較し、ｍｉＲ－４４５４を含む２０種のｍｉＲＮＡが本研究により見出された（データＳ１）。しかし、これらのｍｉＲＮＡは、がんの指標の候補として同定されたものではない。理由は、結果に含まれるｍｉＲＮＡが非がん対象においても見出され、さらに、非がんドナーと膀胱がん患者の尿とで対数蛍光強度に有意差は認められなかったためである。さらに試験を実施すれば、これらのｍｉＲＮＡが候補として同定されるかどうか、残り５種類のｍｉＲＮＡが見つかるかどうかを決定することができる（人口１００万人超で９５％の信頼性と５％の標本誤差で統計的に有意な差を示すには、３８４回の試験を実施する必要がある）。」（第１４頁左欄第１７行－右欄第１２行） （１７） 「考察 まとめると、ＰＤＭＳ基板に組み込まれたナノワイヤとマイクロ流体ヘリングボーン構造のＰＤＭＳ基板とを結合した、我々のナノワイヤを固定したマイクロ液体デバイスが、最も一般的な従来の超遠心法と比べて尿ＥＶ内包ｍｉＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕ抽出に対して、より高い効率を達成することを示した。驚くべきことに、本デバイスは超遠心分離法よりも小さいサンプル体積及び短い処理時間を用いるにもかかわらず、超遠心分離法よりもはるかに多くの種類のｍｉＲＮＡを抽出することができた。正に荷電した表面を有するナノワイヤはＥＶの高効率回収に重要な役割を果たし、溶解緩衝液の流れの間のＰＤＭＳに固定化したナノワイヤの機械的安定性はｍｉＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕ抽出に重要な影響を及ぼした。我々は、泌尿器がんだけでなく非泌尿器がんに対して、ほんの１ｍｌの尿試料からがんに関連するｍｉＲＮＡを見いだすことができた。バイオマーカーの認識にはさらなる試験を行う必要があるものの、本研究の結果は、我々が開発したアプローチは将来の医療応用のために尿試料中のがん関連ｍｉＲＮＡを見いだし、タイムリーな健康診断のための尿ｍｉＲＮＡに基づいた診断を行うための新たな戦略を研究者に提供する強力なツールになると確信している。」（第１４頁右欄第１３行－第３３行） （１８） 「材料と方法 ＰＤＭＳに固定されたナノワイヤの作製方法 Ｓｉ（１００）基板（Ａｄｖａｎｔｅｃｈ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を洗浄した後に（図Ｓ１Ａ）、正フォトレジスト（ＯＦＰＲ８６００，Ｔｏｋｙｏ Ｏｈｋａ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）でＳｉ基板上を被覆し、次いで、フォトリソグラフィによってチャンネルパターンを形成した（図Ｓ１Ｂ）。スパッタリングによってその基板上に１４０ｎｍ厚のＣｒ層（触媒層）を堆積させた（図Ｓ１Ｂ）。フォトレジストの除去後に（図Ｓ１Ｄ）、Ｃｒ層を４００℃で２時間、熱酸化処理した。この熱酸化Ｃｒ層は、ＺｎＯナノワイヤの成長のためのシード層とした。ＺｎＯナノワイヤは、得られた基板を１５ｍＭヘキサメチレンテトラミン（ＨＭＴＡ；Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｌｔｄ．）と１５ｍＭ硝酸亜鉛６水和物（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）の混合溶液中に９５℃で３時間浸漬することによって成長させた（図Ｓ１Ｅ）。基板上で成長したナノワイヤは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水を用いて洗浄し、真空デシケーター中で一晩空気乾燥させた。その後、ＰＤＭＳ（Ｓｉｌｐｏｔ １８４，Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｒｐ．）をナノワイヤが成長した基板上に注ぎ、硬化させた（図Ｓ１Ｆ）。基板からＰＤＭＳを剥がすと、ナノワイヤは、基板からＰＤＭＳに転写された（図Ｓ１Ｇ）。転写されたナノワイヤは、頭部を僅かに露出させつつ、ＰＤＭＳに均一に深く埋め込まれており（図Ｓ１Ｈ）、その頭部は、二次的ナノワイヤのための成長点を提供した。二次的ナノワイヤの成長は、１５ｍＭ ＨＭＴＡと１５ｍＭ硝酸亜鉛６水和物の混合溶液中で、得られたＰＤＭＳを９５℃で３時間浸漬することにより行った（図Ｓ１Ｉ参照）。ナノワイヤを埋め込んだＰＤＭＳ基板をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ水で洗浄した後に、真空デシケーター中で空気乾燥させ、ナノワイヤの直径とナノワイヤ間の間隔をＦＥＳＥＭ（ＳＵＰＲＡ ４０ＶＰ，Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を用いて測定した。」（第１４頁右欄第３４行－第１５頁左欄第６行） （１９） 「尿ＥＶ内包ｍｉＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕ抽出のためのナノワイヤ固定化マイクロ流体デバイス 尿のＥＶ内包ｍｉＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕ抽出のためのナノワイヤ固定化マイクロ流体デバイスは、ナノワイヤ組み込みＰＤＭＳ基板とヘリングボーン構造のＰＤＭＳ基板とを接着させることによって作製した。ヘリングボーン構造のＰＤＭＳ基板は、１２μｍの高さのヘリングボーン構造を伴うマイクロチャンネル（幅、２ｍｍ；長さ、２ｃｍ；及び高さ、５０μｍ）を有した。ナノワイヤ組み込みＰＤＭＳ基板とヘリングボーン構造のＰＤＭＳ基板の表面をプラズマエッチング装置（Ｍｅｉｗａｆｏｓｉｓ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）で処理し、接着させた。この接着されたデバイスは、１８０℃で３分間加熱し、強い接着を達成させた（図Ｓ１Ｊ）。次に、ヘリングボーン構造のＰＤＭＳを、注入口および出口に関してポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）チューブ［０．５ｍｍ（外径）×０．２６ｍｍ（内径）；長さ、１０ｃｍ；Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．Ｌｔｄ．］に連結させた。マイクロ流体ヘリングボーン構造は、回収効率の向上に寄与した（図Ｓ１０参照）。」（第１５頁左欄第７行－第２２行） （２０） 「断面ＦＥＳＥＭ像のＥＤＳ元素マッピング ナノワイヤを有しないＰＤＭＳ、ナノワイヤが埋め込まれたＰＤＭＳ、及びＺｎＯナノワイヤ固定化ＰＤＭＳの元素マッピングは、ＥＤＳ機能を備えたＦＥＳＥＭ（ＪＳＭ－７６１０Ｆ，Ｊｅｏｌ）によって得た。上面視像及び断面像に対しては、それぞれ５ｋｅＶ及び３０ｋｅＶの加速電圧条件を用いた。像は、５１２×３８４ピクセルであり、各ピクセルの遅延時間は０．１秒であった。像は、１００サイクルに対して統合された。Ｓｉ Ｋα（１．７３９ｋｅＶ）及びＺｎ Ｌα（１．０１２ｋｅＶ）のピークを選択して、元素マッピング像を構築した。ＺｎＯ－Ａｌ２Ｏ３のコア－シェルナノワイヤの元素マッピングは、３０ｋｅＶの加速電圧条件でＥＤＳ機能を備えたＦＥＳＥＭによって実施した。走査透過電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）試料の調製のために、通常の切断刀を用いて基板からナノワイヤを切り取り、回収して密着法によってＴＥＭグリッド（炭素マイクログリッドを備えたＣｕメッシュ，ＪＥＯＬ）上に載せ替えた。ＳＴＥＭ像は、５１２×３８４ピクセルであり、各ピクセルの遅延時間は０．１ｍｓであった。像は、１００サイクルに対して統合された。Ｚｎ Ｋα（８．６３０ｋｅＶ）、Ｏ Ｋα（０．５２５ｋｅＶ）、およびＡｌ Ｋα（１．４８６ｋｅＶ）のピークを選択して、元素マッピング像を構築した。」（第１５頁左欄第２３行－第４２行） （２１） 「ナノワイヤ固定化マイクロ流体デバイスを用いた尿ＥＶ内包ｍｉＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕ抽出 市販の尿（単一ドナーのヒト尿、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．）を使用前に遠心分離（１５分、４℃、３０００ｇ）し、アポトーシス小体を除去した（5）。その後、１ｍＬ尿サンプルをシリンジポンプ（ＫＤＳ－２００，ＫＤ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を用いて５０μＬ／分の流速でナノワイヤ固定化デバイスに導入した。ナノワイヤ上に回収されたＥＶからのｍｉＲＮＡの抽出は、細胞溶解緩衝液Ｍ［２０ｍＭ ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４），２００ｍＭ塩化ナトリウム，２．５ｍＭ塩化マグネシウム，および０．０５ｗ／ｖ％ ＮＰ－４０；Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｌｔｄ．］をシリンジポンプを用いて５０μＬ／分の流速でナノワイヤ組み込みデバイスに導入することによって実施した。ナノワイヤの剥離を研究する実験においても同じ溶解緩衝液を５０μＬ／分の流速で使用した（図１Ｉ－Ｋ、および図Ｓ４）。」（第１５頁左欄第４３行－最下行） （２２） 「超遠心を用いた尿におけるＥＶ回収とそれに続くｍｉＲＮＡ抽出 市販の尿（単一ドナーのヒト尿）を使用前に遠心分離（１５分、４℃、３０００ｇ）し、アポトーシス小体を除去した（5）。その後、尿を遠心分離（１５分、４℃、１２０００ｇ）して細胞の残骸を除去した（29）。次に、２０ｍＬの尿サンプルを超遠心（２時間、４℃、１１０，０００ｇ）した（29）。上清を取り除き、回収されたＥＶに対して０．２２μｍフィルタでろ過したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を２０ｍＬ添加して、さらに超遠心した（７０分、４℃、１１０，０００ｇ）（29）。上清を取り除き、回収されたＥＶに対して０．２２μｍフィルタでろ過したＰＢＳを２０ｍＬ添加して、３度目の超遠心（７０分、４℃、１１０，０００ｇ）を行った。最後に、上清を除去し、溶解緩衝液を加えてｍｉＲＮＡを抽出した。」（第１５頁右欄第１行－第１４行） （２３） 「市販のキットを用いた尿におけるＥＶ回収とそれに続くｍｉＲＮＡ抽出 市販の尿（単一ドナーのヒト尿）を、使用前に、アポトーシス小体を除去するために（5）遠心分離（１５分、４℃、３０００ｇ）した。ＥＶをキット（エクソクイック－ＴＣ，Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）の製造者取扱説明書に従って、１ｍＬの尿サンプルから回収した。最後に、溶解緩衝液を添加してｍｉＲＮＡを抽出した。」（第１５頁右欄第１５行－第２２行） （２４） 「ｍｉＲＮＡ発現のマイクロアレイ分析 ｍｉＲＮＡの発現プロファイルは、東レ社の３Ｄ－Ｇｅｎｅ（Ｔｏｒａｙ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）ヒトｍｉＲＮＡチップを用いた。溶解緩衝液で抽出されたｍｉＲＮＡは、ＳｅｒａＭｉｒ Ｅｘｏｓｏｍｅ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｌ－ｕｍｎ Ｋｉｔ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）を用いてその製造者取扱説明書に従って精製した。１５μＬの精製ｍｉＲＮＡを、３Ｄ－Ｇｅｎｅ Ｈｕｍａｎ ｍｉＲＮＡ Ｏｌｉｇｏ ｃｈｉｐ ｖｅｒ．２１（Ｔｏｒａｙ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を用いたｍｉＲＮＡのプロファイリングのために分析した。２５６５のヒトｍｉＲＮＡプローブを含むｍｉＲＮＡの発現のマイクロアレイ分析では、シグナル強度それぞれが一種のｍｉＲＮＡに対応する。各ｍｉＲＮＡの発現レベルは、各マイクロアレイにおけるすべてのｍｉＲＮＡのシグナル強度（バックグラウンドを控除したもの）として表現される。同一の尿のｍｉＲＮＡサンプルにおけるナノワイヤを用いた抽出と超遠心分離または市販のキットを用いた抽出とによるｍｉＲＮＡ間の発現レベルの対比においては、シグナル強度は全体を通して標準化された。全体を通して標準化され、１０以上の強度（ナノワイヤを用いた抽出による強度／超遠心または市販のキットを用いた抽出による強度）を示したものに対して散布図を作成した。従って、散布図上の各点は、標準化された強度である。同一の尿のｍｉＲＮＡサンプルにおけるナノワイヤを用いた抽出と超遠心分離または市販のキットを用いた抽出とによるｍｉＲＮＡ間の発現レベルの対比に関しては、シグナル強度がｌｏｇ２変換された。がんドナーのおよび非がんドナーの尿サンプル間でのｍｉＲＮＡの比較に関しては、各サンプルの全体を通して標準化された強度がｌｏｇ２変換された。標準化された強度は、ヒートマップ上では黒（強度＝５）、青（強度≦２）および黄（強度≧８）で示された。」（（第１５頁右欄第２３行－第４７行） （２５） 「ＥＶのゼータ電位 超遠心工程の後で、ＥＶのゼータ電位を動的光散乱装置（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．）を用いて測定した。」（第１５頁右欄第４８行－第５１行） （２６） 「尿の遊離浮遊物のサイズ分布と濃度 尿の遊離浮遊物のサイズ分布と濃度は、ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．）を用いて測定した。未処理の尿における、本デバイスで処理された尿のフロースルー分画における、および超遠心後の尿における、直径２００ｎｍまでの尿の遊離浮遊物の濃度は、それぞれ２．６×１０１２ｍｌ－１、５．８×１０９ｍｌ－１、および３．５×１０９ｍｌ－１であった。尿の遊離浮遊物のサイズ分布および濃度は、１００－ｎｍ ｎａｎｏｐｏｒｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＮＰ１００，Ｍｅｉｗａｆｏｓｉｓ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を装着したｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ｑＮａｎｏ，Ｍｅｉｗａｆｏｓｉｓ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を用いて測定した。未処理の尿における、ナノワイヤ固定化デバイスで処理された尿のフロースルー分画における、および超遠心後の尿における、尿の遊離浮遊物の濃度は、それぞれ１．４×１０１２ｍｌ－１、２．４×１０１０ｍｌ－１、および２．５×１０１０ｍｌ－１であった。」（第１５頁右欄第５２行－第１６頁左欄第１２行） （２７） 「ＥＶの蛍光分子標識 ＥＶの脂質二重層に透過することができる蛍光分子であるＰＫＨ２６（励起光／蛍光＝５５１／５６７ｎｍ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．ＬＬＣ）を用いてＥＶを標識した。０．２２－μｍフィルタにてろ過したＭｉｌｌｉｐｏｒｅ水（２４０μＬ）中で、１．５×１０８ｍｌ－１のＥＶに対してＰＫＨ２６を５ｍｇ添加した。ＰＫＨ２６で標識されたＥＶは、シリンジポンプを用いて１０μｌ／分の流速でナノワイヤを備えたデバイスに導入され、次いで、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水を同じ流速でデバイスに導入して、未回収のＥＶを除去した。最後に、蛍光顕微鏡（ＡＺ１００，Ｎｉｋｏｎ Ｃｏｒｐ．）を用いてＥＶの蛍光を観察した。その後、ナノワイヤ組み込みデバイスを剥離し、ＦＥＳＥＭ（ＳＵＰＲＡ ４０ＶＰ，Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を用いてＥＶを回収したナノワイヤを観察した。」（第１６頁左欄第１３行－第２４行） （２８） 「膜タンパク質の検出 ナノワイヤを備えたデバイスにＥＶを導入した後にＰＢＳを導入して未回収のＥＶを除去した。その後、当該デバイスに１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａ－ｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を導入して１５分間静置した。ＰＢＳを用いて当該デバイスを洗浄した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８標識したマウス抗ヒトＣＤ６３モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）またはマウス抗ヒトＣＤ８１モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ；Ａｂｃａｍ ＰＬＣ）を当該デバイスに導入し、１５分間静置した。ＣＤ８１の検出においては、当該デバイスを洗浄した後にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８標識のヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体を二次抗体として当該デバイスに導入し、その後１５分間静置した。最後に、ＰＢＳで当該デバイスを洗浄し、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）下で蛍光強度を観察した。バックグラウンドの値を得るために、ＥＶサンプルの代わりにＰＢＳを用いた。９６穴プレート（Ｎｕｎｃ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を用いた検出に関しては、プレートのウェルにＥＶサンプルを注入し、６時間静置し、サンプルを廃棄した。プレートをＰＢＳで洗浄した後、プレートのウェルに１％ＢＳＡ溶液を導入し、９０分間静置し、溶液を廃棄した。再度、ＰＢＳでプレートを洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８標識したマウス抗ヒトＣＤ６３モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）またはマウス抗ヒトＣＤ８１抗体（１０μｇ／ｍｌ）をプレートのウェルに導入し、４５分間静置した。ＣＤ８１の検出ではこれに加えて、ＰＢＳでプレートのウェルを洗浄した後に、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８標識のヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（５μｇ／ｍｌ）を二次抗体としてプレートのウェルに導入し、その後４５分間静置した。最後に、ＰＢＳでデバイスを洗浄し、プレートリーダー（ＰＯＬＡＲｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡ，ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ Ｊａｐａｎ Ｌｔｄ．）を用いて蛍光強度観察を行った。バックグラウンドの値を得るため、ＥＶサンプルの代わりにＰＢＳを用いた。」（第１６頁左欄第２５行－最下行） （２９） 「ＺｎＯ／Ａｌ２Ｏ３コアシェルナノワイヤの作製 ＺｎＯナノワイヤの作製の後に、原子層堆積装置（Ｓａｖａｎｎａｈ Ｇ２，Ｕｌｔｒａｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）を用いてナノワイヤを被覆した。Ａｌ２Ｏ３の積層について、トリメチルアルミニウムとＨ２Ｏ前駆体１５０℃で１００サイクル用いた。」（第１６頁右欄第１行－第５行） （３０） 「尿サンプルの情報とナノワイヤ組み込みデバイスを用いた尿ＥＶ内包ｍｉＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕ抽出 以下の尿サンプル（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ）を用いた：非がん患者（５３歳、６０歳、および５０歳）、肺がん患者（６８歳、ステージ２ｂ；５４歳、ステージ３ａ；５０歳、ステージ３ｂ）、膵臓がん患者（５６歳、ステージ２ａ；６１歳、ステージ２ａ；７４歳、ステージ３）、肝がん患者（４９歳、ステージ３；６４歳、ステージ３ａ；１８歳、ステージ３ｃ）、膀胱がん患者（６３歳、ステージ１；６５歳、ステージ１；６７歳、ステージ０ａ）、および、前立腺がん（５８歳、ステージ４；５７歳、ステージ２ａ；５４歳、ステージ２ｂ）の尿サンプル。これらの尿サンプルは、使用前に、遠心分離（１５分、４℃、３０００ｇ）し、アポトーシス小体を除去した（5）。１ｍｌの尿サンプルをナノワイヤ固定化デバイスにシリンジポンプを用いて５０μｌ／分の流速で導入した。ナノワイヤ上に回収されたＥＶからのｍｉＲＮＡの抽出は、シリンジポンプを用いて５０ｍｌ／分の流速で溶解緩衝液を導入することによって行った。」（第１６頁右欄第６行－第２１行） （３１） 「がんのバイオマーカーとして役立つ可能性のある尿中ｍｉＲＮＡの同定 Ｚスコア１．９６（９５％信頼水準および５％有意水準）および東レ社により提供されたｌｏｇ２（強度）に対する変動変数（ＣＶ）（具体的数値を有しない）の関係に従って、９５％信頼区間は、（平均）±１．９６×（平均×ＣＶ／１００）を用いて計算した。ｌｏｇ２（強度）＝３である関係においてＣＶに対してＸ％を用いると、信頼区間の上限は、８＋０．１６Ｘであった。ｌｏｇ２（強度）＝５または６におけるＣＶ値は、その関係から０．７Ｘ％および０．５Ｘ％であった。信頼区間の下限は、それぞれ、３２－０．４４Ｘ及び６４－０．６３Ｘであった。５％有意水準を考慮すると、各事例に対するＣＶは、４０および７１％未満であった。図５では、７０％を超えるＣＶ値を合理的であるとはせず、統計学的に有意な閾値に対して３つの対数強度の相違を決定した。」（第１６頁右欄第２２行－第３６行） （３２） 「補足資料 この論文に関する補足資料は http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/3/12/e1701133/DC1で入手できる。 図Ｓ１ ＰＤＭＳ中に組み込まれたナノワイヤの作製プロセスの模式図 図Ｓ２ ＰＤＭＳ中に組み込まれたナノワイヤ 図Ｓ３ ナノワイヤ無しのＰＤＭＳ基板、埋め込まれたナノワイヤを有するＰＤＭＳ基板、およびナノワイヤ組み込みＰＤＭＳ基板それぞれのＦＥＳＥＭ像とそれに対応するＥＤＳ元素マッピング 図Ｓ４ 組み込まれたナノワイヤと組み込まれていないナノワイヤの機械的安定性 図Ｓ５ ナノワイヤ組み込みデバイス、超遠心、および市販のキットを用いる尿中ｍｉＲＮＡの抽出プロセス 図Ｓ６ １本のナノワイヤのＦＥＳＥＭ像とＳＴＥＭ像のＥＤＳ元素マッピング 図Ｓ７ ＺｎＯナノワイヤ、ＺｎＯ／Ａｌ２Ｏ３コア－シェルナノワイヤ、およびナノワイヤ無しの表面上のＥＶの抗ＣＤ９抗体による検出 図Ｓ８ 尿中のＥＶのゼータ電位 図Ｓ９ 超遠心法で回収されたＥＶ及びナノワイヤ上に回収されたＥＶ遊離ｍｉＲＮＡのサイズ分布 図Ｓ１０ 尿の遊離浮遊物のサイズ分布 動画Ｓ１ ナノワイヤ固定化マイクロ流体デバイスを用いたＥＶ回収とそれに続くｍｉＲＮＡ抽出 データＳ１ がんｍｉＲＮＡに対する非がんｍｉＲＮＡの対数シグナル強度」（第１６頁右欄第３７行－最下行） （３３） 「参考文献と注釈 （略）」（第１７頁－第１９頁） ２ 引用文献１に記載された発明 引用文献１には、非がん患者の尿サンプルと比べて肺がん患者の尿サンプルにおいて発現が増加しているｍｉＲＮＡの一つとしてｍｉＲ－３１６３が挙げられており（上記（１５）（１６））、これらのｍｉＲＮＡは尿に含まれるＥＶから抽出されたものであるから（上記（２１）－（２５））、少なくとも、肺がん患者の尿サンプルから得られた抽出物はｍｉＲ－３６１３を含んでいると認められる。 したがって、引用文献１には、 「マイクロＲＮＡであるｍｉＲ－３１６３を含む、尿の抽出物」（以下、「引用発明」という。）が記載されている。 ３ 引用文献１に係る公開行為が、特許法第３０条第２項の規定の適用を受けることができるものか否かについて 審判請求人は、引用発明は「権利者の行為に起因して公開された発明が複数存在する場合に、証明する書面が提出されていなくても特許法第３０条第２項の規定の適用を受けることができる発明」に該当すると主張するので、以下検討する。 （１） 特許法第３０条の規定について 特許法第３０条第１項～第３項は、次のように規定する。 「第三十条 特許を受ける権利を有する者の意に反して第二十九条第一項各号のいずれかに該当するに至つた発明は、その該当するに至つた日から一年以内にその者がした特許出願に係る発明についての同項及び同条第二項の規定の適用については、同条第一項各号のいずれかに該当するに至らなかつたものとみなす。 ２ 特許を受ける権利を有する者の行為に起因して第二十九条第一項各号のいずれかに該当するに至つた発明（発明、実用新案、意匠又は商標に関する公報に掲載されたことにより同項各号のいずれかに該当するに至つたものを除く。）も、その該当するに至つた日から一年以内にその者がした特許出願に係る発明についての同項及び同条第二項の規定の適用については、前項と同様とする。 ３ 前項の規定の適用を受けようとする者は、その旨を記載した書面を特許出願と同時に特許庁長官に提出し、かつ、第二十九条第一項各号のいずれかに該当するに至つた発明が前項の規定の適用を受けることができる発明であることを証明する書面（次項において「証明書」という。）を特許出願の日から三十日以内に特許庁長官に提出しなければならない。」 特許法第３０条第１項の趣旨は、特許要件として新規性が要求されているため、特許出願をすることなく、自ら発明を公開した者は、その後に特許を出願しても、自ら発明を公開したことにより特許を受けられない結果になることがあり得るところ、この結果は、発明者、特に特許法の規定を十分知らない技術研究者にとって酷であり、また、発明を公開した者が公開によって不利益を受けることになっては、産業の発達に寄与するという特許法の目的（同法第１条）に悖る結果ともなることから、一定の要件を具備した場合には、発明が既に公開されていることを理由に特許出願を拒絶されることがないようにするというものである。また、特許法第３０条は、第２９条第１項の例外を定めた規定であり、その解釈適用は、例外を定めた趣旨に合致するように、上記のような発明者を救済するために必要な限度で行われるべきであり、発明者を必要以上に保護したり、社会一般に不測の損害を与える結果を招来したりすることがあってはならないと解される（知財高判平成１９年８月３０日判決（平成１８年（行ケ）第１０５５９号））。現行法の特許法第３０条第２項においても、その趣旨は、旧法（平成２３年、３０年改正前）と変更はなく、上記の趣旨の下、第３０条第２項の例外適用を受けようとする者には、同条第３項の証明書（以下「証明書」という。）の提出が義務づけられている。 そして、同項が、新規性喪失の例外を認める手続として特に定められたものであることからすると、権利者の行為に起因して公開された発明が複数存在するような場合には、本来、それぞれにつき同項の適用を受ける手続を行う必要があるが、手続を行った発明の公開行為と実質的に同一とみることができるような密接に関連する公開行為によって公開された場合については、別個の手続を要することなく同項の適用を受けることができるものと解するのが相当である（大阪地判平成２９年４月２０日判決（平成２８年（ワ）第２９８号、同第２６１０号）とされる。 （２） 新規性喪失の例外適用の証明書１～１３４に係る公開行為と引用文献１に係る公開行為について 平成３１年１月１１日に特許庁に提出された新規性喪失の例外適用の証明書（以下、「証明書」という。）１～１３４によれば、本願発明に係る公開行為として、以下の公開行為があったことが認められる。 国立研究開発法人科学技術振興機構、国立研究開発法人国立がんセンター、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、国立大学法人名古屋大学、国立大学法人九州大学及び安井隆雄が、報道機関に対して、「マイクロＲＮＡを含む体液抽出物」に関する研究について平成２９年１２月１３日から１８日にかけてプレスリリース文を送付して本願発明を公開した（証明書１２～９５、１２８～１３４。以下、これらの公開行為をまとめて「行為１」という。）。 国立研究開発法人科学技術振興機構、国立研究開発法人国立がんセンター、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、国立大学法人名古屋大学、及び、国立大学法人九州大学は平成２９年１２月１６日～１２月２５日に「マイクロＲＮＡを含む体液抽出物」に関する研究について各法人のウェブサイトで発表した（証明書５～７、９～１１。以下、これらの公開行為をまとめて「行為２」という。）。 安井隆雄は、平成２９年１２月２５日に「マイクロＲＮＡを含む体液抽出物」に関する研究について国立大学法人名古屋大学工学部・工学研究科のウェブニュースサイトで発表した（証明書８。以下、当該公開行為を「行為３」という。）。 長縄豪、安井隆雄、柳田剛、加地範匡、長島一樹、鷲尾隆及び馬場嘉信並びに湯川博は、平成２９年１２月２０日から平成３０年１２月５日にかけて、学会、研究会、シンポジウム、大学集中講義、セミナー、講演会において、「マイクロＲＮＡを含む体液抽出物」に関する研究について発表して本願発明を公開した（証明書９６～１２７。以下、これらの公開行為をまとめて「行為４」という。）。 発明者である安井隆雄、馬場嘉信は、平成３０年４月１８日から同年９月１８日にかけて最新医学、コンバーテック、ライフライン２１がんの先進医療、Convertech internationalに対して、「マイクロＲＮＡを含む体液抽出物」に関する研究について公開した（証明書１～４。以下、これらの公開行為をまとめて「行為５」という。）。 一方、学術雑誌出版社であるAmerican Association for the Advancement of Science（AAAS）により、引用文献１が公開された（以下、「引用行為」という。）。 （３） 行為１について 行為１関連証明書のそれぞれは、公開の事実として、国立研究開発法人科学技術振興機構、国立研究開発法人国立がんセンター、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、国立大学法人名古屋大学、国立大学法人九州大学及び安井隆雄が、出版・報道機関に対して、「マイクロＲＮＡを含む体液抽出物」に関する研究について平成２９年１２月１３日から１８日にかけてプレスリリース文を送付して本願発明を公開した事実を記載しているだけであって、American Association for the Advancement of Science（AAAS）による本願発明の事実については証明書には記載されていないものである。 当該プレスリリース文は、令和５年７月２１日に提出した手続補正書に添付された以下のとおりのものと認められるところ、プレスリリースに記載された内容と、引用発明を含む公開行為が行われた引用文献１に記載された内容が実質的に同一の発表行為とみることができるような同一性があるかについて、以下検討する。 ［図：0001421814000014.jpg］ ［図：0001421814000015.jpg］ ［図：0001421814000016.jpg］ ［図：0001421814000017.jpg］ これら記載を １ 引用文献１の記載事項 と比較すると、少なくとも、引用文献１における上記１に示した下線部の部分は、上記プレスリリース文に記載された事項ではない。またそれら記載されていない事項のうち、代表的なものとして以下の記載が挙げられる。 ア 酸化亜鉛ナノワイヤが酸化亜鉛ナノワイヤを製造した後、トリメチルアルミニウムとH2O を使用し原子層堆積装置を使用してナノワイヤに酸化アルミニウムAl2O3を堆積させたZnO /Al2O3コアシェルナノワイヤであること。 （１（９）（３０）） イ 尿中のＥＶに封入されたｍｉＲＮＡを収集する方法論を実現するためにナノワイヤを用いる手法が、まず、Ｓｉ基板上の熱酸化クロム層からナノワイヤを成長させ、次に、成長したナノワイヤの上に未硬化ＰＤＭＳを注ぎ、3番目に、ＰＤＭＳを硬化させてナノワイヤと一緒に剥がすことでナノワイヤをＰＤＭＳに埋め込み、4番目に、埋め込まれたナノワイヤからナノワイヤを成長させることによって得られたナノワイヤを固定したマイクロ流体ＰＤＭＳ基板であること（１（５）（６）（１８））。 ウ 製作されたデバイスとエクソクイック法と超遠心分離を比較すると、製作されたデバイスでは、エクソソーム、マイクロベシクル、ＥＶフリーｍｉＲＮＡが得られること、処理時間が４０分であること、三回試行した際に１１１１種のｍｉＲＮＡが得られたこと（エクソクイック法では４９１種、超遠心分離では３５２種）（１（７）（１１）（１２））。 エ 非がんドナーと各がんドナー間で比較した場合のがん特異的に下方制御されるｍｉＲＮＡおよびがん特異的に過剰発現するｍｉＲＮＡがどれであるかということ（緑の線とオレンジの線）（１（１４）） オ 一方のグループでの最小値が、もう一方のグループの３つのパルス最大値よりも大きいため、他のｍｉＲＮＡよりも優れているとされるｍｉＲＮＡがどれかということ（ピンクの線）（１（１４）） カ 各ｍｉＲＮＡの生物学的機能（表２）（１（１５）） キ 膀胱がん患者の尿を解析しmiR-4454など20種類のｍｉＲＮＡが見つかったが、非がん被験者と膀胱がん患者のサンプル間で対数蛍光強度に有意差が見られなかったため、これらのｍｉＲＮＡをがん指標の候補とは特定しなかったこと（１（１６））。 したがって、行為１関連証明書に記載された発表行為と、引用行為の両者は、少なくとも発表内容において実質的に同一であるということはできない。 行為１に関連する報道発表の主催者・発表者は、国立研究開発法人科学技術振興機構、国立研究開発法人国立がんセンター、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、国立大学法人名古屋大学及び、国立大学法人九州大学であって、引用行為を行った専門学術雑誌の出版社と関連性はなく、引用行為の発表者は、国立研究開発法人や国立大学法人ではなく国内外の個々の研究者であるのだから、発表者も異なる。引用行為の発表者の一部である本願の発明者と、行為１に関連する報道発表の主催者・発表者との関係は行為１関連証明書に記載されているものの、発明者以外の引用行為の発表者については言及されていない。そして、報道発表の受け手である新聞購読者、テレビラジオの視聴者は、それぞれ一般大衆であり、各購読者や視聴者が専門学術雑誌にまで目を通すといえる根拠もないから、引用行為に係る専門学術雑誌の読者と関連性はなく、報道発表と専門学術雑誌における発表はその態様を異にする。 したがって、行為１関連証明書に記載された発表行為と、引用行為の両者は、少なくとも行為の主体、客体、内容、態様のいずれも異にする。そして、行為１においては、引用文献１の書誌情報を引用する箇所があるものの、書誌情報を基にさらに引用文献１の記載内容に接するか否かは、報道発表の受け手の自主的な判断・選択に委ねられるのであるから、記載されたその書誌情報の記載をもってその引用先の公表内容までもが引用元の公表行為において必然的に公表されたとはいえず、両者は密接に関連する行為であるともいえない。したがって、行為１については、引用行為と実質的に同一の発表行為とみることができるような密接に関連する行為であると評価することはできない。 さらに、証明書１４－３０に係る公開日は平成２９年１２月１８日であり、証明書９３及び９４に係る公開日は平成２９年１２月２５日であり、証明書９５に係る公開日は平成２９年１２月２６日であり、引用行為の公開日より後である。また、令和５年２月２７日に提出された意見書には、「引用文献１の公開は日本時間の平成２９年１２月１６日４時（米国東部時間の平成２９年１２月１５日１４時）です」と述べた上で、証明書１２８－１３１、１３３に係る公開日である「平成２９年１２月１３日」について、「プレスリリース文に記された日付は同年１２月１６日となっていますが、行為２は、プレスリリース文を各機関のウェブサイトにおいて公開する前に、特定の公開相手にプレスリリース文を送付したものであって、行為１による公開日は、証明書に記載した通り、１２月１３日であることは疑いありません。」と記載されている。上記「行為２」は、「行為１」の誤記と認められる。しかし、論文発表に関するプレスリリースは、論文の公開予定日時を報道解禁日時とすることが一般的であるから、報道解禁より前の時点において公開されていたと認めることはできない。例えば、同意見書に添付して提出されたプレスリリース文の写しと同一の内容であり、報道解禁日時が明記されているプレスリリース文がインターネット上で公開されている（参考資料１）。よって、証明書１２８－１３１、１３３に係る公開日が、日本時間の平成２９年１２月１３日であると認めることはできない。同じく、プレスリリース文を送付している、証明書１２、１３、３１－９２、１３２、１３４に係る公開日についても、日本時間の平成２９年１２月１３日であると認めることはできない。 したがって、引用行為は行為１の公開行為のいずれかと少なくとも同時か、それよりも前に行われた異なるものであるから、この点においても行為１と同一の行為とみることができるような密接に関連するものであるということはできない。 そうであれば、引用行為は特許法第３０条第３項により行為１についての証明書に記載されたものとみることはできない。 参考資料１：平成２９～３３年度文部科学省科学研究費助成事業 新学術領域研究「分子夾雑化学」分子夾雑の生命化学（http://www.bunshi-kyouzatsu.jp/）に掲載されているプレスリリース文 ３．尿中マイクロＲＮＡから「癌」を特定！（Ａ０３：馬場先生），[online]，［令和７年２月４日検索］，インターネット ＜URL：http://www.bunshi-kyouzatsu.jp/achievement_media＞ ［図：0001421814000018.jpg］ （４） 行為２について 行為２関連証明書のそれぞれは、公開の事実として、国立研究開発法人科学技術振興機構、国立研究開発法人国立がんセンター、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、国立大学法人名古屋大学、及び、国立大学法人九州大学は平成２９年１２月１６日～１２月２５日に「マイクロＲＮＡを含む体液抽出物」に関する研究について各法人のウェブサイトで発表した事実を記載しているだけであって、American Association for the Advancement of Science（AAAS）による引用行為については証明書には記載されていないものである。 行為２の発表内容は、上記行為１において検討したプレスリリース文と実質的に同一ないしその英文による翻訳表記であるから、上記行為１において検討したとおり、行為２関連証明書に記載された発表行為と、引用行為の両者は、少なくとも発表内容において実質的に同一であるということはできない。 行為２の発表者は、国立研究開発法人科学技術振興機構、国立研究開発法人国立がんセンター、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、国立大学法人名古屋大学、及び、国立大学法人九州大学であって、引用行為を行った専門学術雑誌の出版社と関連性はなく、引用行為の発表者は、国立研究開発法人や国立大学法人ではなく国内外の個々の研究者であるのだから、発表者も異なる。引用行為の発表者の一部である本願の発明者と、行為２の発表者との関係は行為２関連証明書に記載されているものの、発明者以外の引用行為の発表者については言及されていない。そして、その公表内容が置かれているウェブサイトは、国立研究開発法人科学技術振興機構ではプレス一覧＞共同発表、国立研究開発法人国立がんセンターでは広報活動＞プレスリリース、国立研究開発法人日本医療研究開発機構では、ニュース＞プレスリリース、国立大学法人名古屋大学では、広報（public-relations）又はニュースに置かれPRESS RELEASEと記載されており、国立大学法人九州大学ではニュース＞研究成果に置かれているから、これらのサイトの閲覧者は国立研究開発法人科学技術振興機構、国立研究開発法人国立がんセンター、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、国立大学法人名古屋大学、及び、国立大学法人九州大学のニュースに対して関心を寄せる者であって、専門学術雑誌の読者と関連性はなく、研究開発法人及び、国立大学法人におけるニュースないしプレスリリースと専門学術雑誌における発表はその態様を異にする。したがって、行為２関連証明書に記載された発表行為と、引用行為の両者は、少なくとも行為の主体、客体、内容、態様のいずれも異にする。そして、行為２においては、引用文献１の書誌情報を引用する箇所があり、リンク先の記載もあるものの、書誌情報及びリンクを基にさらに引用文献１の記載内容に接するか否かは、サイトの閲覧者の自主的な判断・選択に委ねられるのであるから、記載されたその書誌情報及びリンクの記載をもってその引用先の公表内容までもが引用元の公表行為において必然的に公表されたとはいえず、両者は密接に関連する行為であるともいえない。さらに、引用行為は行為２の公開のいずれかと少なくとも同時か、それより前に行われた異なるものである。そうであれば、引用行為は特許法第３０条第３項により行為２についての証明書に記載されたものとみることはできない。 （５） 行為３について 行為３関連証明書は、公開の事実として、安井隆雄が、平成２９年１２月２５日に「マイクロＲＮＡを含む体液抽出物」に関する研究について国立大学法人名古屋大学工学部・工学研究科のウェブニュースサイトで発表した事実を記載しているだけであって、American Association for the Advancement of Science（AAAS）による引用行為については証明書には記載されていないものである。 行為３の発表内容は、ナノワイヤデバイスに尿を導入し、マイクロRNAを抽出・検出したところ、尿中から1,000種類にもおよぶマイクロRNA種の回収に成功したこと、非がん患者と5種類のがん（膀胱がん、前立腺がん、肺がん、膵臓がん、肝臓がん）患者の尿をナノワイヤデバイスに導入し、抽出・検出されるマイクロRNAを比較すると、がん種ごとに検出される各マイクロRNA種の検出量の傾向が異なることが分かり、がん診断が可能であることが示唆されたことにとどまり、行為１について検討した引用文献１のみに記載されている事項は何ら記載されていないから、上記行為１において検討したとおり、行為３関連証明書に記載された発表行為と、引用行為の両者は、少なくとも発表内容において実質的に同一であるということはできない。 行為３の発表者である安井隆雄は、引用文献１の引用行為を行った専門学術雑誌の出版社と関連性はなく、引用行為の発表者は、安井隆雄だけではなく、Takeshi Yanagida, Satoru Ito, Yuki Konakade, Daiki Takeshita,Tsuyoshi Naganawa, Kazuki Nagashima, Taisuke Shimada, Noritada Kaji, Yuta Nakamura, Ivan Adiyasa Thiodorus, Yong He,Sakon Rahong, Masaki Kanai, Hiroshi Yukawa, Takahiro Ochiya, Tomoji Kawai, Yoshinobu Babaが含まれるのであるから、発表者も異なる。そして、当該サイトの閲覧者は国立大学法人名古屋大学工学部、工学研究科の研究者に対して関心を寄せる者であって、専門学術雑誌の読者と関連性はなく、国立大学法人における研究者紹介と専門学術雑誌における発表はその態様を異にする。したがって、行為３関連証明書に記載された発表行為と、引用行為の両者は、少なくとも行為の主体、客体、内容、態様のいずれも異にする。そして、行為３においては、引用文献１の書誌情報を表示する箇所があるものの、書誌情報を基にさらに引用文献１の記載内容に接するか否かは、サイトの閲覧者の自主的な判断・選択に委ねられるのであるから、記載されたその書誌情報の記載をもってその引用先の公表内容までもが引用元の公表行為において必然的に公表されたとはいえず、両者は密接に関連する行為であるともいえない。さらに、引用行為は、行為３の公開日よりも前に行われたものである。そうであれば、引用行為は特許法第３０条第３項により行為３についての証明書に記載されたものとみることはできない。 （６） 行為４について 行為４関連証明書のそれぞれは、公開の事実として、平成２９年１２月２０日から平成３０年１２月５日にかけて、学会、研究会、シンポジウム、大学集中講義、セミナー、講演会において、「マイクロＲＮＡを含む体液抽出物」に関する研究について発表して本願発明を公開した事実を記載しているだけであって、American Association for the Advancement of Science（AAAS）による引用行為については証明書には記載されていないものである。 行為４に関連する学会、研究会、シンポジウム、大学集中講義、セミナー、講演会の主催者は、引用行為を行った専門学術雑誌の出版社と関連性はなく、行為４の発表者も長縄豪、安井隆雄、柳田剛、加地範匡、長島一樹、鷲尾隆及び馬場嘉信並びに湯川博であるところ、引用行為の著者には、さらにSatoru Ito, Yuki Konakade, Daiki Takeshita, Taisuke Shimada, Yuta Nakamura, Ivan Adiyasa Thiodorus, Yong He, Sakon Rahong, Masaki Kanai, Takahiro Ochiya, Tomoji Kawaiが含まれるのであるから、発表者も異なる。そして、学会、研究会、シンポジウム、大学集中講義、セミナー、講演会等の出席者と専門学術雑誌の読者も関連性はなく、学会、研究会、シンポジウム、大学集中講義、セミナー、講演会における発表と専門学術雑誌における発表はその態様を異にする。したがって、行為４関連証明書に記載された発表行為と、引用行為の両者は、少なくとも行為の主体、客体、態様のいずれも異にする。そうすると、行為４において仮に引用文献１の書誌情報等に言及したり表示したりする箇所があったとしても、書誌情報等を基にさらに引用文献１の記載内容に接するか否かは、出席者の自主的な判断・選択に委ねられるのであるから、書誌情報の言及ないし記載をもってその引用先の公表内容までもが引用元の公表行為において必然的に公表されたとはいえず、両者は密接に関連する行為であるともいえない。さらに、引用行為は、行為４の公開日よりも前に行われたものである。そうであれば、引用行為は特許法第３０条第３項により行為５についての証明書に記載されたものとみることはできない。 （７） 行為５について 行為５関連証明書のそれぞれは、公開の事実として、平成３０年４月１８日から同年９月１８日にかけて最新医学、コンバーテック、ライフライン２１がんの先進医療、Convertech internationalに対して、「マイクロＲＮＡを含む体液抽出物」に関する研究について発表して本願発明を公開した事実を記載しているだけであって、American Association for the Advancement of Science（AAAS）による引用行為については証明書に記載されていないものである。 行為５に関連する専門学術雑誌の出版社は引用行為を行った専門学術雑誌の出版社と関連性はなく、対象として想定される購読者層も関連性はなく、行為５の発表者も安井隆雄、馬場嘉信及び湯川博並びに高橋綾子であるところ、引用行為の著者には、さらに：Takeshi Yanagida, Satoru Ito, Yuki Konakade, Daiki Takeshita, Tsuyoshi Naganawa, Kazuki Nagashima, Taisuke Shimada, Noritada Kaji, Yuta Nakamura, Ivan Adiyasa Thiodorus, Yong He, Sakon Rahong, Masaki Kanai, Takahiro Ochiya, Tomoji Kawaiが含まれるのであるから、発表者も異なる。引用文献１が参考文献記載部分込みで英文で１９頁、参考文献記載部分を除き１６頁にわたるのに対して行為５関連の専門学術雑誌の記載量はいずれも５～７頁にとどまるから、上記行為１で検討したことと同様に、専門学術雑誌に報告された内容量を含め発表内容が実質的に同一であるとはいえない。したがって、行為５関連証明書に記載された発表行為と、引用行為の両者は、少なくとも行為の主体である出版社及び発表者、客体、内容のいずれも異にする。そうすると、行為５において仮に引用文献１の書誌情報等を記載する記載があるとしても、書誌情報等を基にさらに引用文献１の記載内容に接するか否かは、雑誌読者の自主的な判断・選択に委ねられるのであるから、書誌情報の言及ないし記載をもってその引用先の公表内容までもが引用元の公表行為において必然的に公表されたとはいえず、両者は密接に関連する行為であるともいえない。さらに、引用行為は、行為５の公開日よりも前に行われたものである。そうであれば、引用行為は特許法第３０条第３項により行為５についての証明書に記載されたものとみることはできない。 （８） 特許法第３０条第２項の規定の適用の可否についての判断 発明者から特許を受ける権利を譲渡された出願人は、行為１ないし行為５については、証明書の提出を行っていたから、特許法第３０条第２項の規定を知っていたと認められる。また、引用文献１の公開行為は、発明者の論文投稿に基づいて行われたものであるから、権利者若しくは権利者が公開を依頼した者によって公開されたものであり、当該公開行為について権利者は知っていたものと認められる。そして、当該引用文献１の公開行為について、証明書の提出ができなかったとする事情も認められない。 特許法第３０条第２項の趣旨は、特許法の規定を十分知らない者を救済するために必要な限度で行われるべき例外的な措置である（上記（１））ところ、この趣旨に照らせば、特許法の規定を知っていた権利者の依頼に基づく引用文献１の公開行為について、権利者が証明書の提出を省略したことを救済することは、必要な限度の範囲を超えるものである。 以上を総合考慮すると、引用発明に係る引用行為について特許法第３０条第２項の規定の適用を受けることはできない。 （９） 特許法第３０条第２項の規定の適用についての審判請求人の主張に係る判断 審判請求人の主張について、以下検討する。 審判請求人は、「条件（i）は、「公開された『発明』が同一又は同一であるとみなすことができる」ことを求めているのであって、「公開された『文献』が同一又は同一とみなすことができる」ことを求めてい」ないとして、プレスリリース文と引用文献１とが文献として同一であるか否かで判断するのではなく、プレスリリース文と、引用文献１とで、どのような発明が公開されたか、すなわち、プレスリリース文から把握される技術的思想の創作と、引用文献１から把握される技術的思想の創作とが同一か否かで判断することが求められると解され」ると述べ、引用文献１に記載されている、背景技術や、ナノワイヤによるＥＶ回収の条件、各解析方法の条件等の詳細は、プレスリリース文には存在しないものの、「バイオマーカーとして有用なｍｉＲＮＡ」は、引用文献１及びプレスリリース文の両方で公開されており、引用文献１でのみ公開されていた記載から把握される発明は、本願発明の新規性及び進歩性に影響するものではないと主張している。具体的には、引用文献１には、がんマーカーとして有用と考えられるｍｉＲＮＡが図５及び表２に記載されており、ここで挙げられたｍｉＲＮＡの全ては、プレスリリースの図３に記載されているから、引用文献１に記載された「尿中に肺癌マーカーとして有用なｍｉＲ－３１６３等に代表されるｍｉＲＮＡを同定したこと」から把握される発明は、プレスリリースにおいて公開された発明と同一であるか又は同一とみなすことができると主張している。 しかし、（１）で述べたとおり、同項が、新規性喪失の例外を認める手続として特に定められたものであることからすると、権利者の行為に起因して公開された発明が複数存在するような場合には、本来、それぞれにつき同項の適用を受ける手続を行う必要があるが、手続を行った発明の公開行為と実質的に同一とみることができるような密接に関連する公開行為によって公開された場合については、別個の手続を要することなく同項の適用を受けることができるものと解するのが相当（大阪地判平成２９年４月２０日判決（平成２８年（ワ）第２９８号、同第２６１０号）とされるところ、手続を行った発明の公開行為と手続きを行っていない公開行為が実質的に同一とみることができるような密接に関連する公開行為であることが求められる。 したがって、審判請求人が主張するように、手続きを行っていない公開行為に公開された部分が本願の新規性及び進歩性に影響するものではない場合には、実質的に同一とみることができるような密接に関連する公開行為に該当することをいうものではなく、証明書提出手続を行った行為１～行為５の公開行為と手続きを行っていない引用行為が実質的に同一とみることができるような密接に関連する公開行為であるとはいえないことは、（１）～（８）で述べたとおりであるから、審判請求人の主張は採用できない。 審判請求人は、さらに、「プレスリリースには、ｍｉＲ－３１６３が肺がん患者で過剰発現することが示されています（プレスリリース・図３、左列参照）。」と述べているが、プレスリリース文の図３から読み取れるのは、左列に示されるｍｉＲＮＡは非がん患者と肺がん患者の発現量に差が確認されたものであること、及び、その一つとしてｍｉＲ－３１６３が挙げられていることにとどまる。図３にはそれ以上の説明がなされておらず、左列に示されるマイクロＲＮＡのそれぞれが、がん特異的に下方制御されているのか、それとも過剰発現しているのかは明記されていないし、図中の「－」、「＋」の意味が一義的に明らかではなく、「強度」が何を意味するのかも明らかにされていないから、審判請求人の主張は採用できない。 審判請求人は、「プレスリリースの目的は、引用文献１が公表されることを、特定の相手方に対して事前に告知するものであり、両行為は密接に関連していると考えるべきで」あり、「プレスリリースには、引用文献１の記載内容が分かりやすくまとめられて」おり、また、「引用文献１のタイトル、著者名、掲載雑誌名、及びDOIが記載され、引用文献１が特定されている以上、学術論文の重要性が高い本願発明の属する技術分野の常識からすれば、プレスリリースの公開行為は、引用文献１の公開行為と「深い関係で（＝密接に）つながりがある（＝関連する）」ことは明らか」であると主張している。しかし、論文発表に関するプレスリリース文を報道機関に送付する行為は、研究成果をより多くの人に伝えてもらうことを目的とする情報発信の一つにすぎず、引用文献１の公開行為は、行為１又は行為２がなくても生じるものである。行為１又は行為２によって引用文献１の公開行為が必然的に生じるなどの、両公開行為が密接に関連するといえる事情がないため、両者を密接に関連する公開行為であるということはできない。 審判請求人は、さらに、特許審査基準に示される例３における「学会発表によって公開された発明」と「学会発表内容の概略を記載した講演要旨集の発行によって公開された発明」との関係が、本願における引用文献１の公開行為と行為１の関係と同一であり、何らの差異が認められるものではないと述べているが、「第２項適用発明」が、例３においては「学会発表内容の概略を記載した講演要旨集の発行によって公開された発明」の内容を全て包含し、同一主催者によって開催された「学会発表によって公開された発明」であり、本願においては引用行為によって公開された内容の全てを包含することがないものであり、かつ行為の主体等も異なる行為１である点で異なっており、審判請求人の主張は採用できない。 以上のとおりであるから、審判請求人の主張はいずれも採用することができない。 ４ 原査定の理由１（発明の単一性）について （１）特許法第３７条について 特許法第３７条には、「二以上の発明については、経済産業省令で定める技術的関係を有することにより発明の単一性の要件を満たす一群の発明に該当するときは、一の願書で特許出願をすることができる。」と規定されており、「経済産業省令」に相当する特許法施行規則第２５条の８には、「特許法第３７条の経済産業省令で定める技術的関係とは、二以上の発明が同一の又は対応する特別な技術的特徴を有していることにより、これらの発明が単一の一般的発明概念を形成するように連関している技術的関係をいう。」（第１項） 「前項に規定する特別な技術的特徴とは、発明の先行技術に対する貢献を明示する技術的特徴をいう。」（第２項） 「第１項に規定する技術的関係については、二以上の発明が別個の請求項に記載されているか単一の請求項に択一的な形式によって記載されているかどうかにかかわらず、その有無を判断するものとする。」（第３項） と規定されている。 （２）本願発明の技術的特徴 本願発明の「データＳ１または表２に記載のいずれかのマイクロＲＮＡを含む、尿の抽出物。」という記載は、特許法施行規則第２５条の８第３項の「単一の請求項に択一的な形式によって記載されている」場合に該当する。 ここで、最初に記載された発明は、請求項４、５及び実施例の記載に鑑み、「ｍｉＲ－３１６３を含む、尿の抽出物。」（以下、「本願発明Ａ」という。）と認められるので、最初に記載された「ｍｉＲ－３１６３を含む、尿の抽出物」とその他の「データＳ１または表２に記載のいずれかのマイクロＲＮＡを含む、尿の抽出物」が単一性の要件を満たすか否かについて以下に判断を行う。 請求項１に係る発明のうち、「ｍｉＲ－３１６３を含む、尿の抽出物。」と、その他の「データＳ１または表２に記載のいずれかのマイクロＲＮＡを含む、尿の抽出物」とは、「マイクロＲＮＡを含む、尿抽出物」であるという共通の「技術的特徴」を有している。 （３）原査定における引用文献１に記載された発明 上記２に記載のとおり、引用文献１には、 「マイクロＲＮＡであるｍｉＲ－３１６３を含む、尿の抽出物」（以下、「引用発明」という。）が記載されている。 （４）判断 本願発明の「技術的特徴」は、（３）のとおり、引用文献１に記載されているので、特許法施行規則第２５条の８第２項の「発明の先行技術に対する貢献を明示する技術的特徴」ではない。 したがって、本願発明の「データＳ１または表２に記載のいずれかのマイクロＲＮＡを含む、尿の抽出物。」が、特許法施行規則第２５条の８第１項の「二以上の発明が同一の又は対応する特別な技術的特徴を有していることにより、これらの発明が単一の一般的発明概念を形成するように連関している技術的関係」を有していないので、この出願は、特許法第３７条に規定する要件を満たしていない。 ５ 原査定の理由２（新規性）について （１）本願発明 請求項１の最初に記載された発明は、請求項４、５及び実施例の記載に鑑み、「ｍｉＲ－３１６３を含む、尿の抽出物。」（以下、「本願発明Ａ」という。）と認められる。 （２）原査定における引用文献１に記載された発明 上記２に記載のとおり、引用文献１には、 「マイクロＲＮＡであるｍｉＲ－３１６３を含む、尿の抽出物」（以下、「引用発明」という。）が記載されている。 （３）本願発明Ａと引用発明の対比 上記（１）（２）より、本願発明Ａと引用発明は一致する。 （４）判断 上記（１）～（３）のとおりであるから、本願発明Ａは、引用発明、すなわち引用文献１に記載された発明である。 第５ むすび 以上のとおり、本願は特許法第３７条に規定する要件を満たさず、また、本願発明Ａは、特許法第２９条第１項第３号に該当するから、他の発明について検討するまでもなく、本願は拒絶すべきものである。 よって、結論のとおり審決する。