2021-018151

第２ 本願発明

本願の請求項１～１３に係る発明は、令和５年９月１３日付け手続補正書により補正された特許請求の範囲の請求項１～１３に記載されたとおりのものであるところ、その請求項１に係る発明（以下、「本願発明」という。）は、次のとおりのものである。

「【請求項１】

２０～６０個のアミノ酸を有するペプチドであって、

下記一般式（Ｉ）：

ＰＥＰ（Ａ）－ＬＩＮＫＥＲ－ＰＥＰ（Ｂ） （Ｉ）

（式中、ＬＩＮＫＥＲの一端は、ＰＥＰ（Ａ）の一端と共有結合的に相互作用する。ＬＩＮＫＥＲの他端は、ＰＥＰ（Ｂ）の一端と共有結合的に相互作用する。ＰＥＰ（Ａ）は、４個のアミノ酸を有するペプチドであるＰＥＰ１、および３個のアミノ酸を有するペプチドであるＰＥＰ３を含む。ＰＥＰ（Ｂ）は、５個のアミノ酸を有するペプチドであるＰＥＰ２、および３個のアミノ酸を有するペプチドであるＰＥＰ４を含む。ＬＩＮＫＥＲは、分子量が２８～２，０００Ｄａである直鎖状又は分枝状の２価の有機基、部分又は化合物である。）で表され、

前記ＰＥＰ１は、ＳＡＩＳ、ＳＳＬＳ、ＮＡＩＳ、ＳＡＴＳ、ＳＰＩＳ、ＥＰＩＳ、ＳＰＩＮ、ＫＰＬＳ、ＥＰＬＰ、ＥＰＬＴ、ＳＮＩＴ、ＲＳＶＫ、及びＲＰＶＱからなる群より選択され、

前記ＰＥＰ２は、ＬＫＮＹＱ、ＬＫＶＹＰ、ＬＫＫＹＲ、ＬＲＫＨＲ、ＬＫＹＨＹ、ＫＦＫＹＥ、ＹＧＫＩＰ、ＹＫＱＹＥ、ＤＨＨＫＤ、ＥＱＬＳＮ、ＩＧＥＭＳ、ＬＧＥＭＳ、ＫＥＶＱＶ、及びＫＫＡＴＶからなる群より選択され、

前記ＰＥＰ３は、ＶＰＴ、ＶＰＥ、ＡＰＴ、ＴＰＴ、ＶＰＡ、ＡＰＶ、ＶＰＱ、ＶＳＱ、ＳＲＶ、及びＴＱＶからなる群より選択され、

前記ＰＥＰ４は、ＶＶＥ、ＴＶＥ、ＶＶＲ、ＶＶＫ、ＶＡＥ、ＡＶＳ、ＶＶＤ、ＶＥＥ、ＶＲＳ、ＶＫＳ、ＱＨＮ、ＥＨＳ、ＥＥＨ、及びＥＤＨからなる群より選択され、

配列番号１～１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２９、配列番号３１～３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６５～７０、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号８０～１０７３、配列番号１１４６、配列番号１３６９、配列番号１３７１、配列番号１４０５、配列番号１４０７、配列番号１４７５、配列番号１４７７、配列番号１６５５、配列番号１８６９、配列番号１８７１、配列番号１９０１、配列番号１９０３、配列番号１９６２、配列番号１９６４、配列番号１９９４、配列番号１９９６、配列番号２１２２、配列番号２１４７～２１５７、配列番号２１７７、配列番号２１８０、配列番号２１８１、配列番号２１８２、配列番号２１９０、配列番号２１９８、配列番号２２１１～２２２３、配列番号２２２６～２２６８、配列番号６１８１～９７７６、配列番号１３５７３～１７０４６、配列番号１８７０３～２０１５０、配列番号２１８０７～２３２５４、配列番号２７３２０～３１１９８、配列番号３２３０１～３３３５４、配列番号３４４５７～３５５１０、配列番号３８４９９～４１２６８、配列番号４２２８０～４３２４２、配列番号４４７９５～４６２９７、配列番号４６３０４、配列番号４６３８１、配列番号４６５１２、配列番号４６５６６、配列番号４６７０４、配列番号４６７６３、配列番号４６７７９、配列番号４７１２１、配列番号４７１７０、配列番号４７３４６、配列番号４７３６８、配列番号４７５８２、配列番号４７５８３、配列番号４７７９３、配列番号４７７９７、配列番号４８１７８、配列番号４８１８７、配列番号４８７０７、配列番号４９０４８、配列番号４９０５６、配列番号４９１９５、配列番号４９２４３、配列番号４９２８１、配列番号４９３３１、配列番号４９３３５、配列番号４９３３９、配列番号４９３９８、配列番号４９４０６、配列番号４９５７６、配列番号４９７７６、配列番号４９９１２、配列番号４９９１７、配列番号４９９７７、配列番号５０３３１、配列番号５０３７９、配列番号５０８３６、配列番号５０８３８、配列番号５１２３７、配列番号５１３１２、配列番号５１３３７、配列番号５１３５４～５６１２９、配列番号５７２３４～５８１９９、配列番号６５２０８～７４１１２、配列番号７９０４６～８１６０４、配列番号８１６１１、配列番号８１６８３、配列番号８１８１７、配列番号８１８２３、配列番号８１８３１、配列番号８１８３２、配列番号８１８３９、配列番号８１８４８、配列番号８１８９８、配列番号８１８９９、配列番号８１９７７、配列番号８２０３７、配列番号８２０５２、配列番号８２０８０、配列番号８２１０４、配列番号８２１１７、配列番号８２１１９、配列番号８２１２１、配列番号８２１２３、配列番号８２１７１、配列番号８２１７８、配列番号８２２２７、配列番号８２２３４、配列番号８２３２８、配列番号８２３５４、配列番号８２３５７、配列番号８２４６５、配列番号８２５２３、配列番号８２５６２、配列番号８２６６９、配列番号８２６９７、配列番号８２７０６、配列番号８２７１３、配列番号８２７７２、配列番号８２７８５、配列番号８２７８９、配列番号８２８６５、配列番号８２８９６、配列番号８２８９９、配列番号８２９０４、および配列番号８２９１３～８４１０８で表されるペプチドのいずれか１種を含む、ペプチド。」

第３ 当審で通知した拒絶理由の概要

当審が通知した令和５年３月７日付け拒絶理由通知書は、以下の拒絶理由を含むものである。以下では、その概要を示す。

理由２（サポート要件）

請求項１に係る発明の解決しようとする課題は、請求項１及び本願明細書の段落【０００１】の記載からみて、成長因子受容体結合能を有し、組織形成を誘導する、医療的方法に使用するためのペプチドの提供であると認められる。

本願明細書の記載からでは、本願の出願時の技術常識を考慮しても、本願明細書の実施例で使用された特定のペプチドが、実施例に示された生理活性に関係するなんらかの成長因子受容体に結合することがあったとしても、実施例で使用されたペプチド以外にも多種多様な広範なペプチドを包含する、一般式（Ｉ）の構造とパラメータにより特定されるペプチドが、おしなべて「成長因子受容体」の用語に包含される受容体に結合能を有すること、すなわち、上記の課題を解決できることを、当業者が認識し得るとは認められない。

よって、請求項１に係る発明は、サポート要件に適合するものではないから、この出願は、特許請求の範囲の記載が、特許法第３６条第６項第１号に規定する要件を満たしていない。

第４ 本願明細書等の記載

願書に添付した明細書及び図面（以下「本願明細書等」という。）には、以下の記載がある（下線は当審において付与した。）。

本ａ

「【０００１】

本発明は、組織形成誘導用化合物、該化合物を含む生体材料及び医療機器、医療的方法に使用するための該化合物、並びに非医療的方法における該化合物の使用に関する。」

本ｂ

「【０１２９】

すなわち、ＲＭＳＤは、重ねたポリペプチド又はペプチド模倣体の原子（通常は骨格原子）間の平均距離の尺度である。球状タンパク質立体構造の研究においては、習慣的に、剛体の重ね合わせを最適化してから、Ｃα原子座標のＲＭＳＤによって３次元構造の類似性を測定している。

【０１３０】

具体的に選択した参照構造（以下、「ＰＥＰＲＥＦ」ともいう）に対する所定のペプチド又はペプチド模倣体のＲＭＳＤは、当業者に周知の各種方法によって算出できる。だが、本開示の目的のため、及び疑義を回避するため、本開示で使用する所定のペプチド又はペプチド模倣体のＲＭＳＤは、以下の手順で正確に得られる。

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【０１３１】

（ＳＴＥＰ１）

・・・

【０１４１】

（ＳＴＥＰ２）

・・・

【０１４３】

ＰＥＰＲＥＦの３Ｄ構造座標

本明細書中、別段の指示がない限り又は文脈に矛盾しない限り、ＰＥＰＲＥＦの３Ｄ構造座標は以下の通りである。

【０１４４】

【表１－１】

・・・

【０１５０】

【表１－７】

・・・」

本ｃ

「【０１５９】

成長因子受容体

本明細書中、別段の指示がない限り又は文脈に矛盾しない限り、「成長因子受容体」及び「ＧＦＲ」という用語は、細胞成長、増殖、治癒、及び細胞分化等を刺激できる天然物質である成長因子に結合する受容体である。本発明の実施形態を実施するために好適な成長因子受容体としては、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、繊維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）、血管内皮細胞成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）、インスリン受容体ファミリー、Ｔｒｋ受容体ファミリー、Ｅｐｈ受容体ファミリー、ＡＸＬ受容体ファミリー、ＬＴＫ受容体ファミリー、ＴＩＥ受容体ファミリー、ＲＯＲ受容体ファミリー、ＤＤＲ受容体ファミリー、ＲＥＴ受容体ファミリー、ＫＬＧ受容体ファミリー、ＲＹＫ受容体ファミリー、ＭｕＳＫ受容体ファミリー、肝細胞成長因子受容体（ＨＧＦＲ）、ソマトメジン又はインスリン様成長因子受容体（ＳＧＦＲ）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ－６）スーパーファミリータンパク質（ＡＭＨ、ＡＲＴＮ、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８Ａ、ＢＭＰ８Ｂ、ＧＤＦ１、ＧＤＦ１０、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ１５、ＧＤＦ２、ＧＤＦ３、ＧＤＦ３Ａ、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９、ＧＤＮＦ、ＩＮＨＡ、ＩＮＨＢＡ、ＩＮＨＢＢ、ＩＮＨＢＣ、ＩＮＨＢＥ、ＬＥＦＴＹ１、ＬＥＦＴＹ２、ＭＳＴＮ、ＮＯＤＡＬ、ＮＲＴＮ、ＰＳＰＮ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、及びＴＧＦＢ３等）、並びにこれらの組み合わせ等が挙げられる。」

本ｄ

「【０２１７】

一態様において、本開示はＧＦＲ結合化合物を提供し、上記ＧＦＲ結合化合物は、２０～６０個（特に２０～５０個、より具体的には２０～４５個）のアミノ酸を有し、下記一般式（Ｉ）：

ＰＥＰ（Ａ）－ＬＩＮＫＥＲ－ＰＥＰ（Ｂ） （Ｉ）

（式中、ＬＩＮＫＥＲの一端は、ＰＥＰ（Ａ）の一端と共有結合的に相互作用する。ＬＩＮＫＥＲの他端は、ＰＥＰ（Ｂ）の一端と共有結合的に相互作用する。ＰＥＰ（Ａ）はＰＥＰ１を含む。ＰＥＰ（Ｂ）はＰＥＰ２を含む。ＬＩＮＫＥＲは、分子量（Ｍｗ）が約２８～約２，０００Ｄａ、特に約３００～約１０００Ｄａである直鎖状又は分枝状の２価の有機基、部分又は化合物である。）で表され、ＲＭＳＤが２．４５Å以下である本明細書で定義されるペプチド、その変異体若しくは類似体、又はペプチド模倣体である（以下、化合物（Ｉ）又はペプチド（Ｉ）ともいう）。

・・・

【０２２０】

一態様において、本開示は、一般式（Ｉ）（式中、ＰＥＰ（Ａ）はＰＥＰ１を含む。ＰＥＰ（Ｂ）はＰＥＰ２を含む。ＰＥＰ（Ａ）はＰＥＰ３を更に含む。ＰＥＰ（Ｂ）はＰＥＰ４を更に含む。）で表され、ＲＭＳＤが２．４５Å以下であるＧＦＲ結合化合物を提供する。

・・・

【０３３１】

具体的な一例示において、上記ＧＦＲ結合化合物は、配列番号１～２１５７及び２２４２～８４１０８のペプチドのうちのいずれか１つ又は複数であってもよい。」

本ｅ

「【１１９４】

（実施例４：前駆体骨細胞の増殖）

本明細書に記載した本発明のＧＦＲ結合化合物（配列番号９～１４）の骨芽前駆細胞（ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞、ＡＴＣＣ（登録商標））の増殖に対する効果を調査した。・・・これらのデータを分析したところ、本明細書に記載した本発明のＧＦＲ結合化合物で共有結合的に修飾したアパタイトセラミックでは、従来の非修飾セラミックと比較して増殖が顕著に増大したことが分かった（図２）。

・・・

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【１１９５】

（実施例５：ヒト間葉系幹細胞の骨形成分化）

・・・本明細書に記載した本発明のＧＦＲ結合化合物（配列番号１５～２０）で共有結合的に修飾したチタン上で６２時間細胞培養した後、幹細胞表現型を分析した。

・・・

【１１９７】

図３に示す通り、本発明の共有結合的に修飾したチタンで培養した場合、ヒト骨髄間葉系幹細胞の大多数が付着、伸展し、骨芽細胞様細胞に分化することが、Ｒｕｎｘ２及びＯｓｔｅｒｉｘタンパク質の発現が増大したことで確認された（図３）。

【１１９８】

（実施例６：骨芽前駆細胞の骨形成分化）

本実施例では、本明細書に記載したＧＦＲ結合化合物（配列番号２１）で従来のＰＥＥＫ担体を共有結合的に修飾して本発明の生体材料を作製し、そこでマウス間葉系前骨芽細胞（ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１、ＡＴＣＣ（登録商標）製）を培養した。・・・

【１１９９】

図４に示す通り、細胞外基質の合成（ＥＣＭｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）で示されるように、本発明のＰＥＥＫ生体材料、すなわち本明細書に記載した本発明のＧＦＲ結合化合物の少なくとも１種で共有結合的に修飾した従来のＰＥＥＫ生体材料を用いると、２４時間培養後にマウス間葉系前骨芽細胞が成熟骨芽細胞へ分化できる。

【１２００】

最後に、骨形成性バイオマーカーＲｕｎｘ２（Ｃｂｆａ－１ともいう）の発現を分析することで、共有結合的に修飾したＰＥＥＫ生体材料上で培養した場合に骨芽前駆細胞が成熟骨芽細胞へと形質転換したことが確認された。方法の項で記載した定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応から、従来の非修飾ＰＥＥＫ生体材料と比較して、２４時間培養後にＲｕｎｘ２遺伝子発現の上昇が見られた（図５）。

・・・

（実施例８：前駆体骨細胞の増殖）

本明細書に記載した本発明のＧＦＲ結合化合物（配列番号２４～２７）の骨芽前駆細胞の増殖に対する効果を調査した。・・・これらのデータを分析したところ、骨形成性ペプチドと結合させたアパタイトセラミック及びＩ型コラーゲンスポンジでは、天然アパタイトセラミック及び天然Ｉ型コラーゲンスポンジと比較して細胞増殖が顕著に進んだことが分かった（図８）。

【１２０５】

（実施例９：ヒト間葉系幹細胞の骨形成分化）

本明細書に記載したＧＦＲ結合化合物を、アパタイトセラミック又はＩ型コラーゲン、アパタイトセラミック又はＩ型コラーゲンスポンジに非共有結合的に堆積した。ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）はＬｏｎｚａ（登録商標）製のものを使用した。・・・

【１２０６】

骨形成性ペプチド（配列番号２８～３１）と結合したアパタイトセラミック又はＩ型コラーゲンスポンジ上で９６時間細胞培養した後、細胞表現型を分析した。本明細書に記載したＧＦＲ結合化合物と結合したアパタイトセラミック及びＩ型コラーゲンスポンジにおいて、ヒト骨髄間葉系幹細胞の大多数が付着、伸展し、骨芽細胞様細胞に分化することが、Ｒｕｎｘ２及びＯｓｔｅｒｉｘの発現を分析することで確認される（図９ａ）。・・・

【１２０７】

最後に、骨形成性バイオマーカーＡＬＰの活性（アルカリフォスファターゼ活性）を分析することで、ｈＭＳＣが成熟骨芽細胞に分化したことが確認された。本明細書に記載したＧＦＲ結合化合物（配列番号３２）と結合したＩ型コラーゲンスポンジ上で１週間培養した後にＡＬＰ活性が増大したことを確認した（図９ｂ）。

【１２０８】

（実施例１０：骨芽前駆細胞の骨形成分化）

成熟骨芽細胞は骨形成に関与する細胞であり、前駆体骨芽細胞に由来する。成熟骨芽細胞は、Ｒｕｎｘ２等の骨芽細胞マーカーの発現及び細胞外基質タンパク質の合成によって得られ、特徴付けられる。

【１２０９】

本明細書に記載したＧＦＲ結合化合物（配列番号３３）の骨芽前駆細胞の分化に対する効果を評価した。・・・

【１２１０】

最後に、骨形成性バイオマーカーＲｕｎｘ２の発現を分析することで、骨芽前駆細胞が成熟骨芽細胞へ分化したことが確認された。方法の項で記載した定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応から、２４時間培養後にＲｕｎｘ２遺伝子発現の上昇が見られた（図１１）。

【１２１１】

（実施例１１：軟骨再生）

硬度が１４ｋＰａの天然ヒドロゲル（アクリルアミド・アクリル酸共重合体）及び本明細書に記載したＧＦＲ結合化合物（配列番号３６及び３７）で共有結合的に修飾したヒドロゲル（同様に硬度１４ｋＰａ）上でｈＭＳＣを培養した。９６時間培養後にＳｏｘ９タンパク質の発現が見られたことから、ｈＭＳＣは軟骨細胞様細胞への分化にコミットしたことが示された（図１２ａ）。

【１２１２】

その後、軟骨細胞遺伝子バイオマーカーであるＡｇｇｒｅｃａｎの発現を分析することで、共有結合的に修飾したヒドロゲル上で培養したｈＭＳＣが軟骨細胞へ分化したことが確認された。９６時間培養後、この遺伝子の発現の増加が確認された（図１２ｂ）。・・・

【１２１３】

（実施例１２：内皮化）

天然ポリマー（ＰＥＴ）、及び本明細書に記載した内皮化ＧＦＲ結合化合物（配列番号３８）で共有結合的に修飾したポリマー（ＰＥＴ）上でヒト臍静脈内皮細胞を培養した。共有結合的に修飾したＰＥＴ上で３６時間培養後、接着結合（ＣＤ３１）面積の増大が確認された（図１３）。得られた結果から、本明細書に記載したＧＦＲ結合化合物はステントの内皮化を迅速に誘導できることが分かった。

【１２１４】

（実施例１３：血管新生）

天然ポリマー（ＰＥＴ）、及び血管ペプチド（配列番号３９）で共有結合的に修飾したポリマー（ＰＥＴ）上でヒト臍静脈内皮細胞を培養した。共有結合的に修飾したＰＥＴ上で１８時間培養後、管状構造の形成が確認された（図１４）。得られた結果から、本明細書に記載したＧＦＲ結合化合物は血管新生を迅速に誘導できることが分かった。

【１２１５】

（実施例１４：創傷治癒及び集団細胞遊走の増大）

天然ポリマー（ＰＥＴ）、及び組織閉鎖ペプチド（配列番号４０）で共有結合的に修飾したポリマー（ＰＥＴ）上でヒト上皮細胞を培養した。・・・１８時間培養後、ペプチドで共有結合的に修飾したＰＥＴ上で培養した細胞については細胞遊走速度の上昇が見られた。細胞は集団的に遊走し、細胞間の連絡が維持されていた（図１５ｂ）。実際に、本明細書に記載したＧＦＲ結合化合物で共有結合的に修飾したポリマー上で培養した細胞については損傷が迅速に閉鎖された。得られた結果から、本明細書に記載したＧＦＲ結合化合物は、創傷治癒等の組織閉鎖を迅速に誘導できることが分かった。

【１２１６】

（実施例１５：毛包幹細胞の静止状態の喪失及び活性化）

硬度が７３ｋＰａである天然ヒドロゲル（アクリルアミド・アクリル酸共重合体）、及び本明細書に記載した毛包幹細胞ＧＦＲ結合化合物（配列番号４１及び４２）で共有結合的に修飾したヒドロゲル（同様に硬度７３ｋＰａ）上で、単離した毛包幹細胞を培養した。Ｓｏｘ２タンパク質発現の上昇が見られ、上記幹細胞が活性化されたことが示された（図１６ａ）。同時に、細胞培地においてＢＭＰ－６放出の減少が見られた（図１６ｂ）。これらの状況において、ＢＭＰ－６放出の減少は、毛包幹細胞が活性化され、発毛プロセスが誘導されたことを示している。

【１２１７】

（実施例１６：ヒト間葉系幹細胞の筋肉分化）

硬度が２８ｋＰａである天然ヒドロゲル（アクリルアミド・アクリル酸共重合体）、及び筋原性ペプチド（配列番号４３～４８）で共有結合的に修飾したヒドロゲル（同じく硬度２８ｋＰａ）上でｈＭＳＣを培養した。共有結合的に修飾したヒドロゲル上で培養した細胞について、６２時間培養後に細胞面積の増大が見られたことから、ｈＭＳＣは筋肉への分化にコミットしたことが示された（図１７ａ）。

【１２１８】

その後、筋原性バイオマーカーＣＯＭＰ（軟骨オリゴマー基質タンパク質）の発現を分析することで、共有結合的に修飾したヒドロゲル上で培養した上記ｈＭＳＣが筋肉細胞へ分化したことが確認された。９６時間培養後、この遺伝子の発現の上昇が見られた（図１７ｂ）。・・・

【１２１９】

（実施例１７：ニューロン成長）

天然チタン（コントロール）、及び神経原性ペプチド（配列番号４９）で共有結合的に修飾したチタン上でニューロンを培養した。共有結合的に修飾したチタン上で６時間培養後、樹状突起成長による細胞間接触の迅速な確立が観察された（図１８ａ）。・・・

【１２２０】

（実施例１８：幹細胞性の喪失）

本明細書に記載した各種ＧＦＲ結合化合物（配列番号５０～８８）の溶液の存在下又は非存在下、細胞培地を用いて従来の細胞培養プラスチック皿でｈＭＳＣを培養した。本明細書に記載したＧＦＲ結合化合物の存在下、細胞培養液で培養した細胞について、幹細胞性マーカーＳＴＲＯ－１の迅速な（４８時間）喪失が観察された（図１９）。・・・いずれの配列も、表４で示す通り、本明細書で定義されるＲＭＳＤが２．４５Å以下である。

・・・

【１２２２】

（実施例１９：ヒト造血幹細胞の分化）

本明細書に記載した各種ＧＦＲ結合ペプチド（配列番号２１４７～２１５７）の溶液の存在下又は非存在下、細胞培地を用いて従来の細胞培養プラスチック皿でｈＭＳＣを培養した。本明細書に記載したＧＦＲ結合ペプチドの存在下、細胞培養液で培養した細胞について、幹細胞性マーカーＣＤ３４＋の迅速な（４８時間）喪失が観察された。・・・ＣＤ－３４＋陽性骨髄細胞は多分化能であり、各種のあらゆる血液細胞型に分化できる。いずれの配列も、表５で示す通り、本明細書で定義されるＲＭＳＤが２．４５Å以下である。

【１２２３】

［図：0001408227000001.jpg］

【１２２４】

（実施例２０：ＲＭＳＤ測定及び生物学的活性）

ＲＭＳＤは、本明細書で定義されるあらゆる考えられ得る生理活性担体親和性基を除いたＧＦＲ結合ペプチド配列について常に算出する。・・・

【１２２５】

本明細書で詳述した方法を用いて、これまでに報告した５７種のペプチド配列のＲＭＳＤを求め（表６）、溶液中でのＳＴＲＯ－１発現と相関させた。これらのデータから、ＲＭＳＤの算出値が２．４５Åを超える、特に２Åを超える、より具体的には１．７９Åを超えるものは、処理細胞の顕著なｈＭＳＣコミットメント及び／又は分化と必ずしも相関を示さないことが分かる。なお、細胞におけるＳＴＲＯ－１発現は、実質的に非分化状態の細胞を示しており、その発現の低下率が少なくとも約２０％であれば、分化プロセスを開始しているものの、細胞の分化には至らないかもしれない細胞を示していることが一般的に認められている。５０％を超えて低下している場合、分化状態へ顕著にシフトしていることを示している。７０％を超えて低下している場合、分化状態へ極めて顕著にシフトしていることを示している。５０％又は７０％を超える低下が継続している（例えば、少なくとも９６時間）場合、分化状態へ更に顕著にシフトしていることを示している。

【１２２６】・・・

［図：0001408227000002.jpg］

【１２２７】・・・

［図：0001408227000003.jpg］

【１２２８】

同様に、本明細書で詳述した方法を用いて、これまでに報告した別の２７種のペプチド配列のＲＭＳＤを求め（表７）、溶液中でのＳＴＲＯ－１及びＣＤ－１０５の発現と相関させた。これらのデータから、ＲＭＳＤの算出値が２．４５Åを超える、特に２Åを超える、より具体的には１．７９Åを超えるものは、処理細胞の顕著なｈＭＳＣコミットメント及び／又は分化と必ずしも相関を示さないことが分かる。データは、溶液中のペプチド（すなわち、生理活性担体と組み合わせていない状態）で得た。

【１２２９】・・・

［図：0001408227000004.jpg］

【１２３０】

同様に、本明細書で詳述した方法を用いて、本発明を代表する７５種のＧＦＲ結合ペプチド配列のＲＭＳＤを求め（表８）、ＳＴＲＯ－１発現と相関させた。配列番号１～４９は、実施例の項で定義したように生理活性担体（すなわち、チタン、セラミック、コラーゲン等）と組み合わせて試験し、一方、配列番号２２４２～２２６７は溶液中で試験した。これらのデータから、ＲＭＳＤの算出値が２．４５Å以下、特に２Å以下、より具体的には１．７９Å以下であるものは、処理細胞の顕著なｈＭＳＣコミットメント及び／又は分化と常に相関を示すことが分かる。

【１２３１】・・・

［図：0001408227000005.jpg］

【１２３２】・・・

［図：0001408227000006.jpg］

【１２３３】・・・

［図：0001408227000007.jpg］

【１２３４】

（実施例２１：骨粗鬆症治療への適用）

以下の研究は、骨粗鬆症ラットモデルの臨界サイズ骨折誘導性欠損においてＧＦＲ結合化合物の骨誘導性、骨伝導性、及び破骨細胞阻害活性を実証することを目的とする。

・・・

【１２３８】

Ｂ．２．化合物投与

手術から８週間後、Ｊ０においてＯＶＸラットの大腿骨顆部に３ｍｍの臨界サイズ欠損を穿孔し、ＧＦＲ結合化合物（配列番号６０９及び２２６８）の混合物を部位投与した。

・・・

【１２４４】

試験混合物をカプセルに入れた溶液として欠損部位に投与し、欠損領域で連続的に放出させた。ＨＴＤ－ＰＣＬ－Ｍ０６の投与から１２週間後に、欠損侵入部で骨膜線維組織の閉鎖が確認できる（図２３）。・・・結論として、投与から３週間及び１２週間後に類骨及び石灰化骨組織の形成が増大したことから明らかな通り、ＨＴＤ－ＰＣＬ－Ｍ０６は良好に許容され、臨界欠損部位において効率的に骨形成を誘導する。この骨形成性活性の増大は、骨芽細胞の存在と関連しており、骨誘導の始動を確認できる。加えて、活性破骨細胞が検出されなかったことから、骨吸収活性が大きく低下していることが示された。従って、ＨＴＤ－ＰＣＬ－Ｍ０６は、効率的な骨粗鬆症関連骨折の骨の再構築、並びに骨粗鬆症の治療及び予防に極めて好適であり、溶液として全身投与又は局所投与することで達成できる可能性がある。

・・・

【１２４８】

従って、本開示のＧＦＲ結合化合物は、骨粗鬆症用の新規な治療溶液であって、骨形成の増大及びそれに伴う骨吸収の低減によって、骨吸収を骨形成から切り離すことができるユニークな能力を有する。」

第５ 当審の判断

１．本願発明が解決しようとする課題

本願明細書の【０００１】に「本発明は、組織形成誘導用化合物、該化合物を含む生体材料及び医療機器、医療的方法に使用するための該化合物、並びに非医療的方法における該化合物の使用に関する。」との記載（本ａ）、同【０３３１】に「具体的な一例示において、上記ＧＦＲ結合化合物は、配列番号１～２１５７及び２２４２～８４１０８のペプチドのうちのいずれか１つ又は複数であってもよい。」との記載（本ｄ）があり、同【０１５９】によると、「ＧＦＲ」は「細胞成長、増殖、治癒、及び細胞分化等を刺激できる天然物質である成長因子に結合する受容体」（本ｃ）を意味するから、本願発明が解決しようとする課題は、ＧＦＲ（成長因子受容体）に結合能を有し、組織形成を誘導する、医療的方法等に使用するためのペプチドを提供することにあると認められる。

２．本願明細書の実施例に記載されている事項

本願明細書の実施例（本ｅ）には、実施例で使用されたペプチドが生理活性を示す記載として、

実施例４に、配列番号９～１４のペプチドが、骨芽前駆体細胞を増殖させたこと（【１１９４】）、

実施例５に、配列番号１５～２０のペプチドが、ヒト骨髄間葉系幹細胞の大多数を骨芽細胞様細胞に分化させたこと（【１１９５】～【１１９７】）、

実施例６に、配列番号２１のペプチドが、マウス間葉系前骨芽細胞を成熟骨芽細胞へ分化させたこと（【１１９８】～【１２００】）、

実施例８に、配列番号２４～２７のペプチドが、骨芽前駆細胞の細胞増殖を顕著に進めたこと（【１２０４】）、

実施例９に、配列番号２８～３１のペプチドが、ヒト骨髄間葉系幹細胞の大多数を骨芽細胞様細胞に分化させたこと、配列番号３２のペプチドが、骨形成性バイオマーカーＡＬＰの活性を増大させたこと（【１２０５】～【１２０７】）、

実施例１０に、配列番号３３のペプチドが、骨芽前駆細胞を成熟骨芽細胞へ分化させたこと（【１２０８】～【１２１０】）、

実施例１１に、配列番号３６～３７のペプチドが、ｈＭＳＣ（ヒト骨髄間葉系幹細胞）を軟骨細胞様細胞へ分化させたこと（【１２１１】～【１２１２】）、

実施例１２に、配列番号３８のペプチドが、ステントの内皮化を迅速に誘導できたこと（【１２１３】）、

実施例１３に、配列番号３９のペプチドが、血管新生を迅速に誘導できたこと（【１２１４】）、

実施例１４に、配列番号４０のペプチドが、損傷を迅速に閉鎖したこと（【１２１５】）、

実施例１５に、配列番号４１～４２のペプチドが、毛包幹細胞を活性化させたこと（【１２１６】）、

実施例１６に、配列番号４３～４８のペプチドが、ｈＭＳＣ（ヒト骨髄間葉系幹細胞）を筋肉細胞へ分化させたこと（【１２１７】～【１２１８】）、

実施例１７に、配列番号４９のペプチドが、樹状突起成長による細胞間接触を迅速に確立したこと（【１２１９】）、

実施例１８に、配列番号５０～８８のペプチドが、幹細胞性マーカーＳＴＲＯ－１を迅速に喪失させたこと（【１２２０】～【１２２１】）、

実施例１９に、配列番号２１４７～２１５７のペプチドが、幹細胞性マーカーＣＤ３４＋を迅速に喪失させたこと（【１２２２】～【１２２３】）、

実施例２１に、配列番号６０９及び２２６８のペプチドの混合物が効率的な骨粗鬆症関連骨折の骨の再構築、並びに骨粗鬆症の治療及び予防に極めて好適であったこと（【１２３４】～【１２４８】）が記載されている。

また、実施例２０（【１２２４】～【１２３３】）においては、表６（【１２２６】～【１２２７】）に記載された配列番号２１５８～２２１４のペプチド、及び、表７（【１２２９】）に記載された配列番号２２１５、２２３０、２２３５、２２３８、２２４０のペプチドは、ＲＳＭＤが２．４５Åを超えており、それらのペプチドで処理した細胞は、幹細胞性マーカーＳＴＲＯ－１発現％が高く、実質的に非分化状態であることが示されている（表７の上記ペプチドで処理した細胞については、ＣＤ－１０５発現％が高いことも記載されている。しかし、表７の上記以外のペプチドで処理した細胞は、幹細胞性マーカーＳＴＲＯ－１発現％、ＣＤ－１０５発現％が空欄になっている。）。一方、表８（【１２３１】～【１２３３】）に記載された配列番号１～４９、２２４２～２２６７のペプチドは、ＲＳＭＤが２．４５Å以下で、それらのペプチドで処理した細胞は、幹細胞性マーカーＳＴＲＯ－１発現％が低く、それらのペプチドは、処理細胞を分化状態にシフトさせたことが示されている。

以上の実施例４～６、８～２１の記載からすると、配列番号９～２１（実施例４～６）、２４～３３（実施例８～１０）、３６～８８（実施例１１～１８）、２１４７～２１５７（実施例１９）、６０９及び２２６８（実施例２１）、１～４９（実施例２０）、２２４２～２２６７（実施例２０）のペプチドは、成長因子受容体に対して結合能を有するか否かは不明であるものの、細胞成長、増殖、治癒、及び細胞分化において、生理活性を示すことが記載されている。

しかし、実施例２０の表６、７によると、配列番号２１５８～２２１４、２２１５、２２３０、２２３５、２２３８、２２４０（実施例２０）のペプチドで処理した細胞は、幹細胞性マーカーＳＴＲＯ－１発現％が高く、それらのペプチドは、処理細胞を分化させる生理活性すら示さないことが記載されている。

３．本願発明のサポート要件の判断

本願発明は、上記の実施例４～６、８～２１の記載より、細胞成長、増殖、治癒、及び細胞分化において生理活性を示すことが理解できる、「配列番号１～１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２９、配列番号３１～３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６５～７０、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号８０」、「配列番号２１４７～２１５７」、及び、配列番号８１～８８、６０９、２２４２～２２６８のペプチドを含むものである。

一方、本願発明は、実施例２０の表６、７の記載より、幹細胞性マーカーＳＴＲＯ－１発現％が高く、処理細胞を分化させる生理活性すら示さない、「配列番号２１７７、配列番号２１８０、配列番号２１８１、配列番号２１８２、配列番号２１９０、配列番号２１９８」のペプチド、及び、配列番号２２１１～２２１４、２２１５、２２３０、２２３５、２２３８、２２４０のペプチドも含むものである。

更に、本願発明は、実施例４～６、８～２１に記載がなく、生理活性を示すか否かが明らかでない、その他多数のペプチド、例えば、「配列番号６１８１～９７７６・・・および配列番号８２９１３～８４１０８」等のペプチドも含むものである。

そうすると、本願明細書の実施例４～６、８～２１の記載より、本願発明に含まれる、「配列番号１～１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２９、配列番号３１～３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６５～７０、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号８０」、「配列番号２１４７～２１５７」のペプチド、及び、配列番号８１～８８、６０９、２２４２～２２６８のペプチドが、実施例に示される生理活性に関係するなんらかの成長因子受容体に結合する可能性があることを当業者が理解し得るとしても、本願発明は、生理活性を示さない、「配列番号２１７７、配列番号２１８０、配列番号２１８１、配列番号２１８２、配列番号２１９０、配列番号２１９８」のペプチド、及び、配列番号２２１１～２２１４、２２１５、２２３０、２２３５、２２３８、２２４０のペプチドも含み、更に、生理活性を示すか否か明らかでない「配列番号６１８１～９７７６・・・および配列番号８２９１３～８４１０８」等のその他多数のペプチドも含むものである。

よって、本願発明のペプチドが、おしなべて、成長因子受容体に結合能を有し、組織形成を誘導すること、すなわち、本願発明が、上記の１で示した課題を解決できることを、当業者が、本願明細書等の記載から認識し得るものであるとは認められない。

したがって、本願発明は、サポート要件に適合するものではなく、発明の詳細な説明に記載したものとはいえない。

第６ むすび

以上のとおり、本願は、請求項１について、特許請求の範囲の記載が、特許法第３６条第６項第１号に規定する要件を満たしていないので、請求項２～１３について検討するまでもなく、本願は、拒絶すべきものである。

よって、結論のとおり審決する。