2017-006627

特願２０１３－５５５５９６「遺伝子改変動物、およびそれを作製する方法」拒絶査定不服審判事件〔平成２４年８月３０日国際公開、ＷＯ２０１２／１１６２７４、平成２６年４月１７日国内公表、特表２０１４－５０９１９５〕について、次のとおり審決する。

【結　論】 本件審判の請求は、成り立たない。

【理　由】 第１　手続の経緯 本願は、平成２４年２月２４日を国際出願日とする出願であって、以降の手続の経緯は以下のとおりである。 平成２７年　２月１９日　　　手続補正書 平成２８年　２月２３日付け　拒絶理由通知書 平成２８年　７月２７日　　　意見書・手続補正書 平成２８年１２月１２日付け　拒絶査定 平成２９年　５月　９日　　　審判請求書・手続補正書 平成２９年　６月２１日　　　手続補正書（方式） 平成２９年１１月１４日　　　上申書 なお、本願では、米国における２０１１年（平成２３年）２月２５日の出願を優先権の主張の基礎として、パリ条約による優先権を主張している。 第２　本願発明 本願に係る発明は、平成２９年５月９日提出の手続補正書により補正された特許請求の範囲の請求項１ないし２７に記載された事項により特定されるものであり、そのうち請求項１に係る発明（以下、「本願発明」という。）は、以下のとおりのものである。 「【請求項１】　胚割球、胎仔線維芽細胞、成体耳部線維芽細胞、顆粒膜細胞、体細胞、生殖細胞、幹細胞、もしくは胚細胞、またはインビトロ受精胚を、ＴＡＬＥＮをコードする核酸に接触させることを含む、外来性マーカー遺伝子を使用せずに、偶蹄目において標的化ゲノム改変を行う方法。」 第３　原査定の拒絶の理由 原査定の拒絶の理由は、この出願の請求項１ないし３及び８ないし１１に係る発明は、その出願前に日本国内又は外国において、頒布された又は電気通信回線を通じて公衆に利用可能となった下記の引用例１ないし８に記載された発明に基づいて、その出願前にその発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない、というものである。 引用例１：J Anim Sci, 2011年10月(Epub), Vol.90, No.4, pp.1111-1117. 引用例２：Proc Natl Acad Sci U S A, 2011年7月, Vol.108, No.29, pp.12013-12017. 引用例３：Biochem Biophys Res Commun, 2010年11月, Vol.402, No.1, pp.14-18. 引用例４：Nat Biotechnol, 2011年8月, Vol.29, No.8, pp.695-696. 引用例５：Zebrafish, 2011年9月, Vol.8, No.3, pp.147-149. 引用例６：PLoS One, 2011年12月, Vol.6, No.12, e28897. 引用例７：国際公開第２０１１／０１１７６７号 引用例８：国際公開第２０１０／１４３９１７号 第４　本願の優先権主張について 本願では、米国における２０１１年（平成２３年）２月２５日の出願（出願番号61/446651。以下、この出願を「第一国出願」という。）を優先権の主張の基礎として、パリ条約による優先権を主張しているところ、前記第３に示した引用例には、上記第一国出願の日以降に頒布された引用例が含まれることから、優先権主張の効果について検討する。 本願発明は、ＴＡＬＥＮにより偶蹄目の標的化ゲノム改変を行う方法であり、従来、いずれの者も行ったことがない方法であることから、明細書に当該方法についての具体的な手順や、使用する材料等（改変の対象となる生物種とその細胞の種類並びにその入手方法、対象ゲノムとその配列、改変の態様、相同組換えを行う場合にあってはその鋳型の配列、ＴＡＬＥＮを細胞に導入する具体的な方法、細胞培養の条件、といった事項）と、その結果（結果を得るための具体的な手段を含む）を実施例として詳細に記述することにより、本願発明が発明の詳細な説明に記載されたものであり、また、発明の詳細な説明の記載が、当業者がその実施をすることができる程度に明確かつ充分に記載したものであるということができるものである。そして、本願の明細書には、実施例として１ないし８（本願発明に対応する実施例は、実施例１、３、６及び７）が記載されているところ、第一国出願の出願書類には、これらの実施例は記載されていない。また、第一国出願の日当時、偶蹄目動物を含め、哺乳類に属する生物の胚割球、胎仔線維芽細胞、成体耳部線維芽細胞、顆粒膜細胞、体細胞、生殖細胞、幹細胞、若しくは胚細胞、又はインビトロ受精胚について、ＴＡＬＥＮによる標的化ゲノム改変が実施可能であるという技術常識は存在しなかった。そうしてみると、第一国出願の出願書類には、本願発明が開示されていたということはできず、本願の明細書は、第一国出願の出願書類には記載のなかった実施例を本願の出願時に追加したものであって、本願の出願時に新たな技術的事項を導入したものである。したがって、本願は優先権主張の効果を認めることはできない。 この点について、請求人は、本願発明を特定するために使用されている技術用語が第一国出願の出願書類に記載されており、また、ＴＡＬＥＮによるゲノム編集のストラテジーが第一国出願の出願書類に記載されている旨を主張する。しかし、本願発明が第一国出願の出願書類に開示されているというためには、単に、本願発明を特定するために使用されている技術用語が第一国出願の出願書類に記載されているのみでは足らず、本願発明についての実施例の記載が必要であることは上述したとおりであるし、請求人が述べる第一国出願の出願書類に記載されているＴＡＬＥＮによるゲノム編集のストラテジーとは、ＺＦＮによるゲノム編集のストラテジーにおけるＺＦＮをＴＡＬＥＮに単に置き換えたものであり、そのようなストラテジーが第一国出願の出願書類に記載されているとしても、そのことによって、第一国出願の出願書類に本願発明が開示されていたということはできない。したがって、請求人の上記主張を採用することはできない。 また、請求人は、第一国出願の出願書類には、Nat Biotechnol, 2011年2月, Vol.29, No.2, pp.143-148. が添付されており、斯かる論文にはＴＡＬＥＮの作製方法が記載されている旨も主張する。しかし、上記論文においても胚割球、胎仔線維芽細胞、成体耳部線維芽細胞、顆粒膜細胞、体細胞、生殖細胞、幹細胞、若しくは胚細胞、又はインビトロ受精胚のゲノム改変を行ったことは具体的に記載されておらず、上記論文にＴＡＬＥＮの作製方法が記載されていても、そのことにより、第一国出願の出願書類に本願発明が開示されていたということはできない。したがって、請求人の上記主張も採用することはできない。 第５　引用例の記載 １　引用例２ 原査定で引用された、本願出願日前の２０１１年７月に頒布されたProc Natl Acad Sci U S A, Vol.108, No.29, pp.12013-12017.には以下の事項が記載されている。（引用例２は英語で記載されているので訳文で示す。また、下線は当審で付与した。） (１)　表題の項 「ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いたブタの両アレルノックアウトの効率的な作製」 (２)　要約の項 「ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、高効率で遺伝子ノックアウト（ＫＯ）を作製する強力な手段である。ＺＦＮによる遺伝子破壊は、マウス、ラット及びショウジョウバエのような実験動物では実証されているが、大きな家畜の内因性遺伝子を破壊するためには使用されていない。この研究において、我々は、ブタのα1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧＧＴＡ１）遺伝子の両アレルノックアウトを誘発するためにＺＦＮを使用した。初代ブタ線維芽細胞を、ＧＧＴＡ１の触媒中心をコードする領域を標的として設計されたＺＦＮで処理したところ、処理した細胞の約１％で、両アレルノックアウトが生じた。これらの細胞をガラクトース（Ｇａｌ）エピトープカウンターで選択した集団を体細胞核移植（ＳＣＮＴ）に用いた。誕生した６つの胎仔、全てがＧａｌエピトープを完全に欠き、用いたドナー細胞集団とは表現型で区別できなかったことは、ＺＦＮによる遺伝子改変がクローニングプロセスを妨害しないことを示す。オフターゲット切断事象も、ＺＦＮをコードするプラスミドの組込みも検出されなかった。ＧＧＴＡ１－ＫＯ表現型は、ＧＧＴＡ１がノックアウトされた線維芽細胞が、野生型の細胞と比較して保護されることを示す補体溶解アッセイによって確認された。ＧＧＴＡ１がノックアウトされた胎仔の細胞、及びプールされトランスフェクトされた細胞が、ＳＣＮＴによる子孫を作製するために使用された。この研究論文は、内因性遺伝子のＺＦＮが誘導した両アレルノックアウトを有するクローンブタの作製について報告する。これらの発見は、農業及び生物医学の両者に利益をもたらす遺伝子ＫＯブタの作製に向けたユニークな道を開く。」（１２０１３ページ左欄１～２４行） (３)　序論の項 ア　「・・・α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子は、ブタのすべての組織の細胞表面にあるＧａｌエピトープの生成に関与する酵素をコードする。Ｇａｌエピトープは、ブタを霊長類に移植する際の重要な抗原で、予め形成された抗体と結合することにより超急性拒絶（ＨＡＲ）反応を生じる(13)。」（１２０１３ページ右欄９～１３行） イ　「ＺＦＮは、α1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素の触媒ドメインをコードするＤＮＡを標的とするように設計され、・・・」（１２０１３ページ右欄２３～２４行） (４)　結果(Results) 「ＺＦＮの設計及びＧＧＴＡ１－ＫＯ細胞の作製 ＺＦＮは、酵素の触媒領域をコードするＧＧＴＡ１の一部分（エクソン９）を標的とするように設計された。・・・体細胞核移植（ＳＣＮＴ）に適した初代ブタ線維芽細胞にトランスフェクトした場合、イソレクチンＢ４結合ＦＩＴＣで染色された細胞のＦＡＣＳ分析の結果、ＺＦＮ処理細胞の１％が完全にＧａｌ－であった（図２）。ＺＦＮ処理細胞を上記レクチンで対抗選択し、ＧＧＴＡ１遺伝子の破壊及びＧａｌ発現について分析した。ＧＧＴＡ１のＰＣＲ産物のSurveyorヌクレアーゼアッセイは、標的領域におけるＺＦＮ誘発変異が多く存在することを示した；ＦＡＣＳ分析の結果、これらの細胞の９９％がＧａｌ－であることを示した。」（１２０１３ページ右欄３２行～１２０１４ページ左欄３行） (５)　材料と方法(Materials and Methods) 「細胞培養及び細胞のトランスフェクション 初代ブタ胎仔線維芽細胞を、参考文献２に示されたように２５日齢の胎仔から得、・・・を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（・・・）で７代継代培養した（バッチ番号・・・）。３×１０６の細胞をトリプシン処理（・・・）し、ＰＢＳ（・・・）で洗浄し、遠心分離し、各ＺＦＮプラスミドの７．５μｇのＤＮＡを含む８００μＬのエレクトロポレーション緩衝液（・・・）に懸濁した。」（１２０１６ページ右欄２１～３１行） ２　引用例４ 原査定で引用された、本願出願日前の２０１１年８月に頒布された，Nat Biotechnol, Vol.29, No.8, pp.695-696.には以下の事項が記載されている。（引用例４は英語で記載されているので訳文で示す。また、下線は当審で付与した。） (１)　表題の項 「胚へのＴＡＬＥＮの顕微注入によって作製されたノックアウトラット」 (２)　「非常に活性な転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の最近の報告1は、我々に、実験ラットを用いたin vivo遺伝子処理の有用性を探求するように促した。ラットは、ヒトの疾患及び毒物学のモデルに適しており、貴重な実験動物である。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）技術とラットの胚性幹細胞の単離は、ラットゲノムの標的改変を可能にした2-5。近年、キサントモナス由来の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクタータンパク質が、配列特異的ＤＮＡ認識の明らかに単純な規則のために、多くの関心を引いている。いくつかの研究グループがＴＡＬエフェクタータンパク質にＦｏｋＩヌクレアーゼドメインを融合しＴＡＬＥＮを作製している1, 8-12。しかし、ＴＡＬエフェクタータンパク質の最適な断片のみが、内因性遺伝子座の高頻度遺伝子破壊と標的化ＤＮＡ組込みを可能にした1, 13, 14。ここでは、我々はＴＡＬＥＮを用いてラットのＩｇＭ遺伝子座を破壊し、ＩｇＭ機能のない遺伝的変異を創出する。我々の結果は、哺乳動物におけるin vivo遺伝子ノックアウトのためのＴＡＬＥＮ技術の使用を確立する。」（６９５ページ左欄２行～右欄２行） (３)　「我々は、ラットＩｇＭのエクソン２に対するＴＡＬＥＮを作製し、ラットＳ１６細胞のＩｇＭ遺伝子座を改変する能力を試験した（図１ａ及び補遺 配列）。ＴＡＬＥＮペアは、ＤＮＡとして送達された場合に染色体の約２１％を修飾し、ｍＲＮＡとして送達された場合には最大１３％を修飾した（図１ｂ）。我々は、これらの核酸をラットの胚2に注入し、誕生した仔のＩｇＭ遺伝子座の変化を分析した（図１ｃ）。すべての用量において、ＤＮＡを注入したラットの胚の７／７４（９．５％）、及びｍＲＮＡを注入したラットの胚の５１／８８（５８％）で、ＩｇＭが修飾された（表１）。ｍＲＮＡを注入したＩｇＭ変異ラットでは、１３／５１（２５％）で、両アレルがこの単一ステップで修飾され、いくつかは両方のアレルでＩｇＭ機能を排除すると予測されるフレームシフト変異を含んでいた（補遺 表１）。ＩｇＭ変異の頻度はＴＡＬＥＮの量に関係があり、１０ｎｇ／μｌ及び４ｎｇ／μｌのｍＲＮＡを注入したラットで、その割合が最も高い（７５％）（表１）。」（６９５ページ右欄３～２７行） (４)　「ＺＦＮは２５を超えるラット遺伝子を破壊するために使用されている15一方、この報告はＴＡＬＥＮを用いたラット遺伝子ノックアウトの最初のものである。ＴＡＬＥＮ技術は適応例が少ないので、ラットの遺伝子破壊に関して、ＺＦＮとＴＡＬＥＮの最終的な比較はができない。しかし、ラットＩｇＭ遺伝子座を破壊するためのＺＦＮの以前の使用2は、ＩｇＭを標的とするように設計されたＴＡＬＥＮ及びＺＦＮの限定的な比較を可能にする。ヌクレアーゼをＤＮＡとして顕微注入した場合、変異した動物の頻度は同一であった（９％、ＴＡＬＥＮでは７／７４、ＺＦＮでは１８／１９８）が、ｍＲＮＡ注入では、ＴＡＬＥＮにおいてより高い頻度の改変動物をもたらした（５９％対１９％）。ＩｇＭ ＴＡＬＥＮ注入後に得られた新生動物の全頻度は２５％（１６２／６４２）で、ＩｇＭ ＺＦＮ注射では１３％（２７３／２０７９）2であった。ＩｇＭ ＺＦＮと組み合わせたＦｏｋＩヘテロ二量体の、ＩｇＭ ＴＡＬＥＮと組み合わせたＦｏｋＩヘテロ二量体（それらは、切断活性を増加させ、残留ホモ二量体化を排除して特異性を増加させる）への変更は、この相違を説明することができる（補遺 方法）。いずれにせよ、ＩｇＭ ＴＡＬＥＮは、特にｍＲＮＡとして注入された場合、効率的な標的遺伝子破壊をもたらし、そして、以前に記載されたＺＦＮでの研究と同等の挙動を示したことは明らかである。」（６９５ページ中央欄２０行～右欄１２行） 第６　引用発明 前記第５の１における引用例の摘記（特に下線部）より、引用例２には、「初代ブタ胎仔線維芽細胞を、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする核酸に接触させることを含み、当該細胞における1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧＧＴＡ１）遺伝子のノックアウトを行う方法。」についての発明が記載されているものと認められる。（以下、この発明を「引用発明」という。） 第７　本願発明と引用発明の対比・判断 (１)　対比 本願発明と引用発明を対比する。 本願明細書の段落【０００４】には、「ＴＡＬエフェクターとヌクレアーゼとの融合タンパク質（ＴＡＬＥＮ）は、細胞ＤＮＡの標的二重鎖切断を行うことが可能であり、これを用いて細胞に特異的遺伝子改変を行うことができる。」と記載されており、また、引用例２には、「ＺＦＮは、・・・をコードするＤＮＡを標的とするように設計され」と記載されている（前記第５の１(３)イ）ように、本願発明におけるＴＡＬＥＮ及び引用発明におけるＺＦＮは、いずれも標的とするＤＮＡ配列を特異的に認識するヌクレアーゼである点で共通する。また、本願明細書の段落【００９１】に「・・・遺伝子改変偶蹄目動物家畜類（ブタ(swine)）」と記載されているように、ブタは偶蹄目に属する動物である。そして、引用例２の要約（前記第５の１(２)）では、ＺＦＮによるＧＧＴＡ１遺伝子のノックアウトのことを、「ＺＦＮによる遺伝子改変」と表現していることからも明らかなように、遺伝子のノックアウトは遺伝子の改変の一種と認められる。さらに、引用発明の遺伝子をノックアウトする方法では、外来性マーカー遺伝子は使用されていない。 そうしてみると、本願発明と引用発明は、「胎仔線維芽細胞を、標的とするＤＮＡ配列を特異的に認識するヌクレアーゼをコードする核酸に接触させることを含む、外来性マーカー遺伝子を使用せずに、偶蹄目において標的化ゲノム改変を行う方法。」で一致し、標的とするＤＮＡ配列を特異的に認識するヌクレアーゼが、本願発明ではＴＡＬＥＮであるのに対して、引用発明ではＺＦＮである点において相違する。 (２)　判断 引用例４には、ラットの胚をＴＡＬＥＮをコードする核酸に接触させ、ＩｇＭ遺伝子のノックアウトを行う方法が記載されている（前記第５の２における摘記の下線部）。一方、引用例４には、ＺＦＮ技術とラットの胚性幹細胞の単離がラットのゲノムの標的改変を可能にしたところに、配列特異的ＤＮＡ認識において明らかに単純な規則を有する新たに報告されたＴＡＬＥＮは研究者に多くの関心を引き、引用例４を発表した研究グループに対し、ＴＡＬＥＮ技術をラットに適用しin vivo遺伝子処理の有用性を探求するように促した旨が記載されており（（前記第５の２(２)）、その結果、ＴＡＬＥＮをｍＲＮＡとして注入した場合には、ＺＦＮの場合と比較して効率的な標的遺伝子破壊をもたらしたことが記載されている（前記第５の２(４)）。また、引用例４には、「我々の結果は、哺乳動物におけるin vivo遺伝子ノックアウトのためのＴＡＬＥＮ技術の使用を確立する。」とも記載されている（前記第５の２(３)）。 このように、引用例４には、標的とするＤＮＡ配列を特異的に認識するヌクレアーゼを使用する遺伝子改変について、従前のＺＦＮに代えて、ＤＮＡ認識における単純な規則を有するＴＡＬＥＮを用いたことが記載されており、また、ＺＦＮと比較してＴＡＬＥＮを用いた方が効率的に標的遺伝子を改変することができたことも記載されている。そうしてみると、このような引用例４に接した当業者であれば、引用発明において、標的とするＤＮＡ配列を特異的に認識するヌクレアーゼについて、ＺＦＮをＴＡＬＥＮに代えて遺伝子の改変を行うことを想到することは、格別の創意を要する事項とは認められない。 そして、本願発明において、偶蹄目であるブタ胎仔線維芽細胞の標的化遺伝子改変を行うことができたことは、これらの引用例の記載から当業者が予測可能な事項であって、本願発明が、引用発明との上記相違点に基づいて有利な効果を有しているものとも認められない。 (３)　請求人の主張について ア　請求人は、ＺＦＮとＴＡＬＥＮは異なるヌクレアーゼである旨を主張する。しかし、前記(２)で述べたように、引用例４を発表した研究グループは、ゲノムの標的改変をＺＦＮに代えてＴＡＬＥＮで実施したうえで、両者の比較を行い、ＴＡＬＥＮを用いた方が効率的な場合があることを示している。そうしてみると、たとえ、ＺＦＮとＴＡＬＥＮが異なるものであったとしても、そのことにより、本願発明が進歩性を有するということはできず、請求人の主張には理由がない。 イ　請求人は、平成２９年１１月１４日提出の上申書において補正案を提示し、当該補正案に係る発明は進歩性を有するので、補正の機会を希望する旨を主張しているので、念のため、以下に検討する。 補正案の請求項１に記載された発明は、次のとおりのものである。 「［請求項１］　初代細胞を、ＴＡＬＥＮをコードする核酸に接触させることを含む、外来性マーカー遺伝子を使用せずに、偶蹄目において内在性遺伝子の標的化ゲノム改変を行う方法。」（以下、この発明を「補正案発明」という。） この補正案発明は、改変されるゲノムが含まれる細胞について、本願発明では、「胚割球、胎仔線維芽細胞、成体耳部線維芽細胞、顆粒膜細胞、体細胞、生殖細胞、幹細胞、もしくは胚細胞、またはインビトロ受精胚」と特定されていたものを「初代細胞」と特定し、また、ゲノムについて、「内在性遺伝子の」（標的化）ゲノムとの限定を行うものである。 しかし、まず、第一国出願の出願書類には、初代細胞についてＴＡＬＥＮによる標的化ゲノム改変を行った実施例は記載されていないことから、前記第４で述べた理由と同様の理由により、補正案発明に優先権主張の効果を認めることはできない。また、引用発明におけるＧＧＴＡ１遺伝子はブタの内在性遺伝子であることから、上記限定によっても、補正案発明と引用発明に相違点が生じるものではない。一方、改変されるゲノムが含まれる細胞を「初代細胞」と特定する点について、本願の発明の詳細な説明には、「初代細胞」について、「初代細胞という用語は、生きている動物から単離された細胞であって、組織から単離されて以来０～２回の複製が行われた細胞を意味する。」と定義して記載されているところ（段落【００１８】。下線は当審で付与。）、引用発明における初代ブタ胎仔線維芽細胞は、２５日齢の胎仔から得たものを７代継代培養したものである（前記第５の１(５)）ことから、引用発明における初代細胞は、本願で定義された初代細胞には該当しない。しかしながら、引用例２や本願（実施例８）においても行われている体細胞核移植によるクローン化ブタの作製では、核移植する体細胞について、「体細胞の体外での長時間の培養は染色体異常などの核の変異をもたらす可能性がある。そのため、できるだけ新鮮な細胞の核を利用することがクローン作製に有利と思われる」ことが、「ブタ体細胞クローン作製技術」という表題の総説（日豚会誌, 2004, Vol.41, No.2, pp.49-58.）の５１ページ左欄２１行～右欄２行、「4. ドナー細胞」の項に記載されている。そうしてみると、最終的な遺伝子が改変されたブタの作製を考慮した場合に、引用発明における初代ブタ胎仔線維芽細胞についても、胎仔から単離されものを７代継代培養したものから、単離後０～２回の複製が行われた細胞というように、できるだけ新鮮な細胞を使用することは、当業者であれば容易に想到可能な事項である。 したがって、請求人が上申書において提示した補正案に係る発明も当業者が容易に発明をすることができたものであるから、請求人の主張には理由がなく、補正を行う機会を与える合理的な理由はない。 第８　むすび 以上のとおりであるから、本願発明は、引用例２及び４に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるので、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。 したがって、他の請求項について検討するまでもなく、本願は拒絶すべきものである。 よって、結論のとおり審決する。