2022-003887

特願２０１９－５３１８６１「条件的活性型ポリペプチド及びそれを生成する方法」拒絶査定不服審判事件〔平成３０年 ３月 ８日国際公開、ＷＯ２０１８／０４４６１９、令和 １年１０月１０日国内公表、特表２０１９－５２８３２３〕について、次のとおり審決する。

結 論 本件審判の請求は、成り立たない。

理 由 第１ 手続の経緯 本願は、平成２９年 ８月２２日（パリ条約による優先権主張 ２０１６年 ８月３１日 （ＵＳ）アメリカ合衆国）を国際出願日とする出願であって、令和 ３年１１月 ９日付けで拒絶査定がなされ、これに対して、令和 ４年 ３月１５日に拒絶査定不服審判請求がなされるとともに手続補正がなされたものである。その後の当審における手続の経緯は、以下のとおりである。 令和 ５年１１月２１日付け 拒絶理由通知書 令和 ６年 ２月１９日付け 意見書、手続補正書 第２ 本願発明 本願の請求項１～１２に係る発明は、令和 ６年 ２月１９日付け手続補正書により補正された特許請求の範囲の請求項１～１２に記載されたとおりのものであるところ、その請求項１に係る発明は、次のとおりのものである（以下、「本願発明」という。）。 「【請求項１】 親抗体、親一本鎖抗体または親抗原結合性抗体断片から条件的活性型抗体、条件的活性型一本鎖抗体または条件的活性型抗原結合性抗体断片を調製する方法であって、 ｉ．前記親抗体、親一本鎖抗体または親抗原結合性抗体断片をコードするＤＮＡを、前記ＤＮＡ中の荷電アミノ酸残基のコドンの全数の増加、前記ＤＮＡ中の非荷電アミノ酸残基のコドンの全数の減少及びそれらの組み合わせから選択される１つ以上の技術を用いて前記親抗体、親一本鎖抗体または親抗原結合性抗体断片の正味電荷を増加させて、突然変異体ＤＮＡをもたらすように進化させる工程であって、前記荷電アミノ酸残基が、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リシン及びヒスチジンから選択される、工程と、 ｉｉ．前記突然変異体ＤＮＡを発現させて突然変異体抗体、突然変異体一本鎖抗体または突然変異体抗原結合性抗体断片を取得する工程と、 ｉｉｉ．突然変異体抗体、突然変異体一本鎖抗体または突然変異体抗原結合性抗体断片を、第１のｐＨのｐＨ６．０での抗原に対する結合活性の第１のアッセイ、第２のｐＨのｐＨ７．４での抗原に対する結合活性の第２のアッセイ、および第２のアッセイの第２のｐＨをｐＨ６．０に調節して得られたアッセイ媒体中の抗原に対する結合活性のアッセイに供してｐＨ７．４での結合活性の可逆的不活性化を判断する工程と、 ｉｖ．第１のｐＨのｐＨ６．０での第１のアッセイにおいて、第２のｐＨのｐＨ７．４での第２のアッセイにおける同じ結合活性と比較して、結合活性の増加を呈し、且つ結合活性が第２のｐＨのｐＨ７．４で可逆的に不活性化される前記条件的活性型抗体、条件的活性型一本鎖抗体または条件的活性型抗原結合性抗体断片を前記突然変異体抗体、突然変異体一本鎖抗体または突然変異体抗原結合性抗体断片から選択する工程と を含む方法。」 第３ 当審で通知した拒絶の理由 令和 ５年１１月２１日付けで当審が通知した拒絶理由のうち理由１（進歩性）の概要は、請求項１～１２に係る発明は、本願優先日前に頒布された又は電気通信回線を通じて公衆に利用可能となった下記の引用文献１～２に記載された発明に基いて、当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない、というものである。 引用文献１：国際公開第２０１６／０３６９１６号 引用文献２：特表２０１３－５４１９４０号公報 第４ 引用文献の記載事項及び引用発明の認定 当審の拒絶理由で引用文献１として引用した、本願優先日前に頒布された又は電気通信回線を通じて公衆に利用可能となった引用文献である国際公開第２０１６／０３６９１６号（以下、「引用文献１」という。）には、以下の事項が記載されている（英語で記載されているため、日本語訳で摘記する。下線は合議体による。）。 ア．「１． 条件的活性型生物学的タンパク質を作製する方法であって、 ｉ．野生型生物学的タンパク質を選択する工程と、 ｉｉ．前記野生型生物学的タンパク質をコードするＤＮＡを、１つ以上の進化的技術を用いて、突然変異体ＤＮＡをもたらすように進化させる工程と、 ｉｉｉ．真核細胞産生宿主で前記突然変異体ＤＮＡを発現させて、突然変異体タンパク質を取得する工程と、 ｉｖ．前記突然変異体タンパク質及び前記野生型タンパク質を、正常生理条件下でのアッセイ及び異常条件下でのアッセイに供する工程と、 ｖ．工程（ｉｉｉ）で発現した前記突然変異体タンパク質であって、（ａ）前記正常生理条件での前記アッセイにおいて、前記野生型タンパク質と比較して、活性の低下、及び（ｂ）前記異常条件下での前記アッセイにおいて、前記野生型タンパク質と比較して、活性の増加、のうちの少なくとも１つを呈する条件的活性型生物学的タンパク質を前記突然変異体タンパク質から選択する工程と、 ｖｉ．工程（ｉｉｉ）で使用したのと同じ真核細胞産生宿主で前記条件的活性型生物学的タンパク質を作製する工程と を含む方法。 ２． 前記条件的活性型生物学的タンパク質が、（ａ）前記正常生理条件での前記アッセイにおいて、前記野生型タンパク質と比較して、活性の低下、及び（ｂ）前記異常条件下での前記アッセイにおいて、前記野生型タンパク質と比較して、活性の増加の両方を呈する、請求項１に記載の方法。 ３． 前記野生型生物学的タンパク質が抗体である、請求項１又は２に記載の方法。 ・・・・・・・・・・・・ ６． 前記正常生理条件が、正常生理温度、ｐＨ、浸透圧、重量オスモル濃度、酸化的ストレス及び電解質濃度のうちの１つ以上から選択される、請求項１又は２に記載の方法。 ・・・・・・・・・・・・ ８． 前記進化させる工程が、ＰＣＲ、エラープローンＰＣＲ、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、アセンブリＰＣＲ、セクシャルＰＣＲ突然変異誘発、インビボ突然変異誘発、カセット突然変異誘発、再帰的アンサンブル突然変異誘発、指数関数的アンサンブル突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、遺伝子リアセンブリ、遺伝子部位飽和突然変異誘発、インビトロ突然変異誘発、リガーゼ連鎖反応、オリゴヌクレオチド合成及びこれらの組み合わせからなる群から選択される技法を含む、請求項１又は２に記載の方法。 ・・・・・・・・・・・・ ２５． 請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法によって調製される条件的活性型生物学的タンパク質であって、正常生理条件で可逆的又は不可逆的に不活性化される条件的活性型生物学的タンパク質。」（請求項１～２５） イ．「［０００３２］ 用語「抗体」は、本明細書で使用されるとき、インタクトな免疫グロブリン分子、並びにＦａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、及びＳＣＡ断片などの抗原のエピトープとの結合能を有する免疫グロブリン分子の断片を指す。これらの抗体断片は、それが由来する抗体の抗原（例えばポリペプチド抗原）に選択的に結合するいくらかの能力を保持しているものであり、・・・・・・・・・・・・キメラ抗体、ヒト様抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体が、ヒト患者への投与に特に有用である。」（［０００３２］） ウ．「［０００１２４］ 本明細書で使用されるとき、用語「一本鎖抗体」は、概してスペーサーペプチドを介して連結された、ポリペプチド連鎖におけるＶＨドメインとＶＬドメインとを含むポリペプチドであり、且つアミノ末端及び／又はカルボキシ末端に追加的なアミノ酸配列を含み得るものを指す。例えば、一本鎖抗体は、コードポリヌクレオチドに連結するための係留セグメントを含み得る。例として、ｓｃＦｖは一本鎖抗体である。・・・・・・・・・・・・」（［０００１２４］） エ．「［０００１４４］ 本明細書で使用されるとき、用語「野生型」は、ポリヌクレオチドがいかなる突然変異も含まないことを意味する。「野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）タンパク質」、「野生型（ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ）タンパク質」、「野生型（ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ）生物学的タンパク質」、又は「野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）生物学的タンパク質」は、自然から単離することのできる、自然中に見られる活性レベルで活性であり、且つ自然中に見られるアミノ酸配列を含むタンパク質を指す。野生型タンパク質は、ヒトタンパク質、哺乳類タンパク質、ヒトウイルスタンパク質又は哺乳類タンパク質であり得る。用語「親分子」及び「標的タンパク質」も野生型タンパク質を指す。野生型タンパク質は好ましくは、より高い結合親和性及び／又は酵素活性、特定の温度及び／又はｐＨにおけるより良好な安定性、向上した選択性及び／又は溶解度など、何らかの所望の特性を有する。かかる野生型タンパク質は、タンパク質ライブラリを所望の特性に関してスクリーニングして得ることができる。」（［０００１４４］） オ．「［０００１４６］ 本開示はまた、野生型条件において可逆的に又は不可逆的に不活性であるが、野生型条件と同じ又は等しいレベルの非正常条件において活性である新規な分子を生成するためのタンパク質を操作又は進化させる方法を指示する。これらの新規なタンパク質はまた、「Ｍｉｒａｃ」タンパク質として本明細書に参照される。Ｍｉｒａｃタンパク質は、宿主内において短い又は限定的な期間において活性化する新規な治療薬の開発において特に価値がある。宿主に有害であるが、限定された活性が、所望の治療を実行するのに必要である、投与されるタンパク質の拡張された操作において、これは特に価値がある。有益な適用の実施例は、高濃度においての局所的治療と同様に、高投与量での局所的又は全身的治療を含む。生理的条件下での不活性化は、投与の組み合わせ及びタンパク質の不活性化の割合によって決定されることがある。この条件に基づいた不活性化は、触媒活性が比較的短い期間において実質的に負の影響を引き起こすとき、酵素治療において特に重要である。」（［０００１４６］） カ．「親分子からの進化させた分子の生成 ［０００２６４］ 条件的活性型生物学的タンパク質は、野生型タンパク質の突然変異誘発プロセスと、非野生型条件での活性が野生型条件での活性と同じに留まるか、又はそれより良好でありながら野生型条件では活性が低下することに関する個々の突然変異のスクリーニングとによって生成することができる。 ［０００２６５］ 任意の化学的合成又は組換え突然変異誘発方法を用いて変異ポリペプチド集団を生成し得る。本発明の実施には、特に指示されない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の従来技術を用い得る。かかる技法は文献に十分に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．，１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓらの米国特許第４，６８３，１９５号明細書；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｂｓ ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ ｌ－ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）を参照のこと。 ・・・・・・・・・・・・ ［０００２６９］ 開始分子から選択的タンパク質を作るために、現在、広く使われている突然変異誘発の方法は、オリゴヌクレオチド指定突然変異技術、エラープローンポリメラーゼ鎖反応（エラープローンＰＣＲ）及びカセット突然変異誘発であり、そこでは、最適化される特定の領域は、合成的に突然変異を誘発されたオリゴヌクレオチドと置換される。これらの場合、多くの突然変異部位は元の配列における特定の部位の周辺で発生する。 ［０００２７０］ オリゴヌクレオチド指定突然変異において、短い配列は、合成的に突然変異を誘発されたオリゴヌクレオチドと置換される。オリゴヌクレオチド指定突然変異において、ポリヌクレオチドの短い配列は、制限酵素消化を使用する合成ポリヌクレオチドから除かれ、様々な塩基が元の配列から変更された合成ポリヌクレオチドと置換される。ポリヌクレオチド配列は化学的突然変異誘発によって変更されることもある。化学的突然変異ゲ原は、例えば、重亜硫酸ナトリウム、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、又はギ酸を含む。ヌクレオチド前駆体と類似の他の薬剤は、ニトロソグアニジン、５－ブロモウラシル、２－アミノプリン、又はアクリジンを含む。一般的に、これらの薬剤は、それにより配列を変位させるヌクレオチド前駆体の代わりにＰＣＲ反応に加えられる。プロフラビン、アクリフラビン、キナクリンなどのような薬剤の挿入が使用されることもある。ポリヌクレオチド配列のランダムな突然変異誘発は、Ｘ線又は紫外線照射によって得られることがある。一般的に、突然変異誘発されたプラスミドポリヌクレオチドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内に導入され、交雑プラスミドのプール又はライブラリとして伝播される。 ［０００２７１］ エラープローンＰＣＲは、長い配列にわたってランダムに点突然変異の低レベルを導入するための低忠実度重合条件を使用する。未知の配列の断片の混合物において、エラープローンＰＣＲは、混合物を突然変異誘発するのに用いられることがある。 ［０００２７２］ カセット突然変異誘発において、単一テンプレートの配列遮断は、典型的にはランダム配列によって（部分的に）置換される。Ｒｅｉｄｈａａｒ－Ｏｌｓｏｎ Ｊ Ｆ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ Ｒ Ｔ：Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ａｓ ａ ｐｒｏｂｅ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１（４８６１）：５３－５７，１９８８。 ・・・・・・・・・・・・ ［０００２７４］ 部位飽和点突然変異誘発の１つの方法は、米国特許出願公開第２００９／０１３０７１８号明細書に記載されており、本明細書に参照により組み込まれている。この方法は、テンプレートポリヌクレオチドのコドンに対応する一連の変性プライマーを提供し、及び変性プライマーに対応する配列を含む子孫ポリヌクレオチドを製造するためのポリメラーゼ伸長を実行する。子孫ポリヌクレオチドは、直接的進化において発現され、及びスクリーニングされる。具体的には、これは、一連の子孫ポリペプチドを製造するための方法であって、工程（ａ）テンプレートポリペプチド配列をエンコードするコドンの複数からそれぞれなるテンプレートポリペプチドのコピーを提供する工程、及び（ｂ）テンプレートポリヌクレオチドの各コドンにおいて、（１）一連の変性プライマーを提供する工程、そこでは、各プライマーはテンプレートポリヌクレオチドのコドンに対応する変性コドンからなり、少なくとも１つの隣接配列は、テンプレートポリヌクレオチドのコドンに隣接する配列に相同である、（２）プライマーがテンプレートポリヌクレオチドのコピーにアニール可能な条件を提供する工程、及び（３）テンプレートに沿ったプライマーからのポリメラーゼ伸長反応を実行する工程の（１）～（３）の工程を実行し、それによって子孫ポリヌクレオチドを提供し、それぞれがアニールされたプライマーの変性コドンに対応する配列を含み、それによって一連の子孫ポリヌクレオチドを製造する。 ［０００２７５］ 部位飽和突然変異誘発は、核酸の誘導された進化及び例えば核酸活性及び／又は特異的タンパク質、特に酵素、対象の活性のような結果として生じる対象の活性において進化した核酸を含むクローンのスクリーニングに関するものである。 ［０００２７６］ この技術によって提供された突然変異誘発された分子は、糖、脂質、核酸及び／又はタンパク質組成物を含む生物学的分子を含む、キメラ分子及び点突然変異を有する分子を有することがあり、及び特異的であるが非限定的なこれらの実施例は、抗生物質、抗体、酵素、及びステロイド及び非ステロイドホルモンを含む。 ［０００２７７］ 部位飽和突然変異誘発は、１）分子の子孫世代を調製する工程（ポリヌクレオチド配列からなる分子、ポリペプチドからなる分子、及びポリヌクレオチド配列の部分及びポリペプチド配列の部分からなる分子を含む）、これは少なくとも１つの点突然変異、付加、欠失及び／又はキメラ化を１つ以上の祖先又は親世代テンプレートから得るための突然変異誘発である、２）子孫生成分子をスクリーニングする工程 － 好適には、対象の少なくとも１つの性質（例えば、酵素活性における改良、又は安定性の増加、又は新規の化学療法的効果）において、高スループット法を使用する工程、３）親及び／又は子孫世代分子に関する構造及び／又は機能的情報を任意選択により得る及び／又は一覧にする工程、及び４）任意の工程１）～３）を任意選択により繰り返す工程からなる方法を一般的に意味する。 ［０００２７８］ 部位飽和突然変異誘発において、生成された（例えば、親ポリヌクレオチドテンプレートから）「コドン部位飽和突然変異誘発」と称されるポリヌクレオチドの子孫世代は、全てのコドン（又は同じアミノ酸をエンコードする変性コドンの全系統）が各コドン位置で表れるように、それぞれが、３つ以上の隣接点突然変異（すなわち、新しいコドンからなる異なる塩基）の少なくとも１組を有する。このポリヌクレオチドの子孫世代に対応する、及びこのポリヌクレオチドの子孫世代によってエンコードされるのは、それぞれ少なくとも１つの単一アミノ酸点突然変異を有する、生成された一連の子孫ポリペプチドである。好適な態様において、生成された「アミノ酸部位飽和突然変異誘発」と称される一例は、ポリペプチドに沿った各アミノ酸位置及び全アミノ酸位置でアルファアミノ酸置換を形成する、自然にエンコードされる１９のポリペプチドのそれぞれにおける変異ポリペプチドである。この収量は － 親ポリペプチドに沿った各アミノ酸位置及び全アミノ酸位置 － 元のアミノ酸を含む２０の異なる子孫ポリペプチドの全て、又は付加アミノ酸が、２０の自然にエンコードされたアミノ酸の代わりに、又は付加されてのいずれかで使用される場合、潜在的に２１以上の異なる子孫ポリペプチドである。」（［０００２６４］～［０００２７８］） キ．「変異体のスクリーニングによる可逆的又は非可逆的変異体の同定 ［０００３２３］ 望ましい分子の同定は、許容型の条件及び野生型の条件におけるタンパク質活性を測定することによって、非常に直接的に達成される。最も高い活性の比（許容型／野生型）を示す変異体を、次いで選択し、標準的な方法を用いて個々の変異を組み合わせることで、点変異の並べ替え（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）を生成することができる。次いで、この組み合わせた並べ替えタンパク質ライブラリから、許容型と野生型の活性に最も大きい差を示すタンパク質をスクリーニングする。 ［０００３２４］ 上清の活性を、様々な方法、例えば、蛍光アッセイなどのハイスループットな活性アッセイを使ってスクリーニングして、希望する特性（温度、ｐＨなど）に感受性を有する、タンパク質変異体を同定することが可能である。例えば、時間的感受性の変異体をスクリーニングするためには、個々の変異体ごとに、低い温度（２５℃など）と、元のタンパク質が機能する温度（３７℃など）とにおいて、商業的に利用可能な基質を用いて、酵素活性又は抗体活性の測定を行う。反応は、最初は９６ウェルアッセイなどのマルチウェルアッセイの形式で行われ、１４ｍｌチューブ形式などの異なる形式を用いて確認されてもよい。 ［０００３２５］ 本開示は、酵素を同定するためのスクリーニングアッセイをさらに提供するものであって、アッセイは、（ａ）複数の核酸又はポリペプチドを提供する工程と、（ｂ）複数の核酸又はポリペプチドから、酵素活性をテストするためのポリペプチドの候補を取得する工程と、（ｃ）候補の酵素活性をテストする工程と、（ｄ）これらのポリペプチドの候補であって、例えば、温度、ｐＨ、酸化的ストレス、浸透圧性、電解質濃度、又は浸透圧の条件が、異常な条件又は非生理的な条件下において、野生型酵素タンパク質に比べてより高い酵素活性を示し、通常の生理的な条件下において、より低い酵素活性を示すものである、ポリペプチドの候補を同定する工程とを有するものである。 ［０００３２６］ 一態様において、本方法は、候補の条件的生物活性をテストする前に、少なくとも１つの核酸又はポリペプチドを修飾する工程をさらに含み、別の態様において、テストする工程（ｃ）は、宿主細胞又は宿主生物におけるポリペプチドの発現の向上をテストする工程をさらに含み、さらなる態様において、テストする工程（ｃ）は、約ｐＨ３～約ｐＨ１２のｐＨ範囲内で酵素活性をテストする工程をさらに含む。さらなる態様において、テストする工程（ｃ）は、約ｐＨ５～約ｐＨ１０のｐＨ範囲内で酵素活性をテストする工程をさらに含む。さらなる態様において、テストする工程（ｃ）は、約ｐＨ６～約ｐＨ８のｐＨ範囲内で酵素活性をテストする工程をさらに含む。さらなる態様において、テストする工程（ｃ）は、約ｐＨ６．７及び約ｐＨ７．５で酵素活性をテストする工程をさらに含む。別の態様において、テストする工程（ｃ）は、約４℃～約５５℃の温度範囲内で酵素活性をテストする工程をさらに含む。別の態様において、テストする工程（ｃ）は、約１５℃～約４７℃の温度範囲内で酵素活性をテストする工程をさらに含む。別の態様において、テストする工程（ｃ）は、約２０℃～約４０℃の温度範囲内で酵素活性をテストする工程をさらに含む。別の態様において、テストする工程（ｃ）は、約２５℃及び約３７℃で酵素活性をテストする工程をさらに含む。別の態様において、テストする工程（ｃ）は、正常な浸透圧下、及び異常な（正又は負の）浸透圧下で酵素活性をテストする工程をさらに含む。別の態様において、テストする工程（ｃ）は、正常な電解質濃度下、及び異常な（正又は負の）電解質濃度下で酵素活性をテストする工程をさらに含む。テストされる電解質濃度は、カルシウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、塩素、重炭酸、及びリン酸濃度の１つから選択され、別の態様において、テストする工程（ｃ）は、安定した反応産物をもたらす酵素活性をテストする工程をさらに含む。 ［０００３２７］ 別の態様において、本開示は、酵素活性を有する本開示のポリペプチド又はその断片に特異的に結合する精製抗体を提供する。一態様において、本開示は、酵素活性を有するポリペプチドに特異的に結合する抗体の断片を提供する。 ［０００３２８］ スクリーニング分析の正常生理条件及び異常条件は、温度、ｐＨ、浸透圧、重量オスモル濃度、酸化、及び電解質濃度から選択される任意の条件、並びに２つ以上のかかる条件の組み合わせであり得る。例えば、温度に関する正常生理条件は３７．０℃の正常なヒト体温であってもよく、一方、温度に関する異常条件は、３７．０℃の温度と異なる温度であってもよい。正常生理条件及び異常条件はまた、正常な生理的ｐＨ及び異常なｐＨであってもよい。 ［０００３２９］ 正常生理条件下及び異常条件下の両方とも、分析は、例えば緩衝液を含有し得る媒体、例えば液体媒体を使用して実施され得る。一般的なスクリーニング緩衝液はクレブス緩衝液である。しかしながら、分析に好適であることが当業者に公知の他の緩衝液が用いられてもよい。これらの緩衝液の多くは、血清又はリンパ液などの体液の組成を模擬しようとするものである。本発明の方法で使用される緩衝液は、哺乳動物又はヒトの体液に一般に見出される無機化合物、イオン及び有機分子の１つ以上から選択される少なくとも１つの構成成分を含有し得る。かかる構成成分の例としては、少なくとも栄養素及び代謝産物、並びに体液に見られ得る任意の他の構成成分が挙げられる。これらの実施形態において、緩衝液中の構成成分の濃度は、哺乳動物、好ましくはヒトの天然に存在する体液中に典型的に見られる同じ構成成分の濃度と同じ又は実質的に同じであり得る。これは、体液中のその構成成分の正常生理的濃度と称され得る。 ［０００３３０］ 一実施形態において、正常生理条件下での分析は、正常な生理的ｐＨ、例えばｐＨ７．４の組成物で実施される。この分析は、哺乳動物又はヒトの体液に一般に見出される無機化合物、イオン、及び有機分子から選択される少なくとも１つの構成成分の存在下で行われる。異常条件下での分析は、緩衝液など同じ構成成分の存在下で、ｐＨ６など、正常な生理的ｐＨと異なる異常なｐＨで実施される。従って、この実施形態において両分析が行われる流体は、好ましくは正常な生理的濃度の範囲内であるか又はそれに近いものであるべき同じ濃度の同じ１つ又は複数の構成成分を含む。」（［０００３２３］～［０００３３０］） ク．「［０００３５６］ 一実施形態において、条件的活性型生物学的タンパク質は抗体であり、これは異常条件での活性と正常生理条件での活性との比が少なくとも約５：１、又は少なくとも約６：１、又は少なくとも約７：１、又は少なくとも約８：１、又は少なくとも約９：１、又は少なくとも約１０：１であり得る。一実施形態において、この条件的活性型生物学的タンパク質は腫瘍部位の標的化に使用され、条件的活性型生物学的タンパク質は腫瘍部位で特別な活性を有し、非腫瘍部位（正常生理条件）では同じ活性に関して活性が大幅に低いか、又は不活性である。」（［０００３５６］） ケ．「［０００４３１］ 一部の実施形態において、本発明は、ＢＢＢ－Ｒに対する親抗体又は野生型抗体から生成される条件的活性型抗体を提供する。この条件的活性型抗体は、ＢＢＢの血液側ではＢＢＢ－Ｒに結合し、ＢＢＢの脳側ではＢＢＢ－Ｒに対する親和性が親抗体又は野生型抗体より低い。一部の他の実施形態において、この条件的活性型抗体は、ＢＢＢの血液側では野生型抗体又は親抗体と比べてＢＢＢ－Ｒに対する親和性を有し、ＢＢＢの脳側ではＢＢＢ－Ｒに対する親和性を有しない。」（［０００４３１］） コ．「腫瘍に対する条件的活性型生物学的タンパク質の操作 ［０００４５２］ 固形腫瘍の癌細胞は、その周囲に腫瘍微小環境を形成して癌細胞の成長及び転移を支援する能力を有する。腫瘍微小環境は、周囲血管、免疫細胞、線維芽細胞、他の細胞、可溶性因子、シグナル伝達分子、細胞外マトリックス、並びに新生物形質転換を促進し、腫瘍成長及び浸潤を支援し、腫瘍を宿主免疫から保護し、治療抵抗性を助長し、及び潜伏転移が発育するためのニッチを提供することのできる機械的キューを含めた、腫瘍が存在する細胞環境である。・・・・・・・・・・・・ ［０００４５４］ 加えて、腫瘍細胞は、酸素を必要としない乳酸発酵によって生成されるエネルギーに頼る傾向がある。そのため腫瘍細胞は、酸素を必要とする通常の好気的呼吸を使用することが少ない。乳酸発酵を使用する結果、腫瘍微小環境は酸性となり（ｐＨ６．５～６．９）、これは典型的に中性又は弱塩基性のいずれかである体の他の部分と対照的である。例えば、ヒト血漿は約７．４のｐＨを有する。・・・・・・・・・・・・ ［０００４５６］ 従って、腫瘍微小環境は、血漿中における生理条件など、体の他の部分の生理条件と異なる少なくともいくつかの生理条件を有する。腫瘍微小環境は、体の他の部分、特に血漿（ｐＨ７．４）と比べてｐＨ（酸性）が低い。腫瘍微小環境は、血漿などの体の他の部分と比べて酸素濃度が低い。また、腫瘍微小環境は、体の他の部分、特に血漿と比べて栄養素の利用可能性も低い。腫瘍微小環境はまた、体の他の部分、特に血漿にはあまり見られないいくつかの特徴的な細胞型も有する。 ・・・・・・・・・・・・ ［０００４６２］ 一部の実施形態において、本発明は、腫瘍治療候補であり得る野生型生物学的タンパク質から生成される条件的活性型生物学的タンパク質を提供する。この条件的活性型生物学的タンパク質は、血漿などの腫瘍微小環境以外の体の部分における少なくとも１つの生理条件下で野生型生物学的タンパク質より低い活性を有し、一方、腫瘍微小環境における少なくとも１つの生理条件下で野生型生物学的タンパク質より高い活性を有する。かかる条件的活性型生物学的タンパク質は、腫瘍を治療するため腫瘍微小環境にある癌細胞に優先的に作用することができ、従って副作用を引き起こしにくい。生物学的タンパク質が腫瘍細胞の表面上の抗原（抗原が腫瘍微小環境に曝露している）に対する抗体である実施形態において、条件的活性型抗体は、体の他の部分、例えば非腫瘍微小環境では抗原に対する親和性が野生型抗体より低く、一方、腫瘍微小環境では抗原に対する親和性が野生型抗体より高い。かかる条件的活性型抗体は、体の他の部分では抗原に弱く結合し得るか、又は全く結合せず、しかし、腫瘍微小環境では抗原により高い結合性を有し、又は強力且つ緊密に結合する。」（［０００４５２］～［０００４６２］） サ．「実施例６．最適な抗体発現のためのＦｃコドン変異体ライブラリの作成及びスクリーニング ［０００５４７］ 本例は、親型のＦｃポリペプチドと比較して産生宿主細胞における発現が向上するように最適化されたＦｃ変異体を得るためのＦｃコドン変異体ライブラリの作成方法及びスクリーニング方法を提供する。 Ｆｃコドン変異体ライブラリの設計及び構築 ［０００５４８］ 標的範囲（この場合ヒトＩｇＧ１分子のＦｃ部）の各コドンについて、標的コドン及び両側に２０塩基を含む縮重プライマー（フォワード及びリバース）の対を設計する。標的コドンの３番目の位置（ゆらぎ位置）は、同じコドンを使用した標的位置における全てのサイレント突然変異の発生を可能にする混合塩基（表２）を含有する（例Ａ）。同じコドン位置について、対応するアミノ酸が別のコドンよってコードされ得る場合、第２の縮重プライマーの組を設計する（例Ｂ）。対応するフォワード及びリバース縮重プライマーを１：１混合し、テンプレートにアニールし、且つ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用したストランド置換によって完全長産物に伸長する。テンプレートをＤｐｎＩで消化し、完全長伸長産物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換する。突然変異誘発反応当たり最大１２個のコロニーを配列決定する。配列が確認された変異体を９６ウェルプレートにアレイ化し、グリセロール保存する。このグリセロールストックを使用して、哺乳類細胞へのトランスフェクション及びスクリーニング用のプラスミドＤＮＡをミニプレップする。 Ｆｃコドン変異体ライブラリの発現及びＥＬＩＳＡベースのスクリーニング ［０００５４９］ Ｆｃコドン変異体ライブラリからのクローンを哺乳類細胞株にトランスフェクトした。完全長ＩｇＧが産生され、培地中に分泌された。親クローンより高いＩｇＧ発現レベルに関して、発現したＦｃコドン変異体の上清をＥＬＩＳＡ分析を用いてスクリーニングした。ＥＬＩＳＡデータは、トランスフェクション効率を計測することによってβ－ガラクトシダーゼ分析で正規化した。一次スクリーニングで同定された上位ヒットの再トランスフェクション及び再スクリーニングを３回行い、発現レベルの増加を確認した。 実施例７：ｓｃＦｖ条件的活性型抗体の作成 ［０００５５０］ 薬物標的Ｘに対する２つの条件的活性型抗体（ＣＡＢ－ｓｃＦｖ－６３．９－４及びＣＡＢ－ｓｃＦｖ－６３．９－６）を野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃとのホモ二量体として発現させ（図２～図３の二価抗体ＣＡＢ－ｓｃＦｖ－６３．９－４－０１及びＣＡＢ－ｓｃＦｖ－６３．９－６－０１が得られた）、並びにノブインホールシステムのヘテロ二量体として発現させて一価ｓｃＦｖを得た（図２～図３の一価抗体ｓｃＦｖ ＣＡＢ－ｓｃＦｖ－６３．９－４－０２及びＣＡＢ－ｓｃＦｖ－６３．９－６－０２が得られた）。 ［０００５５１］ ｐＨ６．０及びｐＨ７．４での薬物標的Ｘに対するこれらの抗体の結合親和性をＥＬＩＳＡ分析によって計測した。図２に示されるように、これらのｓｃＦｖ抗体はｐＨ６．０及びｐＨ７．４の両方で薬物標的Ｘに親和性を示し、この親和性は完全二価抗体と同等であった。さらに、図３に示されるように、ｐＨ７．４と比べたｐＨ６．０でのこれらのｓｃＦｖ抗体の選択性も完全二価抗体と同等であった。この例では、本発明の条件的活性型抗体がｓｃＦｖ抗体又は完全二価抗体のいずれとしても同等の親和性及び選択性を有することが実証された。従って、本発明の条件的活性型抗体は、本発明のＣＡＲ－ＴプラットフォームにおいてＣＡＲをコードするＤＮＡ分子に単一ＤＮＡ鎖として挿入し得る。 実施例８：条件的活性型抗体の発現 ［０００５５２］ 本発明の一実施形態において、選択性及び親和性、並びにｐＨ６．０及びｐＨ７．４の両方での発現レベルに関して同時にスクリーニングすることにより、薬物標的Ｘに対する条件的活性型抗体を生成した。血清中にスクリーニングに関して偽陽性を生じ得るヒト抗体があったため、スクリーニングは血清中でＦＬＡＧタグを使用して行った。スクリーニング緩衝液は、カーボネート緩衝液（リンゲル標準緩衝液を含むがＰＢＳとは異なるクレブス緩衝液）であった。生成された条件的活性型抗体は、両方ともに野生型抗体との比較において、ｐＨ６．０で薬物標的Ｘに対してより高い親和性を有するが、同じ薬物標的Ｘに対してｐＨ７．４では親和性がより低いことが分かった。さらに、これらの条件的活性型抗体は全て、以下の表３に示すように（列「クローン」は抗体を示し、及び発現レベル「ｍｇ／ｍｌ」が２番目の列に示される）、高い発現レベルを有する。 ［０００５５３］ これらの抗体のクローンを依頼発現レベル（「注文量」、予想発現レベル）と共にサービス提供者に送った。しかしながら、これらの抗体の実際の発現レベル（「納品量」）は極めて高く、予想発現レベルを超えていた。 ［０００５５４］ 図４に例としてＢＡＰ０６３．９－１３－１抗体を使用して示すように、条件的活性型抗体は緩衝液中で凝集を示さなかった。ＢＡＰ０６３．９－１３－１抗体はサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。図４では唯１つのピークが検出され、抗体の凝集がほとんど又は全くないことが実証された。 ［０００５５５］ 条件的活性型抗体はまた、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）も用いて分析し、薬物標的Ｘに対するそのオン及びオフ速度を計測した。ＳＰＲ分析は、条件的活性型抗体のオン及びオフ速度を計測することが知られている。ＳＰＲ分析は重炭酸塩の存在下で実施した。条件的活性型抗体のインビボでの（動物及びヒトにおける）オン及びオフ速度は、条件的活性型抗体にとって極めて重要な特徴である。 ［０００５５６］ 条件的活性型抗体は、陰性対照（ＢＡＰ０６３ １０Ｆ１０、これはｐＨ６．０及びｐＨ７．４の両方で同様のオン速度を有する）との比較において、ｐＨ６．０でオン速度が速く、ｐＨ７．４ではより遅いオン速度であることが観察された（図５）。加えて、室温から６０℃に温度を上げても、ＳＰＲ分析結果が大幅に変わることはない（図５）。ＳＰＲ分析はまた、これらの条件的活性型抗体が、ｐＨ７．４と比較したときｐＨ６．０で極めて選択的であることも示した（図６Ａ～図６Ｂは例として１つの抗体を示す）。 ［０００５５７］ 条件的活性型生物学的抗体について、表４に要約する。これらの抗体のうちの２つはｓｃＦｖとして発現させた（ＢＡＰ０６３．９－１３．３及びＢＡＰ０６３．９－４８．３）。抗体を６０℃で１時間インキュベートしたが、抗体の多くの親和性は変化しなかった（「熱安定性」）。ＳＰＲを用いたｐＨ６．０及びｐＨ７．４での結合活性の計測データを報告する２つの列において（表４の最後２つのカラム）、「ＢＡＰ０６３．６－ｈｕｍ１０Ｆ１０－ＦＬＡＧ」（陰性対照、表４の第２列）との比較を行った。これらの抗体の選択性は、２つの最終カラムのデータ間の差により決定し得る。２つのｓｃＦｖ抗体は極めて高い選択性（ｐＨ７．４で０％に対し、ｐＨ６で７５％及び５０％）を有した。 」（［０００５４７］～［０００５５７］） シ．「実施例９：抗体の軽鎖又は重鎖を進化させる ［０００５５８］ 抗体Ｆ１－１０Ｆ１０の重鎖及び軽鎖を、ＣＰＥを用いて別個に進化させた。軽鎖変異体をスクリーニングすると、条件的活性を有する２６個の軽鎖変異体が見付かり、この場合、変異体は、ｐＨ６．０では野生型と比べて活性がより高く、且つ変異体はｐＨ７．４で野生型と比べて活性が低かった。２６個の軽鎖変異体は、軽鎖の８つの異なる位置にその突然変異を有した。それらの８つの位置のうちの３つは、２６個の軽鎖変異体のうちの６個以上に見られた。これらの３つの位置を、軽鎖におけるホットスポットと見なした。重鎖変異体をスクリーニングすると、条件的活性を有する２８個の重鎖変異体が見付かった。これらの２８個の重鎖変異体は、重鎖の８つの異なる位置にその突然変異を有した。それらの８つの位置のうちの３つは、２８個の重鎖変異体のうちの６個以上に見られた。これらの３つの位置を、重鎖におけるホットスポットと見なした。軽鎖変異体及び重鎖変異体の条件的活性は、ＥＬＩＳＡ分析によって確認した。 ［０００５５９］ この例で生成された最良の条件的活性型抗体は、ｐＨ７．４でのその活性に対するｐＨ６．０でのその活性が１７倍の差であった。加えて、条件的活性型抗体の多くが、７．４の正常生理的ｐＨと６．０の異常ｐＨとの間のｐＨで可逆の活性を有した。興味深いことに、ＥＬＩＳＡ分析によって５．０～７．４のｐＨ範囲で条件的活性型抗体の活性を試験したとき、この例で生成された条件的活性型抗体のほとんどが約５．５～６．５のｐＨで最適な結合活性を呈した。 ［０００５６０］ この例で生成された条件的活性型抗体の活性はまた、全細胞を使用したＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）分析によっても確認し、ここではＣＨＯ細胞を使用して、ｐＨ６．０及びｐＨ７．４で抗体の抗原を発現させた。条件的活性型抗体をＣＨＯ細胞に加えることにより、結合活性を計測した。ＦＡＣＳ分析により、ｐＨ７．４と比べたｐＨ６．０での条件的活性型抗体の選択性に関するＥＬＩＳＡ分析の結果に一般的な傾向が確認された。 実施例１０：特殊緩衝液中における条件的活性型抗体の選択 ［０００５６１］ 本発明における進化させる工程によって生成した変異体抗体を、７．４の正常生理的ｐＨでの分析及び６．０の異常なｐＨでの分析に供した。両方の分析とも、ヒト血清に見られる重炭酸塩を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液を使用して実施した。溶液中の重炭酸塩の濃度は、ヒト血清中の典型的な重炭酸塩濃度、すなわち生理的濃度であった。重炭酸塩を含有しない同じＰＢＳ溶液を使用して、比較試験を行った。 ［０００５６２］ この例の変異体抗体又は条件的活性型抗体の結合活性を計測するための分析は、ＥＬＩＳＡ分析であった。重炭酸塩を含有するＰＢＳ緩衝溶液における分析は、条件的活性型抗体の選択に関して有意に高い成功率をもたらしたことが分かった。加えて、重炭酸塩を含有するＰＢＳ緩衝溶液を使用して選択された条件的活性型抗体は、ｐＨ７．４での活性に対するｐＨ６．０でのその活性の比がはるかに高い傾向があり、従って有意に高い選択性をもたらした。 ［０００５６３］ さらに、選択された条件的活性型抗体（重炭酸塩を含むＰＢＳ緩衝溶液を使用）を、重炭酸塩を含まないＰＢＳ緩衝溶液中で試験したとき、ｐＨ７．０と比べたｐＨ６．０での条件的活性型抗体の選択性は有意に低下したことが確認された。しかしながら、このＰＢＳ緩衝溶液に生理的量の重炭酸塩を添加すると、同じ条件的活性型抗体の選択性が回復した。 ［０００５６４］ 別の分析において、選択された条件的活性型抗体を、重炭酸塩を添加したクレブス緩衝溶液で試験した。ｐＨ７．４での活性に対するｐＨ６．０での活性のより高い比が、重炭酸塩を添加したこのクレブス緩衝溶液においても観察された。これは、少なくとも部分的には、クレブス緩衝溶液中の重炭酸塩の存在に起因した可能性があるものと思われる。 ［０００５６５］ ＰＢＳ緩衝溶液中で重炭酸塩濃度をその生理的濃度未満の濃度に低下させると、７．４の正常な生理的ｐＨにおける条件的活性型抗体の活性が増加したことが観察された。ｐＨ７．４での条件的活性型抗体の活性の増加は、ＰＢＳ緩衝溶液中の重炭酸塩濃度の低下に関係することが観察された。 ［０００５６６］ 野生型抗体は、ｐＨ７．４で分析したとき、条件的活性型抗体について試験したＰＢＳ緩衝溶液中の同じ重炭酸塩濃度のいずれにおいてもその活性が同じままであったため、ＰＢＳ緩衝溶液中の重炭酸塩量の違いによる影響は受けなかった。 実施例１１：異なる緩衝液における条件的活性型抗体の選択 ［０００５６７］ 本発明に係る進化させる工程によって生成した変異体抗体を、正常な生理的ｐＨ（７．４）でのＥＬＩＳＡ分析及び異常なｐＨ（６．０）でのＥＬＩＳＡ分析に供した。いずれのＥＬＩＳＡ分析も、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有クレブス緩衝液ベースの緩衝液、並びに重炭酸塩及びＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液ベースの緩衝液を含む種々の緩衝液を使用して実施した。 ［０００５６８］ 重炭酸塩含有ＰＢＳ緩衝溶液中での分析を用いて選択された条件的活性型抗体は、重炭酸塩を含まないＰＢＳ緩衝溶液中での分析を用いて選択されたものとの比較において、ｐＨ７．４での活性に対するｐＨ６．０での活性の比がはるかに高かった。加えて、重炭酸塩が添加されたクレブス緩衝溶液も、重炭酸塩を含まないＰＢＳ緩衝溶液中での分析と比較したとき、ｐＨ７．４での活性に対するｐＨ６．０での活性の比がより高かった。望ましい条件的活性型抗体の選択に重炭酸塩が重要であるものと思われる。」（［０００５５８］～［０００５６８］） 当審の拒絶理由で引用文献２として引用した、本願優先日前に頒布された又は電気通信回線を通じて公衆に利用可能となった引用文献である特表２０１３－５４１９４０号公報（以下、「引用文献２」という。）には、以下の事項が記載されている（下線は合議体による。）。 ス．「【請求項１】 腫瘍を治療し、中性ｐＨよりも低ｐＨで活性である治療用タンパク質を同定／選択する方法であって、 ａ）低ｐＨを含む条件下でタンパク質の活性を試験することと、 ｂ）中性ｐＨを含む条件下でタンパク質の活性を試験することと、 ｃ）ａ）における活性を、ｂ）における活性と比較することと、 ｄ）ｂ）と比較して、ａ）においてより大きな活性を有するタンパク質を選択／同定し、それによって、高ｐＨよりも低ｐＨで活性であるタンパク質を同定することと を含む方法。 【請求項２】 低ｐＨが、７．４未満である、請求項１に記載の方法。 【請求項３】 低ｐＨが、５．８～６．８の間またはほぼ５．８～６．８の間である、請求項１または請求項２に記載の方法。 【請求項４】 中性ｐＨが、７．２～７．６の間またはほぼ７．２～７．６の間である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。 【請求項５】 中性ｐＨが、約７．４であるかまたは７．４である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。 ・・・・・・・・・・・・ 【請求項８】 非腫瘍微小環境においてよりも腫瘍微小環境においてより活性である治療用タンパク質を同定／選択する方法であって、 ａ）腫瘍微小環境において存在するが、活性が望まれる非腫瘍環境には存在しない条件下でタンパク質の活性を試験することと、 ｂ）非腫瘍微小環境において存在する条件下でタンパク質の活性を試験することと、 ｃ）ａ）における活性を、ｂ）における活性と比較することと、 ｄ）ｂ）と比較して、ａ）において大きな活性を有するタンパク質を選択／同定し、それによって、非腫瘍微小環境においてよりも腫瘍微小環境においてより活性であるタンパク質を同定することと を含む方法。 ・・・・・・・・・・・・ 【請求項１２】 ａ）およびｂ）の各々を、腫瘍微小環境において存在するが非腫瘍微小環境においては存在しない条件（単数または複数）を除いて、同一条件下で実施する、請求項８から１１のいずれかに記載の方法。 【請求項１３】 腫瘍微小環境において存在する条件が、血管新生の増大、低酸素、ｐＨの低下、乳酸濃度の上昇、ピルビン酸濃度の上昇、間質液圧の増大および代謝産物の変更または腫瘍を示す代謝の中から選択される１つまたは複数の特性を含む、請求項８から１２のいずれかに記載の方法。 【請求項１４】 腫瘍微小環境において存在する条件が、中性より低いｐＨまたは非腫瘍微小環境よりも低いｐＨを含む、請求項８から１３のいずれかに記載の方法。 【請求項１５】 腫瘍微小環境において存在する条件が、７．４未満のｐＨを含む、請求項８から１４のいずれかに記載の方法。 【請求項１６】 腫瘍のｐＨが、ほぼ５．８～６．８（５．８および６．８を含む）または５．８～６．８（５．８および６．８を含む）であり、腫瘍微小環境において存在する条件が、５．８～６．８の間またはほぼ５．８～６．８の間のｐＨを含む、請求項８から１５のいずれかに記載の方法。 ・・・・・・・・・・・・ 【請求項２８】 複数のタンパク質を、ａ）およびｂ）の各々において試験し、 各タンパク質を、ａ）およびｂ）の各々において試験し、 ｂ）と比較して、ａ）においてより大きな活性を有する任意のタンパク質を選択する、請求項１から２７のいずれかに記載の方法。 【請求項２９】 複数のタンパク質が、治療用タンパク質の修飾された変異体を含むか、または治療用タンパク質の修飾された変異体であり、変異体の収集物を、ａ）およびｂ）の各々において試験する、請求項２８に記載の方法。 ・・・・・・・・・・・・ 【請求項３２】 治療用タンパク質が、抗体、酵素、ホルモンまたはサイトカインである、請求項１から３１のいずれかに記載の方法。 【請求項３３】 治療用タンパク質が、抗体である、請求項３２に記載の方法。 【請求項３４】 治療用タンパク質が、抗腫瘍抗体である、請求項１から３３のいずれかに記載の方法。 ・・・・・・・・・・・・ 【請求項３６】 修飾された変異体が、治療用タンパク質の修飾されていない形態と比較して、アミノ酸残基（単数または複数）のアミノ酸置換、挿入および／または欠失を含有する、請求項２９から３５のいずれかに記載の方法。 【請求項３７】 試験されるタンパク質が、抗体の修飾されていない形態と比較して、相補性決定領域（ＣＤＲ）中に１つまたは複数のアミノ酸置換を含む変異型抗体である、請求項１から３６のいずれかに記載の方法。 【請求項３８】 各変異型タンパク質が、治療用タンパク質の修飾されていない形態と比較して、単一アミノ酸置換を含有する、請求項２９から３７のいずれかに記載の方法。 【請求項３９】 各変異型タンパク質が、治療用抗体の修飾されていない形態と比較して、２、３、４、５、６、７、８、９またはそれ以上のアミノ酸置換を含有する、請求項２９から３７のいずれかに記載の方法。 【請求項４０】 収集物中で、変化している位置各々のアミノ酸が、その位置の元のアミノ酸以外の最大１～１９種のアミノ酸で置換され、 治療用タンパク質またはその選択された部分の長さに沿ってどのアミノ酸も置換される、請求項２９から３９のいずれかに記載の方法。 【請求項４１】 置換アミノ酸が、治療用タンパク質中の対応する位置のアミノ酸とは異なるという条件で、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＶａｌの中から選択される、請求項２９から４０のいずれかに記載の方法。 【請求項４２】 ヒスチジンが、置換アミノ酸であるか、またはタンパク質中のヒスチジンが、非塩基性もしくは非荷電アミノ酸で置換される、請求項２９から４１のいずれかに記載の方法。 【請求項４３】 修飾が、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＨｉｓおよびＬｙｓの中から選択されるアミノ酸とのアミノ酸置換を含む、請求項２９から４２のいずれかに記載の方法。 【請求項４４】 修飾が、Ｈｉｓとのアミノ酸置換を含む、請求項２９から４３のいずれかに記載の方法。 【請求項４５】 タンパク質が、抗体であり、修飾される選択された部分が、ＣＤＲである、請求項２９から４４のいずれかに記載の方法。 ・・・・・・・・・・・・ 【請求項７９】 複数回反復し、各反復において、選択されたタンパク質（単数または複数）のさらなる変異体を作製し、試験し、それによって、治療用タンパク質が、非腫瘍環境においてよりも腫瘍環境において活性の増大を示すよう発展（ｅｖｏｌｖｅｄ）し、それによって、毒性の低減または有害な副作用の低減を示す、請求項１から７８のいずれかに記載の方法。」（特許請求の範囲） セ．「【０１９５】 ２．条件的活性についての、２種の異なる生理学的条件下での活性のスクリーニングまたは試験 ・・・・・・・・・・・・ 【０２０５】 （１）ｐＨ 腫瘍微小環境をシミュレートするための条件セットの一部の例では、１種または複数のバッファーのｐＨが、腫瘍の微小環境をシミュレートするよう調整される。・・・・・・・・・・・・したがって、活性を低ｐＨをシミュレートする条件下で、また正常な生理学的ｐＨ（例えば、中性ｐＨ）をシミュレートする条件下で測定するアッセイを使用して、腫瘍微小環境において条件的に活性である生物学的有効性を有する分子を同定できる。 【０２０６】 例えば、正常な微小環境条件のｐＨは、生理学的条件下で存在する任意のｐＨ、例えば、約７．０～約７．８の任意のｐＨ、例えば、少なくともｐＨ７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７もしくは７．８または約ｐＨ７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７もしくは７．８またはｐＨ７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７もしくは７．８（例えば、米国特許第７７８１４０５号を参照のこと）、一部の例では、ｐＨ７．４であり得る。 【０２０７】 腫瘍微小環境のｐＨは、正常微小環境からより酸性であるｐＨ、例えば、約５．６～６．８の任意のｐＨ、例えば、ｐＨ５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７もしくは６．８未満または約ｐＨ５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７または６．８未満またはｐＨ５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７または６．８未満を有するよう選択される。したがって、正常微小環境をシミュレートする条件セットのｐＨは、腫瘍条件よりも塩基性であり得る。当業者に公知の、または本明細書に記載された任意のバッファーを、所望のｐＨに調整できる。 【０２０８】 一部の例では、腫瘍のｐＨ環境は、アッセイに使用されるバッファーのｐＨを変更することによってアッセイにおいてシミュレートされる。ｐＨおよび緩衝能は、アッセイ条件の関数であり、当業者によって経験的に決定または選択され得る。当業者に公知の、または本明細書に記載された任意のバッファーを、所望のｐＨに調整し、本明細書に記載されたアッセイにおいて使用できる。当業者ならば、ＨＣｌなどの酸またはＮａＯＨなどの塩基を添加することによってバッファーのｐＨを調整できる。通常、バッファーは、アッセイ条件の温度を平衡化でき、バッファーのｐＨは、使用前に必要に応じて、確認され、調整される。」（【０１９５】～【０２０８】） ソ．「【０２１７】 ３．条件的に活性である修飾されたタンパク質の検出および同定 本方法では、条件（単数または複数）を選択した後、治療用タンパク質または修飾された治療用タンパク質、例えば、修飾された抗ＥＧＦＲ抗体などの試験分子が、第１の条件 および第２の条件下での活性について評価される。分子またはタンパク質の活性を評価するための種々のアッセイは、当業者に公知であり、特定の分子またはタンパク質に応じて変わる。例えば、アッセイは、結合アッセイまたは機能アッセイを含む。例示的アッセイは、以下の節Ｃに記載されている。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体の活性を評価するために、ＥＧＦＲとの結合が評価され得る。 【０２１８】 次いで、各条件下で得られた活性を比較する。通常、腫瘍環境において存在するなどの病変条件をシミュレートするかまたは再現する条件である第１の条件セット下でより大きな活性を示す分子またはタンパク質が同定され、選択される。例えば、腫瘍微小環境をシミュレートする条件下での活性（例えば、結合活性）を、非腫瘍または正常な生理学的環境をシミュレートする条件下での同一活性（例えば、結合活性）と比較する。比較のために、活性は、第１の条件セット（例えば、非病変正常微小環境の条件）下と比較した、第２の条件（例えば、疾患微小環境の条件）下での活性の割合として表され得る。例えば、第１および第２の条件間で異なるパラメータが、ｐＨである場合には、活性は、酸性ｐＨ対より中性のｐＨで観察される活性の割合、例えば、ｐＨ６．０／７．４での活性の割合として表され得る。１より大きい割合を示し、その結果、分子が、病変または腫瘍微小環境においてより大きな活性を示す、治療用タンパク質または修飾された治療用タンパク質、例えば、抗体または変異型抗体、例えば、修飾された抗ＥＧＦＲ抗体などの試験分子が同定され、選択される。例えば、割合は、１．５～１００の間またはほぼ１．５～１００の間、例えば、２～５０、例えば、５～３０以上である。したがって、本方法では、条件的に活性であるタンパク質または変異体が同定され得る。 【０２１９】 さらに、活性を、突然変異を含有しないタンパク質などの対照と比較して、突然変異（単数または複数）を含有しないタンパク質と比較して、病変または腫瘍微小環境において増大した活性を示すタンパク質を同定できる。一部の例では、修飾されたタンパク質の活性は、非修飾タンパク質の活性に対して正規化できる。したがって、修飾されたタンパク質の条件的活性は、正規化された活性に基づいて決定され得る。例示的な例として、非修飾タンパク質が、それぞれ、正常微小環境および病変微小環境において１０および１の活性を有し、修飾されたタンパク質が、それぞれ、正常微小環境および病変微小環境において２および１の活性を有する場合に、正常および病変環境における修飾されたタンパク質の正規化された活性は、それぞれ、０．２（２／１０）および１（１／１）である。したがって、この仮説上の例では、修飾されたタンパク質は、正常微小環境において、病変微小環境においての２倍活性であるが、病変環境における修飾されたタンパク質の正規化された活性が、正常環境における正規化された活性の５倍（１／０．２＝５）であるので、病変微小環境について条件的に活性であり得る。したがって、本明細書において提供される方法を使用して、修飾されたタンパク質の正規化された活性の割合を変更し得る修飾を同定できる。 【０２２０】 ４．反復法 一例では、本明細書を実施した後に、任意の同定された条件的活性分子を、条件的活性を増大するまたは最適化するために修飾またはさらに修飾できる。例えば、同定された治療用タンパク質または変異体を鋳型として使用し、最初に同定された条件的活性タンパク質にさらなる修飾を導入することによって二次ライブラリーを作製できる。例えば、条件的活性を増大すると同定された修飾を組み合わせることができる。二次ライブラリーは、本明細書に記載されたアッセイおよび方法を使用して試験できる。 【０２２１】 本方法の反復性態様の別の例では、所望により、活性ではないかまたは第１の条件セット下で増大した活性を有さないような条件的活性を示さないと同定される分子を、さらに修飾し、条件的活性について再試験してもよい。さらなる修飾は、分子の活性および／または安定性と関連している特定の領域（例えば、特定のアミノ酸残基）付近にターゲッティングできる。例えば、分子の活性および／または安定性と関連している残基は、一般に、重大な残基であり、構造的フォールディングまたは結合などの分子のその他の活性に関与している。 【０２２２】 重大な残基は、突然変異されると、タンパク質の正常な活性が取り除かれるかまたは減少するので、同定できる。例えば、突然変異されると、治療用タンパク質のそのコグネイト結合パートナーとの減少した結合活性かまたは取り除かれた結合活性を示す重大な残基が同定できる。重大な残基は、結合ポケット中にある残基を含み得る。特に、本明細書における目的上、条件的活性が、ｐＨの相違（例えば、腫瘍環境の酸性ｐＨ環境）に依存している場合には、荷電アミノ酸残基（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓ）に突然変異されると、コグネイト結合パートナーとの結合が取り除かれるかまたは減少する重大な残基を同定することによって、タンパク質相互作用に対する荷電効果を決定することができる。次いで、重大な残基は、それらが活性にとって必要であるので、条件的活性タンパク質を作製するための突然変異誘発の標的とされてはならない残基として同定される。それにもかかわらず、同定された重大な残基に隣接するかまたはその付近の残基は、変化され得る、結合などの特定の活性に影響を及ぼし得る特定の標的であり得る。例えば、隣接する残基の突然変異は、結合のポケットに影響を及ぼし、それによって結合活性を変更し得る。 【０２２３】 したがって、本方法の任意選択の工程の一例では、本明細書において重大な残基と呼ばれる、タンパク質活性および／または安定性、および特に、結合（例えば、酸性ｐＨでの）にとって重要であるアミノ酸残基を同定できる。次いで、同定された重大なアミノ酸残基の付近を標的とする、例えば、同定された重大なアミノ酸残基に隣接するアミノ酸突然変異を用いて修飾されたタンパク質のさらなるライブラリーを作製できる。一部の例では、突然変異は、隣接する位置での最大１９種のその他のアミノ酸残基のうちの任意のその他のものへのアミノ酸置換であり得る。その他の例では、突然変異は、例えば、発展している特定の条件付き活性に応じて合理的にかまたは経験的に行うことができる。例えば、ｐＨ条件下での条件的活性が発展している場合には、重大な残基の付近のまたはそれに隣接するアミノ酸残基の突然変異は、荷電残基へ、特に、弱く荷電しており、６．５～６．８あたりのｐＫを有するヒスチジン（Ｈ）残基へであり得る。例えば、各々、重大なアミノ酸残基に隣接するかまたはその付近のアミノ酸残基でのヒスチジンへの単一アミノ酸置換を含有する複数の突然変異体または変異型タンパク質が作製される、タンパク質突然変異体のライブラリーを作製できる。 【０２２４】 重大な残基に隣接する残基で突然変異を含有する新しい複数の突然変異体各々の活性を、評価または決定できる。例えば、さらなるライブラリーの各メンバーは、個々に発現させ、上記で本明細書において記載されるように、第１の条件および第２の条件で活性について個々に試験できる。両条件下で試験した後、第２の条件（例えば、正常組織の生理学的環境または中性ｐＨ環境などの望ましくない環境）下で、発現されないかまたは優先的結合を示すタンパク質変異体を排除する。したがって、いずれの条件下でも同様の活性を示す（すなわち、結合などの活性に影響を及ぼさない）および／または第１の条件で優先的活性を示す変異体のみを選択する。突然変異された残基の正体を決定でき、重要な残基と呼ばれる。 【０２２５】 次いで、重要な残基位置での突然変異の組合せを含むさらなるコンビナトリアルライブラリーを作製する。重要な残基での突然変異は、１９種のその他のアミノ酸残基のうち任意のその他のものへのアミノ酸置換であり得る。その他の例では、突然変異は、発展している特定の条件付き活性に応じて合理的にかまたは経験的に行うことができる。例えば、ｐＨ条件下での条件的活性が発展している場合には、重要なアミノ酸残基での突然変異は、荷電残基へ、特に、ヒスチジン（Ｈ）残基へであり得る。例えば、１１個の重要な残基が同定されている場合には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個または１１個すべての残基が変化しているタンパク質変異体を、任意の組合せで含有するコンビナトリアルライブラリーを作製することができる。例として、重要な残基のみがヒスチジン（Ｈ）残基に突然変異されているコンビナトリアルライブラリーが作製される場合には、各位置は、野生型アミノ酸またはヒスチジンであり得、突然変異され得る１１部位があり、組み合わせられるので、ライブラリー中の突然変異体の数（ライブラリーの大きさ）は、２１１個のメンバーまたは２０４８の組合せの突然変異体として算出できる。野生型および１１種の単一Ｈｉｓ突然変異（上記ですでに試験された）を排除すると、ライブラリーは、２０３６の組合せを含有するということは理解される。ライブラリーの大きさは、同定された重要な残基の数および重要な残基位置各々で行われるアミノ酸置換の数に応じて増大または減少し得るということも理解される。次いで、本明細書に上記に記載される方法においてさらなるライブラリーをスクリーニングして、非腫瘍または健常環境よりも腫瘍環境において増大した活性などの、所定の条件で条件的活性タンパク質を同定できる。 【０２２６】 例えば、正常微小環境（例えば、ｐＨ７．４）と比較して、腫瘍微小環境（例えば、ｐＨ６．０）をシミュレートする条件下で増大した活性を有する、条件的活性の修飾された、治療用抗体、例えば、アービタックスなどの治療用タンパク質を選択するために、治療用タンパク質中のアミノ酸を突然変異させて、単一アミノ酸が修飾された治療用タンパク質のライブラリーを形成してもよい。このライブラリーを、腫瘍微小環境および正常環境をシミュレートするインビトロアッセイ条件下でアッセイして、突然変異されると、両条件下で活性の喪失をもたらす重大な残基を同定することができる。例えば、ライブラリーの１種または複数のメンバーとして、２つのｐＨ条件間でプロトン化状態を変更し得るイオン化できる基を有するアミノ酸（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓなど）で独立に置換され得る修飾されたタンパク質が挙げられる。タンパク質中のイオン化できる残基のプロトン化状態は、タンパク質の１つまたは複数の活性（親和性、触媒活性、溶解度、電荷および安定性など）をｐＨ依存的に変更し得る（Ｒｏｓｔｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ． （２０１１）， ＢＭＣ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． １１：６）。重大な残基は、荷電アミノ酸に突然変異されると、両条件下で活性がなくなるアミノ酸位置として定義され得る。したがって、残基は、結合ポケット中にある、および／または、その他の形でそのコグネイト結合パートナーとの結合への荷電効果と関連しているものである。ＥＬＩＳＡスクリーニングなどの活性スクリーニングから、ｐＨ６．０および７．４で、荷電残基に突然変異されると、結合を失う重大な残基が同定され得る。 【０２２７】 第２の工程では、重大な残基を同定した後に、重大な残基に隣接するアミノ酸の置換を含有するタンパク質変異体の活性を、決定または評価できる。置換アミノ酸は、すべての可能性あるアミノ酸から、またはすべての可能性あるアミノ酸のサブセットから無作為に選択され得る。例えば、置換アミノ酸は、帯電しているアミノ酸残基などの、上記で論じたように腫瘍および正常状態間でイオン化状態を変更し得るアミノ酸を含み得る。特定の例では、隣接する残基で置換されるアミノ酸がヒスチジンである。重大な残基に隣接する残基で突然変異を含有する新規の複数の突然変異体各々の活性は、腫瘍環境の条件（例えば、酸性ｐＨおよび／または高乳酸の条件）を摸倣またはシミュレートする第１の条件で、また非腫瘍環境を摸倣またはシミュレートする第２の条件（例えば、中性ｐＨ７．４および／または低乳酸濃度の条件）で評価または決定できる。いずれの条件下でも同様の活性を示し（すなわち、結合などの活性に影響を及ぼさない）、発現され、および／または第１の条件で優先的活性を示す変異体が選択される。選択された突然変異体の突然変異された残基の正体が決定され、重要な残基と呼ばれる。 【０２２８】 次いで、最終工程として、同定された重要な残基位置での突然変異体のすべての組合せを含有するさらなるコンビナトリアルライブラリーを作製する。正常微小環境（例えば、ｐＨ７．４）と比較して、腫瘍微小環境（例えば、ｐＨ６．０）をシミュレートする条件下で増大した活性を有する、条件的活性の修飾された、治療用抗体、例えば、アービタックス（Ｅｒｂｉｔｒｕｘ）などの治療用タンパク質を選択するために、置換アミノ酸は、２つのｐＨ条件間でプロトン化状態を変更し得るイオン化できる基を有するもの（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓなど）である。例えば、各重要な残基での置換アミノ酸がヒスチジンであるコンビナトリアルライブラリーを作製する。コンビナトリアルライブラリーの各メンバーの活性は、腫瘍環境の条件（例えば、ｐＨ６．０などの酸性ｐＨおよび／または高乳酸の条件）を摸倣またはシミュレートする第１の条件で、また非腫瘍環境を摸倣またはシミュレートする第２の条件（例えば、中性ｐＨ７．４および／または低乳酸濃度の条件）で評価または決定できる。第１の条件で増大した活性を示す変異体が、条件的活性タンパク質として同定されるかまたは選択される。」（【０２１７】～【０２２８】） 引用文献１には、野生型生物学的タンパク質が抗体である場合（上記記載事項ア．）には、野生型生物学的タンパク質が親抗体に相当し、親抗体から条件的活性型抗体が生成されることが記載されている（上記記載事項エ．、ケ．）。 また、引用文献１には、ｐＨ６．０の異常条件下での抗原に対する結合活性のアッセイ、ｐＨ７．４の正常生理条件下での抗原に対する結合活性のアッセイを行い（上記記載事項ア．、キ．、サ．、シ．）、ｐＨ６．０の異常条件下でのアッセイにおいて、ｐＨ７．４の正常生理条件下でのアッセイにおける同じ結合活性と比較して、活性の増加を呈する条件的活性型抗体を調製すること、結合活性がｐＨ７．４の正常生理条件下で可逆的に不活性化される条件的活性型抗体を調製すること（上記記載事項ア．、オ．、キ．、ク．、サ．、シ．）が記載されている。 また、引用文献１には、「正常生理条件下及び異常条件下の両方とも、分析は、例えば緩衝液を含有し得る媒体、例えば液体媒体を使用して実施され得る。・・・・・・一実施形態において、正常生理条件下での分析は、正常な生理的ｐＨ、例えばｐＨ７．４の組成物で実施される。この分析は、哺乳動物又はヒトの体液に一般に見出される無機化合物、イオン、及び有機分子から選択される少なくとも１つの構成成分の存在下で行われる。異常条件下での分析は、緩衝液など同じ構成成分の存在下で、ｐＨ６など、正常な生理的ｐＨと異なる異常なｐＨで実施される。従って、この実施形態において両分析が行われる流体は、好ましくは正常な生理的濃度の範囲内であるか又はそれに近いものであるべき同じ濃度の同じ１つ又は複数の構成成分を含む。」（上記記載事項キ．）、「実施例８：条件的活性型抗体の発現・・・・・・・・・・・・条件的活性型生物学的抗体について、表４に要約する。これらの抗体のうちの２つはｓｃＦｖとして発現させた（ＢＡＰ０６３．９－１３．３及びＢＡＰ０６３．９－４８．３）。・・・・・・ＳＰＲを用いたｐＨ６．０及びｐＨ７．４での結合活性の計測データを報告する２つの列において（表４の最後２つのカラム）、「ＢＡＰ０６３．６－ｈｕｍ１０Ｆ１０－ＦＬＡＧ」（陰性対照、表４の第２列）との比較を行った。これらの抗体の選択性は、２つの最終カラムのデータ間の差により決定し得る。２つのｓｃＦｖ抗体は極めて高い選択性（ｐＨ７．４で０％に対し、ｐＨ６で７５％及び５０％）を有した」こと（上記記載事項サ．）、「実施例９：抗体の軽鎖又は重鎖を進化させる・・・・・・・・・・・・この例で生成された最良の条件的活性型抗体は、ｐＨ７．４でのその活性に対するｐＨ６．０でのその活性が１７倍の差であった。加えて、条件的活性型抗体の多くが、７．４の正常生理的ｐＨと６．０の異常ｐＨとの間のｐＨで可逆の活性を有した」こと（上記記載事項シ．）が記載されているから、引用文献１に記載されている条件的活性型抗体の調製方法において、「ｐＨ７．４の正常生理条件下でのｐＨの値をｐＨ６．０に調節して得られたアッセイ媒体中の抗原に対する結合活性のアッセイに供してｐＨ７．４での結合活性の可逆的不活性化を判断」しているものと認められる。 そうすると、上記記載事項ア．～シ．から、引用文献１には、「親抗体から条件的活性型抗体を調製する方法であって、 ｉ．前記親抗体をコードするＤＮＡを、１つ以上の進化的技術を用いて、突然変異体ＤＮＡをもたらすように進化させる工程と、 ｉｉ．前記突然変異体ＤＮＡを発現させて、突然変異体抗体を取得する工程と、 ｉｉｉ．前記突然変異体抗体を、ｐＨ６．０の異常条件下での抗原に対する結合活性のアッセイ、ｐＨ７．４の正常生理条件下での抗原に対する結合活性のアッセイ、およびｐＨ７．４の正常生理条件下でのｐＨの値をｐＨ６．０に調節して得られたアッセイ媒体中の抗原に対する結合活性のアッセイに供してｐＨ７．４での結合活性の可逆的不活性化を判断する工程と、 ｉｖ．ｐＨ６．０の異常条件下でのアッセイにおいて、ｐＨ７．４の正常生理条件下でのアッセイにおける同じ結合活性と比較して、活性の増加を呈し、且つ結合活性がｐＨ７．４の正常生理条件下で可逆的に不活性化される前記条件的活性型抗体を前記突然変異体抗体から選択する工程と を含む方法。」の発明（以下、「引用発明」という。）が記載されていると認められる。 第５ 対比 本願発明と引用発明とを対比すると、引用発明の「ｐＨ６．０の異常条件下での抗原に対する結合活性のアッセイ」は、本願発明の「第１のｐＨのｐＨ６．０での抗原に対する結合活性の第１のアッセイ」に相当し、引用発明の「ｐＨ７．４の正常生理条件下での抗原に対する結合活性のアッセイ」は、本願発明の「第２のｐＨのｐＨ７．４での抗原に対する結合活性の第２のアッセイ」に相当し、引用発明の「ｐＨ６．０の異常条件下でのアッセイ」は、本願発明の「第１のｐＨのｐＨ６．０での第１のアッセイ」に相当し、引用発明の「ｐＨ７．４の正常生理条件下でのアッセイ」は、本願発明の「第２のｐＨのｐＨ７．４での第２のアッセイ」に相当する。 そうすると、本願発明と引用発明は、「親抗体から条件的活性型抗体を調製する方法であって、 ｉ．前記親抗体をコードするＤＮＡを、１つ以上の技術を用いて、突然変異体ＤＮＡをもたらすように進化させる工程と、 ｉｉ．前記突然変異体ＤＮＡを発現させて突然変異体抗体を取得する工程と、 ｉｉｉ．突然変異体抗体を、第１のｐＨのｐＨ６．０での抗原に対する結合活性の第１のアッセイ、第２のｐＨのｐＨ７．４での抗原に対する結合活性の第２のアッセイ、および第２のアッセイの第２のｐＨをｐＨ６．０に調節して得られたアッセイ媒体中の抗原に対する結合活性のアッセイに供してｐＨ７．４での結合活性の可逆的不活性化を判断する工程と、 ｉｖ．第１のｐＨのｐＨ６．０での第１のアッセイにおいて、第２のｐＨのｐＨ７．４での第２のアッセイにおける同じ結合活性と比較して、結合活性の増加を呈し、且つ結合活性が第２のｐＨのｐＨ７．４で可逆的に不活性化される前記条件的活性型抗体を前記突然変異体抗体から選択する工程と を含む方法。」である点で一致し、両者は以下の点で相違する。 相違点：親抗体をコードするＤＮＡを突然変異体ＤＮＡをもたらすように進化させる工程が、本願発明は、親抗体をコードするＤＮＡ中の荷電アミノ酸残基のコドンの全数の増加、前記ＤＮＡ中の非荷電アミノ酸残基のコドンの全数の減少及びそれらの組み合わせから選択される１つ以上の技術を用いて前記親抗体の正味電荷を増加させて、前記荷電アミノ酸残基が、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リシン及びヒスチジンから選択されるのに対し、引用発明は、そのような特定は記載されていない点。 第６ 当審の判断 以下、上記相違点について検討する。 引用文献２には、条件的活性型抗体の２種の異なる生理学的条件下での活性のスクリーニングを、腫瘍微小環境のｐＨ５．８～６．８でのアッセイ、正常な微小環境条件のｐＨ７．４でのアッセイで行うことが記載されている（上記記載事項セ．、ス．）。 そして、引用文献２には、「ｐＨ条件下での条件的活性が発展している場合には、重大な残基の付近のまたはそれに隣接するアミノ酸残基の突然変異は、荷電残基へ、特に、弱く荷電しており、６．５～６．８あたりのｐＫを有するヒスチジン（Ｈ）残基へであり得る。例えば、各々、重大なアミノ酸残基に隣接するかまたはその付近のアミノ酸残基でのヒスチジンへの単一アミノ酸置換を含有する複数の突然変異体または変異型タンパク質が作製される、タンパク質突然変異体のライブラリーを作製できる。」、「ｐＨ条件下での条件的活性が発展している場合には、重要なアミノ酸残基での突然変異は、荷電残基へ、特に、ヒスチジン（Ｈ）残基へであり得る。例えば、１１個の重要な残基が同定されている場合には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個または１１個すべての残基が変化しているタンパク質変異体を、任意の組合せで含有するコンビナトリアルライブラリーを作製することができる。」、「置換アミノ酸は、帯電しているアミノ酸残基などの、上記で論じたように腫瘍および正常状態間でイオン化状態を変更し得るアミノ酸を含み得る。特定の例では、隣接する残基で置換されるアミノ酸がヒスチジンである。重大な残基に隣接する残基で突然変異を含有する新規の複数の突然変異体各々の活性は、腫瘍環境の条件（例えば、酸性ｐＨおよび／または高乳酸の条件）を摸倣またはシミュレートする第１の条件で、また非腫瘍環境を摸倣またはシミュレートする第２の条件（例えば、中性ｐＨ７．４および／または低乳酸濃度の条件）で評価または決定できる。いずれの条件下でも同様の活性を示し（すなわち、結合などの活性に影響を及ぼさない）、発現され、および／または第１の条件で優先的活性を示す変異体が選択される。選択された突然変異体の突然変異された残基の正体が決定され、重要な残基と呼ばれる。」、「次いで、最終工程として、同定された重要な残基位置での突然変異体のすべての組合せを含有するさらなるコンビナトリアルライブラリーを作製する。正常微小環境（例えば、ｐＨ７．４）と比較して、腫瘍微小環境（例えば、ｐＨ６．０）をシミュレートする条件下で増大した活性を有する、条件的活性の修飾された、治療用抗体、例えば、アービタックス（Ｅｒｂｉｔｒｕｘ）などの治療用タンパク質を選択するために、置換アミノ酸は、２つのｐＨ条件間でプロトン化状態を変更し得るイオン化できる基を有するもの（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓなど）である。例えば、各重要な残基での置換アミノ酸がヒスチジンであるコンビナトリアルライブラリーを作製する。コンビナトリアルライブラリーの各メンバーの活性は、腫瘍環境の条件（例えば、ｐＨ６．０などの酸性ｐＨおよび／または高乳酸の条件）を摸倣またはシミュレートする第１の条件で、また非腫瘍環境を摸倣またはシミュレートする第２の条件（例えば、中性ｐＨ７．４および／または低乳酸濃度の条件）で評価または決定できる。第１の条件で増大した活性を示す変異体が、条件的活性タンパク質として同定されるかまたは選択される。」と記載されている（上記記載事項ソ．、ス．）ように、ｐＨ７．４の正常微小環境条件下と比較して、ｐＨ６．０の腫瘍微小環境条件下で増大した活性を有する条件的活性型抗体を選択するために、同定された重要な残基のすべてをＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓなどの荷電アミノ酸残基に突然変異させた突然変異体抗体のライブラリーを作製することが記載されているから、引用発明において、親抗体をコードするＤＮＡにおいて、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リシン及びヒスチジンから選択される荷電アミノ酸残基のコドンの全数を増加させるなどして、前記親抗体の正味電荷を増加させることは、当業者が容易に想到し得ることである。 第７ 審判請求人の主張 審判請求人は、令和 ６年 ２月１９日付け意見書において、以下の（ア）～（ウ）の点を主張しているので、以下この点について検討する。 （ア）引用文献１は、ｐＨ６．０の第一のアッセイで可逆的に活性化され、ｐＨ７．４の第二のアッセイで可逆的に不活性化される突然変異体抗体等から、条件的活性型抗体等を選択することを教示も示唆もするものではなく、また、請求項１の工程ｉｉｉで規定される「第２のアッセイの第２のｐＨをｐＨ６．０に調節して得られたアッセイ媒体中の抗原に対する結合活性のアッセイに供してｐＨ７．４での結合活性の可逆的不活性化を判断する」ことを教示も示唆もするものではない。 （イ）引用文献２の段落０２２２および０２２６の開示は、条件的活性型タンパク質を得ることを目的とする場合、変異させるべきではない重大な残基を特定する目的で、荷電アミノ酸を導入することに関するもので、引用文献２は、荷電アミノ酸残基を導入することによって条件的活性型タンパク質を得ることを教示も示唆もしておらず、むしろ、条件的活性型タンパク質を得ようとする場合、変異させるべきではない重大な残基を特定するために、荷電アミノ酸を使用しているから、引用文献２を引用文献１と組み合わることに阻害要因があったといえる。 （ウ）本願発明の条件的活性型抗体等は、正常生理学的ｐＨ７．４では不活性であり、さらにｐＨ６．０で可逆的に活性化されるという特徴を有するため、投与時の副作用を低減またはなくすことができるということは、引用文献１及び２の抗体に対する予期せぬ利点および改善であるといえる。 主張（ア）について 上記第４で述べたように、引用文献１には、「２５． 請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法によって調製される条件的活性型生物学的タンパク質であって、正常生理条件で可逆的又は不可逆的に不活性化される条件的活性型生物学的タンパク質。」（上記記載事項ア．）、「本開示はまた、野生型条件において可逆的に又は不可逆的に不活性であるが、野生型条件と同じ又は等しいレベルの非正常条件において活性である新規な分子を生成するためのタンパク質を操作又は進化させる方法を指示する。」（上記記載事項オ．）、「この条件的活性型生物学的タンパク質は腫瘍部位の標的化に使用され、条件的活性型生物学的タンパク質は腫瘍部位で特別な活性を有し、非腫瘍部位（正常生理条件）では同じ活性に関して活性が大幅に低いか、又は不活性である。」（上記記載事項ク．）と記載されているから、引用文献１には、ｐＨ６．０の第一のアッセイで可逆的に活性化され、ｐＨ７．４の第二のアッセイで可逆的に不活性化される突然変異体抗体等から、条件的活性型抗体等を選択することが記載されているといえる。 また、上記第４で述べたように、引用文献１には、「正常生理条件下及び異常条件下の両方とも、分析は、例えば緩衝液を含有し得る媒体、例えば液体媒体を使用して実施され得る。・・・・・・一実施形態において、正常生理条件下での分析は、正常な生理的ｐＨ、例えばｐＨ７．４の組成物で実施される。この分析は、哺乳動物又はヒトの体液に一般に見出される無機化合物、イオン、及び有機分子から選択される少なくとも１つの構成成分の存在下で行われる。異常条件下での分析は、緩衝液など同じ構成成分の存在下で、ｐＨ６など、正常な生理的ｐＨと異なる異常なｐＨで実施される。従って、この実施形態において両分析が行われる流体は、好ましくは正常な生理的濃度の範囲内であるか又はそれに近いものであるべき同じ濃度の同じ１つ又は複数の構成成分を含む。」（上記記載事項キ．）、「実施例８：条件的活性型抗体の発現・・・・・・・・・・・・２つのｓｃＦｖ抗体は極めて高い選択性（ｐＨ７．４で０％に対し、ｐＨ６で７５％及び５０％）を有した」こと（上記記載事項サ．）、「実施例９：抗体の軽鎖又は重鎖を進化させる・・・・・・・・・・・・この例で生成された最良の条件的活性型抗体は、ｐＨ７．４でのその活性に対するｐＨ６．０でのその活性が１７倍の差であった。加えて、条件的活性型抗体の多くが、７．４の正常生理的ｐＨと６．０の異常ｐＨとの間のｐＨで可逆の活性を有した」こと（上記記載事項シ．）が記載されているから、引用文献１に記載されている条件的活性型抗体の調製方法において、「ｐＨ７．４の正常生理条件下でのｐＨの値をｐＨ６．０に調節して得られたアッセイ媒体中の抗原に対する結合活性のアッセイに供してｐＨ７．４での結合活性の可逆的不活性化を判断」しているものと認められる。 したがって、審判請求人の上記主張（ア）は採用できない。 主張（イ）について 上記第６で述べたように、そして、引用文献２には、重大な残基を特定する目的以外に、「ｐＨ条件下での条件的活性が発展している場合には、重要なアミノ酸残基での突然変異は、荷電残基へ、特に、ヒスチジン（Ｈ）残基へであり得る。例えば、１１個の重要な残基が同定されている場合には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個または１１個すべての残基が変化しているタンパク質変異体を、任意の組合せで含有するコンビナトリアルライブラリーを作製することができる。」、「置換アミノ酸は、帯電しているアミノ酸残基などの、上記で論じたように腫瘍および正常状態間でイオン化状態を変更し得るアミノ酸を含み得る。特定の例では、隣接する残基で置換されるアミノ酸がヒスチジンである。重大な残基に隣接する残基で突然変異を含有する新規の複数の突然変異体各々の活性は、腫瘍環境の条件（例えば、酸性ｐＨおよび／または高乳酸の条件）を摸倣またはシミュレートする第１の条件で、また非腫瘍環境を摸倣またはシミュレートする第２の条件（例えば、中性ｐＨ７．４および／または低乳酸濃度の条件）で評価または決定できる。いずれの条件下でも同様の活性を示し（すなわち、結合などの活性に影響を及ぼさない）、発現され、および／または第１の条件で優先的活性を示す変異体が選択される。選択された突然変異体の突然変異された残基の正体が決定され、重要な残基と呼ばれる。」、「次いで、最終工程として、同定された重要な残基位置での突然変異体のすべての組合せを含有するさらなるコンビナトリアルライブラリーを作製する。正常微小環境（例えば、ｐＨ７．４）と比較して、腫瘍微小環境（例えば、ｐＨ６．０）をシミュレートする条件下で増大した活性を有する、条件的活性の修飾された、治療用抗体、例えば、アービタックス（Ｅｒｂｉｔｒｕｘ）などの治療用タンパク質を選択するために、置換アミノ酸は、２つのｐＨ条件間でプロトン化状態を変更し得るイオン化できる基を有するもの（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓなど）である。例えば、各重要な残基での置換アミノ酸がヒスチジンであるコンビナトリアルライブラリーを作製する。コンビナトリアルライブラリーの各メンバーの活性は、腫瘍環境の条件（例えば、ｐＨ６．０などの酸性ｐＨおよび／または高乳酸の条件）を摸倣またはシミュレートする第１の条件で、また非腫瘍環境を摸倣またはシミュレートする第２の条件（例えば、中性ｐＨ７．４および／または低乳酸濃度の条件）で評価または決定できる。第１の条件で増大した活性を示す変異体が、条件的活性タンパク質として同定されるかまたは選択される。」と記載されている（上記記載事項ソ．、ス．）ように、引用文献１に記載されている条件的活性型抗体と同様のｐＨ７．４の正常微小環境条件下と比較して、ｐＨ６．０の腫瘍微小環境条件下で増大した活性を有する条件的活性型抗体を選択するために、重要なアミノ酸残基をＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓなどの荷電アミノ酸残基に突然変異させた突然変異体抗体のライブラリーを作製することが記載されているから、引用文献２を引用文献１と組み合わることに阻害要因があったとはいえない。 したがって、審判請求人の上記主張（イ）は採用できない。 主張（ウ）について 引用文献１には、「［０００４６２］ 一部の実施形態において、本発明は、腫瘍治療候補であり得る野生型生物学的タンパク質から生成される条件的活性型生物学的タンパク質を提供する。この条件的活性型生物学的タンパク質は、血漿などの腫瘍微小環境以外の体の部分における少なくとも１つの生理条件下で野生型生物学的タンパク質より低い活性を有し、一方、腫瘍微小環境における少なくとも１つの生理条件下で野生型生物学的タンパク質より高い活性を有する。かかる条件的活性型生物学的タンパク質は、腫瘍を治療するため腫瘍微小環境にある癌細胞に優先的に作用することができ、従って副作用を引き起こしにくい。生物学的タンパク質が腫瘍細胞の表面上の抗原（抗原が腫瘍微小環境に曝露している）に対する抗体である実施形態において、条件的活性型抗体は、体の他の部分、例えば非腫瘍微小環境では抗原に対する親和性が野生型抗体より低く、一方、腫瘍微小環境では抗原に対する親和性が野生型抗体より高い。かかる条件的活性型抗体は、体の他の部分では抗原に弱く結合し得るか、又は全く結合せず、しかし、腫瘍微小環境では抗原により高い結合性を有し、又は強力且つ緊密に結合する。」と記載されており（上記記載事項コ．）、また、引用文献２には、「【請求項７９】 複数回反復し、各反復において、選択されたタンパク質（単数または複数）のさらなる変異体を作製し、試験し、それによって、治療用タンパク質が、非腫瘍環境においてよりも腫瘍環境において活性の増大を示すよう発展（ｅｖｏｌｖｅｄ）し、それによって、毒性の低減または有害な副作用の低減を示す、請求項１から７８のいずれかに記載の方法。」と記載されている（上記記載事項ス．）から、本願発明の条件的活性型抗体等の「正常生理学的ｐＨ７．４では不活性であり、さらにｐＨ６．０で可逆的に活性化されるという特徴を有するため、投与時の副作用を低減またはなくすことができる」という審判請求人が主張する効果は、引用文献１及び２の記載から当業者が予測することができる範囲の効果である。 したがって、審判請求人の上記主張（ウ）は採用できない。 第８ むすび 以上のとおり、本願の請求項１に係る発明は、引用文献１～２に記載された発明に基いて、当業者が容易に発明をすることができたものであり、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないので、本願は、他の請求項について検討するまでもなく、拒絶すべきものである。 よって、結論のとおり審決する。