2017-004802

特願２０１４－２０６９６２「核酸増幅方法、核酸増幅用の核酸試料の製造方法および核酸解析方法」拒絶査定不服審判事件〔平成２７年　５月２１日出願公開、特開２０１５－　９６０６１〕について、次のとおり審決する。

【結　論】 本件審判の請求は、成り立たない。

【理　由】 第１　手続の経緯 本願は、平成２６（２０１４）年１０月８日（優先権主張　平成２５年１０月８日）の出願であって、平成２８年４月２５日付けの拒絶理由の通知に対し、平成２８年７月１日に意見書が提出されるとともに手続補正がなされたが、平成２８年１２月２２日付けで拒絶査定がなされ、これに対して平成２９年４月５日に審判の請求がなされると同時に手続補正がなされたものである。 第２　平成２９年４月５日にされた手続補正についての補正の却下の決定 ［補正の却下の決定の結論］ 平成２９年４月５日にされた手続補正（以下「本件補正」という。）を却下する。 ［理由］ １　本件補正について（補正の内容） （１）本件補正後の特許請求の範囲 本件補正により、特許請求の範囲の請求項１の記載は、次のとおりに補正された。（下線部は、補正箇所である。） 「総体積０．０１～１ｍｍ３の単離した生体組織ならびに水、緩衝液および生理食塩水からなる群から選択された少なくとも一つである水性溶媒１０～４０μＬのみを含む混合物を、５～２０分間の加熱処理時間で加熱することにより、前記生体組織から核酸を放出させる加熱処理工程、および、反応液５０μＬ当たりに含まれる核酸試料が、総体積０．０１～１ｍｍ３の前記生体組織から得られた試料となるように、前記加熱処理工程後の前記混合物の全量をそのまま採取して、その全量を前記核酸試料とし、前記核酸試料を含む前記反応液中で、前記核酸試料中の核酸を鋳型として、核酸増幅を行う増幅工程を含み、前記加熱処理工程の前後において、組織溶解用の酵素による酵素処理を行わず、前記単離した生体組織および前記水性溶媒のみを含む前記混合物の加熱処理のみにより前記核酸試料を調製することを特徴とする、核酸増幅方法。」 （２）本件補正前の特許請求の範囲 本件補正前の、平成２８年７月１日にされた手続補正により補正された特許請求の範囲の請求項１の記載は、次のとおりである。 「単離した生体組織ならびに水、緩衝液および生理食塩水からなる群から選択された少なくとも一つである水性溶媒のみを含む混合物を、５～６０分間の加熱処理時間で加熱することにより、前記生体組織から核酸を放出させる加熱処理工程、および、反応液５０μＬ当たりに含まれる核酸試料が、総体積０．０１～１ｍｍ３の前記生体組織から得られた試料となるように、前記加熱処理工程後の前記混合物をそのまま採取して、その全量を前記核酸試料とし、前記核酸試料を含む前記反応液中で、前記核酸試料中の核酸を鋳型として、核酸増幅を行う増幅工程を含み、前記加熱処理工程の前後において、組織溶解用の酵素による酵素処理を行わず、前記単離した生体組織および前記水性溶媒のみを含む前記混合物の加熱処理のみにより前記核酸試料を調製することを特徴とする、核酸増幅方法。」 ２　本件補正の適否 本件補正は、本件補正前の請求項１に記載された発明を特定するために必要な事項である「単離した生体組織」の総体積、「水性溶媒」の量、「加熱処理時間」の「６０分間」、採取する「加熱処理工程後の前記混合物」の量を、それぞれ、出願当初の明細書の【００１９】に記載されていた「０．０１～１ｍｍ３」、同【００２６】に記載されていた「１０～４０μＬ」、同【００２３】に記載されていた「２０分間」、同【００１６】に記載されていた「全量」に限定するものである。 補正前の請求項１に記載された発明と補正後の請求項１に記載される発明の産業上の利用分野及び解決しようとする課題は同一であるから、審判請求時の補正は、特許法第１７条の２第５項２号の特許請求の範囲の減縮を目的とするものに該当する。 そこで、本件補正後の請求項１に係る発明（以下「本件補正発明」という。）が同法第１７条の２第６項において準用する同法第１２６条第７項の規定に適合するか（特許出願の際独立して特許を受けることができるものであるか）について、以下で検討する。 （１）本件補正発明 本件補正発明は、上記１（１）に記載したとおりのものである。 （２）引用発明の認定 ア　引用文献１の記載事項 原査定の拒絶の理由で引用された本願の優先日（平成２５年１０月８日）前に頒布された又は電気通信回線を通じて公衆に利用可能となった引用文献である、「Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９４年，Ｖｏｌ．４７，ｐ．３１８－３２３」（平成６年発行。以下「引用文献１」という。）には、次の記載がある。（当審にて、翻訳を行い、下線を付与した。） ア－１ 目的 所定に固定されたパラフィン包埋組織から、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）にＤＮＡを提供する４つの迅速なＤＮＡ抽出方法を、評価すること。 手段 様々な組織から得られた１８ブロック、子宮頸管がん検体の１８ブロック、Ｂ細胞リンパ腫の９ブロックが調査された。正常サイズと生検標本サイズの両方の組織が検査された。ＤＮＡは、４つの方法、すなわち蒸留された水の中での２０分間の沸騰；５％のＣｈｅｌｅｘ－１００樹脂の溶液中での２０分間の沸騰；３時間のｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋでの消化；及び３時間のｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋでの消化に続く５％のＣｈｅｌｅｘ－１００樹脂の溶液中での２０分間の沸騰；により抽出された。ｐ５３遺伝子の異なるエクソン、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）の配列、イムノグロブリン重鎖（ＩｇＨ）遺伝子の再編成物が、抽出物より、増幅された。 結果 Ｃｈｅｌｅｘ沸騰、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ消化、及びｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ消化－Ｃｈｅｌｅｘ沸騰の方法においては、４５のサンプルの全てで所定の増幅が行えた。水中沸騰は、４５のサンプルのうち３つ（７％）でＰＣＲの鋳型が不十分となり、４２の陽性例のうち６つ（１４％）で弱いバンドが観察された。殆どが生検検体の場合であったりＢ細胞リンパ腫の場合であった。ｐ５３遺伝子の断片は、沸騰水抽出で、４０８ｂｐまで首尾良く増幅した。・・・全ての鋳型は－２０℃で３ヶ月保存後も再利用できた。 結論 Ｃｈｅｌｅｘ沸騰、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ消化、及びｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ消化－Ｃｈｅｌｅｘ沸騰の方法は、多様なパラフィン包埋組織切片から、ＰＣＲにとって最適な鋳型を提供した。５％のＣｈｅｌｅｘ－１００溶液中で２０分間沸騰という簡易な方法は、最小限な操作、時間で行えるため、特に多くの材料を所定の手順で処理する際に有用である。（要約） ア－２ ホルマリン固定パラフィン包埋組織からのＤＮＡ抽出で、最も広く知られたプロトコールは、３時間から数日の範囲で、プロテアーゼ処理を行うもので、追加的に有機溶剤による純化、エタノール沈殿９－１３を要するか要しないものである。ＰＣＲのための組織処理の代替法として、蒸留水を沸騰する方法３　１４　１５、捕獲樹脂を含む溶液を沸騰させて溶解した細胞を得る方法４　５　１０がある。・・・ 大規模且つ所定の手順で、包埋物を処理するために、ＤＮＡ抽出は、ＰＣＲの結果に影響を与えることなく、簡易且つ迅速に行われるべきである。更に、汚染の可能性を最小化するためにできるだけ少ない工程とされるべきである。（３１８頁右欄２１行～３９行） ア－３ ＤＮＡ抽出 正常サイズ組織から５μｍの切片（集められた平均体積１．４４ｍｍ３）、生検標本サイズ組織から１０μｍの切片（集められた平均体積０．０３４ｍｍ３）が切り出され以下の４つの方法（方法Ａ～Ｄ）に付された。 方法Ａ 切片は前処理を行い、又は行わずに１００μｌ（生検標本切片は５０μｌ）の蒸留水に再懸濁され、２０分間沸騰された（Lenth等の方法１５を改訂）。前処理を行う場合には、６０℃で２０分間のキシレンによる２回のワックス除去、無水エタノールでの脱水（rehydrationはdehydrationの誤記と解した。）、乾燥が含まれる。（３１９頁左欄下から８行～右欄９行） ア－４ ＰＣＲ ＰＣＲは、Perkin Elmer Cetus Thermal Cycler（Perkin-Elme，Norwalk，Connecticut，USA）にて行われた。反応混合物（全容量で５０μｌ又は２５μｌ）で１０－２０ｐモルのプライマー、１×ＰＣＲバッファー・・・鋳型を含んでいる。（３２０頁左欄３行～１４行） イ　引用発明の認定 摘記ア－３には、平均体積０．０３４ｍｍ３の生検標本組織を切り出し、５０μｌの蒸留水に懸濁、２０分間沸騰させることによって、当該組織から、ＤＮＡを抽出できることが記載され、摘記ア－１、ア－４には、抽出されたＤＮＡを、鋳型として、５０μｌのＰＣＲの反応混合物に加え、ｐ５３遺伝子の断片を首尾良く増幅したことが記載されている。 以上の記載事項からすると、引用文献１には、 「平均体積０．０３４ｍｍ３の生検標本組織と５０μｌの水を含む混合物を、２０分間加熱することによりＤＮＡを抽出し、５０μｌの反応混合物に、抽出されたＤＮＡを鋳型として加え、ＤＮＡの増幅を行う、ＤＮＡの増幅方法」の発明（引用発明）が記載されている。 （３）本件補正発明と引用発明との対比 引用発明の「生検標本組織」、「ＤＮＡ」、「反応混合物」、「抽出」は、本件補正発明の「単離した生体組織」、「核酸」、「反応液」、「放出」にそれぞれ相当し、本件補正発明と引用発明は、核酸（ＤＮＡ）の放出（抽出）を、水のみを含む混合物の加熱処理にて行うこと、当該加熱処理の前後で組織溶解用の酵素による処理を行わないことで共通している。 そうすると、本件補正発明（前者）と引用発明（後者）は、 「単離した生体組織ならびに水である水性溶媒のみを含む混合物を、２０分間の加熱処理時間で加熱することにより、前記生体組織から核酸を放出させる加熱処理工程、および、核酸試料を含む反応液中で、前記核酸試料中の核酸を鋳型として、核酸増幅を行う増幅工程を含み、前記加熱処理工程の前後において、組織溶解用の酵素による酵素処理を行わず、前記単離した生体組織および前記水性溶媒のみを含む前記混合物の加熱処理のみにより前記核酸試料を調製する、核酸増幅方法」で一致し、 前者が、加熱する混合物として、総体積０．０１～１ｍｍ３の生体組織と水性溶媒１０～４０μＬを含む混合物を使用しているのに対し、後者が、平均体積０．０３４ｍｍ３の生体組織と水性溶媒５０μｌを含む混合物を使用している点（相違点１）、 前者が、反応液５０μＬ当たりに含まれる核酸試料が、総体積０．０１～１ｍｍ３となるように、加熱処理工程後の混合物の全量をそのまま採取し、その全量を核酸試料に用いているのに対し、後者では、加熱処理工程後の混合物における核酸試料の全量を反応混合物に用いることについて言及していない点（相違点２） で相違している。 （４）相違点の判断 以下、相違点１、２について検討する。 （ｉ）相違点１について 摘記ア－３によれば、正常サイズ組織の場合に、体積１．４４ｍｍ３のものを１００μｌの水性媒体に懸濁させるとされているので、使用する生体組織の大きさや種類に応じて、当業者が水性媒体の量を適宜設定できることは、引用文献１に示唆されているといえる。 そうすると、水性媒体の使用量として、５０μｌに近接する１０～４０μｌの範囲を採用すること、また、この水性媒体の使用量に見合った生体組織の大きさを、平均体積０．０３４ｍｍ３や１．４４ｍｍ３を参考にして、取捨選択し、総体積０．０１～１ｍｍ３の範囲に至ることは、当業者が容易になし得たものである。 （ｉｉ）相違点２について 摘記ア－２によれば、ＤＮＡ抽出は、簡易且つ迅速に行われるべきものであり、汚染を防ぐために、工程数を可能な限り少なくすることが求められていたところ、５０μｌの水に含まれる０．０３４ｍｍ３の生検標本組織から抽出されたＤＮＡを、摘記ア－４に記載される５０μｌのＰＣＲ反応混合物に、そのまま用いる方法が、より簡易且つ迅速で、工程数も少なくなることは、当業者に明らかである。 なお、水性溶媒のみを含む混合物ではないが、組織溶解用の酵素による酵素処理を行わずに加熱によりＤＮＡを抽出する方法において、加熱後の混合物の全量を、ＰＣＲ反応に供する例は、当業者に各種知られている。 （例えば、摘記ア－２の「蒸留水を沸騰させたり３」の番号３で引用されている「Ｊ．ＥＸＰ．ＭＥＤ．，１９８８年，Ｖｏｌ．１６７，ｐ．２２５－２３０」の２２６頁３２行～４５行や平成２８年４月２５日付け拒絶理由通知書で引用された「Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ：　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０００年，Ｖｏｌ．５３，ｐ．５１－５２」（引用文献２）の５１頁右欄２８行～５２頁右欄４行を参照。） そうすると、引用発明において、加熱処理後の混合物の全量を、ＰＣＲ反応液の核酸試料として用い、反応液５０μＬ当たりに含まれる核酸試料が、総体積０．０１～１ｍｍ３となるように調整することは、当業者が容易になし得たものである。 また、本件補正発明の効果についてみても、引用発明では、体積０．０３４ｍｍ３という小さい切片体積の生検標本組織が使用され、ｐ５３遺伝子の断片の増幅に成功しているから、本件補正発明によって、当業者の期待、予測を超える効果を奏したとは評価できない。 （ｉｉｉ）審判請求人の主張について 審判請求人は、引用文献１に記載のＤＮＡの抽出方法では、加熱処理前に、本願発明の核酸増幅方法における水性溶媒の量（１０～４０μＬ）よりも多い、５０～１００μｌの精製水を添加した後に、２０分間加熱処理しており、ＰＣＲ反応に適切な核酸の量とするためには、加熱処理して得られたサンプル中の水を、更に、蒸発等により除去する時間が必要であり、引用文献１は、本願発明の課題である、「簡易に効率よく核酸を回収する」ことを想定していない、そのため、引用文献１に記載のＤＮＡ抽出方法では、加熱処理工程後の混合物の全量を核酸試料とし、核酸増幅を行う動機付けはない、と主張している。 しかし、引用発明の加熱前の混合物とＰＣＲ反応混合物は、５０μｌで同じ容量なので、簡易且つ迅速にＤＮＡの増幅を行うために、加熱後の混合物に含まれるＤＮＡを、そのままＰＣＲ反応混合物に利用することは、当業者が容易に想到し得たものである。 しかも、本願明細書の表１には、水性溶媒として２０μＬを使用し、加熱温度９４～９６℃で１０分間加熱を行った場合、水性溶媒が９μＬまで減少することが記載されているので、この１０分よりも加熱時間の長い２０分で加熱を実施している引用発明においては、加熱後の水性溶媒の量が、当初の５０μｌよりも相当程度、減少していることが、推認できる。 そうすると、審判請求人が主張するように、ＰＣＲ反応に必要な容量５０μｌに合わせるために、蒸発等により水性溶媒を除去する必要があったとは認められない。 一方、ＤＮＡ抽出が、簡易且つ迅速に行われるべきものであることは、摘記ア－２に記載されているので、引用文献１は、「簡易に効率よく核酸を回収する」という課題を想定したものといえる。 したがって、引用発明において、混合物の全量を核酸試料とし、核酸増幅を行うことに動機付けがないとの審判請求人の主張を採用することはできない。 （５）小括 本件補正発明は、引用発明及び引用文献１に記載された技術的事項に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであり、特許法２９条２項の規定により、特許出願の際独立して特許を受けることができないものである。 ３　本件補正についてのむすび 本件補正は、特許法１７条の２第６項において準用する同法１２６条７項の規定に違反するので、同法１５９条１項の規定において読み替えて準用する同法５３条１項の規定により却下すべきものである。 よって、上記補正の却下の決定の結論のとおり決定する。 第３　本願発明について １　本願発明 平成２９年４月５日にされた手続補正は、上記のとおり却下されたので、本願の請求項に係る発明は、平成２８年７月１日にされた手続補正により補正された特許請求の範囲の請求項１～１３に記載された事項により特定されるものであるところ、その請求項１に係る発明（以下「本願発明」という。）は、その請求項１に記載された事項により特定される、上記の第２［理由］１（２）に記載のとおりのものである。 ２　原査定の拒絶の理由 原査定の拒絶の理由は、この出願の請求項１～１３に係る発明は、本願の優先権主張の日前に頒布された又は電気通信回線を通じて公衆に利用可能となった下記の引用文献１に記載された発明に記載された事項に基づいて、その出願前にその発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法２９条２項の規定により特許を受けることができない、というものである。 引用文献１．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９４年，Ｖｏｌ．４７，ｐ．３１８－３２３ ３　引用文献 原査定の拒絶の理由で引用された引用文献１の記載事項は、上記の第２の［理由］２（２）に記載したとおりである。 ４　対比・判断 本願発明は、上記の第２の［理由］２で検討した本件補正発明から、「０．０１～１ｍｍ３」、「１０～４０μＬ」、「２０分間」、「全量」に係る限定事項を削除したものである。 したがって、本願発明の発明特定事項を全て含み、さらに他の限定事項を付加したものに相当する本件補正発明が、上記の第２の［理由］２（３）～（５）に記載したとおり、引用発明及び引用文献１に記載された技術的事項に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであるから、本願発明も、引用発明及び引用文献１に記載された技術的事項に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものである。 第４　むすび 以上のとおり、本願発明は、特許法２９条２項の規定により特許を受けることができないから、他の請求項に係る発明について検討するまでもなく、本願は拒絶されるべきものである。 よって、結論のとおり審決する。