2025-700050

特許第７５１３３０５号発明「３次元培養された幹細胞から細胞外小胞体を製造する方法」の特許異議申立事件について、次のとおり決定する。

結 論 特許第７５１３３０５号の請求項１～１３に係る特許を維持する。

理 由 第１ 手続の経緯及び証拠方法 １．手続の経緯 特許第７５１３３０５号（請求項の数１３。以下、「本件特許」という。）は、令和３年４月２８日（優先権主張 ２０２０年４月２８日 （ＫＲ）韓国）に国際出願（特願２０２２－５６５８８４号）され、令和６年７月１日に特許権の設定登録がされたものである（特許掲載公報の発行日は、令和６年７月９日である。）。 その後、本件特許の請求項１～１３に係る特許に対して、令和７年１月８日に特許異議申立人である磯崎 紀雄（以下、単に「申立人」という。）から特許異議申立書（以下、単に「申立書」という。）が提出され、特許異議の申立てがなされた。 ２．証拠方法 申立人は申立書とともに、証拠方法として、以下に挙げる甲第１号証～甲第９号証を提出した。 甲第１号証：特表２０１８－５０８４８６号公報 甲第２号証：韓国公開特許１０－２０１９－００８０７２３号公報及び抄訳文 甲第３号証：ＫＩＭ， Ｍ．ら，ＴＩＳＳＵＥ ＥＮＧ ＲＥＧＥＮ ＭＥＤ，２０１８年，１５巻４号，４２７－４３６ページ及び抄訳文 甲第４号証：平野 雄，鎌倉女子大学学術研究所報，２０１９年，第１９巻，２１－２９ページ 甲第５号証：崔 ケン（山偏に見）鎭ら，ＯＲＧＡＮ ＢＩＯＬＯＧＹ，２０１９年，２６巻２号，８５－９４ページ 甲第６号証：イディリス アリムジャンら，ＡＧＣ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＲＥＰＯＲＴ，２０１９年，６９号，ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｇｃ．ｃｏｍ／ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ／ｌｉｂｒａｒｙ／ｄｅｔａｉｌｈｔｍｌ／１２０００６５＿４２８３．ｈｔｍｌ 甲第７号証：国際公開第２０１８／１９４１６１号 甲第８号証：特許第６１８３８１４号公報 甲第９号証：ＣＯＳＥＮＺＡ，Ｓ．ら，ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＲＥＰＯＲＴＳ，２０１７年１１月，７巻１６２１４号，１－１２ページ及び抄訳文 第２ 本件発明 請求項１～１３に係る発明は、特許請求の範囲の請求項１～１３に記載された、以下の事項によって特定されるとおりのものである。 【請求項１】 次のステップを含む、幹細胞由来の細胞外小胞体（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）の製造方法であって、前記幹細胞は間葉幹細胞である、該製造方法： （ａ）対象体から分離された幹細胞を培養して細胞凝集体（ｃｅｌｌ ａｇｇｒｅｇａｔｅ）を形成するステップ、及び （ｂ）前記細胞凝集体を、ＴＧＦ－β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ）であるＴＧＦ－β３を含む培養液で３次元培養するステップ。 【請求項２】 前記ステップ（ａ）は、多重ウェル（ｍｕｌｔｉ－ｗｅｌｌ）培養容器で幹細胞を浮遊培養（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ）することによって行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。 【請求項３】 前記多重ウェル（ｍｕｌｔｉ－ｗｅｌｌ）培養容器は、ウェル当たり３００～５００μｍの大きさを有するマイクロウェルプレートであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。 【請求項４】 前記浮遊培養は、前記多重ウェル（ｍｕｌｔｉ－ｗｅｌｌ）培養容器内にウェル当たり３００～５００個の細胞を分注することによって行われることを特徴とする、請求項２に記載の方法。 【請求項５】 前記ステップ（ｂ）は、前記細胞凝集体を浮遊状態で回転振盪培養（ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ）することによって行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。 【請求項６】 前記回転振盪培養は、５０～７０ｒｐｍの回転速度で行われることを特徴とする、請求項５に記載の方法。 【請求項７】 前記方法は、前記ステップ（ｂ）で収得した培養液から複数回の遠心分離を介して細胞外小胞体を分離するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。 【請求項８】 前記細胞外小胞体は、３０～１５０ｎｍの平均直径を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。 【請求項９】 請求項１～８のいずれか一項に記載の方法により幹細胞由来の細胞外小胞体を得て、該細胞外小胞体を有効成分として含む炎症もしくは自己免疫疾患の予防又は治療用組成物を得る、該組成物の製造方法。 【請求項１０】 前記自己免疫疾患又は炎症性疾患は、リウマチ性関節炎、反応性関節炎、１型糖尿病、２型糖尿病、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、特発性線維性肺胞炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、限局性強皮症、全身性強皮症、大腸炎、炎症性腸疾患、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、レイノー現象（Ｒａｙｎａｕｄ’ｓ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）、ベーチェット病（Ｂｅｃｈｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、川崎病（Ｋａｗａｓａｋｉ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、原発性胆汁性硬化症（ｐｒｉｍａｒｙ ｂｉｌｉａｒｙ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、原発性硬化性胆管炎（ｐｒｉｍａｒｙ ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ）、潰瘍性大腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ）、移植片対宿主病（Ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ、ＧＶＨＤ）またはクローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）であることを特徴とする、請求項９に記載の製造方法。 【請求項１１】 前記幹細胞由来の細胞外小胞体は、ペルオキシレドキシン－４（Ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ－４）、チオレドキシン還元酵素１（Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ １）及びプロスタグランジンＧ／Ｈシンターゼ２（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｇ／Ｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ ２）で構成された群から選択される１つ以上のタンパク質を高発現するものである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。 【請求項１２】 前記細胞外小胞体は、ＨＳＰ９０－β（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ９０－β）、ネプリリシン（Ｎｅｐｒｉｌｙｓｉｎ）、Ｔ－複合体タンパク質１（ＴＣＰ１）サブユニット－α、フィラミンＡ（Ｆｉｌａｍｉｎ－Ａ）、４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ３、ミオシン－９、トランスアルドラーゼ、ファシン（Ｆａｓｃｉｎ）、チオレドキシン還元酵素１、及びＲＵＶＢＬ２（ＲｕｖＢ－ｌｉｋｅ ２）で構成された群から選択される１つ以上のタンパク質をさらに高発現することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。 【請求項１３】 前記細胞外小胞体は、コロニン－１Ａ（Ｃｏｒｏｎｉｎ－１Ａ）、プロリル４－ヒドロキシラーゼサブユニットα－２（Ｐｒｏｌｙｌ ４－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ α－２）及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ｐｕｒｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）で構成された群から選択される１つ以上のタンパク質に対して陽性であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。 以下、本件発明を、項番に従い、「本件発明１」～「本件発明１３」という。 第３ 特許異議申立ての理由の概要 申立人が申立書に記載した特許異議申立ての理由（以下、「申立理由」という。）は、概略、以下のとおりである。 本件発明１～１３は、甲第１～９号証に記載された発明に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであり、それらの発明に係る特許は、特許法第２９条第２項の規定に違反してされたものであるから、特許法第１１３条第２号に該当し、取り消されるべきものである。 第４ 申立理由に係る当審の判断 １．甲第１号証に記載された事項 甲第１号証に記載された事項は以下のとおりである。なお、下線は当審で付した。 （１） 特許請求の範囲 「【請求項１】 軟骨細胞に分化されている幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む軟骨細胞への分化誘導または軟骨組織再生用組成物。 【請求項９】 請求項１ないし請求項４のいずれかの項に記載の組成物を含む軟骨疾患治療用薬剤学的組成物。」 （２） 段落００１３、図１ 「【００１３】 本発明で使用される用語、「軟骨細胞に分化されている幹細胞」とは、図１のように軟骨細胞に分化中の幹細胞を意味する。これから、軟骨細胞の遺伝情報、タンパク質、成長因子を含有しているエキソソームを分離することができる。」 「【図１】 ［図：0001423530000001.jpg］ 」 （３） 段落００１７ 「【００１７】 前記エキソソームは、当業界に知られているエキソソーム分離方法を用いて製造することができ、例えば、 １）幹細胞を増殖する段階； ２）前記増殖された幹細胞を軟骨細胞に分化させる段階；および ３）軟骨細胞に分化されている幹細胞からエキソソームを分離および精製する段階；を含む方法を用いることができる。」 （４） 段落００２０～００２１ 「【００２０】 前記軟骨細胞に分化されている幹細胞は、軟骨細胞に分化可能な成体幹細胞であってもよい。 【００２１】 前記軟骨細胞に分化可能な成体幹細胞は、骨髄幹細胞、臍帯血幹細胞または脂肪由来幹細胞であってよく、例えば、脂肪由来幹細胞であってもよい。」 （５） 段落００２５ 「【００２５】 本発明による軟骨細胞に分化される期間中に分離された幹細胞由来のエキソソームは細胞から分泌される生体膜小胞体である。また、細胞膜と類似の脂質構造を持っているので、体内に注入されたとき周りの細胞への吸収率に優れ、効能物質の迅速な伝達に軟骨組織の効果的な再生誘導が可能である。」 （６） 段落００２８ 「【００２８】 前記軟骨細胞への分化誘導用培地組成物は、幹細胞を軟骨細胞に分化させるためにデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、……、およびＴＧＦ－β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒβ１）などの分化誘導物質をさらに含むことができるが、これに限定されない。」 （７） 段落００３６～００３７ 「【００３６】 本発明のさらなる具体例は、前記軟骨細胞への分化誘導または軟骨組織再生用組成物を含む軟骨疾患治療用薬剤学的組成物を提供する。 【００３７】 本明細書で使用される用語、「軟骨疾患」は、軟骨組織の損傷に由来する軟骨疾患であってもよく、具体的には骨関節炎、変形性関節症、軟骨形成異常症、退行性関節炎、リウマチ性関節炎、骨軟化症、繊維性骨炎および無形成骨疾患から構成される群から選択されたものであってもよいが、これらに限定されない。」 （８） 段落００５４ 「【００５４】 本発明の具体例による軟骨細胞への分化誘導または軟骨再生用組成物は、軟骨細胞に分化する幹細胞由来のエキソソームを有効因子として含んでいる。幹細胞の分化過程で分泌されるエキソソームは、幹細胞の細胞増殖、再生に関連する遺伝子、タンパク質だけでなく軟骨細胞の分化に関連する成長因子を含有しており、損傷した軟骨組織の再生誘導に優れている。また、既存の細胞治療剤の副作用を最小限に抑えながら、細胞由来の伝達体として安定的かつ迅速に効能物質を細胞内に伝達することができる。したがって、軟骨疾患の予防および治療のための注射剤組成物による簡単な施術で患者の苦痛を軽減するだけでなく、施術後に継続的かつ効果的な軟骨疾患の治療が可能である。」 （９） 段落００５５ 「【００５５】 …… 【図２】 軟骨細胞に分化されている幹細胞からエキソソームが分離される時期のもので、軟骨細胞に分化されている幹細胞の形態変化の観察、およびアルシアンブルー染色（ａｌｃｉａｎ ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）による軟骨特異的基質の合成を確認した図である。 ……」 （１０） 段落００５７～００５８（実施例１）、図２ 「【００５７】 ＜実施例１＞軟骨細胞に分化されている幹細胞からエキソソームの分離 軟骨細胞に分化されている幹細胞からエキソソームを分離するために、ヒト脂肪由来幹細胞を一般培養培地［１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ）］で８０～９０％程度増殖させた後、分化培地［５％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、……、１０ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦ－β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ β１）を含有するＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ）］に交換し、合計５週間培養することにより、軟骨細胞への分化を誘導した。 【００５８】 分化培地に交換した後、エキソソームを分離する前に、幹細胞を無血清培地でありながらフェノールレッド（ｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄ）がないＤＭＥＭ培地に交換して２４時間維持した後、細胞培養上清を回収した。回収した細胞培養上清を３００ｘｇで１０分間遠心分離して細胞を除去し、２，０００ｘｇで３０分間遠心分離して細胞の分泌物を除去した。その後、分子量３，０００のフィルターが装着された遠心分離チューブ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ ｏｆｆ＝３０００、ａｍｉｃｏｎ ｔｕｂｅ）を用いて、５，０００ｘｇで６０分間遠心分離をして濃縮した。濃縮後、得られた上清は、エキソソーム分離試薬（ｅｘｏｓｏｍｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ）と１：０．５の割合で混合し、４℃で１日保管した。その後、１０，０００ｘｇで６０分間遠心分離を介してエキソソームの沈殿物を得た後、０．２２μｍフィルター（ｅｘｏｓｏｍｅ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ）を介して濾過し、リン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）で洗浄した。洗浄したエキソソーム沈殿物は、１０，０００ｘｇで６０分間遠心分離した後、ＰＢＳに再懸濁した。上清を回収した後、再び分化培地を添加して、幹細胞の軟骨細胞分化を誘導し、このような過程を５週まで繰り返した。分化培地交換２週後から、軟骨細胞に分化時に観察される細胞間凝縮現象が現れ始めて５週後には、コロニーが生成されることを確認した（図２）。したがって、細胞の形状の変化が確実に現れる分化誘導後２週後から５週までの期間中に回収した上清からエキソソームを分離した。」 「【図２】 ［図：0001423530000002.jpg］ 」 ２．甲第１号証に記載された発明 甲第１号証には、１．（１）～（１０）で摘記したとおりの記載があり、特に、エキソソームの具体的な製造例については、１．（３）や実施例（１．（１０））に記載されている。 そして、これらの記載にみられる「軟骨細胞に分化されている幹細胞」とは「軟骨細胞に分化中の幹細胞」を意味しているから（１．（２））、甲第１号証には、次のとおりの発明（以下、「引用発明１」という。）が記載されているものと認める。 「エキソソームの製造方法であって、 （ａ）ヒト脂肪由来幹細胞を培養して増殖する段階； （ｂ）前記増殖されたヒト脂肪由来幹細胞をＴＧＦ－β１を含む培地で培養することにより、軟骨細胞への分化を誘導する段階； （ｃ）軟骨細胞に分化中の幹細胞とエキソソームを分離する段階 を含む方法。」 ３．本件発明１について （１） 対比 引用発明１の「ヒト脂肪由来幹細胞」について、甲第１号証では後に軟骨形成への分化時に観察される細胞間凝縮現象がみられる細胞がであることが記載されており（１．（１０））、「ヒト脂肪由来幹細胞」は軟骨へも分化可能な幹細胞といえるところ、脂肪と軟骨はいずれも中胚葉系組織であって、他の組織にも分化可能であることを踏まえると、「ヒト脂肪由来幹細胞」は本件発明１の「間葉幹細胞」に相当するものと理解できる。また、引用発明１の「エキソソーム」は本願明細書で細胞外小胞体の一種として記載されているから（段落００１２～００１３）、本件発明１の「細胞外小胞体」に相当する。さらに、引用発明１の「ＴＧＦ－β１」はＴＧＦ－βの一種であるから、本件発明１の「ＴＧＦ－β」に相当する。そして、引用発明１のステップ（ｃ）が本件発明１には対応するステップが明記されていないものの、細胞外小胞体を細胞と分離するステップが本件発明１の細胞外小胞体の製造方法に含まれるものであることは明らかである。 そうすると、本件発明１と引用発明１とは、 「次のステップを含む、細胞外小胞体の製造方法： （ａ）対象体から分離された間葉幹細胞を培養するステップ、及び （ｂ）培養により得られた細胞を、ＴＧＦ－βを含む培養液で培養するステップ。」 である点で一致し、以下の点で相違している。 （相違点１） 本件発明１ではステップ（ａ）において培養により「細胞凝集体」を形成するのに対し、引用発明１では「ヒト脂肪由来幹細胞」培養後の細胞の形態が特定されていない点。 （相違点２） 本件発明１では、ステップ（ｂ）として、ステップ（ａ）で形成された「細胞凝集体」を、ＴＧＦ－β３を含む培養液で３次元培養するのに対し、引用発明１では「増殖されたヒト脂肪由来幹細胞」をＴＧＦ－β１を含む培養液で培養し、「軟骨細胞に分化中の幹細胞」とする点。 （相違点３） 本件発明１では製造方法により得られる細胞外小胞体が「間葉幹細胞」に由来するのに対し、引用発明１では細胞外小胞体の由来が明記されていない点。 （２） 相違点１～３について ア 甲第１号証の記載に基づく検討 甲第１号証をみると、引用発明１の「軟骨細胞に分化中の幹細胞」について、増殖された「ヒト脂肪由来幹細胞」をＴＧＦ－β１を含有する分化培地に交換し、合計５週間培養することにより、軟骨細胞への分化を誘導したこと、また、分化誘導後エキソソームを分離する前に、ＤＭＥＭ培地に交換して２４時間維持した後、細胞培養上清を回収し、エキソソームを得ていることが記載されている（１．（１０））。また、「軟骨細胞に分化中の幹細胞」からエキソソームを分離する時期については、図２に、軟骨形成開始、すなわち、分化培地での培養開始を０日目として、１４日目以降３５日目までの期間であることが記載されている。分化培地の培養期間からみて、引用発明１でエキソソームを産生している細胞である「軟骨細胞に分化中の幹細胞」とは、間葉幹細胞が本来有する、他の中胚葉系組織にも分化可能であるという複能性を喪失した状態のものと認められるから、引用発明１におけるエキソソームの由来は、間葉幹細胞である「ヒト脂肪由来幹細胞」とは別異のものである。そして、甲第１号証には、エキソソームとして、ヒト脂肪由来幹細胞等の間葉幹細胞がそれより分化していない段階で産生したものを用いることについては、記載も示唆もない。 また、甲第１号証には、「ヒト脂肪由来幹細胞」や「軟骨細胞に分化中の幹細胞」の培養を３次元、２次元のいずれの態様で培養したのかは明示されていないものの、上清を回収した後の細胞を用い、再び分化培地を添加して、幹細胞の軟骨細胞分化を誘導した時の細胞の状態を示す図２をみれば、細胞は平面培養であることが理解できる。そして、他に、３次元培養したと判断できる記載はなく、３次元培養することを示唆する記載もない。 したがって、甲第１号証には相違点１～３のいずれについても当業者が容易になし得たと判断できる記載はなく、引用発明１と甲第１号証の記載に基づいて、当業者が容易に本件発明１とすることができたと解することはできない。 イ 甲第２～９号証の記載も踏まえた検討 申立人は甲第１号証に加えて甲第２～９号証を提出しているので、甲第２～９号証の記載についても検討する。 甲第２号証、甲第３号証には間葉幹細胞から３次元培養してスフェロイド、すなわち、細胞凝集体を形成しエキソソームを生産することが記載されているが、細胞凝集体をＴＧＦ－β３を含む培養液で３次元培養することは記載されておらず、示唆もない。 甲第４号証には間葉幹細胞を３次元培養してスフェロイド、すなわち、細胞凝集体を形成することが記載されているが、間葉幹細胞由来の細胞外小胞体を製造することや細胞凝集体をＴＧＦ－β３を含む培養液で３次元培養することは記載されておらず、示唆もない。 甲第５号証、甲第６号証にはｉＰＳ細胞を３次元培養することが記載されているが、ｉＰＳ細胞は内胚葉や外胚葉にあたる組織への分化も可能であり、本件発明１で使用される間葉幹細胞とは異なるものであるから、甲第５号証、甲第６号証は、間葉幹細胞に関するものではないばかりか、細胞凝集体をＴＧＦ－β３を含む培養液で培養することや細胞外小胞体を製造することすら記載されておらず、示唆もない。 甲第７号証には間葉系幹細胞を振盪培養して細胞塊を得ること、細胞塊を分化誘導培地で分化誘導することが記載されているが、細胞外小胞体を製造することは記載されておらず、示唆もない。また、ＴＧＦ－β３については、幹細胞を軟骨細胞へと分化誘導するため使用されたとの記載はあるが（段落００４４、００６５）、細胞外小胞体の製造において使用することについての記載や示唆は存在しない。 甲第８号証には間葉系幹細胞、および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成される移植可能な人工組織について記載されているが、細胞外小胞体を製造することは記載されておらず、示唆もない。また、間葉幹細胞に対するＴＧＦ－β３の使用については、幹細胞を軟骨細胞へと分化誘導するためであることが記載されるが（段落０１１２）、細胞外小胞体の製造において使用することについての記載や示唆は存在しない。 甲第９号証にはＴＧＦ－β３を用いて間葉幹細胞を培養し、エキソソームを得たことが記載されるものの（特に、要旨、２頁１１～２２行）、「ＥＶ産生のために、ＢＭ－ＭＳＣを２×１０４個／ｃｍ２の密度で増殖培地に播種し、２４時間培養した。ＥＶの軟骨保護機能を特異的に評価するため、増殖培地にＴＧＦ－β３（１０ｎｇ／ｍＬ）を添加し、２４時間培養した。」（２ページ１６～１８行。なお、「ＥＶ」及び「ＢＭ－ＭＳＣ」は、それぞれ細胞外小胞体及び骨髄由来間葉幹細胞の略称。）と記載され、培養条件が単位面積あたりの細胞密度で示されていて、一貫して２次元培養で培養を実施していることが理解できるものであるから、甲第９号証は、間葉幹細胞の細胞凝集体を３次元培養することを記載や示唆するものではない。また、上記記載では、ＴＧＦ－β３の添加目的について「ＥＶの軟骨保護機能を特異的に評価するため」と明記されていることから、細胞外小胞体の製造を目的として細胞凝集体の培養液にＴＧＦ－β３を含むようにすることが直ちに読み取れるものでもない。 そうすると、アにおける検討も加味すれば、甲第１～９号証のいずれにも、細胞外小胞体の製造方法において、「（ｂ）前記細胞凝集体を、・・・ＴＧＦ－β３を含む培養液で３次元培養するステップ」を設けることが記載も示唆もない。 したがって、引用発明１に甲第１～９号証に記載された事項を組み合わせることを検討しても、相違点１及び２について容易になし得たということはできず、さらに相違点３を含む本件発明１は、なおさら、甲第１号証から甲第９号証の記載を踏まえても、当業者が引用発明１から容易に発明することができたということはできない。 （３） 小括 よって、本件発明１に係る特許は、特許法第２９条第２項に違反してされたものではないから、申立理由は理由がない。 ４． 本件発明２～１３について 上記２．及び３．で検討したように、本件発明１は、当業者が容易に発明することができたとはいえないところ、本件発明２～１３ではいずれも請求項１を引用しており、本件発明１の発明特定事項を更に限定するものである。 そうすると、１．～３．で検討した内容はいずれも本件発明２～１３においても同様に当てはまるものといえ、当業者といえども、本件発明２～１３は、引用発明１と甲第１号証から甲第９号証の記載に基づいて、容易に発明することができたということはできない。 よって、本件発明２～１３に係る特許についても、特許法第２９条第２項に違反するものではないから、申立理由は理由がない。 第５ むすび 以上のとおりであるから、特許異議申立書に記載した特許異議の申立ての理由によっては、本件請求項１～１３に係る特許を取り消すことはできない。 また、他に本件請求項１～１３に係る特許を取り消すべき理由を発見しない。 よって、結論のとおり決定する。