2023-008801

特願２０２１－ ３７２８１「細胞膜透過ペプチドおよびこれを含む細胞内伝達体」拒絶査定不服審判事件〔令和 ３年 ７月 １日出願公開、特開２０２１－ ９８７３０〕について、次のとおり審決する。

結 論 本件審判の請求は、成り立たない。

理 由 第１ 手続の経緯 本願は、２０１７年１２月１５日（パリ条約による優先権主張 ２０１６年１２月１６日 （ＫＲ）韓国、２０１７年１２月１５日 （ＫＲ）韓国）を国際出願日とする特願２０１９－５２９９１２号の一部を令和３年３月９日に新たな特許出願としたものであって、令和４年４月１５日付け拒絶理由通知に応答して同年１０月２５日に意見書及び手続補正書が提出されたが、令和５年１月２０日付けで拒絶査定がなされ、同年５月３０日に拒絶査定不服審判が請求されたものである。 第２ 本願発明 本願の請求項１～６に係る発明は、令和４年１０月２５日付け手続補正書の特許請求の範囲１～６に記載された事項により特定されるものであるところ、そのうち請求項１に係る発明（以下、「本願発明」という。）は、以下のとおりである。 「【請求項１】 次の一般式Ｉで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド末端に細胞内輸送対象のカーゴ（ｃａｒｇｏ）が結合された細胞内伝達体： ［一般式Ｉ］ Ｃｙｓ－Ｘａａ１－Ｘａａ２－Ｃｙｓ－Ｘａａ３－Ｘａａ４－Ｘａａ５－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ－Ｘａａ６－Ｘａａ７－Ｘａａ８－Ｘａａ９－Ｃｙｓ 前記一般式において、Ｘａａ１はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎからなる群より選択され、 Ｘａａ２はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＧｌｎからなる群より選択され、 Ｘａａ３およびＸａａ４は互いに独立にＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈr、Ａｓｎ、ＧｌｎおよびＧｌｙからなる群より選択され、 Ｘａａ５はＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＴｒｐおよびＰｒｏからなる群より選択され、 Ｘａａ６およびＸａａ７は互いに独立にＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐからなる群より選択され、 Ｘａａ８はＬｙｓ、ＡｌａまたはＡｒｇであり、 Ｘａａ９はＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎからなる群より選択されるアミノ酸である。」 第３ 原査定の拒絶理由 本願発明に対する原査定の拒絶の理由５の概要は、以下のとおりである。 本願明細書中において、細胞透過性を有するペプチドのアミノ酸配列として具体的に記載されているのは、配列番号１０～１５に示されたもののみであるところ、上記機能を有するペプチドを新たに取得するためには、無数のアミノ酸配列からなるペプチドを作製し、それぞれについて細胞に処理し、細胞透過性の解析を繰り返すことが必要となり、当業者に期待し得る程度を越えた試行錯誤を求めることになるので、本願は、発明の詳細な説明が、当業者が本願発明を実施できる程度に明確かつ十分に記載されたものではなく、特許法第３６条第４項第１号に規定する要件を満たしていない。 上記理由５について、以下で検討する。 第４ 当審の判断 １ 本願明細書の記載 本願発明の細胞内伝達体に関して、発明の詳細な説明には以下の記載がある。なお、下線は当審合議体が付加した。 （１） 段落０００４ 「【０００４】 本発明者らは、ＨＩＶ ＮＣペプチドの生理学的活性を研究している最中、ＮＣペプチドが細胞膜透過活性を有しているのを確認し、それにより細胞内物質伝達が可能なドラッグデリバリーシステム（ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）として利用できるのを確認し、本発明を完成するに至った。」 （２） 段落００１２ 「【００１２】 本明細書において、用語、「細胞内伝達体」は、細胞膜を透過して組織まで浸透できる伝達体を意味する。」 （３） 段落００１４～００２１ 「【００１４】 前記一般式Ｉで表されるポリペプチドは様々なレトロウイルス（例えば、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）、ＭＬＶ（Ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）、ＳＩＶ（Ｓｉｍｉａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）、ＲＳＶ（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）、ＦＩＶ（Ｆｅｌｉｎｅ ｉｍｍｕｎｉｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）、ＥＩＶ（Ｅｑｕｉｎｅ ｉｍｍｕｎｉｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ））のＮＣペプチド内に存在するジンクフィンガードメイン（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｄｏｍａｉｎ）の保存配列（Ｃｙｓ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｃｙｓ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｈｉｓ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｃｙｓ）を示すものであり、本発明者らは実験により前記配列を含むポリペプチドが細胞膜透過活性に優れるのを確認し、それにより細胞内物質伝達が可能なドラッグデリバリーシステムとして利用できるということを明らかにした。 【００１５】 本発明の一具体例によれば、一般式Ｉ（配列番号１６）において、前記Ｘａａ１は、疎水性アミノ酸であるＡｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、極性アミノ酸であるＳｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎからなる群より選択されるアミノ酸である。より好ましくは、前記Ｘａａ１は、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ＡｌａおよびＧｌｎからなる群より選択されるアミノ酸である。 【００１６】 一具体例によれば、前記Ｘａａ２は、疎水性アミノ酸であるＡｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、塩基性アミノ酸であるＡｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、極性アミノ酸であるＳｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎからなる群より選択されるアミノ酸である。より好ましくは、前記Ｘａａ２は、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、ＬｅｕおよびＴｙｒからなる群より選択されるアミノ酸である。 【００１７】 また、一具体例によれば、前記Ｘａａ３およびＸａａ４は、互いに独立に、親水性アミノ酸であるＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈr、Ａｓｎ、ＧｌｎおよびＧｌｙからなる群より選択されるアミノ酸である。より好ましくは、前記Ｘａａ３はＧｌｙ、ＡｓｐおよびＬｙｓからなる群より選択されるアミノ酸であり、Ｘａａ４はＡｒｇ、Ｓｅｒ、ＧｌｙおよびＧｌｕからなる群より選択されるアミノ酸である。 【００１８】 また、本発明の一具体例によれば、前記Ｘａａ５は、極性アミノ酸を除いたＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＴｒｐおよびＰｒｏからなる群より選択されるアミノ酸である。より好ましくは、前記Ｘａａ５は、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ＩｌｅおよびＭｅｔからなる群より選択されるアミノ酸である。 【００１９】 また、一具体例によれば、前記Ｘａａ６およびＸａａ７は、互いに独立に、疎水性アミノ酸であるＡｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、極性アミノ酸であるＳｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎまたはＧｌｎからなる群より選択され、より好ましくは、Ｘａａ６はＴｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｍｅｔ、ＴｙｒおよびＴｒｐからなる群より選択されるアミノ酸であり、Ｘａａ７はＡｌａ、ＭｅｔおよびＧｌｎからなる群より選択されるアミノ酸である。 【００２０】 また、一具体例によれば、前記Ｘａａ８はＬｙｓ、ＡｌａまたはＡｒｇであるアミノ酸であり、Ｘａａ９は酸性アミノ酸であるＡｓｐ、Ｇｌｕ、極性アミノ酸であるＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎからなる群より選択されるアミノ酸であり、好ましくは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＡｓｎまたはＧｌｎである。 【００２１】 本発明の一具体例によれば、前記一般式Ｉで表されるアミノ酸配列を含むペプチドは、レトロウイルスのジンクフィンガー（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ）ドメインを含むポリペプチドとして、配列番号１７～配列番号２３のアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群より選択されてもよい。」 （４） 段落００２３～００２６ 「【００２３】 本明細書において、用語、「ＮＣペプチド」はレトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）のヌクレオカプシド（ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ）を構成するポリペプチドを意味し、前記ポリペプチドはレトロウイルスのゲノムＲＮＡに強く結合してリボ核タンパク質コア複合体（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｒｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成するものとして知られている。 【００２４】 本明細書において、用語、「細胞透過ペプチド（ｃｅｌｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ、ＣＰＰ）」はインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）および／またはインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）上で輸送対象のカーゴ（ｃａｒｇｏ）を細胞内に輸送できる能力を有したペプチドを意味し、細胞透過ペプチドはそのものでリン脂質二重膜の細胞膜を通過できるアミノ酸配列を有するペプチドである。 …… 【００２６】 本明細書において、用語、「カーゴ（ｃａｒｇｏ）」は、細胞膜透過ペプチドとして作用するＮＣペプチドに結合して細胞内に輸送される化学物質、小さい分子化合物、ポリペプチド、核酸などを意味する。」 （５） 段落００５６～００５７ 「【００５６】 また、ＦＩＴＣ－ＮＣペプチドによる細胞膜透過活性の変化を確認するために前記と同様の方法により、ヘキサペプチド（ｈｅｘａｐｅｐｔｉｄｅ）、ＦＩＴＣ－ヘキサペプチド、ＦＩＴＣ－ＮＣ－ヘキサペプチド、ＦＩＴＣ－１３ＮＣ３５ペプチドおよびＦＩＴＣ－２９ＮＣ５０ペプチドをＨｅＬａ細胞に３時間処理し、共焦点レーザ走査顕微鏡で観察した。一方、上記で用いられたヘキサペプチド、ＰＴＤ－ｙｓペプチド、ＴＬＭペプチド、ＴＤ１ペプチド、ＮＣ－ヘキサペプチド、１３ＮＣ３５ペプチドおよび２９ＮＣ５０ペプチドのアミノ酸配列は下記の表５のとおりである。 【００５７】 【表５】 ［図：0001419742000001.jpg］ 」 （６） 段落００６３～００８３ 「【００６３】 実験結果 １．様々なレトロウイルスＮＣペプチドの細胞膜透過活性の確認 ＮＣペプチド配列の類似（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）程度に応じて細胞膜透過活性の程度の差があるか否かを確認するために、ＦＩＴＣが結合されたＨＩＶ、ＳＩＶ、ＲＳＶおよびＭＬＶのＮＣペプチドとＴａｔペプチドを１．０μＭの濃度でＲＡＷ２６４．７細胞に１時間処理した。その結果、図２に示すように、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＲＳＶおよびＭＬＶのＮＣペプチドが細胞膜透過性に優れるのをＦＩＴＣ蛍光明るさを通じて確認し、ＦＡＣＳ分析でもＨＩＶのＮＣペプチドが９６．８％、ＳＩＶのＮＣペプチドが５４．０％、ＲＳＶのＮＣペプチドが２４．２％、ＭＬＶのＮＣペプチドが５．７％の細胞において蛍光が現れるのを確認した。前記実験結果は、ＨＩＶをはじめとする種々のレトロウイルスのＮＣペプチドが既存のＴａｔペプチドに比して細胞膜透過活性に優れることを意味する。また、図２に示すように、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＲＳＶおよびＭＬＶのＮＣペプチドは、ジンクフィンガー（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ）ドメインが保存配列（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）として含まれているのを確認することができた。 【００６４】 一方、上記で用いられたＨＩＶ、ＳＩＶ、ＲＳＶおよびＭＬＶのＮＣペプチドのアミノ酸配列は下記の表６のとおりである。 【００６５】 【表６】 ［図：0001419742000002.jpg］ 【００６６】 ２．ＨＩＶ－ＮＣペプチドの細胞膜透過活性の確認 前記実験において、細胞膜透過活性の最も高いＨＩＶ－ＮＣペプチド（配列番号１２）を対象に細胞膜透過活性を濃度別に確認するために、ＦＩＴＣ－ＨＩＶ－ＮＣペプチドを０．５、１、２．５、５．０および１０μＭの濃度で１時間ＲＡＷ２６４．７マクロファージに処理した。１時間後、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｏｓｃｏｐｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ドイツ）で細胞の蛍光程度を確認した結果、図３ａに示すように、ＦＩＴＣ－ＨＩＶ－ＮＣペプチドの濃度が増加するほど、ペプチドの細胞膜透過性が高くなるのを確認することができた。また、蛍光分析器により確認した結果、図３ｂに示すように、ＦＩＴＣ－ＨＩＶ－ＮＣペプチドの濃度が増加するほど、蛍光信号が増加するのを確認して細胞膜透過性が増加することが分かった。 【００６７】 また、処理時間に応じたＦＩＴＣ－ＨＩＶ－ＮＣペプチドの細胞膜透過程度を確認するために、２．５μｍの濃度でＲＡＷ２６４．７細胞に２０分、４０分および６０分間ペプチドを処理した。その結果、図３ｃに示すように、ＦＩＴＣーＨＩＶ－ＮＣペプチドを処理した時間が増加するに伴い、ペプチドの細胞膜透過性が有意に増加するのを蛍光顕微鏡およびＦＡＣＳ分析により確認することができた。 【００６８】 また、ＨＩＶ－ＮＣペプチドの細胞膜透過性を確認するために、ＨｅＬａ細胞に免疫染色を行って共焦点レーザ走査顕微鏡で観察した。その結果、図４に示すように、多数のＨＩＶ－ＮＣペプチドが細胞膜、細胞質および核膜に満遍なく分布しており、一部のＨＩＶ－ＮＣペプチドは核内側に分布するのを確認することができた。前記結果は、ＨＩＶ－ＮＣペプチドが低い濃度で細胞膜を透過することができ、ＨＩＶ－ＮＣペプチドの細胞膜透過が速い時間内でなされることを意味する。 【００６９】 ３．様々な細胞におけるＨＩＶ－ＮＣペプチドの細胞膜透過活性の確認 細胞の種類に応じてＨＩＶ－ＮＣペプチドの細胞膜透過活性に差があるか否かを確認するために、ＲＡＷ２６４．７、ＴＨＰ－１、ＣＥＭ、ＭＤＣＫおよび２９３ＦＴ細胞にＦＩＴＣ－ＨＩＶ－ＮＣペプチドを１．０、２．５および５．０μＭの濃度で１時間または２時間処理した。その結果、図５ａ～５ｅに示すように、ＦＩＴＣ－ＨＩＶ－ＮＣペプチドの濃度が増加するに伴い、ペプチドの細胞膜透過性が有意に増加するのを蛍光顕微鏡およびＦＡＣＳ分析により確認することができた。図５ａはＲＡＷ２６４．７（マウスマクロファージ）、図５ｂはＴＨＰ－１（ヒト単球細胞株）細胞の結果であり、図５ｃはＣＥＭ、図５ｄはＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙ ｃａｎｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ、イヌ腎臓由来細胞）および図５ｅは２９３ＦＴ（ヒト胎児腎臓細胞由来）の結果である。前記結果は、ＨＩＶ－ＮＣペプチドが癌細胞、免疫細胞、上皮細胞などの様々な細胞膜を透過できることを意味する。 【００７０】 ４．ＨＩＶ－ＮＣペプチドとＴａｔペプチドの細胞膜透過活性の比較 ＨＩＶ－ＮＣペプチドの細胞膜透過活性の程度を確認するために、既存の細胞透過タンパク質として知られたＴａｔペプチドとの比較実験を行った。緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＧＦＰ）が結合されたＨＩＶ－ＮＣペプチド（以下、ＧＦＰ－ＨＩＶ－ＮＣペプチド）を０．２５、０．５、１．０、２．５および５．０μＭの濃度で、ＧＦＰ－Ｔａｔペプチドを１．０、２．５、５．０および１０μＭの濃度で、各々１時間ＲＡＷ２６４．７細胞に処理し、１時間後、ペプチドの蛍光程度を確認した。その結果、図６ａおよび６ｂに示すように、ＧＦＰ－ＨＩＶ－ＮＣペプチドは０．２５μＭの低い濃度で蛍光が現れる反面、ＧＦＰ－Ｔａｔペプチドは１０μＭの高い濃度でも蛍光が微小に現れるのを確認することができた。また、細胞を回収してＦＡＣＳで分析した結果、図６ａおよび６ｂに示すように、ＧＦＰ－ＨＩＶ－ＮＣペプチドは１μＭの濃度で９９．９％の細胞が蛍光を示すが、ＧＦＰ－Ｔａｔペプチドは同一の濃度で４．３％の細胞が蛍光を示すのを確認した。 【００７１】 また、蛍光分析器により確認した結果、図６ｃに示すように、ＧＦＰ－ＨＩＶ－ＮＣペプチドは、濃度が増加するに伴い、細胞膜透過性も増加するが、ＧＦＰ－Ｔａｔペプチドは、処理濃度に関係なく、細胞膜透過性が非常に低いのを確認することができた。前記実験結果は、既存の細胞透過タンパク質としてよく知られたＴａｔペプチドに比して、ＨＩＶ－ＮＣペプチドが高効率の細胞透過ペプチドであることを意味する。 【００７２】 ５．ＨＩＶ－ＮＣペプチドと他の細胞透過ペプチドの細胞透過活性の比較 ＦＩＴＣ－ＨＩＶ－ＮＣペプチド、ＦＩＴＣ－Ｔａｔペプチド、ＦＩＴＣ－ＭＡ１１ペプチド、ＦＩＴＣ－ＰＴＤ－ｙｓペプチド、ＦＩＴＣ－ＴＬＭペプチド、ＦＩＴＣ－ＴＤ１ペプチドをＨｅＬａ細胞に処理した後、各ペプチドの細胞膜透過程度を確認した。 【００７３】 その結果、図７に示すように、ＦＩＴＣ－ＴＬＭペプチドおよびＦＩＴＣ－ＴＤ１ペプチドは、２０μＭの高濃度で処理したにもかかわらず、細胞膜をほぼ透過することができなかったが、ＦＩＴＣ－ＨＩＶ－ＮＣペプチドは、３μＭで処理しても、蛍光信号が強く現れて、細胞膜透過活性に顕著に優れるのを確認することができた。また、ＦＩＴＣ－ＨＩＶ－ＮＣペプチドの細胞膜透過活性は、ＦＩＴＣ－ＭＡ１１ペプチドに比して約２．５倍、ＦＩＴＣ－Ｔａｔペプチドに比して約７倍、ＦＩＴＣ－ＰＴＤ－ｙｓペプチドに比して約１０倍ほど優れるのを確認することができた。 【００７４】 ６．ＮＣペプチド内のジンクフィンガードメインの細胞膜透過活性の確認 実験結果１において多数種のレトロウイルスＮＣペプチドが細胞膜透過活性があるのを確認し、図２に示すように、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＲＳＶは２個、ＭＬＶは１個のジンクフィンガードメイン（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｄｏｍａｉｎ）があるのを確認した。 【００７５】 そこで、細胞膜透過活性が種々のＮＣペプチド内の保存配列（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）であるジンクフィンガードメインによって表れるか否かを確認するために、ＨＩＶ－ＮＣペプチドの１３番目のアミノ酸～３５番目のアミノ酸からなる１番目のジンクフィンガードメインを含むペプチド（１３ＮＣ３５ペプチド、配列番号１０）と、２９番目のアミノ酸～５０番目のアミノ酸からなる２番目のジンクフィンガードメインを含むペプチド（２９ＮＣ５０ペプチド、配列番号１１）を対象にＦＩＴＣを結合させ、ＨｅＬａ細胞における細胞膜透過活性を確認した。 【００７６】 その結果、図８および図９に示すように、１３ＮＣ３５ペプチドと２９ＮＣ５０ペプチドの両方とも濃度に比例して蛍光信号が増加するのを確認することができた。これは、ＮＣペプチドのジンクフィンガードメインが細胞膜透過活性を示す重要な部分であることを意味する結果である。 【００７７】 一方、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＲＳＶおよびＭＬＶのＮＣペプチドのジンクフィンガードメインのアミノ酸配列は下記の表７に示す。 【００７８】 【表７】 ［図：0001419742000003.jpg］ 【００７９】 ７．ＨＩＶ－ＮＣペプチドの生体内組織への浸透および組織細胞における分布有無の確認 【００８０】 ＮＣペプチドが生体内組織に浸透して組織細胞に満遍なく分布するか否かを確認するために、マウス尾静脈にＨＩＶ－ＮＣペプチドを投与した結果、図１０に示すように、腎臓、肝臓、肺、心臓および脾臓組織細胞に満遍なく分布することが分かった。特に腎臓、肝臓および肺組織細胞に対する分布効率が顕著に優れていた。その反面、Ｔａｔペプチドは、腎臓を除いた他の組織にはほぼ分布しないのを確認することができた。 【００８１】 また、眼球の硝子体内と網膜下への投与経路を通じてＨＩＶ－ＮＣペプチドを投与した結果、図１１に示すように、蛍光信号が強く現れるのを確認して、ＨＩＶ－ＮＣペプチドが眼球投与経路を通じて眼球組織を浸透して網膜細胞に満遍なく分布することが分かった。 【００８２】 ８．ＨＩＶ－ＮＣペプチドによるポリペプチドの細胞膜透過有無の確認 ポリペプチドをカーゴ（ｃａｒｇｏ）にしてＨＩＶ－ＮＣペプチドによる細胞膜透過が可能であるか否かを確認するために、ＨＩＶ－ＮＣペプチドにヘキサペプチドを結合して細胞に処理して蛍光信号を観察した。その結果、図１２に示すように、ヘキサペプチドそのものは細胞膜を透過することはできないが、ＨＩＶ－ＮＣペプチドと結合した場合には細胞膜透過が可能であり、濃度に比例して細胞膜透過活性が増加するのを確認することができた。 【００８３】 ９．ＨＩＶ－ＮＣペプチドによるポリヌクレオチドの細胞膜透過有無の確認 ポリヌクレオチドをカーゴ（ｃａｒｇｏ）にしてＨＩＶ－ＮＣペプチドによる細胞膜透過が可能であるか否かを確認するために、ＨＩＶ－ＮＣペプチドとｓｉＧＬＯ ＲＮＡを結合してＭＴ４細胞に処理した後に細胞を観察した。その結果、図１３に示すように、ＨＩＶ－ＮＣペプチドの処理濃度に応じてＧＦＰ蛍光信号が増加するのを確認し、ｓｉＧＬＯの細胞膜透過程度が増加したことが分かった。この結果は、ＨＩＶ－ＮＣペプチドがポリヌクレオチドの細胞膜透過程度を顕著に改善できることを意味する。」 ２ 実施可能要件の判断 （１） 発明の詳細な説明の記載が実施可能要件に適合するか否かは、明細書の発明の詳細な説明に、当業者が、明細書の発明の詳細な説明の記載及び出願時の技術常識に基づいて、過度の試行錯誤を要することなく、その発明を実施することができる程度に明確かつ十分に記載されているか否かを検討して判断すべきものと解される。 特に、物の発明について実施可能要件を充足するには、明細書の発明の詳細な説明において、当業者が、明細書の発明の詳細な記載及び出願時の技術常識に基づき、過度の試行錯誤を要することなく、その物を生産し、かつ、使用することができる程度の記載があることを要するものと解される。 この観点で本願明細書の発明の詳細な説明の記載を検討すると、本願発明では「一般式Ｉで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド末端に細胞内輸送対象のカーゴ（ｃａｒｇｏ）が結合された細胞内伝達体」という発明特定事項を有するから、本願発明が実施可能要件に適合するためには、本願明細書の発明の詳細な説明に、「一般式Ｉで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド末端に細胞内輸送対象のカーゴ（ｃａｒｇｏ）が結合された細胞内伝達体」を製造でき、かつ、それが細胞内伝達体として使用できることを当業者が認識できる記載が必要であるといえる。 ここで、請求項１の記載をみると、「一般式Ｉで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」は、１４残基のアミノ酸からなるポリペプチドであり、Ｎ末端側からみて１番目、４番目、及び１４番目がシステイン、９番目がヒスチジン、８番目がグリシンで特定されているだけであって、その他の箇所は、請求項１の記載や１（３）にあるように、複数のアミノ酸から択一的に選択可能なように記載され、それらの組合せを計算すると全部で６億９９８４万種のポリペプチドを含むものとなっている。また、このポリペプチドの末端に結合される「細胞内輸送対象のカーゴ（ｃａｒｇｏ）」は、ポリペプチドのいずれの末端側に結合されるのかが特定されておらず、かつ、１（４）にもあるように、「カーゴ（ｃａｒｇｏ）」にあたる具体的な被輸送物に関する限定もないため、任意の分子が該当する。これらの点と１（２）の記載を考慮すると、「一般式Ｉで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド末端に細胞内輸送対象のカーゴ（ｃａｒｇｏ）が結合された細胞内伝達体」を製造でき、かつ、それが細胞内伝達体として使用できるといえるためには、その前提として、６億９９８４万種のポリペプチドを含む１４残基のアミノ酸より構成される「一般式Ｉで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」自体が、細胞膜を透過して組織まで浸透できる細胞内伝達体として機能することを、本願明細書の発明の詳細な記載及び本願出願時の技術常識に基づき当業者が推認できる必要があるといえる。 （２） 上記１（１）では、ＨＩＶ ＮＣペプチドが細胞膜透過活性を有しているのを確認し、それにより細胞内物質伝達が可能なドラッグデリバリーシステムとして利用できるのを確認し、本発明を完成するに至ったことが記載され、また、１（６）では、「ＦＩＴＣが結合されたＨＩＶ、ＳＩＶ、ＲＳＶおよびＭＬＶのＮＣペプチド」（各ＮＣペプチドのアミノ酸配列は配列番号１２～１５に対応する。）や「緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＧＦＰ）が結合されたＨＩＶ－ＮＣペプチド」、「ＨＩＶ－ＮＣペプチドの１３番目のアミノ酸～３５番目のアミノ酸からなる１番目のジンクフィンガードメインを含むペプチド（１３ＮＣ３５ペプチド、配列番号１０）と、２９番目のアミノ酸～５０番目のアミノ酸からなる２番目のジンクフィンガードメインを含むペプチド（２９ＮＣ５０ペプチド、配列番号１１）を対象にＦＩＴＣを結合させ」たものが細胞膜透過活性を示すことについて、具体的な試験結果とともに記載されているので（配列番号１０～１１は１（５）の表５を参照のこと。）、本願明細書の発明の詳細な説明には、配列番号１０～１５のアミノ酸配列を有するポリペプチドについては、それ自体で細胞膜を透過して組織まで浸透できる細胞内伝達体として機能することが記載されているといえる。 一方、上記１（６）の段落００７６では、ＦＩＴＣを結合させた１３ＮＣ３５ペプチド及び２９ＮＣ５０ペプチドの試験結果を踏まえ、ＮＣペプチドのジンクフィンガードメインが細胞膜透過活性を示す重要な部分であることを意味する結果であるとの記載があり、段落００７７、表７では、「ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＲＳＶおよびＭＬＶのＮＣペプチドのジンクフィンガードメインのアミノ酸配列」として配列番号１７～２３として「一般式Ｉで表されるアミノ酸配列」を具体化した１４残基のアミノ酸配列が記載されている。 しかし、配列番号１０～１５をみればわかるように、これらのポリペプチドはいずれも、「一般式Ｉで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」のＮ末端側、Ｃ末端側の双方に、８残基以上のアミノ酸が更に付加しているので、２２残基以上のアミノ酸配列を有する配列番号１０～１５のポリペプチドの実験結果や上記の段落００７６、００７７の記載を根拠にして、１４残基しかアミノ酸を有しない配列番号１７～２３のポリペプチドが、それ自体で細胞膜を透過して組織まで浸透できる伝達体として機能することを当業者は推認できない。 （３） 配列番号１７～２３のポリペプチドを上位概念化した「一般式Ｉで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」に関し、１（３）では様々なレトロウイルスのＮＣペプチド内に存在するジンクフィンガードメインの保存配列を示したものであると記載されているが、保存配列のうちアミノ酸が特定されているのはＮ末端側からみて１番目、４番目、及び１４番目のシステイン、並びに９番目がヒスチジンのいわゆるＣＣＨＣ配列のみである。（１）で述べたように、請求項１の一般式Ｉでは、上記システイン、ヒスチジンに関する箇所に加え、Ｎ末端側からみて８番目がグリシンに特定され、残りの９残基は複数のアミノ酸から択一的に選択可能なように記載されているので、それらの組合せを計算すると６億９９８４万種のポリペプチドが含まれている。 しかし、上記１（３）に記載されるＸａａ１～Ｘａａ９の各選択肢の説明をみると、例えば、疎水性アミノ酸と極性アミノ酸（Ｘａａ１、Ｘａａ６、Ｘａａ７）、疎水性アミノ酸と塩基性アミノ酸と極性アミノ酸（Ｘａａ２）、極性アミノ酸以外（Ｘａａ５）、酸性アミノ酸と極性アミノ酸（Ｘａａ９）のように、アミノ酸の化学的特性が大きく異なるものがグループ化されているので、「一般式Ｉで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」が、総じて、本願明細書の実施例で細胞内伝達体の効果が裏付けられている配列番号１０～１５のアミノ酸配列を有するポリペプチドと同様の化学的特性を備えることは期待できない。 また、１（５）の段落００７６では「ＮＣペプチドのジンクフィンガードメインが細胞膜透過活性を示す重要な部分であることを意味する」と記載されるところ、Ｘａａ２～Ｘａａ５のアミノ酸の選択肢には、ヒスチジンも含まれ、ヒスチジンが選択された「一般式Ｉで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」は、ジンクフィンガードメイン中のＣＣＨＣ配列に更に最大４個のＨが含まれることになるので、当該ポリペプチドが、総じて、配列番号１０～１５のアミノ酸配列を有するポリペプチドと同様の生物学的特性を備えることは期待できない。 （４） 上記（２）を踏まえると、「一般式Ｉで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」は、それを具体化した配列番号１７～２３のポリペプチドであっても、それ自体で細胞膜を透過して組織まで浸透できる伝達体として機能することを当業者は推認できない。 また、上記（３）を踏まえると、「一般式Ｉで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」には、６億９９８４万種のポリペプチドが含まれ、本願明細書の実施例で細胞内伝達体の効果が裏付けられている配列番号１０～１５のアミノ酸配列を有するポリペプチドと同様の化学的特性、生物学的特性を備えることが期待できないものが相当程度含まれている。 したがって、「一般式Ｉで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」自体が、細胞膜を透過して組織まで浸透できる細胞内伝達体として機能することは、本願明細書の発明の詳細な記載及び本願出願時の技術常識に基づき当業者は推認することができない。 よって、「一般式Ｉで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド末端に細胞内輸送対象のカーゴ（ｃａｒｇｏ）が結合された細胞内伝達体」を製造し、かつ、それを細胞内伝達体として使用するには、著しく多数のポリペプチドを製造する必要があるとともに、それらのポリペプチドに対し、細胞内伝達体として機能するか否かを判別する試験を行う必要があるため、本願発明の実施には、当業者に過度の試行錯誤・実験を要するものと認められる。 ３ 小括 以上からすると、本願明細書の発明の詳細な説明の記載は、本願発明を実施することができる程度に明確かつ十分に記載されたものではないので、本願発明は、特許法第３６条第４項第１号の規定により特許を受けることができないものである。 ４ 審判請求人の主張 審判請求人は、令和４年１０月２５日付け意見書及び審判請求書において、追加データが記載された「参考資料１」を示しつつ、 (Ｃｙｓ－Ｘａａ１－Ｘａａ２－Ｃｙｓ－Ｘａａ３－Ｘａａ４－Ｘａａ５－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ－Ｘａａ６－Ｘａａ７－Ｘａａ８－Ｘａａ９－Ｃｙｓ中における)、－ＣＣＨＣ－配列が細胞透過性の必須部分であり、本願明細書は、ＣＣＨＣ配列の特徴（効果）を十分に開示する旨を主張するとともに、追加データは、ジンクフィンガードメイン中のＣＣＨＣ配列が細胞透過性の必須部分であることを示していること、すべてのＣＣＨＣ配列がＳＳＨＳ配列に置換されると、細胞透過性が失われること、他のアミノ酸は細胞透過性にとって必須ではないことを示している旨を主張する。 しかし、「参考資料１」の試験に使用されたポリペプチドはいずれも「一般式Ｉで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」のＮ末端側、Ｃ末端側の双方にアミノ酸が更に結合されたものであって、その試験結果はアミノ酸配列が配列番号１０～１５で表されるポリペプチドによる試験結果と同程度の内容に過ぎないし、６億９９８４万種のポリペプチドを含む「一般式Ｉで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」がそれ自体で、細胞膜を透過して組織まで浸透できる細胞内伝達体として機能することを実証するものでもない。 したがって、上記主張はいずれも採用できない。 第５ むすび 以上のとおり、本願は、発明の詳細な説明の記載が特許法第３６条第４項第１号に規定する要件を満たしていないので、他の請求項に係る発明について検討するまでもなく、本願は特許を受けることができない。 よって、結論のとおり審決する。