2023-700912

特許第７２３２７５８号発明「膜透過性の高い環状ペプチド化合物、及びこれを含むライブラリ」の特許異議申立事件について、次のとおり決定する。

結 論 特許第７２３２７５８号の請求項１～１３に係る特許を維持する。

理 由 第１ 手続の経緯 特許第７２３２７５８号（請求項の数１３。以下、「本件特許」という。）は、平成３０年６月８日（優先権主張 平成２９年６月９日）を国際出願日とする特願２０１９－５２３９９６号の請求項１～１３に係る発明について、令和５年２月２２日に特許権の設定登録がされ、特許掲載公報が令和５年３月６日に発行されたものである。 その後、令和５年９月５日に、本件特許の請求項１～１３に係る特許に対して、特許異議申立人である須長英男（以下、「申立人」という。）から、特許異議の申立てがされた。 よって、本件特許異議の申立てに係る審理対象は、全ての請求項に係る特許についてであり、審理対象外の請求項は存しない。 第２ 本件発明 本件特許第７２３２７５８号の請求項１～１３の特許に係る発明は、それぞれ、その特許請求の範囲の請求項１～１３に記載された事項により特定されるとおりのものである（以下、請求項１～１３に係る発明を、項番に従い、「本件発明１」～「本件発明１３」といい、それらを総称して、「本件発明」という。また、本件特許の設定登録時の願書に添付した明細書及び図面を「本件明細書等」という。）。 「【請求項１】 標的分子に特異的に結合できる化合物の同定に使用するための、環状ペプチド化合物のライブラリであって、前記ライブラリが、環状部の側鎖に、（１）インドール骨格、及び（２）置換又は無置換のヒドロキシフェニル基、を有しない環状ペプチド化合物から実質的になり、 前記ライブラリに、環状部に酸性の側鎖を有する環状ペプチド化合物が含まれる場合、同環状ペプチド化合物が、該酸性の側鎖のｐＫａが３．５～１０である環状ペプチド化合物から実質的になり、 前記ライブラリに、環状部に塩基性の側鎖を有する環状ペプチド化合物が含まれる場合、同環状ペプチド化合物が、該塩基性の側鎖のＢａｓｉｃ ｐＫａが４．０～１０である環状ペプチド化合物から実質的になり、 前記ライブラリに含まれる環状ペプチド化合物の環状部を構成するアミノ酸の数の平均が７～１４であり、 前記ライブラリが、長さが５．４～１３オングストロームの長側鎖を環状部に有する環状ペプチド化合物を含み、 前記ライブラリが、１×１０3以上の多様性を有する、 ライブラリ。 【請求項２】 前記長側鎖が、その側鎖上にアミド結合を含まないか、又は１個のアミド結合を含む側鎖である、請求項１に記載のライブラリ。 【請求項３】 前記ライブラリに含まれる環状ペプチド化合物のＣｌｏｇＰ／ｔｏｔａｌ ａａの平均が、１．０～１．８である、請求項１又は２に記載のライブラリ。 【請求項４】 前記ライブラリに含まれる環状ペプチド化合物が、環状ペプチド－核酸複合体である、請求項１～３のいずれか一項に記載のライブラリ。 【請求項５】 前記環状ペプチド－核酸複合体が、核酸が連結されている直鎖部（核酸連結部）を含む、請求項４に記載のライブラリ。 【請求項６】 前記ライブラリに含まれる環状ペプチド－核酸複合体の核酸連結部以外のペプチド部位を構成するアミノ酸の数の平均が、７～２０である、請求項５に記載のライブラリ。 【請求項７】 前記ライブラリに含まれる環状ペプチド－核酸複合体の核酸連結部以外のペプチド部位に含まれるアミノ酸の数に占めるＮ置換アミノ酸の数の割合の平均が３０％以上である、請求項５又は６に記載のライブラリ。 【請求項８】 前記ライブラリに含まれる環状ペプチド化合物のＣｌｏｇＰ／ｔｏｔａｌ ａａの平均が、１．０～１．８であり、 前記環状ペプチド－核酸複合体のＣｌｏｇＰ／ｔｏｔａｌ ａａが、核酸によりコードされる環状ペプチド化合物の核酸連結部以外のペプチド部位のＣｌｏｇＰ／ｔｏｔａｌ ａａである、請求項５～７のいずれか一項に記載のライブラリ。 【請求項９】 前記長側鎖がＲ１を含み、ここでＲ１は、 （ａ）フェニル基、若しくは、（ｂ）酸素原子及び窒素原子からなる群より独立に選択されるヘテロ原子を環内に１～３個有している４～６員の複素環基、 ここで（ａ）及び（ｂ）は下記Ａ群より独立に選択される置換基を少なくとも一つ有していてもよく、 Ａ群：オキソ、ハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１－Ｃ４アルキル基、及びＣ１－Ｃ４ジアルキルアミノ基（ここで、Ｃ１－Ｃ４アルキル基中の隣接しない１又は２個のメチレン基が酸素原子で置換されていてもよい） 又は、 （ｃ）以下の一般式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、若しくは（ＩＶ）： 【化１】 ［図：0001406724000001.jpg］ ［式中、 Ｘ１は単結合、又は下記Ｂ群より独立して選択される置換基を少なくとも一つ有していてもよいＣ１－Ｃ２アルキレン基を表し、 Ｘ２は単結合、又は下記Ｂ群より独立して選択される置換基を少なくとも一つ有していてもよいＣ１－Ｃ２アルキレン基を表し、 Ｙ１は単結合、酸素原子、カルボニル基（－ＣＯ－）、又はスルホニル基（－ＳＯ２－）を表し、 Ｙ２は単結合、Ｃ１－Ｃ４アルキル基で置換されていてもよいＣ１－Ｃ２アルキレン基、カルボニル基（－ＣＯ－）、又はスルホニル基（－ＳＯ２－）を表し、 Ｚ１は単結合、下記Ｂ群より独立して選択される置換基を少なくとも一つ有していてもよいメチレン基、又は酸素原子を表し、 Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、水素原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ２－Ｃ４アルケニル基、又はＣ２－Ｃ４アルキニル基を表し、ここで該Ｃ１－Ｃ６アルキル基は、ハロゲン原子で置換されていてもよく、また、該Ｃ１－Ｃ６アルキル基中の隣接しない１若しくは２個のメチレン基が酸素原子で置換されていてもよく Ｒ２及びＲ３、又はＲ２及びＸ１が結合して４～６員環の環状構造を形成していてもよく、この場合に該環状構造は、Ｃ１－Ｃ４アルキル基又はハロゲン原子で置換されていてもよく、環内に酸素原子を有していてもよく、該環状構造は部分的に不飽和であってもよく、 Ｒ４はＣ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ２－Ｃ６アルケニル基、Ｃ２－Ｃ６アルキニル基、又はＣ１－Ｃ６アルカノイル基を表し、 Ｒ５は水素原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ２－Ｃ６アルケニル基、又はＣ２－Ｃ６アルキニル基を表し、Ｒ４及び／又はＲ５のＣ１－Ｃ６アルキル基中の隣接しない１若しくは２個のメチレン基が酸素原子で置換されていてもよく、 あるいはＲ４及びＲ５、又はＲ５及びＸ２はそれらが結合している原子と一緒になって４～６員環の環状構造を形成していてもよく、この場合に該環状構造は、Ｃ１－Ｃ４アルキル基又はハロゲン原子で置換されていてもよく、環内に酸素原子を有していてもよく、該環状構造は部分的に不飽和であってもよく、 Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ４アルキル基、Ｃ２－Ｃ４アルケニル基、又はＣ２－Ｃ４アルキニル基を表し、該Ｃ１－Ｃ４アルキル基中の隣接しない１若しくは２個のメチレン基が酸素原子で置換されていてもよく、 【化２】 ［図：0001406724000002.jpg］ は結合点を表す。 Ｂ群：ハロゲン原子、Ｃ１－Ｃ４アルキル基、及びＣ１－Ｃ２アルコキシ基］ で表される基である、 請求項１～８のいずれか一項に記載のライブラリ。 【請求項１０】 前記ライブラリに含まれる環状ペプチド化合物の環状部の側鎖に含まれる芳香環の数の平均が０～３である、請求項１～９のいずれか一項に記載のライブラリ。 【請求項１１】 以下の工程を含む、標的分子に特異的に結合できる環状ペプチド化合物のスクリーニング方法： （ｉ）請求項１～１０のいずれか一項に記載のライブラリと該標的分子を接触させる工程；及び （ｉｉ）該標的分子に特異的に結合できる環状ペプチド化合物を選択する工程。 【請求項１２】 請求項１に記載の環状ペプチド化合物のライブラリの製造方法であって、以下（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される少なくとも一つの工程を含む、方法： （ａ）（１）側鎖にインドール骨格を有するアミノ酸を実質的に含まず、 （２）側鎖に置換又は無置換のヒドロキシフェニル基を有するアミノ酸を実質的に含まず、 （３）長さが５．４～１３オングストロームの長側鎖を有するアミノ酸を含み、 （４）酸性の側鎖を有するアミノ酸を含む場合、該酸性の側鎖のｐＫａが３．５～１０であり、かつ、 （５）塩基性の側鎖を有するアミノ酸を含む場合、該塩基性の側鎖のＢａｓｉｃ ｐＫａが４．０～１０である、 アミノ酸プールを用意し、該プールに含まれるアミノ酸の一部又は全部を構成アミノ酸としてペプチド化合物を合成する工程；及び （ｂ）（１）側鎖にインドール骨格を有するアミノ酸をコードする核酸を実質的に含まず、 （２）側鎖に置換又は無置換のヒドロキシフェニル基を有するアミノ酸をコードする核酸を実質的に含まず、 （３）長さが５．４～１３オングストロームの長側鎖を有するアミノ酸をコードする核酸を含み、 （４）酸性の側鎖を有するアミノ酸をコードする核酸を含む場合、該酸性の側鎖のｐＫａが３．５～１０であり、かつ、 （５）塩基性の側鎖を有するアミノ酸をコードする核酸を含む場合、該塩基性の側鎖のＢａｓｉｃ ｐＫａが４．０～１０である、 鋳型プールを用意し、該鋳型プールからペプチド化合物を合成する工程。 【請求項１３】 以下の工程を含む、環状ペプチド化合物の製造方法： （ｉ）請求項１～１０のいずれか一項に記載のライブラリと標的分子を接触させる工程； （ｉｉ）該標的分子に結合できる環状ペプチド化合物を選択する工程；及び （ｉｉｉ）（ｉｉ）で選択された環状ペプチド化合物のアミノ酸配列に基づき、環状ペプチド化合物を製造する工程。」 第３ 申立人が申し立てた特許異議申立理由 申立人が申し立てた特許異議申立の理由（以下、「申立理由」という。）の概要及び証拠方法は以下のとおりである。 １．申立理由の概要 （１）申立理由１（進歩性） 本件発明１～１３は、甲第１号証及び甲第２号証に記載された発明に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。 したがって、本件発明１～１３に係る特許は、同法第２９条第２項の規定に違反してされたものであるから、同法第１１３条第２号の規定により取り消すべきものである。 （２）申立理由２（実施可能要件、サポート要件） 「（１）インドール骨格、及び（２）置換又は無置換のヒドロキシフェニル基」以外の環状部の側鎖に有するとすると膜透過性が低くなると推認される基、例えばアミノブチル基、を側鎖として有するペプチド化合物を含むライブラリを使用する場合、又は、実施例に記載された特定の4種類以外の標的の場合に、膜透過性の高い環状ペプチド化合物をスクリーニングできるとする根拠が不明である。 また、ライブラリに含まれる、長側鎖を環状部に有する環状ペプチド化合物の比率が少なくなると、標的分子に特異的に結合できる環状ペプチド化合物のヒット率が低下するものと推測される。 したがって、本件発明１～１２についての本件特許は、特許法第３６条第４項第１号及び同法同条第６項第１号に規定する要件を満たしていない特許出願に対してされたものであって、本件特許は、同法第１１３条第４号に該当し、取り消されるべきものである。 （３）申立理由３（実施可能要件） ア．本件発明１３について 本件発明１３において、工程（ｉｉｉ）を行うためには、工程（ｉｉ）で選択された環状ペプチド化合物のアミノ酸配列を把握する必要があるが、工程（ｉ）で用いられる多様な環状ペプチド化合物群からどのようなものが選択されるか当業者は理解することができないうえ、実施例に記載された特定の標的分子を用いて選択された特定の環状ペプチド化合物のアミノ酸配列から、それ以外の標的分子を用いた場合の環状ペプチド化合物のアミノ酸配列を類推できるといえない。 よって、本件発明１３は、特許法第３６条第４項第１号に規定する要件を満たしていない。 イ．本件発明１について 環状部にｐＫａ３．５～１０である酸性の側鎖を有する環状ペプチド化合物がライブラリに含まれる場合、及び、環状部にＢａｓｉｃ ｐＫａが４．０～１０である塩基性の側鎖を有する環状ペプチド化合物がライブラリに含まれる場合において、膜透過性の高い環状ペプチド化合物をスクリーニングできるとの根拠が不明である。 よって、本件発明１は、特許法第３６条第４項第１号に規定する要件を満たしていない。 ウ．本件発明３、８について 本件明細書等の発明の詳細な説明には、１×１０3以上の多様性を有し、かつＣｌｏｇＰ／ｔｏｔａｌ ａａの平均が１．０～１．８であるライブラリをどのように製造すべきか記載されておらず、かかるライブラリが技術常識に基づいて当業者が作製できるとも理解できない。 よって、本件発明３、８についての本件特許は、特許法第３６条第４項第１号に規定する要件を満たしていない。 したがって、本件発明１、３、８、１３についての本件特許は、特許法第３６条第４項第１号に規定する要件を満たしていない特許出願に対してされたものであって、本件特許は、同法第１１３条第４号に該当し、取り消されるべきものである。 ２．証拠方法 甲第１号証：国際公開第２０１３／１００１３２号 甲第２号証：Medchemcomm. 2012 October ; 3(10): 1282-1289 （以下、「甲第１号証」、「甲第２号証」を、「甲１」、「甲２」という。） 第４ 当審の判断 当審は、申立人が主張する上記の申立理由は、いずれも理由がなく、ほかに本件発明１～１３に係る特許を取り消すべき理由も発見できないから、本件発明１～１３に係る特許は、いずれも取り消すべきものではなく、維持すべきものと判断する。 １．本件明細書等の記載 本件明細書等には、以下の事項が記載されている。（下線は当審による。） 本ａ 「【発明が解決しようとする課題】 【０００７】 本発明は、このような状況を鑑みてなされたものであり、非限定的な一側面において、細胞膜透過性（「膜透過性」ともいう。）の高い環状ペプチド化合物をスクリーニングするための、環状ペプチド化合物のライブラリを提供することを課題とする。また、本発明は、非限定的な一側面において、標的分子に特異的に結合できる環状ペプチド化合物を効率的にスクリーニングするための、環状ペプチド化合物のライブラリを提供することを課題とする。本発明は、他の側面において、膜透過性の高い環状ペプチド化合物、又はその製造方法、若しくはスクリーニング方法を提供することを課題とする。」 本ｂ 「【課題を解決するための手段】 【０００８】 本発明者らは、標的分子に特異的に結合できる環状ペプチド化合物をスクリーニングする際に、長い側鎖を環状部に有する環状ペプチド化合物を含むライブラリを用いることで、標的分子に特異的に結合できる環状ペプチド化合物のヒット率が向上し得ること、すなわちスクリーニングの効率を高め得ることを見出した。 【０００９】 一方で、従来経口低分子医薬品に採用されていたインドール骨格やヒドロキシフェニル基を有するアミノ酸残基であるトリプトファンやチロシン残基が、実は、高い膜透過性を狙うペプチドには適さないこと、つまり、同構造を有するペプチドは高い膜透過性を発揮することが難しくなることを驚くべきことに見出した。 【００１０】 特に、トリプトファンやチロシン残基のような長い側鎖を有するアミノ酸残基を有する環状ペプチド化合物を含むライブラリを用いて、標的分子に結合できる化合物のパニングを繰り返すと、膜透過性の低い環状ペプチド化合物がヒット化合物として濃縮されることを、本発明者らは見出した。 【００１１】 また、特定の理論に拘束されることを必ずしも意図しないが、上記により濃縮された環状ペプチド化合物から、hit to leadにより高い膜透過性を有する環状ペプチド化合物を得ようとしても、標的分子との結合に寄与すると考えられる長い側鎖自体が、高い膜透過性を発揮しにくい構造を有することから、（ｉ）標的分子との結合親和性と（ｉｉ）高い膜透過性を両立できる可能性は低いと考えられる。 【００１２】 そこで、本発明者らは、膜透過性が高く、標的分子に特異的に結合できる環状ペプチド化合物を効率よくスクリーニングすることができるライブラリの一態様として、環状部に長い側鎖を有し、かつ、高い膜透過性を発揮しにくい側鎖を有しない環状ペプチド化合物のライブラリを見出し、本発明を完成するに至った。」 本ｃ 「【００８３】 ペプチド化合物 限定を意図しないが、本開示における「ペプチド化合物」には、鎖状ペプチド化合物、及び環状ペプチド化合物が含まれる。また、本開示におけるペプチド化合物には、ペプチド、ペプチドと核酸の複合体（ペプチド－核酸複合体）、ペプチドとリボソームと核酸の複合体等が含まれる。限定を意図しないが、本開示におけるペプチド化合物には、鎖状ペプチド、環状ペプチド、鎖状ペプチド部位と核酸の複合体（鎖状ペプチド－核酸複合体）、及び環状ペプチド部位と核酸の複合体（環状ペプチド－核酸複合体）が含まれる。非限定の一態様において、環状ペプチド化合物の環状部は、翻訳合成されたペプチド化合物を環化反応に供することにより形成される。本明細書において、ペプチドそのもの、又はペプチド－核酸複合体におけるペプチドの部分を「ペプチド部位」と記載する場合がある。また、本開示における「核酸」にはＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びｔＲＮＡが含まれる。本明細書において、ペプチド化合物を構成する「アミノ酸」を「アミノ酸残基」ということがある。本明細書において、環状部を有するペプチド化合物を「環状ペプチド化合物」とよぶことがある。本明細書において、ペプチド化合物の「環状部」とは、２以上のアミノ酸残基が連結され、形成されている環状の部分を意味する。本明細書において、環状ペプチド化合物の部分構造を指す際に使用される「直鎖部」とは、環状部の主鎖構造に含まれない部分であって、該部分の鎖上に少なくとも一つのアミド結合及び／又はエステル結合を有するものをいう。また、本明細書における「ペプチド化合物」には、その薬学的に許容される塩が含まれてもよい。」 本ｄ 「【０１０９】 非限定の一態様において、本開示における環状ペプチド化合物のClogPは、４以上が好ましく、５以上がより好ましく、６以上が更に好ましく、８以上が特に好ましく、１８以下、１７以下、１６以下が好ましく例示され、４～１８、５～１７、及び６～１６が例示される。本明細書におけるClogPは、コンピューターで計算した分配係数であって、Daylight Chemical Information Systems, Inc.のDaylight Version 4.9を用いて計算できる。 【０１１０】 非限定の一態において、本開示における環状ペプチド化合物のClogP/total aaは、１.０以上が好ましく、１．１以上がより好ましく、１．２以上が更に好ましく、１．８以下、１．７以下、１．６以下、１．５以下が好ましく例示され、１．０～１．８、１．０～１．７、１．１～１．６、及び１．１～１．５が例示される。本明細書において「total aa」 (「total AA」とも表記される。) とは、ペプチド化合物の核酸連結部以外のペプチド部位を構成するアミノ酸の数を意味する。例えば、環状部が１０個のアミノ酸からなり、核酸が連結していない直鎖部が１個のアミノ酸からなる環状ペプチド化合物のtotal aaは１１である。本明細書においてClogP/total aaとは、ClogPをtotal aaで除することにより算出される。」 本ｅ 「【０１１５】 上述の方法により算出したアミノ酸の側鎖の長さを表１－１および表１－２に示す。 【表１－１】 ［図：0001406724000003.jpg］ 【表１－２】 ［図：0001406724000004.jpg］ 」 本ｆ 「【０１８６】 ライブラリ 本開示におけるライブラリには、本開示におけるペプチド化合物を含むライブラリ、及び本開示におけるペプチド化合物をコードする核酸を含むライブラリが含まれる。本開示におけるライブラリには、本開示におけるペプチド化合物のライブラリ、ペプチド－核酸複合体のライブラリが含まれ、中でも環状ペプチド化合物、又は環状ペプチド－核酸複合代のライブラリが好ましく、特に環状ペプチド－ｍＲＮＡ複合体のライブラリが好ましい。ライブラリとしては、ディスプレイライブラリが好ましい。ディスプレイライブラリとしては、ディスプレイを利用したライブラリが例示され、中でもｍＲＮＡディスプレイライブラリ、ＤＮＡディスプレイライブラリ、リボソームディスプレイライブラリが好ましく、ｍＲＮＡディスプレイライブラリがより好ましい。」 本ｇ 「【０２１１】 本開示におけるライブラリにおいて、環状ペプチド化合物の「バリエーションの理論上の（総）数」を求める際、実際に環状ペプチド化合物として製造され得ないものは、理論上の（総）数には算入しない。例えば、以下（１）及び（２）のような場合には、該当するアミノ酸は翻訳合成されないことから、このようなアミノ酸を含むペプチド化合物は、理論上の（総）数に算入しない：（１）ペプチド化合物の材料として翻訳液中にアミノ酸が添加されていても、同アミノ酸をコードする核酸を鋳型として含まない場合；（２）ペプチド化合物の鋳型となる核酸には塩基配列を含むが、これに対応するアミノ酸を含まない翻訳液を使用する場合。また、環状ペプチド化合物を製造する過程での副反応物や未反応物が存在する場合には、これらは前記理論上の（総）数には算入しない。」 本ｈ 「【０２１４】 本開示におけるライブラリには、環状ペプチド化合物、又はこれらをコードする核酸が複数含まれる。本明細書において、ライブラリに含まれる環状ペプチド化合物のバリエーション（種類）の数のことを「多様性」という。本開示におけるライブラリに含まれる環状ペプチド化合物、又はこれらをコードする核酸の多様性は特に限定されないが、１０３以上、１０４以上、１０５以上、１０６以上、１０７以上、１０８以上、１０９以上、１０１０以上、１０１１以上、及び１０１２以上が例示される。これら多様性は、実測値に限定されるものではなく、理論値であってよい。」 本ｉ 「【０２２２】 ディスプレイライブラリ ディスプレイライブラリは表現型であるペプチドとその遺伝子型であるペプチドをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡが対応付けられているライブラリである。このライブラリを使用して、標的分子に特異的に結合できるペプチド化合物を同定することができる。例えば、所望の固定した標的にライブラリを接触させ、標的に結合しない分子を洗い流すことで、標的に結合するペプチドの濃縮が可能である(パニング法)。このような過程を経て選択されたペプチドに対応付けられている遺伝子情報を解析することで標的に結合したペプチドの配列を明らかにすることができる。例えば、アミノアシルｔＲＮＡのアナログである抗生物質ピューロマイシンがリボソームによるｍＲＮＡ翻訳伸長中の蛋白質に非特異的に連結されることを利用する方法がmRNAディスプレイ(Proc Natl Acad Sci USA. 1997;94:12297-302. RNA-peptide fusions for the in vitro selection of peptides and proteins. Roberts RW, Szostak JW.)ないしはin vitro virus(FEBS Lett. 1997;414:405-8. In vitro virus: bonding of mRNA bearing puromycin at the 3'-terminal end to the C-terminal end of its encoded protein on the ribosome in vitro. Nemoto N, Miyamoto-Sato E, Husimi Y, Yanagawa H.)として報告されている。 【０２２３】 Ｔ７プロモーターなどのプロモーターを含むＤＮＡライブラリから転写にて得たｍＲＮＡのライブラリの３'端にピューロマイシンなどのスペーサーを結合しておき、無細胞翻訳系でｍＲＮＡをタンパク質に翻訳させるとピューロマイシンがリボソームによってアミノ酸と間違ってタンパク質に取り込まれ、ｍＲＮＡとこれにコードされる蛋白質が連結され、ｍＲＮＡとその産物が対応付けられたライブラリになる。この過程では大腸菌などの形質転換を含まないため高い効率が実現され、大規模なディスプレイライブラリを構築することが出来る。パニングで濃縮、選択された分子についている遺伝子情報を含むタグであるｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ増幅し、塩基配列を解析することで結合した蛋白の配列を明らかにすることが出来る。」 本ｊ 「【０２２８】 ペプチド化合物、及びライブラリの製造方法 一実施態様において、本開示における製造方法には、ペプチド化合物、及びペプチド化合物を含むライブラリの製造方法が含まれる。これら製造方法としては、特に限定されないが、例えば化学合成、翻訳合成、又はこれらの組み合わせを利用することができる。」 本ｋ 「【０２２９】 ペプチド化合物の化学合成方法 本開示におけるペプチド化合物の化学合成方法としては、液相合成法、Fmoc合成やBoc合成等を用いた固相合成法、及びこれらの組み合わせ等が例示される。Fmoc合成では、主鎖アミノ基がFmoc基により保護され、側鎖官能基が必要に応じてピペリジンなどの塩基性で切断されない保護基で保護され、主鎖カルボン酸を保護しないアミノ酸を基本単位とする。基本単位としては、その他、Fmoc保護されたアミノ基とカルボン酸基を有する組み合わせであれば、特に限定されない。例えばジペプチドを基本単位としてもよい。Ｎ末端に配置させる基本単位は、Fmocアミノ酸以外であってもよい。例えば、Bocアミノ酸であってもよく、アミノ基を有しないカルボン酸類縁体であってもよい。主鎖カルボン酸基を固相担体の官能基との化学反応により固相に担持させる。続いてピペリジンやDBUなどの塩基によりFmoc基を脱保護し、新たに生じたアミノ基と続いて添加される基本単位のカルボン酸を有する保護アミノ酸とを縮合反応させることで、ペプチド結合を生成させる。縮合反応では、DICとHOBｔの組み合わせ、DICとHOAtの組み合わせ、HATUとDIPEAとの組み合わせなど様々な組み合わせが可能である。脱Fmoc基とそれに続くペプチド結合生成反応の繰り返しにより、望みのペプチド配列を生成させることができる。望みの配列が得られた後、固相からの切り出しと必要に応じて導入した側鎖官能基の保護基の脱保護が行われる。また、固相からの切り出しを行う前にペプチドの構造変換や環化を行うことも可能である。固相からの切り出しと、脱保護は同一の条件、例えば９０：１０のＴＦＡ／Ｈ２Ｏで行っても良いし、必要に応じて別々の条件で脱保護しても良い。固相からの切り出しは、１％ＴＦＡなどの弱酸での切り出しが可能なものもあれば、保護基としてＰｄなどを利用して、両者の化学反応の直行性を利用することが可能である。これらの工程の間もしくは最後に、環化などの工程を実施することもできる。例えば、側鎖カルボン酸とＮ末端主鎖のアミノ基とを縮合させることや、側鎖アミノ基とＣ末端主鎖のカルボン酸を縮合させることができる。この際、Ｃ末端側のカルボン酸と環化させる側鎖カルボン酸の間、もしくはＮ末端側の主鎖アミノ基またはヒドロキシ基と環化させる側鎖アミノ基の間で反応直行性が必要であり、前述のとおり保護基の直行性を考慮して保護基の選択が行われる。このようにして得られた反応物を逆相カラムや、分子ふるいカラムなどで精製することができる。これらの詳細は、例えばメルク株式会社が平成14年5月1日に発行した固相合成ハンドブックなどに記載されている。 【０２３０】 ペプチド化合物の翻訳合成方法 本開示におけるペプチド化合物の翻訳合成方法としては、無細胞翻訳系を用いて合成する方法が例示され、同方法には再構成無細胞翻訳系による合成法が含まれる。排除したい因子を除くことができる点で、再構成無細胞翻訳系を利用するのが好ましい。 【０２３１】 一局面において、本開示は、表２－１～表２－６に記載されたアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１種、２種以上、又は３種以上のアミノ酸を含むペプチド化合物の翻訳合成方法を提供する。限定はされないが、このような翻訳合成方法は、以下(i)および(ii)を含んでよい： (i) 表２－１～表２－６に記載されたアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１種、２種以上、又は３種以上のアミノ酸が結合したtRNAを用意する工程； (ii) 前記tRNAのアンチコドンに対応するコドンを少なくとも１つ含む核酸を無細胞翻訳系で翻訳し、前記ペプチド化合物を得る工程。 非限定の一態様において、本開示における翻訳合成方法は、環状ペプチド化合物の翻訳合成方法であってよい。 【０２３２】 無細胞翻訳系 本明細書において「無細胞翻訳系」とは、細胞より抽出したリボソームの他、翻訳に関与する蛋白因子群、ｔＲＮＡ、アミノ酸、ＡＴＰなどのエネルギー源、その再生系を組み合わせたもので、ｍＲＮＡを蛋白質に翻訳することが出来るものであれば限定されない。また、翻訳合成反応が進行している間の系も、本明細書における「無細胞翻訳系」に含まれてよい。本明細書における無細胞翻訳系は、ペプチドを翻訳する際の鋳型となる核酸を含んでいてよく、これら以外にも、開始因子、伸長因子、解離因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素などを含むことができる。これらの因子は、種々の細胞の抽出液から精製することによって得ることができる。因子を精製するための細胞は、例えば原核細胞、または真核細胞を挙げることができる。原核細胞としては、大腸菌細胞、高度好熱菌細胞、または枯草菌細胞を挙げることができる。真核細胞としては、酵母細胞、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、植物細胞、昆虫細胞、または動物細胞を材料にしたものが知られている。またｔＲＮＡやアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ARS）は天然に存在するものに加え、人工ｔＲＮＡや非天然アミノ酸を認識する人工アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を用いることもできる。人工ｔＲＮＡや人工アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を用いることにより部位特異的に非天然アミノ酸を導入したペプチドを合成することができる。なお、必要に応じて、無細胞翻訳系にT7 RNA polymeraseなどのRNAポリメラーゼを加えることで、鋳型DNAから転写させることもできる。 【０２３３】 本明細書において、「無細胞翻訳系がある物質を含む」とは、翻訳合成の開始時に該物質を含んでいなくても、翻訳合成の過程において系内で該物質が合成され含まれることになる態様も含む。例えば、翻訳合成の過程で、アミノ酸がアシル化されたｔＲＮＡが合成される場合には、無細胞翻訳系が該アミノアシルｔＲＮＡを含むと理解される。 【０２３４】 PURESYSTEM（登録商標）(BioComber, Japan)は大腸菌の翻訳に必要な蛋白因子類、エネルギー再生系酵素、リボソームそれぞれを抽出、精製し、tRNA、アミノ酸、ATP、GTPなどと混合した再構成無細胞翻訳系である。不純物の含有量が少ないだけでなく、再構成系であるため排除したい蛋白因子、アミノ酸を含まない系を容易に作製することができる。((i)Nat Biotechnol. 2001;19:751-5. Cell-free translation reconstituted with purified components. Shimizu Y, Inoue A, Tomari Y, Suzuki T, Yokogawa T, Nishikawa K, Ueda T.(ii)Methods Mol Biol. 2010;607:11-21.PURE technology.Shimizu Y, Ueda T.)。 【０２３５】 例えば、非天然アミノ酸を導入するコドンとして終止コドンを利用する方法が多く報告されているが、前述のPURESYSTEMを用いることで天然アミノ酸、ARSを除いた合成系を構築できる。これにより、除外する天然アミノ酸をコードするコドンに、非天然アミノ酸を対応付けることが出来る(J Am Chem Soc. 2005;127:11727-35.Ribosomal synthesis of unnatural peptides. Josephson K, Hartman MC, Szostak JW.)。さらにコドンの縮重を解くことにより天然アミノ酸を除外することなく非天然アミノ酸を加えることが出来る（Kwon I,et al. Breaking the degeneracy of the genetic code. J Am Chem Soc. 2003, 125, 7512-3.）。N-メチルアミノ酸を含むペプチドがPURESYSTEMなどの無細胞翻訳系の活用によりリボソームにて合成できる。 【０２３６】 より具体的には、翻訳合成は、例えば、大腸菌の翻訳に必要な蛋白因子類（メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ、EF-G、RF1、RF2、RF3、RRF、IF1、IF2、IF3、EF-Tu、EF-Ts、ARS（AlaRS、ArgRS、AsnRS、AspRS、CysRS、GlnRS、GluRS、GlyRS、HisRS、IleRS、LeuRS、LysRS、MetRS、PheRS、ProRS、SerRS、ThrRS、TrpRS、TyrRS、ValRSから必要なものを選ぶ））、リボソーム、アミノ酸、クレアチンキナーゼ、ミオキナーゼ、無機ピロフォスファターゼ、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、E. coli 由来tRNA、クレアチンリン酸、グルタミン酸カリウム、HEPES-KOH pH7.6、酢酸マグネシウム、スペルミジン、ジチオスレイトール、GTP、ATP、CTP、UTPなどを適宜取捨選択して混合したPURESYSTEM等の公知の無細胞翻訳系にmRNAを加えることによって行うことが出来る。また、T7 RNA polymeraseを加えておけば、T7プロモーターを含む鋳型DNAからの転写、翻訳を共役して行なうこともできる。また、所望のアミノアシルtRNA群やアミノアシルtRNA合成酵素（ARS）が許容する非天然アミノ酸群（例えばF-Tyr）を系に添加することによって非天然アミノ酸を含むペプチド化合物を翻訳合成することが出来る（Kawakami T, et al. Ribosomal synthesis of polypeptoids and peptoid-peptide hybrids. J Am Chem Soc. 2008, 130, 16861-3., Kawakami T, et al. Diverse backbone-cyclized peptides via codon reprogramming. Nat Chem Biol. 2009, 5, 888-90.）。さらに、天然のARSに代えて又はこれら加えて、ARSの改変体を系に含めるとともに、非天然アミノ酸群を系に含めることによっても、非天然アミノ酸を含むペプチド化合物を翻訳合成することが出来る。あるいは、リボソームやEF-Tuなどの変異体を利用することによって非天然アミノ酸の翻訳導入の効率を高めることも出来る(Dedkova LM, et al. Construction of modified ribosomes for incorporation of D-amino acids into proteins. Biochemistry. 2006, 45, 15541-51., Doi Y, et al. Elongation factor Tu mutants expand amino acid tolerance of protein biosynthesis system. J Am Chem Soc. 2007, 129, 14458-62., Park HS, et al. Expanding the genetic code of Escherichia coli with phosphoserine. Science. 2011, 333, 1151-4.)。 【０２３７】 非限定の一態様において、本開示にける無細胞翻訳系（「本開示における翻訳系」ともいう。）は、ペプチド化合物を製造するための翻訳系であってよく、好ましくは環状ペプチド化合物を製造するための翻訳系である。 【０２３８】 非限定の一態様において、本開示におけ翻訳系は、以下（ａ）～（ｃ）からなる群より選択される少なくとも一つ、二つ、又はすべてを実質的に含まない無細胞翻訳系であってよい：（ａ）側鎖にインドール骨格を有するアミノ酸、又は該アミノ酸をコードする核酸；（ｂ）側鎖に２以上の芳香環による縮環構造を有するアミノ酸、又は該アミノ酸をコードする核酸；及び（ｃ）側鎖に置換又は無置換のヒドロキシフェニル基を有するアミノ酸、又は該アミノ酸をコードする核酸。非限定の一態様において、本開示におけ翻訳系は、以下（ｄ）～（ｆ）からなる群より選択される少なくとも一つ、二つ、又はすべてを実質的に含まない無細胞翻訳系であってよい：（ｄ）側鎖にインドール骨格を有するアミノ酸をコードする核酸；（ｅ）側鎖に２以上の芳香環による縮環構造を有するアミノ酸をコードする核酸；及び（ｆ）側鎖に置換又は無置換のヒドロキシフェニル基を有するアミノ酸をコードする核酸。非限定の一態様において、本開示におけ翻訳系は、以下（ｇ）～（ｉ）からなる群より選択される少なくとも一つ、二つ、又はすべてを実質的に含まない無細胞翻訳系であってよい：（ｇ）側鎖にインドール骨格を有するアミノ酸；（ｈ）側鎖に２以上の芳香環による縮環構造を有するアミノ酸；及び（ｉ）側鎖に置換又は無置換のヒドロキシフェニル基を有するアミノ酸。なお、翻訳系にあるアミノ酸や核酸が含まれていたとしても、翻訳合成に利用されないような態様で含まれている場合には、該翻訳系は、該アミノ酸や該核酸を実質的に含まないと理解される。例えば、アミノ酸は存在するものの、対応するＡＲＳが含まれていないために、該アミノ酸が翻訳合成に利用されないような場合等が挙げられる。非限定の一態様において、前記「２以上の芳香環による縮環構造」は、「縮環構造」であってもよい。 【０２３９】 非限定の一態様において、本開示における翻訳系は、該翻訳系が酸性の側鎖を有するアミノ酸がアシル化されたｔＲＮＡ、及び該アミノ酸をコードする核酸を含む場合、該アミノ酸の側鎖のpKaが3.5～10であってよい。一態様において、前記pKaは、３．５～１０、３．９～１０、４．５～１０、５．０～１０，又は５．５～１０，５．７～１０の範囲が好ましく例示される。これらpKaを計算pKaであらわすと、３．５～１０、４．５～１０、５．０～１０，５．４～１０，８．０～１０，又は８．３～１０の範囲が好ましく例示される。 【０２４０】 非限定の一態様において、本開示における翻訳系は、該翻訳系が塩基性の側鎖を有するアミノ酸がアシル化されたｔＲＮＡ、及び該アミノ酸をコードする核酸を含む場合、該アミノ酸の側鎖のBasic pKaが4.0～10であってよい。一態様において、前記Basic pKaは４．０～１０、４．０～９．５、４．０～９．０、４．０～８．５、４．０～７．５、４．０～７．２、４．０～６．５の範囲が好ましく例示される。これらpKaを計算pKaであらわすと、４．０～１０、４．０～９．５、４．０～９．０、４．０～８．８，４．０～８．６，４．０～８．５、４．０～７．５、４．０～６．５の範囲が好ましく例示される。 【０２４１】 非限定の一態様において、本開示における翻訳系は、例えば長さが5.4～13、又は5.4～10オングストロームの長側鎖を有するアミノ酸を含んでいてよい。一態様における前記「長側鎖」は、「ペプチド化合物」の項目に記載したとおりであってよい。一態様において、長側鎖の少なくとも一種、又は二種以上が、芳香環を有する側鎖であってもよい。 【０２４２】 非限定の一態様において、本開示における翻訳系は、５～３２種類、５～２８種類、又は５～２０種類の非天然アミノ酸を含んでいてよく、８～２０種類、１０～２０種類、１３～２０種類が好ましく例示される。一態様において、本開示における翻訳系に含まれるアミノ酸の種類の数のうち、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上が非天然アミノ酸であってよい。 【０２４３】 非限定の一態様において、本開示における翻訳系は、５～２８種類、又は５～２０種類のＮ置換アミノ酸を含んでいてよく、５～１８種類、５～１５種類が好ましく例示される。一態様において、本開示における翻訳系に含まれるアミノ酸の種類の数のうち、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上がＮ置換アミノ酸であってよい。ここでのＮ置換アミノ酸は、Ｎ－アルキルアミノ酸、又はＮ－メチルアミノ酸を意味してもよいが、その場合であっても、本開示における翻訳系に他のＮ置換アミノ酸が含まれることを否定するものではない。 【０２４４】 非限定の一態様において、本開示における翻訳系は、該翻訳系を用いて製造される環状ペプチド化合物に含まれる芳香環の数の平均が一定の範囲内となるように調整されていてもよい。例えば、翻訳合成される環状ペプチド化合物において、環状部を構成するアミノ酸の数に占める芳香環を有するアミノ酸の数の割合の平均が４０％以下、３５％以下、３０％以下、２７％以下、２５％以下、若しくは２０％以下になるように、又は、８～１１個のアミノ酸から構成される環状部を有する環状ペプチド化合物の環状部の側鎖に含まれる芳香環の数の平均が０～３になるように、本開示における翻訳系を調整してよい。調整方法は特に限定されないが、例えば、翻訳系に含まれるアミノ酸の種類の数に占める芳香環を有するアミノ酸の種類の数を調整することが挙げられる。 【０２４５】 非限定の一態様において、本開示における翻訳系は、芳香環を有するアミノ酸を含んでいてよく、翻訳系に含まれるアミノ酸の種類の数に占める芳香環を有するアミノ酸の種類の数の割合は４０％以下が好ましく、３５％以下、３０％以下、２７％以下、２５％以下、２０％以下が好ましく例示される。 【０２４６】 非限定の一態様において、本開示における無細胞翻訳系は、表２－１～表２－６に記載されたアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１種、２種以上、又は３種以上のアミノ酸を含むペプチド化合物を製造するための無細胞翻訳系であってよい。限定はされないが、このような無細胞翻訳系は、以下(i)および(ii)を含んでよい： (i) 表２－１～表２－６に記載されたアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１種、２種以上、又は３種以上のアミノ酸が結合したtRNA； (ii) 前記ペプチド化合物をコードする核酸、 ここで該核酸は前記tRNAのアンチコドンに対応するコドンを少なくとも１つ含んでよい。」 本ｌ 「【０２５０】 ペプチド部位の環化方法 非限定的な一態様において、本開示におけるペプチド化合物のペプチド部位は、環状部を有することが好ましい。ペプチド化合物の環化方法は特に限定されないが、例えば、化学合成、又は翻訳合成等によりペプチド化合物を合成した後に、環化反応を行うことができる。例えば、アミド結合、炭素－炭素結合、チオエーテル結合、ジスルフィド結合、エステル結合、チオエステル結合、ラクタム結合、トリアゾール構造を介した結合、フルオロフォア構造を介した結合等を利用した環化が挙げられる。ペプチド化合物の合成工程と環化反応の工程は、分離していても、連続して進行してもよい。環化は、例えばWO2013/100132、WO2008/117833、WO2012/074129等に記載された当業者に公知の方法により行うことができる。 【０２５１】 環化部としては、限定されないが、ペプチドのN末端とC末端の結合、ペプチドのN末端と他のアミノ酸残基の側鎖の結合、ペプチドのC末端と他のアミノ酸残基の側鎖の結合、又はアミノ酸残基の側鎖同士の結合のいずれであってもよく、これらの二以上を組み合わせて使用してもよい。C末端側に核酸が連結されているペプチド－核酸複合体を環化させる場合には、ペプチドのN末端と他のアミノ酸残基の側鎖の結合、又はアミノ酸残基の側鎖同士の結合であってよい。 【０２５２】 非限定の一態様において本開示における環状ペプチド化合物は、以下の方法により製造できる。例えば、以下の工程を含む製造方法を挙げることができる： （１）アミノ酸残基、もしくは、アミノ酸残基及びN末端カルボン酸類縁体により構成される非環状のペプチド化合物を、該ペプチド化合物をコードする核酸から翻訳して合成する工程であって、該非環状のペプチド化合物は、C末端側に側鎖の１つに反応点を有するアミノ酸残基、及び、N末端側にもう1つの反応点を有するアミノ酸残基又はN末端カルボン酸類縁体を含む、工程；及び （２）N末端側のアミノ酸残基、又はN末端カルボン酸類縁体の反応点と、C末端側の側鎖に有するアミノ酸残基の反応点とを結合させ、アミド結合、炭素-炭素結合又はチオエーテル結合を形成させる工程。 なお、これら（１）と（２）の工程は、分離していても、連続して進行してもよい。 【０２５３】 アミド結合によるペプチド化合物の環化方法の非限定的な一態様として、Ｎ末端にシステインまたはシステイン類縁体を持ち、Ｃ末端側のアミノ酸の側鎖に活性エステルを持つペプチド化合物を翻訳してネイティブケミカルライゲーションを用いて環化させる方法がある。この環状ペプチド化合物の前駆体であるＮ末端にシステインまたはシステイン類縁体を持つペプチド化合物を翻訳合成する方法は特に制限されない。」 本ｍ 「【０２５９】 ライブラリの製造方法 非限定の一態様において、本開示におけるライブラリを製造する際は、所望の特性に寄与する構成アミノ酸を含ませるとともに、好ましくない性質を有する構成アミノ酸を含ませないことが好ましい。また、一態様においては、できる限りライブラリの多様性を拡大することが望ましい。具体的には、以下（１）～（４）からなる群より選択される少なくとも一つに寄与し得るアミノ酸を構成アミノ酸として含めるのが好ましい：（１）標的分子と特異的に結合できるペプチド化合物のヒット率向上；（２）標的分子との結合親和性増大；（３）代謝安定性増大；及び（４）膜透過性増大。一方で、前記（１）～（４）からなる群より選択される少なくとも一つに対して負の影響を与え得るアミノ酸は構成アミノ酸に含めないことが好ましい。 【０２６０】 非限定の一態様において、本開示におけるライブラリの製造は、上述した本開示におけるペプチド化合物の製造方法に準じて行うことができ、適宜公知の方法と組み合わせることができる。一態様において、上述した本開示における無細胞翻訳系を使用して本開示におけるペプチド化合物のライブラリを製造できる。すなわち、本開示におけるライブラリの製造方法には、本開示における無細胞翻訳系を使用してペプチド化合物を合成する工程を含んでよい。一態様において、本開示における無細胞翻訳系において記述した、例示、好ましい範囲、態様が、本開示におけるライブラリの製造方法においてもそのまま適用できる。 【０２６１】 非限定の一態様において、本開示におけるペプチド化合物のライブラリの製造方法は、以下（ａ）の工程を含んでよい：（ａ）側鎖にインドール骨格を有するアミノ酸を実質的に含まないアミノ酸プールを用意し、該プールに含まれるアミノ酸の一部又は全部を構成アミノ酸としてペプチド化合物を合成する工程。また、一態様において、本開示におけるペプチド化合物のライブラリの製造方法は、以下（ｂ）の工程を含んでよい：（ｂ）側鎖にインドール骨格を有するアミノ酸をコードする核酸を実質的に含まない鋳型プールを用意し、該鋳型プールからペプチド化合物を合成する工程。 【０２６２】 本明細書において、アミノ酸プールがあるアミノ酸を含んでいても、そのアミノ酸が翻訳合成に利用されない態様で含まれる場合や極少量しか含まれない場合には、該アミノ酸プールは該アミノ酸を実質的に含まないと理解される。例えば、アミノ酸プールがあるアミノ酸を含んでいても、該アミノ酸に対応するARSを含まないために該アミノ酸が翻訳合成に利用されないような場合には、該アミノ酸プールは、該アミノ酸を実質的に含んでいないと理解される。なお、ARSを含まなくても、翻訳合成に利用される態様で該当するアミノ酸が含まれていれば、アミノ酸プールに該アミノ酸が含まれると理解される。 【０２６３】 本明細書において、鋳型プールがあるアミノ酸をコードする核酸を含んでいても、該アミノ酸が翻訳合成に利用されない態様で該核酸が含まれる場合や極少量しか含まれない場合には、該鋳型プールは該核酸を実質的に含まないと理解される。 【０２６４】 非限定の一態様において、前記工程（ａ）及び（ｂ）のプールは、それぞれ、側鎖に２以上の芳香環による縮環構造を有するアミノ酸、及び該アミノ酸をコードする核酸、を実質的に含まないプールであってよい。一態様において、前記工程（ａ）及び（ｂ）のプールは、それぞれ、側鎖に置換又は無置換のヒドロキシフェニル基を有するアミノ酸、及び該アミノ酸をコードする核酸、を実質的に含まないプールであってよい。非限定の一態様において、前記「２以上の芳香環による縮環構造」は、「縮環構造」であってもよい。 【０２６５】 非限定の一態様において、前記ペプチド化合物の合成の際に使用されるアミノ酸プールに酸性の側鎖を有するアミノ酸が含まれ、かつ鋳型プールに該アミノ酸をコードする核酸が含まれてもよく、この場合、該アミノ酸の側鎖のpKaは３．５～１０、３．９～１０、４．５～１０、５．０～１０，又は５．５～１０，５．７～１０の範囲が好ましく例示される。これらpKaを計算pKaであらわすと、３．５～１０、４．５～１０、５．０～１０，５．４～１０，８．０～１０，又は８．３～１０の範囲が好ましく例示される。 【０２６６】 非限定の一態様において、前記ペプチド化合物の合成の際に使用されるアミノ酸プールに塩基性の側鎖を有するアミノ酸が含まれ、かつ鋳型プールに該アミノ酸をコードする核酸が含まれてもよく、この場合、該アミノ酸の側鎖のBasic pKaは４．０～１０、４．０～９．５、４．０～９．０、４．０～８．５、４．０～７．５、４．０～７．２、４．０～６．５の範囲が好ましく例示される。これらpKaを計算pKaであらわすと、４．０～１０、４．０～９．５、４．０～９．０、４．０～８．８，４．０～８．６，４．０～８．５、４．０～７．５、４．０～６．５の範囲が好ましく例示される。 【０２６７】 非限定の一態様において、前記ペプチド化合物の合成の際に使用されるアミノ酸プールは、上述の長側鎖を有するアミノ酸を含んでいてよい。該「長側鎖」には、上述の例示、好ましい範囲、態様に関する記述がそのまま適用できる。一態様において、前記アミノ酸プールに含まれる長側鎖の少なくとも一種、二種、又は三種以上が、芳香環を有する側鎖であってもよい。 【０２６８】 非限定の一態様において、前記ペプチド化合物の合成の際に使用されるアミノ酸プールは、上述の非天然アミノ酸、Ｎ置換アミノ酸、及び芳香環を有するアミノ酸を含んでいてよく、「無細胞翻訳系」の項目に記載した例示、好ましい範囲、態様がそのまま適用できる。前記アミノ酸プールに含まれるアミノ酸の種類の数に占める、非天然アミノ酸、Ｎ置換アミノ酸、又は芳香環を有するアミノ酸の種類の数の割合は、本開示における翻訳系におけるそれらの割合と同様に選択されてよい。 【０２６９】 ｍＲＮＡディスプレイライブラリは、非限定の一態様において、以下のように製造することができる。まずＴ７プロモーターなどのプロモーターの下流に所望の配列を配置したＤＮＡのライブラリを化学合成し、これを鋳型にプライマー伸長反応にて二本鎖ＤＮＡにする。これを鋳型にT7 RNApolymeraseなどのRNAポリメラーゼを用いてｍＲＮＡに転写する。このＲＮＡの３'末端にアミノアシルｔＲＮＡのアナログである抗生物質ピューロマイシンなどがつながったリンカー（スペーサー）を結合させる。これを上記のPURESYSTEMなど公知の無細胞翻訳系に加え、保温することによってｍＲＮＡが翻訳され、ｍＲＮＡとこれにコードされるペプチドがピューロマイシンなどを含むリンカーを介して連結される。このようにしてｍＲＮＡとその産物が対応付けられたｍＲＮＡとその産物の複合体からなるディスプレイライブラリを構築することが出来る。リンカーはさらに、当業者に周知のスペーサーを含むことができる。また、必要に応じて、上述の方法や公知の方法により、環化等の翻訳後修飾を行うことができる。 【０２７０】 非限定の一態様において、本開示におけるライブラリは、表２－１～表２－６に記載されたアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１種、２種以上、又は３種以上のアミノ酸を含むペプチド化合物を含むペプチド化合物ライブラリであってよい。このようなライブラリの製造方法としては、以下(i)および(ii)を含む無細胞翻訳系でペプチド化合物を翻訳合成する工程を含んでよい： (i) 表２－１～表２－６に記載されたアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１種、２種以上、又は３種以上のアミノ酸が結合したtRNA； (ii) 前記ペプチド化合物ライブラリをコードする核酸ライブラリ、 ここで該核酸ライブラリには前記tRNAのアンチコドンに対応するコドンを少なくとも１つ含む核酸が含まれてよい。」 本ｎ 「【０２７２】 非限定の一態様において、本開示におけるスクリーニング方法は、本開示における環状ペプチド化合物のライブラリと標的分子を接触させ、標的分子に結合しないペプチド化合物を洗い流すことで標的分子に結合するペプチド化合物を濃縮することができる（パニング）。一態様においては、このようにして選択されたペプチド化合物に含まれる塩基配列情報を含むタグであるｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ増幅し、塩基配列を解析することで、結合したペプチドのアミノ酸配列を明らかにすることができる。なお、一態様において、上記で増幅されたｃＤＮＡを転写することによって、ｍＲＮＡライブラリを得てもよく、これらを鋳型として再度ペプチド化合物のライブラリを製造してもよい。このライブラリは標的分子に結合できるペプチド化合物が濃縮されているため、このライブラリを用いて再度パニングを行うことで、標的分子に特異的に結合できるペプチド化合物を、より濃縮することができる。この工程を複数回繰り返すことにより、目的のペプチド化合物を、更に濃縮することができる。一態様において、このようにして濃縮されたペプチド化合物に含まれる塩基配列情報を基にアミノ酸配列を同定し、標的分子に特異的に結合できるペプチド化合物を製造することができる。一態様において、本開示におけるスクリーニング方法は、in vitroで行うことができる。」 本ｏ 「【０２９６】 実施例１ ペプチド化合物の化学合成 ＷＯ２０１３／１００１３２に記載のＦｍｏｃ法によるペプチド合成法に従い、下記の基本ルートでペプチドの伸長を行った。すなわち、１）Ａｓｐ側鎖のカルボン酸を２－クロロトリチルレジンに担持させたものの、ＡｓｐのＮ末からのＦｍｏｃ法によるペプチド伸長反応、２）２－クロロトリチルレジンからのペプチドの切り出し過程、３）切り出し過程によって２－クロロトリチルレジンから外れて生じたＡｓｐ側鎖のカルボン酸と、ペプチド鎖Ｎ末端（三角ユニット）のアミノ基との縮合によるアミド環化、４）ペプチド鎖に含む側鎖官能基の保護基の脱保護、５）ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅＨＰＬＣによる化合物の精製、の５段階の工程である。本実施例において、特に記述がない限り、この基本ルートをもとにペプチド化合物の合成をおこなった。 ［図：0001406724000005.jpg］ ・・・ 【０５２２】 １－４．ペプチドの化学合成 特別な記載がない限り、ｐｄ５０～ｐｄ７０、ｐｄ１００～ｐｄ２４７、およびｐｄ３００～ｐｄ５０４のペプチド化合物の合成は実施例１の冒頭に記載した基本ルートで、以下の方法にて行った。 １）自動合成機によるペプチド固相合成 ＷＯ２０１３／１００１３２に記載の方法にてペプチド合成機（ＭｕｌｔｉｐｅｐＲＳ；Ｉｎｔａｖｉｓ社製）を用いて、Ｆｍｏｃ法によりペプチド合成を行った。なお、操作の詳細な手順については合成機に付属のマニュアルに従った。 【０５２３】 合成機にＮ末端がＦｍｏｃで保護されたアスパラギン酸の側鎖カルボン酸部位が結合した２－クロロトリチルレジン（１カラムあたり１００ｍｇ）と、各種Ｆｍｏｃ－アミノ酸（０．６ｍｏｌ／Ｌ、Ｆｍｏｃ－ＭｅＨｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（化合物ａａ０５）の場合は下記の方法で塩酸塩とした後、０．５ｍｏｌ／Ｌの溶液として用いた）と１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）もしくはｏｘｙｍａ（０．３７５ｍｏｌ／Ｌ）のＮＭＰ溶液と、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液（１０％ｖ／ｖ）をセットした。Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ＴＨＰ）－ＯＨ（化合物ａａ０１）、Ｆｍｏｃ－ＭｅＳｅｒ（ＴＨＰ）－ＯＨ（化合物ａａ０６）はＮＭＰ溶液においてｏｘｙｍａと共存させ、さらにモレキュラシーブス４Ａ１／８（和光純薬工業）もしくはモレキュラシーブス４Ａ１／１６（和光純薬工業）を添加してセットした。また、使用するアミノ酸が塩酸塩などの塩（例えばＦｍｏｃ－ＭｅＨｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（化合物ａａ０５）の塩酸塩）を用いる場合、ＤＩＰＥＡ／ＤＭＦ＝３／１の溶液をセットし、ペプチド伸長の際に使用するアミノ酸に対して、０．９６等量分のＤＩＰＥＡを上記のＤＭＦ溶液として別途添加した。 【０５２４】 Ｆｍｏｃ－ＭｅＨｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（化合物ａａ０５）の塩酸塩は下記の方法で調製した。 Ｆｍｏｃ－ＭｅＨｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（化合物ａａ０５）（１．１６６ｇ）にＤＣＭ（１０．５ｍＬ）を加え、０℃にて４ＮのＨＣｌ／１，４－ｄｉｏｘａｎｅ（０．８８ｍＬ）をＤＣＭ（５．３ｍＬ）で希釈した溶液を滴下しながら加えた。その後、反応液を０℃にて５分間撹拌し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下濃縮した。得られた残渣をオイルポンプを用いて減圧下乾燥させることでＦｍｏｃ－ＭｅＨｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（化合物ａａ０５）を塩酸塩として得た。その後、ＮＭＰ（２．２１ｍＬ）を加え、０．５ｍｏｌ／Ｌの溶液として調整した。 Ｆｍｏｃ脱保護溶液としてジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）のＤＭＦ溶液（２％ｖ／ｖ）を用いて合成を行った。レジンはＤＭＦにて洗浄した後、Ｆｍｏｃ脱保護に次いでＦｍｏｃアミノ酸の縮合反応を１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことでレジン表面上にペプチドを伸長させた。ペプチド伸長完了後、レジンのＮ末端のＦｍｏｃ基の除去をペプチド合成機上にて行った後、レジンをＤＭＦにて洗浄した。 【０５２５】 ２）伸長したペプチドのレジンからの切り出し ＷＯ２０１３／１００１３２に記載の方法にて、上記の方法によって得られた固相上に担持された鎖状ペプチドに対し、ＤＣＭを加えレジンを再膨潤させた後、レジンに２，２，２－トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）／ＤＣＭ（１／１，ｖ／ｖ，２ｍＬ）を加えて室温にて２時間振とうした。続いてチューブ内の溶液を合成用カラムでろ過することによりレジンを除き、残ったレジンをさらに２，２，２－トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）／ＤＣＭ（１／１，ｖ／ｖ，１ｍＬ）にて２回洗浄した。得られた全ての切り出し溶液を混合し、減圧下濃縮した。 【０５２６】 ３）切り出したペプチドの環化法 切り出し後に減圧下濃縮した残渣をＤＭＦ／ＤＣＭ（１／１，ｖ／ｖ，８ｍＬ）に溶解した。０．５ＭのＯ－（７－アザ－１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）／ＤＭＦ溶液（用いたレジン上のモル数（ローディング量（ｍｍｏｌ／ｇ）に使用したレジン量（通常は０．１０ｇ）をかけたもの）に対して１．５等量となる容量）と、ＤＩＰＥＡ（用いたレジン上のモル数に対して１．８等量）を加え、室温にて２時間振とうした。その後、減圧下溶媒を留去した。目的の環状ペプチドの生成はＬＣＭＳ測定によって確認した。 【０５２７】 ４）５）環状ペプチドが有する側鎖官能基の保護基の脱保護 配列中にＴｙｒ（３－Ｆ，ｔＢｕ）を含む場合には、調製した０．１Ｍの硫酸水素テトラメチルアンモニウム／１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロイソプロピルアルコール（ＨＦＩＰ）溶液（２％トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ））を２ｍＬ加え、残渣を溶解させた後、室温もしくは３０度にて２４時間静置した。配列中にＴｙｒ（３－Ｆ）を含まない場合には、調製した０．０５Ｍの硫酸水素テトラメチルアンモニウム／１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロイソプロピルアルコール（ＨＦＩＰ）溶液（２％トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ））を４ｍＬ加え、残渣を溶解させた後、室温にて４時間静置した。いずれの場合においても、一定時間静置した後、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（７０μＬ）を加え、減圧下溶媒を留去した。 【０５２８】 減圧下、溶媒を留去した後、ＤＭＦもしくはＤＭＳＯを加え、不溶物をフィルターろ過にて取り除いた後、ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ－ＨＰＬＣで精製した。 なお、０．１Ｍの硫酸水素テトラメチルアンモニウム／ＨＦＩＰ溶液（２％ＴＩＰＳ）、は、ＨＦＩＰ（１１．６６ｍＬ）、ＴＩＰＳ（０．２４ｍＬ）、ＤＣＥ（０．１０ｍＬ）を混合した溶液から４ｍＬを抜き取り、これに６８．５ｍｇの硫酸水素テトラブチルアンモニウムを溶解させて調製した。また、０．０５Ｍの硫酸水素テトラメチルアンモニウム／ＨＦＩＰ溶液（２％ＴＩＰＳ）は、ＨＦＩＰ（１１．６６ｍＬ）、ＴＩＰＳ（０．２４ｍＬ）、ＤＣＥ（０．１０ｍＬ）を混合した溶液から４ｍＬを抜き取り、これに３４．３ｍｇの硫酸水素テトラブチルアンモニウムを溶解させて調製した。これらの溶液（０．１Ｍの硫酸水素テトラメチルアンモニウム／ＨＦＩＰ溶液（２％ＴＩＰＳ）及び０．０５Ｍの硫酸水素テトラメチルアンモニウム／ＨＦＩＰ溶液（２％ＴＩＰＳ））はＨＦＩＰの代わりに別のフルオロアルコール、例えば２，２，２－トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）なども用いることができる。」 本ｐ 「【０５３３】 実施例２ ペプチド化合物の翻訳合成 ・・・ 【０８３５】 ２－３．ペプチド化合物の翻訳合成 様々なアミノ酸によりアミノアシル化されたｔＲＮＡを、無細胞翻訳系に加えて翻訳を開始することにより、所望の非天然アミノ酸を含有するペプチド化合物の翻訳合成を行った。翻訳系は、原核生物由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、翻訳液（１ｍＭＧＴＰ，１ｍＭＡＴＰ，２０ｍＭクレアチンリン酸，５０ｍＭＨＥＰＥＳ－ＫＯＨｐＨ７．６，１００ｍＭ酢酸カリウム，１０ｍＭ酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌＥ．ｃｏｌｉＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．１ｍＭ１０－ＨＣＯ－Ｈ４ｆｏｌａｔｅ，０．６μＭメチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ，０．２６μＭＥＦ－Ｇ，０．２４μＭＲＦ２，０．１７μＭＲＦ３，０．５μＭＲＲＦ，４μｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭＩＦ１，０．４μＭＩＦ２，１．５μＭＩＦ３，４０μＭＥＦ－Ｔｕ，２８μＭＥＦ－Ｔｓ，１．２μＭリボソーム，０．７３μＭＡｌａＲＳ，０．０３μＭＡｒｇＲＳ，０．３８μＭＡｓｎＲＳ，０．１３μＭＡｓｐＲＳ，０．０２μＭＣｙｓＲＳ，０．０６μＭＧｌｎＲＳ，０．２３μＭＧｌｕＲＳ，０．０９μＭＧｌｙＲＳ，０．０２μＭＨｉｓＲＳ，０．４μＭＩｌｅＲＳ，０．０４μＭＬｅｕＲＳ，０．１１μＭＬｙｓＲＳ，０．０３μＭＭｅｔＲＳ，０．６８μＭＰｈｅＲＳ，０．１６μＭＰｒｏＲＳ，０．０４μＭＳｅｒＲＳ，０．０９μＭＴｈｒＲＳ，０．０３μＭＴｒｐＲＳ，０．０２μＭＴｙｒＲＳ，０．０２μＭＶａｌＲＳ）に、鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１２）、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ならびにアミノアシル化ｔＲＮＡを翻訳反応混合物に添加し、３７℃で３０分から１時間静置することで行った。翻訳産物はマトリックスとしてα－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸を用いてＭＡＬＤＩ－ＭＳスペクトルを測定して同定した。 【０８３６】 ２－４．非天然アミノ酸を含むペプチド化合物の翻訳合成 １μＭの鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１２）に、各０．２５ｍＭのＬｅｕを除く１９種類のタンパク質を構成するアミノ酸（Ａｌａ，Ａｒｇ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｃｙｓ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ、Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，ＴｙｒおよびＶａｌ）、２０μＭのアシル化ｔＲＮＡを含む前述の転写翻訳液、Ｆ－Ｐｎａｚ保護を持つ非天然アミノ酸を翻訳する場合は０．５μＭ大腸菌由来ペニシリンＧアミダーゼ（ＰＧＡ）を加え、３７℃で６０分間保温した。なお、Ｐｈｅ（４－ＯＣＨＦ２）を評価するときは、アミノアシルｔＲＮＡは加えず、Ｐｈｅのアミノ酸を除き、かわりにＰｈｅ（４－ＯＣＨＦ２）を１ｍＭとなるように添加した。得られた翻訳反応物を、ＳＥＰＣ－ＴＩＰ（日京テクノス社）で精製し、ＭＡＬＤＩ－ＭＳで分析した。その結果、非天然アミノ酸を含むペプチド化合物の分子量を示すマススペクトル（ＭＳ）が主生成物として観測された（図３～図６）。鋳型ｍＲＮＡと期待される翻訳ペプチド化合物（配列番号：１１）、その分子量（計算値）に関しては、以下の表９（個別翻訳）に記載した。 【０８３７】 【表９】 ［図：0001406724000006.jpg］ ［図：0001406724000007.jpg］ 」 本ｑ 「【０８４７】 実施例４ 標的結合ペプチド化合物のパニング（試験管内選択） ４－１．アシル化ｔＲＮＡの合成 特許文献（ＷＯ２０１３／１００１３２）に記載の手法でパニングに使用するアシル化ｔＲＮＡを調製した。使用したtRNA(CA欠損)の塩基配列を表１１に示した。表１２に示すＥｌｏｎｇａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ混合物を調製した。以降、翻訳で使用する際には、表１２に示す最終濃度となるよう翻訳液を調製した。Ａｃｂｚ保護のｐＣｐＡアミノ酸は、ヨウ素による脱保護の代わりに、最終濃度４２ｍＭとなるようにＴＣＥＰを添加し、室温で４５分間脱保護を行ったのち、フェノール抽出以降の作業を行った。Ｐｎａｚ保護のｐＣｐＡアミノ酸は、脱保護を実施せずにフェノール抽出以降の作業を行った。Ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡの調製は、ライゲーション反応後、脱保護を実施せずにフェノール抽出以降の作業を行った。表１３に示す三種類を個別に調製し、翻訳で使用する際にもいずれか一つを表に示す最終濃度で翻訳液に添加した。 【０８４８】 【表１１】 ［図：0001406724000008.jpg］ 【０８４９】 【表１２】 ［図：0001406724000009.jpg］ 【０８５０】 【表１３】 ［図：0001406724000010.jpg］ 【０８５１】 ４－２．ペプチド化合物ライブラリをコードするランダム化された二本鎖ＤＮＡライブラリ 特許文献（ＷＯ２０１３／１００１３２）に記載の手法で、DNAライブラリを構築した。膜透過性の低い長い側鎖のアミノ酸を含むパニングのうち、ｉＳＰ用として、TTT, TTG, CTA, ATT, GTT, CCG, ACT, GCT, TAC, CAT, CAG, TGG, CGG, AGT, AGG, GGTのいずれかのコドンがランダムに9回繰り返しで出現するもの、ｉＲＴ用として、CTT, CTA , ATT, ATG, GTT, ACT, TAC, CAG, TGG, AGT, GGT, TTT, TTG , CCG , GCT, TAG, CAT, AAC, GAA, CGG, AGGのいずれかのコドンが9回繰り返しで出現するもの、および、膜透過性の高い長い側鎖のアミノ酸評価パニング用として、ランダム領域のトリプレットが8回ないし9回繰り返しで出現するものを用意した。 【０８５２】 ４－３．ビオチン化標的タンパク質の調製 パニングに使用する標的タンパク質として、ＧＴＰａｓｅＫＲａｓ（ＫＲＡＳ）、Ｄｕａｌｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｋｉｎａｓｅ１（ＭＥＫ１）、Ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ３（ＥＲＫ１）、インターロイキン６受容体（ＩＬ－６Ｒ）を用いた。ＫＲＡＳ、ＥＲＫ１、ＩＬ－６Ｒのビオチン化は非特許文献BMC biotechnology, 2008,8,41、及び非特許文献Protein Science,1999,8,921-929の方法を用いた。ＩＬ－６Ｒの調製は非特許文献J Biochem. 1990;108(4):673-6.に従って行った。ＥＲＫ１の調製はBiochem Biophys Res Commun. 2008 Dec 26;377(4):1123-7.の方法に準じ行った。ＭＥＫ１はカルナバイオサイエンス社よりビオチン化されたａｃｔｉｖｅ体（Product Number: 07-441-20N）を購入した。ＫＲＡＳは、大腸菌で発現・精製したものを使用した。 【０８５３】 ４－４．パニングに使用する翻訳液 膜透過性の低い長い側鎖のアミノ酸を含むパニングに使用した翻訳液は以下の組成で構成される。１ｍＭのＧＴＰ，１ｍＭのＡＴＰ，２０ｍＭのクレアチンリン酸，５０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＫＯＨｐＨ７．６，１００ｍＭの酢酸カリウム，１０ｍＭの酢酸マグネシウム，２ｍＭのスペルミジン，１ｍＭのジチオスレイトール，０．５ｍｇ／ｍｌのＥ．ｃｏｌｉＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），４μｇ／ｍｌのクレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌのミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌの無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌのヌクレオシド二リン酸キナーゼ，０．２６μＭのＥＦ－Ｇ，２．７μＭのＩＦ１，０．４μＭのＩＦ２，１．５μＭのＩＦ３，４０μＭのＥＦ－Ｔｕ，４４μＭのＥＦ－Ｔｓ，１．２μＭのリボソーム，２．７３μＭのＡｌａＲＳ，０．０９μＭのＧｌｙＲＳ，０．４μＭのＩｌｅＲＳ，０．５μＭの変異体ＰｈｅＲＳ０５（WO2016/148044），０．１６μＭのＰｒｏＲＳ，１μＭの変異体ＳｅｒＲＳ３７（WO2016/148044），０．０９μＭのＴｈｒＲＳ，０．０１μＭのＴｒｐＲＳ，０．０２μＭのＴｙｒＲＳ，１μＭの変異体ＶａｌＲＳ１３（WO2016/148044），０．１１μＭのＬｙｓＲＳ，０．３３μＭのＨｉｓＲＳ，３μＭのin vitro転写大腸菌ｔＲＮＡ Ａｌａ１Ｂ，３μＭの精製大腸菌ｔＲＮＡ Ｈｉｓ ＱＵＧ（Nucleic Acids Res. 2010 Apr;38(6):e89.の手法に習い精製。），２５０μＭのグリシン、２５０μＭのイソロイシン、２５０μＭのプロリン、２５０μＭのスレオニン、２５０μＭのトリプトファン、２５０μＭのリジン、５ｍＭのＮ－メチルバリン、５ｍＭのＮ－メチルセリン、５ｍＭのＮ－メチルアラニン、５ｍＭのＮ－メチルフェニルアラニン、２５０μＭの３－フルオロチロシン、５ｍＭのＮ－メチルヒスチジン、表１２に示すＥｌｏｎｇａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ混合物（膜透過性の低い長い側鎖のアミノ酸を含むパニング）。さらに、Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法（iＳＰ）を用いる場合は、Ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（表１３）のなかのいずれか一つを、Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｒｅａｄ－ｔｈｒｏｕｇｈ法（ｉＲＴ）を用いる場合は、２５０μＭのシステインおよび０．０２μＭのＣｙｓＲＳを加えて調製した。膜透過性の高い長い側鎖のアミノ酸評価パニング用の翻訳液は以下の組成で構成される。１ｍＭのＧＴＰ，１ｍＭのＡＴＰ，２０ｍＭのクレアチンリン酸，５０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＫＯＨｐＨ７．６，１００ｍＭの酢酸カリウム，１０ｍＭの酢酸マグネシウム，２ｍＭのスペルミジン，１ｍＭのジチオスレイトール，１．０ｍｇ／ｍｌのＥ．ｃｏｌｉＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），４μｇ／ｍｌのクレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌのミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌの無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌのヌクレオシド二リン酸キナーゼ，０．２６μＭのＥＦ－Ｇ，２． ７μＭのＩＦ１，０．４μＭのＩＦ２，１．５μＭのＩＦ３，４０μＭのＥＦ－Ｔｕ，４６μＭのＥＦ－Ｔｓ，１．２μＭのリボソーム，５．４６μＭのＡｌａＲＳ，０．０９μＭのＧｌｙＲＳ，０．５μＭの変異体ＰｈｅＲＳ０５（WO2016/148044），０．１６μＭのＰｒｏＲＳ，０．０９μＭのＴｈｒＲＳ，１μＭの変異体ＶａｌＲＳ１３（WO2016/148044），３μＭのin vitro転写大腸菌ｔＲＮＡＡｌａ１Ｂ，２５０μＭのグリシン、２５０μＭのプロリン、２５０μＭのスレオニン、５ｍＭのＮ－メチルバリン、５ｍＭのＮ－メチルアラニン、５ｍＭのＮ－メチルフェニルアラニン、表１２に示すＥｌｏｎｇａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ混合物（膜透過性の高い長い側鎖のアミノ酸評価パニング）、Ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（表１３）のＡｃｂｚ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）－ｔＲＮＡｆＭｅｔＣＡＵ。 【０８５４】 ４－５．パニングの実施 前述の二本鎖ＤＮＡライブラリと翻訳液を使用し、ＷＯ２０１３／１００１３２に倣ってパニングを実施した。膜透過性の高い長い側鎖のアミノ酸評価パニングでは、標的タンパク質とビオチンとの間にＴＥＶプロテアーゼ認識配列を導入し、ＴＥＶプロテアーゼによる溶出を行った。ペプチドライブラリをビオチン化タンパク質と相互作用させた後に、ストレプトアビジン固定化磁気ビーズで回収後、洗浄作業を行った後、ビーズにＴＥＶ溶出液（５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ８．０、０．５ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、０．１Ｕ／μＬＡｃＴＥＶプロテアーゼ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、製品番号１２５７５０１５））を添加し、３０℃１０分間反応した。反応後、上清を回収しＰＣＲを行った。各パニングに使用したＮ末端のアミノ酸と標的の一覧を以下の表１４に示す。 【０８５５】 【表１４】 ［図：0001406724000011.jpg］ 【０８５６】 ４－６．濃縮配列の解析 パニングの各ラウンドのＤＮＡプールの塩基配列解析を行い、ＵＰＧＭＡによる系統樹構築を行った。類似度マトリックスには、アミノ酸が一致する場合に１を、一致しない場合には０をあたえるものを用いた。プルーニングラインをリーフから０．２として、クラスタを分割した。さらに、最低１ラウンド以上で出現頻度が０．０５％を上回り、直前のラウンドのプールを分割し標的を添加せずにパニングした場合に比べ、標的を添加した場合に出現頻度が１０倍以上増加する配列を抽出した。クラスタごとに、ランダム領域の各アミノ酸グループ(長側鎖を有するアミノ酸、長側鎖を有しない芳香族アミノ酸、長側鎖を有しない非芳香族アミノ酸)の出現頻度を計算した。得られた全クラスタのアミノ酸出現頻度を合計しクラスタ数で割った値を、そのパニングにおける各アミノ酸グループの出現頻度とした。アミノ酸を以下の表１５「アミノ酸分類」に従い３つに分類し、パニングごとの出現頻度をまとめたものを表１６に示す。解析の結果、標的によらず長側鎖のアミノ酸の出現頻度が高い傾向があることが明らかとなった。このことから、標的分子に特異的に結合できる環状ペプチド化合物をスクリーニングする際に、長側鎖を有する環状ペプチド化合物を含むライブラリを用いることで、標的分子に特異的に結合できる環状ペプチド化合物のヒット率が向上し得ること、すなわちスクリーニングの効率を高め得ることが考えられた。 【０８５７】 【表１５】 ［図：0001406724000012.jpg］ 【０８５８】 【表１６】 ［図：0001406724000013.jpg］ 」 本ｒ 「【０８５９】 実施例５ 長側鎖を有する環状ペプチド化合物の膜透過性試験 上述のとおり、Trp、Tyr(3-F)、Phe(3-Cl)、MePhe(4-Cl)の側鎖のような長側鎖を有する環状ペプチド化合物が、標的分子と特異的に結合できるヒット化合物としてパニングにより濃縮されることが分かった。次に、これら側鎖を有する環状ペプチド化合物の膜透過性を前記の改良法により評価した。 【０８６０】 ５－１．Trpの側鎖を有する環状ペプチド化合物の膜透過性試験 Trpの側鎖を有する環状ペプチド化合物、及び同側鎖を有しない環状ペプチド化合物を合成し、改良法により膜透過性試験を行った。なお、MeTrpはTrpの側鎖を含むことから、構成アミノ酸にMeTrpを含む環状ペプチド化合物も、Trpの側鎖を有する環状ペプチド化合物に含まれる。その結果、Ｔｒｐの側鎖を持たない環状ペプチド化合物はＣｌｏｇＰを上昇させることによりＰａｐｐ≧１．０×１０－６ｃｍ／秒を達成することが可能であった（図１１）。一方、Ｔｒｐの側鎖を１つ以上有しているとＣｌｏｇＰを上昇させてもＰａｐｐ≧１．０×１０－６ｃｍ／秒まで膜透過性を上げるのは難しかった（図１２）。例えばＴｒｐ側鎖の位置、Ｎアルキルのパターンを変えたもので、１．０６≦ＣｌｏｇＰ／ｔｏｔａｌａａ≦１．４３の範囲にある環状ペプチド化合物の配列を表１７に示すが、これらはＰａｐｐ≧１．０×１０－６ｃｍ／秒の膜透過性を達成することは難しかった。 【０８６１】 CｌｏｇＰはコンピューターで計算した分配係数であって、ＤａｙＬｉｇｈｔＣｈｅｍｉｃａｌＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．社のＤａｙＬｉｇｈｔＶｅｒｓｉｏｎ４．９５を用いて計算した。なお、膜透過性評価を行ったペプチド配列（ｐｄ５０－ｐｄ７０、ｐｄ１００－ｐｄ２４７、およびｐｄ３００－ｐｄ５０４）の構造情報及び分析情報は下記表２６、表２７にまとめて記載した。 【０８６２】 ｐｄ１００を例にとり、表１７のカラムについて説明する。交差ユニットの部分を1番目のアミノ酸と定義する。ｐｄ１００の場合ではＡｓｐが該当する。交差ユニット（Ａｓｐ）の隣で環状部を構成するアミノ酸を２番目のアミノ酸と定義し（ｐｄ１００の場合Ｔｈｒが該当）、以下３番目、４番目とＮ末端（▲ユニット）まで繰り返す（ｐｄ１００の場合３番目ＭｅＡｌａ、４番目ＭｅＧｌｙとなり、環状部が１１残基からなるためＮ末端（▲ユニット）は１１番目のＤ－Ｖａｌ）。またＣ－ｔｅｒｍのカラムはＣ末端のアミノ酸のカルボン酸部位と縮合する官能基を意味しており、ｐｉｐはＰｉｐｅｒｉｄｉｎｅを表し、ｐｙｒｒｏはＰｙｒｒｏｒｉｄｉｎｅを意味している。Ｃ－ｔｅｒｍがｎｏｎｅの場合は、Ｃ末端がカルボン酸のまま存在していることを表している（ｐｄ１００の場合、Ｃ末端のアミノ酸は交差ユニットであるＡｓｐであり、そのカルボン酸部位がｐｉｐ（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ）と縮合した構造になる）。そして、▲ユニットと交差ユニットをアミド結合により環化させたペプチドであるということを表１７で表している。本文中に記載の環状ペプチド化合物に関しては特に記述が無い限り、全て同様の手法で表現している。なお、表１７に記載のすべての化合物で１番目と１１番目のアミノ酸残基が環状部を形成している。 ［図：0001406724000014.jpg］ 【０８６３】 【表１７】 Ｔｒｐの側鎖を有する環状ペプチド化合物の膜透過性 ［図：0001406724000015.jpg］ 【０８６４】 以上のとおり、Ｔｒｐの側鎖を有する環状ペプチド化合物は、修飾によりClogP/total aaを上昇させても、膜透過性をＰａｐｐ≧１．０×１０－６ｃｍ／秒のレベルまで向上させることは困難であることが示された。 【０８６５】 ５－２．Tyr(3-F)又はTyrの側鎖を有する環状ペプチド化合物の膜透過性試験 Tyr(3-F)又はTyrの側鎖を有する環状ペプチド化合物を合成し、改良法により膜透過性試験を行った。その結果、Ｔｙｒ（３－Ｆ）又はＴｙｒの側鎖を有する環状ペプチド化合物もＴｒｐの側鎖を有する環状ペプチド化合物と同様の傾向であった。１．０６≦CｌｏｇＰ／ｔｏｔａｌ ａａ≦１．２９の範囲にある環状ペプチド化合物の配列を表１８に示すが、Ｔｒｐの場合と同様、これらがＰａｐｐ≧１．０×１０－６ｃｍ／秒を達成することは困難であった。 【０８６６】 【表１８】 Ｔｙｒ（３－Ｆ）又はＴｙｒの側鎖を有する環状ペプチド化合物の膜透過性 ［図：0001406724000016.jpg］ 【０８６７】 ５－３．Phe(3-Cl)、MePhe(4-Cl)、又はPhe(4-CF3)の側鎖を有する環状ペプチド化合物の膜透過性試験 Phe(3-Cl)、MePhe(4-Cl)、又はPhe(4-CF 3)の側鎖を有する環状ペプチド化合物を合成し、改良法により膜透過性試験を行った。その結果、これら側鎖を有する環状ペプチド化合物の中には、ＣｌｏｇＰ／ｔｏｔａｌａａ≧１．１０の領域でＰａｐｐ≧１．０×１０－６ｃｍ／秒を達成するものが多数存在した。図１３にＰｈｅ（４－ＣＦ３）の例を示す。Ｐｈｅ（４－ＣＦ３）の側鎖を有する環状ペプチド化合物はCｌｏｇＰ／ｔｏｔａｌ ａａ≧１．１０の範囲で、Ｐａｐｐ≧１．０×１０－６ｃｍ／秒を達成可能であった（図１３）。 【０８６８】 Ｐｈｅ（４－ＣＦ３）の側鎖を有する環状ペプチド化合物で１．１０≦CｌｏｇＰ／ｔｏｔａｌ ａａ≦１．５０の範囲でＰａｐｐ≧１．０×１０－６ｃｍ／秒であった環状ペプチド化合物の一部の配列を表１９に示す。 【０８６９】 【表１９】 ［図：0001406724000017.jpg］ 【０８７０】 Ｐｈｅ（３－Ｃｌ）の側鎖を有する環状ペプチド化合物もＰｈｅ（４－ＣＦ３）の側鎖を有する環状ペプチド化合物と同様の傾向であった。１．１７≦CｌｏｇＰ／ｔｏｔａｌ ａａ≦１．３１の範囲でＰａｐｐ≧１．０×１０－６ｃｍ／秒であった環状ペプチド化合物の一部の配列を表２０に示す。 【０８７１】 【表２０】 ［図：0001406724000018.jpg］ 【０８７２】 ＭｅＰｈｅ（４－Ｃｌ）の側鎖を有する環状ペプチド化合物もＰｈｅ（３－Ｃｌ）、又はＰｈｅ（４－ＣＦ３）の側鎖を有する環状ペプチド化合物と同様の傾向であった。１．２２≦ＣｌｏｇＰ／ｔｏｔａｌａａ≦１．３１の範囲でＰａｐｐ≧１．０×１０－６ｃｍ／秒であった環状ペプチド化合物の一部の配列を表２１に示す。 【０８７３】 【表２１】 ［図：0001406724000019.jpg］ 【０８７４】 以上より、Trp、Tyr、及びTyr(3-F)の側鎖を有する環状ペプチド化合物は、修飾を加えClogP/total aaを上昇させても、Papp≧1.0×10-6 cm/秒の基準を満たす環状ペプチド化合物を得ることは難しかった。一方、その他の長側鎖を有する環状ペプチド化合物は、修飾を加えClogP/total aaを上昇させることで、Papp≧1.0×10-6 cm/秒の基準を満たす化合物を多数得ることができた。 例えば、長側鎖を有するアミノ酸（Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）、ＭｅＳｅｒ（ｉＰｅｎ）、Ｈｐｈ、ＭｅＨｐｈ、Ｓｅｒ（ｎＰｒ）、Ｈｎｌ（７－Ｆ２）、Ｓｅｒ（Ｐｈ－２－Ｃｌ）、Ｓｅｒ（Ｐｈ－３－Ｃｌ）、Ｓｅｒ（３－Ｆ－５－Ｍｅ－Ｐｙｒ）、Ｓｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）、Ｈｐｈ（２－Ｃｌ）、Ｈｐｈ（３－Ｃｌ）、Ｈｐｈ（４－Ｃｌ）、Ｐｈｅ｛＃（ＣＨ２）２｝、Ｓｅｒ（Ｂｎ）、Ｈｙｐ（Ｅｔ）、ＭｅＡｂｕ（ｐｉｐ－３－Ｆ２）、ＭｅＡｂｕ（ｐｉｐ－４－Ｆ２）、Ａｌａ（３－Ｐｙｒ－４－ＮＭｅ２）、ｎＰｅｎＧｌｙ、ｎＨｅｘＧｌｙ、（ＰｈＥｔ）ＮＧｌｙ、（ＥｔＯＥｔ）ＮＧｌｙ、（ＰｈＯＥｔ）Ｇｌｙ、Ｓｅｒ（Ｓ－２－ＰｒＯＨ）、Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＨ）、Ｓｅｒ（２－Ｍｅ－２－ＢｕＯＨ）、Ｇｌｎ（Ｍｅ２）、Ｓｅｒ（ＮｔＢｕ－Ａｃａ）、ＭｅＳｅｒ（ＮｔＢｕ－Ａｃａ）、Ｈｓｅ（Ｅｔ）、Ｎｌｅ（６－ＯＨ）、ＭｅＡｂｕ（Ｍｏｒ）、２－（（ｐｉｐ－４－Ｆ２）－Ｅｔ）Ｇｌｙ、Ｐｒｏ（ｐｉｐ－４－Ｆ２）、ｃｉｓＰｒｏ（ｐｉｐ－４－Ｆ２）、Ｇｌｎ（Ｍｅ）、Ａｈｐ（２）（３－Ｒ－ＯＨ）、Ｌｙｓ（Ａｃ）、Ｐｈｅ（４－ＣＨＦ２）、Ｐｈｅ（４－ＯＣＨＦ２）、Ｓｅｒ（Ｅｔ－２－Ｍｏｒ）、Ａｂｕ（５－Ｏｘｏ－Ｏｄｚ）、Ｓｅｒ（ＥｔＯＨ）、Ｓｅｒ（Ｒ－２－ＰｒＯＨ）、Ｈｎｌ（７－Ｆ３－６－ＯＨ）、Ｓｅｒ（１－ＣＦ３－ＥｔＯＨ）を含む環状ペプチドの膜透過性評価したところ、１．１３≦ＣｌｏｇＰ／ｔｏｔａｌＡＡ≦１．３５の領域でＣａｃｏ－２≧１．０ｘ１０－６ｃｍ／ｓｅｃを達成することが可能であった。下記に配列情報の一部を示す。 【０８７５】 【表２２】 ［図：0001406724000020.jpg］ 【０８７６】 必ずしも特定の理論に拘束されることを意図しないが、本発明者らは以下のように考える。上記の結果から、Trp、Tyr、又はTyr(3-F)のような側鎖を有する環状ペプチド化合物をヒット化合物として得たとしても、hit to leadにより膜透過性を高めることは難しいと考えられる。一方、その他の長側鎖であれば、パニングの際に標的分子との結合に寄与し得るし、これらの側鎖を有する環状ペプチド化合物は高い膜透過性を有し得るため、標的分子に特定的に結合でき、かつ、膜透過性の高い環状ペプチド化合物を得るために有用であると考えられる。」 本ｓ 「【０８７７】 実施例６ 環状ペプチド中の芳香環の数（ＡＲＣ）が膜透過性に与える影響の評価 Ｐａｐｐ≧１．０×１０－６を達成するためには、環状ペプチド化合物の環状部の側鎖に含まれる芳香環の数（ＡＲＣ）が３以下であることが好ましいことが以下のデータより示された（図１４）。ＡＲＣが増加するにともなって環状ペプチド化合物のＰａｐｐが低下、すなわち膜透過性が低下する傾向があり、ＡＲＣが４以上になるとＰａｐｐ≧１．０×１０－６を達成するのは困難であった。 なお、本解析では、環状部の側鎖に縮環構造を有するもの、並びに置換及び無置換のヒドロキシフェニル基を有する環状ペプチド化合物を解析対象から除外した。ＡＲＣ＝３の場合、ＣｌｏｇＰ／ｔｏｔａｌ ＡＡが０．８８以上の配列で、１．０×１０－６以上のＰａｐｐが認められた。一方、ＡＲＣ＝４の場合は前記ＡＲＣ＝３の化合物群と同程度のＣｌｏｇＰ／ｔｏｔａｌ ＡＡ（０．８８以上）の化合物であっても、Ｐａｐｐが１．０×１０－６以上となるものはほとんど存在しなかった。このことから、同程度の脂溶性の配列群であるにも関わらず、ＡＲＣ＝３とＡＲＣ＝４を比較すると、ＡＲＣ＝３の方が良好な膜透過性を示すことが示された（表２３－１、表２３－２、表２４）。また、直鎖部１を含むペプチドであるｐｄ１９８を例にとり、表２３－１、表２３－２及び表２４のカラムについて説明する。前述した通り、交差ユニットの部分を1番目のアミノ酸と定義する。ｐｄ１９８の場合ではＡｓｐが該当する。交差ユニット（Ａｓｐ）の隣で環状部を構成するアミノ酸を２番目のアミノ酸と定義し（ｐｄ１９８の場合Pheが該当）、以下３番目、４番目とＮ末端（▲ユニット）まで繰り返す（ｐｄ１９８の場合３番目ＭｅVal、４番目ＭｅLeuとなり、環状部が１０残基からなるためＮ末端（▲ユニット）は１０番目のｇ－MeAbu）。また直鎖部１のアミノ酸を交差ユニット（ｐｄ１９８の場合はAsp）から近い順に、H-1、H-2、H-3で示している。ｐｄ１９８の場合H-1はMePhe、H-2はAlaであるので、直鎖部１は交差ユニットであるAspのC末端にMePheが結合しており、ついでAlaが結合していることを意味している。またＣ－ｔｅｒｍのカラムはＣ末端のアミノ酸のカルボン酸部位と縮合する官能基を意味しており、ｐｉｐはＰｉｐｅｒｉｄｉｎｅを表し、ｐｙｒｒｏはＰｙｒｒｏｒｉｄｉｎｅを意味している。Ｃ－ｔｅｒｍがｎｏｎｅの場合はＣ末端はカルボン酸のまま存在していることを表している（ｐｄ１９８の場合、Ｃ末端のアミノ酸はH-2のAlaであり、そのカルボン酸部位がｐｉｐ（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ）と縮合した構造になる）。そして、▲ユニットと交差ユニットをアミド結合により環化させたペプチドであるということを表２３－１、表２３－２及び表２４で表している。本文中に記載の環状ペプチドに関しては特に記述が無い限り、全て同様の手法で表現している。 ・・・ 【０８８０】 塩基性および酸性側鎖を有するアミノ酸で膜透過性に関して、Ｐａｐｐ≧１．０ｘ１０－６ｃｍ／秒を達成することが困難であったアミノ酸の例 実測値のbasic pKaが９．１、計算値のbasic pKaが８．９のアミノ酸であるＳｅｒ（Ｅｔ－２－ＮＭｅ２）を含む配列は、１．２１≦ＣｌｏｇＰ／ｔｏｔａｌ ａａ≦１．３６の範囲で、膜透過性に関してＰａｐｐ≧１．０ｘ１０－６ｃｍ／秒を達成することが困難であった（ｐｄ５０～ｐｄ５８）。一方、本明細書に記載の通り、ＭｅＡｂｕ（ｐｉｐ－４－Ｆ２）、ＭｅＡｂｕ（Ｍｏｒ）、Ｓｅｒ（Ｅｔ－２－Ｍｏｒ）、ＭｅＡｂｕ（ｐｉｐ－３－Ｆ２）を含む配列は膜透過性、Ｐａｐｐ≧１．０ｘ１０－６ｃｍ／秒を達成することが可能であった。 【０８８１】 一方、実測値のｐＫａが３．８、計算値のｐＫａが５．３のアミノ酸であるＧｌｎ（Ｍｓ）を含む配列は１．２０≦ＣｌｏｇＰ／ｔｏｔａｌ ａａ≦１．３３の範囲で、膜透過性に関してＰａｐｐ≧１．０ｘ１０－６ｃｍ／秒を達成することが困難であった（ｐｄ５９～ｐｄ７０）。一方、本明細書に記載の通り、Ａｂｕ（５－Ｏｘｏ－Ｏｄｚ）を含む配列は膜透過性、Ｐａｐｐ≧１．０ｘ１０－６ｃｍ／秒を達成することが可能であった。 【０８８２】 Ｓｅｒ（Ｅｔ－２－ＮＭｅ２）またはＧｌｎ（Ｍｓ）を含む環状ペプチド化合物の膜透過性 【表２５】 ［図：0001406724000021.jpg］ 」 ２．甲号証に記載された事項 （１）甲１に記載された事項 甲１には、以下の記載がある。（下線は当審による。） 甲１ａ 「[0068] 以下にアミド環化を利用する場合を例にした反応設計を述べる。三角ユニットの反応させたいアミノ基と反応させたくない塩基性官能基との反応選択性を獲得するためには反応させたいアミンの反応性をその他の官能基に対して向上させる必要がある場合があり得る。通常アミンより活性化させる手法として、例えば、アミン近傍に反応補助基を導入することが可能である。反応補助基としてはＲＮＡが反応しない程度にアミンを活性化できるものであれば特に限定されないが、例えば末端アミンからメルカプトエチル基やメルカプトプロピル基を導入することも可能であり、また、システインのように、アミンのα位からチオール部位を位置させることも可能である（スキームＣ参照）。これらのチオール基は翻訳導入の過程では、保護されていても、保護されていなくてもよいが、反応時もしくは事前に必要に応じて脱保護反応によりチオール基を生成させる。このように活性化されたアミンとカルボン酸活性エステルとの反応により望みの位置でのアミド環化されたペプチドが得られる。得られた環状ペプチドのＳＨ基をＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシルエチル）ホスフィン）とＶＡ－０４４（２，２'－アゾビスー２－（２－イミダゾリン－２－イル）プロパン）などの試薬を加えるＲＮＡが反応しない温和な反応条件で脱硫させることができる。」 甲１ｂ 「[0104] initiation read through（イニシエーション リード スルー：開始コドンの読み飛ばし）を利用することによって、上記のメチオニン以外のアミノ酸、アミノ酸類縁体又はN末端カルボン酸類縁体のN末端導入による末端が多様なペプチド化合物又はペプチド化合物ライブラリーの合成法での複数種類アミノアシル翻訳開始ｔＲＮＡの用意の必要がない方法がある。initiation read throughとは、一般的にはタンパクやペプチドはAUCコドンとしてコードされる翻訳開始アミノ酸であるメチオニンから翻訳されるが、無細胞翻訳系において翻訳開始メチオニルtRNAが含まれない場合や翻訳効率の低い非天然アミノ酸が翻訳開始tRNAに付加されたものからの翻訳を開始させようとした際に2番目以降のコドンにコードされるアミノ酸からの翻訳産物が生じる現象を意味する。」 甲１ｃ 「[0180] ここで、上述の工程(i)に記載のアミノ酸及びアミノ酸類縁体の総数、及び、工程(ii)に記載の環状部のアミノ酸及びアミノ酸類縁体の残基数の合計には、翻訳後修飾によって除かれるアミノ酸又はアミノ酸類縁体は含まれない。例えば、上述のスキームF3において、直鎖部２を有するペプチド化合物の製造中で翻訳後修飾中に当該ペプチドから脱離されるCys-Pro配列は、工程(i)及び(ii)のアミノ酸及びアミノ酸類縁体の数には含まれない、その他、例えば、ペプチド化合物とRNAのリンカー部位としてGly-Serの繰り返し構造部を含むものを利用する場合は当該Gly-Serの繰り返し構造部や、固定されているアミノ酸領域、本発明の環状部を有するペプチド化合物、特にドラックライクなペプチド化合物部分と核酸とを結合させる目的の部分はリンカーに含まれ、工程(i)及び(ii)のアミノ酸及びアミノ酸類縁体の数には含まれない。その場合には、工程（ii）の環化後の環部の残基数は５～１１ではなくそれより長い残基数であるが、直鎖部２を生成させる反応後に環部の残基数が５～１１になればよい。」 甲１ｄ 「[0187] さらに、所望の固定した標的に当該ライブラリーを接触させ、標的に結合しない分子を洗い流すことで標的に結合する分子を濃縮することが出来る（パニング）。このように選択された分子についている遺伝子情報を含むタグであるｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ増幅し、塩基配列を解析することで結合したペプチドの配列を明らかにすることが出来る。」 甲１ｅ 「[0390] 配列番号 Ｄ－６（配列番号：６） KA03 DNA配列 GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATatgACTAGAACTaaggcgTACTGGAGCcttCCGggcggctaa」 甲１ｆ 「[0549] ２．メチオニン以外のアミノ酸、アミノ酸類縁体又はN末端カルボン酸類縁体をN末端に導入する方法を用いた翻訳合成およびアミド環化反応 鋳型ＤＮＡとしてKA03 DNA配列（配列番号 Ｄ－６）を用いて翻訳反応を行った。 鋳型ＤＮＡに、前述の転写翻訳液、ＭｅｔおよびＬｅｕを除く各０．３ｍＭの１８種類のタンパク質性アミノ酸，および前記の方法で調製した２５μＭ tBuSSEtGABA-tRNAfMetCAU（化合物番号 ＡＴ－６－Ｃ）と５０μＭ Asp(SMe)-tRNAEnAsnGAG（化合物番号 ＡＴ－１－ＩＡ２）を加え３７℃で３時間翻訳した。翻訳産物に、１／２０（ｖ／ｖ）量の２００ｍＭ ＴＣＥＰ（ｐＨ６．６）を添加し、３７℃で１５分反応させ、Asp(SMe)部位と分子内環化反応を行った。その結果、目的の環状ペプチド（ペプチド配列Ｐ－４３）がＭＳスペクトルで確認された（図２７）。チオエステルに続くアミノ酸をＮ－アルキルアミノ酸とすることで効率的に翻訳・環化が実現された。 [0550] ペプチド配列Ｐ－４２ [tBuSSEtGABA]ThrArgThrLysAlaTyrTrpSer[Asp(SMe)]ProGlyGly MALDI-MS:m/z: [M+H]+ = 1601.7 (Calc.1601.0) [0551] ペプチド配列Ｐ－４３ [HSEtGABA]ThrArgThrLysAlaTyrTrpSer[Asp(SMe)]ProGlyGlyのGABAの主鎖窒素原子とAspの側鎖カルボン酸でアミド環化した化合物 MALDI-MS:m/z: [M+H]+ = 1465.6 (Calc.1465.0) ［図：0001406724000022.jpg］ 」 甲１ｇ 「 ［図：0001406724000023.jpg］ 」 甲１ｈ 「[0552] ［実施例１５］Intioation read through法を用いた翻訳および環化 １．NCL（Native Chemical Ligation）を介したアミド型環化ペプチドの合成 鋳型ＤＮＡとしてKA02.5U DNA配列（配列番号 Ｄ－３２）を用いて翻訳反応を行った。 鋳型ＤＮＡに、前述の転写翻訳液、ＭｅｔおよびＡｌａ、Leuを除く各０．３ｍＭの１７種類のタンパク質性アミノ酸，３ ｍＭ乳酸、および前記の方法で調製した５０μＭ Asp(SRex2)-tRNAEnAsnGAG （Ｒex2：ベンジル，メチル，エチル，イソプロピル、ターシャリーブチル、フェネチル）（化合物番号 ＡＴ－１－ＩＡ２、ＩＢ２、ＩＣ２、ＩＤ２、ＩＥ２，ＩＧ２）を加え３７℃で３時間翻訳した。その結果、環化した全長ペプチドがＭＳスペクトルで確認された（図２８～図２９）。 [0553] 配列番号 Ｄ－３２（配列番号：２８） KA02.5U DNA配列: GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATG tgcACTAGAACTaaggcgTACTGGAGCcttCCGggctaa [0554] 翻訳ペプチド CysThrArgThrLys[Lac]TyrTrpSer[Asp(SRex2)]ProGly （Ｒex2：ベンジル、メチル、エチル、イソプロピル、ターシャリーブチル、フェネチル、Ｌａｃ：乳酸） 翻訳後、環化したペプチドの化学構造（ペプチド配列番号P－４４からP－４９） CysThrArgThrLys[Lac]TyrTrpSer[Asp(SRex2)]ProGlyのCysの主鎖アミノ基とAspの側鎖カルボン酸との分子内アミド化された化合物 ［図：0001406724000024.jpg］ [0555] [表6] ［図：0001406724000025.jpg］ [0556] 以上の結果からIninitiation read through法によりCysが翻訳導入され、翻訳および環化がスムースに進行し、様々なチオエステル体から主生成物としてアミド環化体が得られることが明らかとなった。さらに、乳酸を含む本配列が有効に翻訳されたことから、乳酸がＡｌａＲＳにより選択的かつ効率的に導入できることが初めて明らかとなった。 [0557] Initiation read through法にて述べたように、アミンを活性化させる役割のＳＨ基が保護されていない場合には、チオエステルに続く非天然型アミノ酸（タンパク性アミノ酸も含む）はＮ－アルキル基を有するアミノ酸に拘らなくとも良い。翻訳後すぐにＳＨ基との反応を経由してアミドが生成するためである。ＳＨ基が保護されたアミノ酸を翻訳させる場合には、翻訳工程終了後から脱保護工程に至る時間内にアスパルチミド形成される。 ・・・」 甲１ｉ 「[1517] [実施例２５] アミド環化にて環化されたディスプレイライブラリーの実施 ｐｄCpA-アミノ酸群の合成、続いてｔRNA－アミノ酸複合体の合成により、導入される非天然型アミノ酸のうち、ARSによらずに導入されるものの準備を行った。続いて、多様性が高いランダムDNAの準備を行った。転写、翻訳、化学修飾によるRNAと環化ペプチドとの複合体作製に続き、パニングを実施してTNFα、TNFR1、IL-6Rに対する結合ペプチドを取得するための実験を行った [1518] １．ディスプレイライブラリ構築のためのｐｄＣｐＡ－アミノ酸の合成 ｐｄＣｐＡとの複合体として、以下の非天然型アミノ酸（ＭｅＧｌｙ、Ｐｈｇ、Ｐｈｅ（４－ＣＦ３）、Ｍｅｔ（Ｏ２）、βＡｌａ、ＭｅＡｌａ（４－Ｔｈｚ）、ＭｅＰｈｅ（３－Ｃｌ）、ｎＰｒＧｌｙ、ＭｅＳｅｒ、Ｈｙｐ（Ｅｔ））を翻訳導入するための合成を行った。すなわち、以下のスキームに従い、化合物SP７０５（Ｐｅｎ－ＭｅＧｌｙ－ｐｄＣｐＡ）、化合物SP７１０（Ｐｅｎ－Ｐｈｇ－ｐｄＣｐＡ）、化合物SP７１５（Ｐｅｎ－Ｐｈｅ（４－ＣＦ３）－ｐｄＣｐＡ）、化合物SP７２０（Ｐｅｎ－Ｍｅｔ（Ｏ２）－ｐｄＣｐＡ）、化合物SP７２５（Ｐｅｎ－βＡｌａ－ｐｄＣｐＡ）、化合物SP７３１（Ｐｅｎ－ＭｅＡｌａ（４－Ｔｈｚ）－ｐｄＣｐＡ）、化合物SP７３７（Ｐｅｎ－ＭｅＰｈｅ（３－Ｃｌ）－ｐｄＣｐＡ）、化合物SP７４２（Ｐｅｎ－ｎＰｒＧｌｙ－ｐｄＣｐＡ）、化合物SP７５４（Ｐｅｎ－Ｈｙｐ（Ｅｔ）－ｐｄＣｐＡ）を合成した。化合物６i－C（ｔBuSSEｔGABA）、化合物１ｉ－ＩＡの合成は既に記載済である。 ・・・ [1605] ２．ディスプレイライブラリ構築のための転写ｔRNAおよび転写ｔＲＮA(CA欠損)の合成 パニングに使用する転写ｔＲＮＡおよび転写ｔＲＮA（ＣＡ欠損）を以下の通り調製した。 ・・・ [1635] ３．ｔRNA(CA欠損)とｐｄＣｐＡ－アミノ酸との反応による、ｔRNA-アミノ酸複合体の合成 [1636] アミノアシル化ｐｄＣｐＡと転写ｔＲＮＡ（ＣＡ欠損）のligationによるパニング用アミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＴＬ－１～１３）の合成、およびアミノアシル化tRNA混合物の調製 まず、個別にアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＴＬ-１～１３）を調製した。ライゲーションは、ligation buffer （５０ｍＭ HEPES-KOH pH７．５, ２０ｍＭ MgCl2, １ｍＭ ATP）、２５μＭ転写tRNA (-CA)（配列番号ＭＴＬ－１～１２、Ｒ－５）、０．６Ｕ／μｌＴ４ ＲＮＡリガーゼ（New england bio lab.社）、０．５ｍＭ アミノアシル化ｐｄＣｐＡの条件で行った。25μＭ転写tRNA (-CA) と0.5 ｍＭ アミノアシル化ｐｄＣｐＡの組み合わせは、以下の表２０～２２の通りに行った。 ライゲーションを行う前に、ligation buffer、転写tRNA (-CA)（配列番号ＭＴＬ－１～１２、Ｒ－５）およびNuclease free waterを混合したものを、９５℃で２分間加熱した後、室温で５分間放置し、予めｔＲＮＡのリフォールディングを行った。その後、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ、アミノアシル化ｐｄＣｐＡのＤＭＳＯ溶液を上述の通り加え、１５℃で４５分間ライゲーション反応を行った。 ライゲーション反応液に、０．３Ｍ 酢酸ナトリウムと、６２．５ｍＭヨウ素（水：ＴＨＦ＝１：１溶液）を加え、室温で１時間（ただし、化合物ＳＰ７４９を用いる際は室温で５分間）、ペンテノイル基の脱保護を行い、化合物ＡＴＬ-１～１２を得た。ペンテノイル基を持たない化合物６i－Ｃを用いる際は、脱保護は行わず、ライゲーション反応まで行い、化合物ＡＴＬ-１３を得た。 次に、翻訳液Ｓ用アミノアシル化tRNA 混合物（Initiation suppression翻訳に使用）、翻訳液Ｓ用Initiatorアミノアシル化tRNA（Initiation suppression翻訳に使用）、および翻訳液Ｔ用アミノアシル化tRNA混合物（Read through翻訳に使用）を調製した。得られた化合物ＡＴＬ-１～１３を、表２０～２２に示す混合比で混合し、翻訳液Ｓ用アミノアシル化tRNA混合物、翻訳液Ｓ用Initiatorアミノアシル化tRNA、翻訳液Ｔ用アミノアシル化tRNA混合物として、フェノール抽出した後、エタノール沈殿により回収した。調製したアミノアシル化ｔＲＮＡは、翻訳液に添加する直前に１ｍＭ酢酸ナトリウムに溶解した。以降、翻訳で使用する際には、表２０～２２に示す最終濃度となるよう翻訳液を調製した。 [1637] [表20] ［図：0001406724000026.jpg］ [1638] [表21] ［図：0001406724000027.jpg］ [1639] [表22] ［図：0001406724000028.jpg］ [1640] 化合物ＡＴＬ－１（配列番号：１２７） βAla－tRNAGluCUG (-CA) ［図：0001406724000029.jpg］ [1641] 化合物ＡＴＬ－２（配列番号：１２８） Asp(SMe)－tRNAGluACG (-CA) ［図：0001406724000030.jpg］ [1642] 化合物ＡＴＬ－３（配列番号：１２９） MeAla(4-Thz)－tRNAGluUUC (-CA) ［図：0001406724000031.jpg］ [1643] 化合物ＡＴＬ－４（配列番号：１３０） MePhe(3-Cl)－tRNAGluCCU (-CA) ［図：0001406724000032.jpg］ [1644] 化合物ＡＴＬ－５（配列番号：１３１） MeGly－tRNAGluCAA (-CA) ［図：0001406724000033.jpg］ [1645] 化合物ＡＴＬ－６（配列番号：１３２） Phe(4-CF3)－tRNAGluUAG (-CA) ［図：0001406724000034.jpg］ [1646] 化合物ＡＴＬ－７（配列番号：１３３） Hyp(Et)－tRNAGluCUA (-CA) ［図：0001406724000035.jpg］ [1647] 化合物ＡＴＬ－８（配列番号：１３４） MeSer－tRNAGluCCG (-CA) ［図：0001406724000036.jpg］ [1648] 化合物ＡＴＬ－９（配列番号：１３５） Phg－tRNAGluAAG (-CA) ［図：0001406724000037.jpg］ [1649] 化合物ＡＴＬ－１０（配列番号：１３６） Met(O2)－tRNAGluGCA (-CA) ［図：0001406724000038.jpg］ [1650] 化合物ＡＴＬ－１１（配列番号：１３７） Met(O2)－tRNAGluCAU (-CA) ［図：0001406724000039.jpg］ [1651] 化合物ＡＴＬ－１２（配列番号：１３８） ｎPrGly－tRNAAsn-E2GUU (-CA) ［図：0001406724000040.jpg］ [1652] 化合物ＡＴＬ－１３（配列番号：１３９） tBuSSEtGABA－tRNAfMetCAU (-CA) ［図：0001406724000041.jpg］ ・・・ [1710] ７．ｍＲＮＡ－ピューロマイシンリンカーライゲーション産物調製 PCRにより調製したＤＮＡライブラリー(配列番号 ＤＭＬ－１～ＤＭＬ－３(Initiation suppression翻訳用)、ＤＭＬ－４～ＤＭＬ－６(Read throuth翻訳用)) を鋳型に、in vitro転写により以下のmRNA（配列番号ＭＭＬ－１～ＭＭＬ－３(Initiation suppression翻訳用)、配列番号ＭＭＬ－４～ＭＭＬ－６(Read throuth翻訳用))を調製し、RNeasy mini kit (Qiagen社)を用いて精製した。１０μＭのmRNAに、１５μＭのピューロマイシンリンカー (Sigma社)(配列番号Ｃ－１)、 1X T4 RNAライゲースリアクションバッファー(New england bio lab.社)、１ｍＭ ＡＴＰ、１０％ ＤＭＳＯ、０．６２５ｕｎｉｔ／μｌ Ｔ４ ＲＮＡライゲース(New england bio lab.社)を加え、37℃で30分間ライゲーション反応させた後、RNeasy Mini kit(Qiagen社)により精製した。配列番号ＭＭＬ－１とＭＭＬ－４は30μｌスケール、配列番号ＭＭＬ－２とＭＭＬ－５は60μｌスケール、配列番号ＭＭＬ－３とＭＭＬ－６は240μｌスケールで、ライゲーションを行い、精製した。ピューロマイシンリンカー（配列番号Ｃ－１）と連結したＭＭＬ－１，ＭＭＬ－２，ＭＭＬ－３をそれぞれモル比１：２１：４４１となるように、ピューロマイシンリンカー（配列番号Ｃ－１）と連結したＭＭＬ－４，ＭＭＬ－５，ＭＭＬ－６をそれぞれモル比１：２１：４４１となるように混合し、前者をinitiation suppression翻訳用ｍＲＮＡ－ピューロマイシンリンカーライゲーション産物混合物と、後者をRead throuth 翻訳用ｍＲＮＡ－ピューロマイシンリンカーライゲーション産物混合物とした。 [1711] 配列中に（RRR）と示した箇所は、UUU、AUU、GUU、AGU、CCG、ACU、GCU、CAU、UGG、GGU、UAC、CAG、AAC、CGG、AGG、UUG、CUU、CUA、UAG、UGC、GAA がランダムに出現することを、（YYY）と示した箇所には、UUU、CCG、GCU、CAU、AAC、CGG、AGG、UUG、UAG、GAAがランダムに出現することを、（SSS）と示した箇所には、UUU、AUU、AUG、GUU、AGU、CCG、ACU、GCU、CAU、UGG、GGU、UAC、CAG、AAC、CGG、AGG、UUG、CUU、CUA、UAG、GAAがランダムに出現することを意味する。 [1712] 配列番号ＭＭＬ－１（配列番号：１５４） GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUG(RRR)7CGU(YYY)(RRR)AGCGGCUCUGGCUCUGGCUCUUAGGGCGGCGGGGACAAA [1713] 配列番号ＭＭＬ－２（配列番号：１５５） GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUG(RRR)8CGU(YYY)(RRR)AGCGGCUCUGGCUCUGGCUCUUAGGGCGGCGGGGACAAA [1714] 配列番号ＭＭＬ－３（配列番号：１５６） GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUG(RRR)9CGU(YYY)(RRR)AGCGGCUCUGGCUCUGGCUCUUAGGGCGGCGGGGACAAA [1715] 配列番号ＭＭＬ－４（配列番号：１５７） GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGUGC(SSS)7CGU(SSS)2 AGCGGCUCUGGCUCUGGCUCUUAGGGCGGCGGGGACAAA [1716] 配列番号ＭＭＬ－５（配列番号：１５８） GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGUGC(SSS)8CGU(SSS)2 AGCGGCUCUGGCUCUGGCUCUUAGGGCGGCGGGGACAAA [1717] 配列番号ＭＭＬ－６（配列番号：１５９） GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGUGC(SSS)9CGU(SSS)2 AGCGGCUCUGGCUCUGGCUCUUAGGGCGGCGGGGACAAA [1718] ビオチン化標的タンパク質の調製 パニングに使用する標的タンパク質として、インターロイキン６受容体（ＩＬ－６Ｒ）、Tumor Necrosis Factor-α（ＴＮＦα）、Tumor Necrosis Factor Receptor1（ＴＮＦＲ１）を用いた。ＩＬ－６Ｒのビオチン化は非特許文献BMC biotechnology, 2008,8,41、および非特許文献Protein Science,1999,8,921-929の方法を用いた。ＩＬ－６Ｒの調製は非特許文献J Biochem. 1990;108(4):673-6.に従って行った。ＴＮＦαはProspec社のRcombinant Human Tumor Necrosis Factor-alpha（Catalog Number #CYT-223）を、ＴＮＦＲ１はSinoBiological社のRecombinant Human TNFR1/Fc Chimera（Catalog Number 10872-H03H）を購入した。それぞれThermo scientific社のEZ-Link NHS-PEG4-Biotin（Catalog Number 21329）を用いてビオチン化を行った。 [1719] ・パニングに使用する翻訳液の定義 パニングに使用した翻訳液Ｓは以下の組成で構成される。１ｍＭ ＧＴＰ，１ｍＭ ＡＴＰ，２０ｍＭクレアチンリン酸，５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ ｐＨ７．６，１００ｍＭ 酢酸カリウム，１０ｍＭ 酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ ジチオスレイトール，０．５ｍｇ／ｍｌ Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），４μｇ／ｍｌ クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ 無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，０．２６μＭ ＥＦ－Ｇ，２．７μＭ ＩＦ１，０．４μＭ ＩＦ２，１．５μＭ ＩＦ３，４０μＭ ＥＦ－Ｔｕ，８４μＭ ＥＦ－Ｔｓ，１．２μＭ リボソーム，２．７３μＭ ＡｌａＲＳ，０．０９μＭ ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ ＩｌｅＲＳ，０．６８μＭ ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ ＰｒｏＲＳ，０．０４μＭ ＳｅｒＲＳ，０．０９μＭ ＴｈｒＲＳ，０．０３μＭ ＴｒｐＲＳ，０．２２μＭ ＴｙｒＲＳ，０．０２μＭ ＶａｌＲＳ、３μＭ 転写ｔＲＮＡ Ａｌａ１Ｂ（配列番号ＭＴＬ－１３）、３μＭ 転写ｔＲＮＡ Ｔｙｒ１（配列番号ＭＴＬ－１４）、２５０μＭグリシン、２５０μＭイソロイシン、２５０μＭプロリン、２５０μＭスレオニン、２５０μＭトリプトファン、２５０μＭバリン、１００μＭセリン、５ｍＭ Ｎ－メチルアラニン、５ｍＭ Ｎ－メチルフェニルアラニン、２ｍＭ Ｄ－チロシン。さらに翻訳液Ｓ用アミノアシル化ｔＲＮＡ混合物および翻訳液Ｓ用Initiatorアミノアシル化tRNAを加えて調製した。また翻訳液Ｔは上記の翻訳液Ｓ用アミノアシル化ｔＲＮＡ混合物および翻訳液Ｓ用Initiatorアミノアシル化tRNAを含まない翻訳液Ｓに０．０２μＭ ＣｙｓＲＳ、２５０μＭシステイン、および翻訳液Ｔ用アミノアシル化ｔＲＮＡ混合物を加えて調製した。 [1720] ・ラウンド１のパニングを行うための翻訳、環化、脱硫、逆転写反応、パニング、PCR １μＭ initiation suppression翻訳用もしくはRead throuth 翻訳用ｍＲＮＡ－ピューロマイシンリンカーライゲーション産物混合物を含む前述のＳ用、Ｔ用それぞれ２ｍｌ翻訳液を調製し、３７℃で１２０分間保温後、室温で１２分間放置した。この翻訳混合物に対して、２００μｌの２００ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０、Nacalai社、14362-24）および１００μｌの２００ｍＭ ＴＣＥＰ溶液（ｐＨ７．０）を加え、３７℃で１２０分間保温し、環化反応を行った。その後、翻訳混合物に対して、２６０μｌの２５０ｍＭ Ｃｙｓ溶液および４０００μｌの４００ｍＭ ＴＣＥＰ溶液（ｐＨ７．０）を加え、４０℃で５分間保温した。続けて、１６００μｌの１Ｍ ＶＡ－０４４（Wako社、CAS No.27776-21-2）を加えて、４０℃で１時間脱硫反応後、RNeasy mini kit（Qiagen社）により精製し、１ｍｌのペプチド－mRNA複合体溶液を調製した。この溶液に、３μＭ プライマー（配列番号ＤＯＬ－３）、M-MLV reverse transcriptase reaction buffer（Promega社、M368B）、０．５ｍＭ ｄＧＴＰ，０.５ｍＭ ｄＡＴＰ，０.５ｍＭ ｄＣＴＰ，０.５ｍＭ ｄＴＴＰ、８Ｕ/μｌ M-MLV Reverse transcriptase (H-) (Promega社、M368B)を加えNuclease free waterで２ｍｌにメスアップし、４２℃、１時間保温し、逆転写反応を行った。逆転写溶液に対してブロッキング剤SuperBlock T20（Pierce社、37516）を等量加え、４ｍｌのペプチド－mRNA複合体溶液とした。 [1721] 上記の溶液に対して、ビオチン化標的タンパク質を２００ｎＭとなるように加え、４℃、３０分間回転混和を行った。その後、Dynabeads M-270 streptavidin（invitrogen社、653-05）を加え、４℃、５分間回転混和を行った。上清を取り除き、１ｘＴＢＳＴ（Nacalai社）で２度洗浄した。ＤＮＡポリメラーゼを含まず、０．５μＭ プライマー（配列番号ＤＯＬ－４）および０．５μＭ プライマー（配列番号ＤＯＬ－５）を含むＰＣＲ溶液をDynabeadsに加え、９５℃で１０分間加熱溶出し、上清を回収した。上清に対してＤＮＡポリメラーゼ Ex taq（Takara社、RR001A-24）を加え、ＰＣＲによってｃＤＮＡを増幅後、QIAquick PCR purification kit（Qiagen社）によりＤＮＡを精製した。 [1722] 配列番号ＤＯＬ－３（配列番号：１６０） TTTGTCCCCGCCGCCCTAAGAGCCAGAGCCAGAGCCGCT [1723] 配列番号ＤＯＬ－４（配列番号：１６１） GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGA [1724] 配列番号ＤＯＬ－５（配列番号：１６２） TTTGTCCCCGCCGCCcta [1725] ・ラウンド２のパニングを行うための転写、ライゲーション、翻訳、環化、脱硫、逆転写反応→パニング操作→PCR ラウンド１で増幅したｃＤＮＡから、RiboMAX Express Large Scale RNA Production System (Promega社，Ｐ１３２０）を用いてｍＲＮＡを合成し、RNeasy MinElute kit（Qiagen社）により精製した。次にT4 RNA ligase(NEB, M0204L)を利用してｍＲＮＡとピューロマイシンリンカーを連結し、RNeasy MinElute kit（Qiagen社）により精製した。１μＭ ｍＲＮＡ－ピューロマイシンリンカーライゲーション産物を含む前述の１００μｌ翻訳液を調製し、３７℃で６０分間保温後、室温で１２分間放置した。この翻訳混合物に対して環化反応のために、１０μｌの２００ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０、Nacalai社、14362-24）および５μｌの２００ｍＭ ＴＣＥＰ溶液（ｐＨ７．０）を加え、３７℃で１２０分間保温した。翻訳液Ｓに０．５Ｍ ＫＯＨを加えて、ｐＨ１０に調整後、４２℃で３０分間保温した。その後、０．５Ｍ ＨＣｌを加えて、ｐＨ７に調整した。その後、それぞれの翻訳混合物に対して、１３μｌの２５０ｍＭ Ｃｙｓ溶液および２００μｌの４００ｍＭ ＴＣＥＰ溶液（ｐＨ７．０）を加え、４０℃で１分間保温した。続けて、８０μｌの１Ｍ ＶＡ－０４４（Wako社、CAS No.27776-21-2）を加えて、４０℃で１時間脱硫反応後、RNeasy MinElute kit（Qiagen社）により精製し、１００μｌのペプチド－mRNA複合体溶液を調製した。この溶液に、３μＭ プライマー（配列番号ＤＯＬ－３）、M-MLV reverse transcriptase reaction buffer（Promega社、M368B）、０．５ｍＭ ｄＧＴＰ，０.５ｍＭ ｄＡＴＰ，０.５ｍＭ ｄＣＴＰ，０.５ｍＭ ｄＴＴＰ、８Ｕ／μｌ M-MLV Reverse transcriptase (H-) (Promega社、M368B)を加えNuclease free waterでメスアップし、２００μｌ溶液で４２℃、１５分間保温し、逆転写反応を行った。逆転写溶液に対してブロッキング剤SuperBlock T20（Pierce社、37516）を等量加え、４００μｌのペプチド－mRNA複合体溶液とした。 [1726] 上記の溶液に対して、Dynabeads M-270 streptavidinを加え、４℃、５分間回転混和を行い、上清を回収した。上清に対してビオチン化標的タンパク質を２００ｎＭとなるように加え、４℃、３０分間回転混和を行った。その後、Dynabeads M-270 streptavidinを加え、４℃、５分間回転混和し、上清を取り除き、１ｘＴＢＳＴ（Nacalai社）で３度洗浄した。ＤＮＡポリメラーゼを含まず、０．５μＭ プライマー（配列番号ＤＯＬ－４）および０．５μＭ プライマー（配列番号ＤＯＬ－５）を含むＰＣＲ溶液をDynabeadsに加え、９５℃で１０分間加熱溶出し、上清を回収した。上清に対してＤＮＡポリメラーゼ Extaq（Takara社、RR001A-24）を加え、ＰＣＲによってｃＤＮＡを増幅後、QIAquick PCR purification kit（Qiagen社）によりＤＮＡを精製した。 [1727] ・ラウンド３のパニングを行うための転写、ライゲーション、翻訳、環化、脱硫、逆転写反応→パニング操作→PCR ラウンド２で増幅したｃＤＮＡから、RiboMAX Express Large Scale RNA Production System (Promega社，Ｐ１３２０）を用いてｍＲＮＡを合成し、RNeasy MinElute kit（Qiagen社）により精製した。次にT4 RNA ligase(NEB, M0204L)を利用してｍＲＮＡとピューロマイシンリンカーを連結し、RNeasy MinElute kit（Qiagen社）により精製した。１μＭ ｍＲＮＡ－ピューロマイシンリンカーライゲーション産物を含む前述の１０μｌ翻訳液を調製し、３７℃で６０分間保温後、室温で１２分間放置した。この翻訳混合物に対して環化反応のために、１μｌの２００ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０、Nacalai社、14362-24）および０．５μｌの２００ｍＭ ＴＣＥＰ溶液（ｐＨ７．０）を加え、３７℃で１２０分間保温した。翻訳液Ｓに０．５Ｍ ＫＯＨを加えて、ｐＨ１０に調整後、４２℃で３０分間保温した。その後、０．５Ｍ ＨＣｌを加えて、ｐＨ７に調整した。その後、それぞれの翻訳混合物に対して、１．３μｌの２５０ｍＭ Ｃｙｓ溶液および２０μｌの４００ｍＭ ＴＣＥＰ溶液（ｐＨ７．０）を加え、４０℃で１分間保温した。続けて、８μｌの１Ｍ ＶＡ－０４４（Wako社、CAS No.27776-21-2）を加えて、４０℃で１時間脱硫反応後、RNeasy MinElute kit（Qiagen社）により精製し、１０μｌのペプチド－mRNA複合体溶液を調製した。この溶液に、３μＭ プライマー（配列番号ＤＯＬ－３）、M-MLV reverse transcriptase reaction buffer（Promega社、M368B）、０．５ｍＭ ｄＧＴＰ，０.５ｍＭ ｄＡＴＰ，０.５ｍＭ ｄＣＴＰ，０.５ｍＭ ｄＴＴＰ、８Ｕ／μｌ M-MLV Reverse transcriptase (H-)（Promega社、M368B）を加えNuclease free waterで２００μｌにメスアップし、４２℃、１５分間保温し、逆転写反応を行った。逆転写溶液に対してブロッキング剤SuperBlock T20（Pierce社、37516）を等量加え、４０μｌのペプチド－mRNA複合体溶液とした。 [1728] 上記の溶液１０μｌに対して、Dynabeads M-270 streptavidinを加え、４℃、５分間回転混和を行い、上清を回収した。この操作を計３回繰り返した上清に対してビオチン化標的タンパク質を２００ｎＭとなるように加え、４℃、３０分間回転混和を行った。その後、Dynabeads M-270 streptavidinを加え、４℃、５分間回転混和を行った。上清を取り除き、１ｘＴＢＳＴ（Nacalai社）で３度洗浄した。ＤＮＡポリメラーゼを含まず、０．５μＭ プライマー（配列番号ＤＯＬ－４）および０．５μＭ プライマー（配列番号ＤＯＬ－５）を含むＰＣＲ溶液をDynabeadsに加え、９５℃で１０分間加熱溶出し、上清を回収した。上清に対してＤＮＡポリメラーゼ Ex taq（Takara社、RR001A-24）を加え、ＰＣＲによってｃＤＮＡを増幅後、QIAquick PCR purification kit（Qiagen社）によりＤＮＡを精製した。 ラウンド４－６においても、ラウンド３と同じ操作を繰り返すことで標的タンパク質特異的な結合を示すｃＤＮＡの濃縮を行った。濃縮されたＤＮＡプールの塩基配列解析を行い、濃縮されたペプチド配列を同定した。」 （２）甲２に記載された事項 甲２には、以下の記載がある。（原文は英文であるため当審による翻訳文で示す。下線は当審による。） 甲２ａ 「本研究の目的は、ペプチドおよびペプチド模倣体のin vitroアッセイの予測性を最適化するために、ADMEデータのin vitro/in vivo相関を構築することである。立体化学、分子内水素結合、及びN－メチル化を考慮すると、計算モデルにより、環状ペプチドの相対的なin vitro膜透過性を正確に予測できることがこれまでに示されている。本研究のもう一つの目的は、側鎖の極性が膜透過性に及ぼす影響を考慮するための計算モデルの有効性をさらに最適化することである。」（第２頁第３パラグラフ） 甲２ｂ 「化合物1のデザインは、脂溶性環状ペプチド天然物の一種にヒントを得たもので、この天然物は、「薬物らしくない」外見にもかかわらず、経ロバイオアベイラビリティを含め、薬物のようなPK特性を示し得る。これらの天然物は、主鎖のN－メチル化、広範な分子内水素結合、及び、脂肪族アミノ酸の優位性により特徴付けられる。以前の研究では、立体化学とN－メチル化のパターンが主鎖の形状に及ぼす効果と、その結果として生じる膜透過性への影響を評価した。 この環状ヘキサペプチドテンプレートの膜透過性とクリアランス特性に対する個々のアミノ酸置換の影響をより詳細に理解するために、Rを、さまざまなイオン化状態およびlog D値の範囲にまたがる8つの追加の標準アミノ酸側鎖（化合物3-10）で置換した。これらの化合物をin vitroでプロファイリングし、脂溶性、膜透過性、クリアランス特性を評価した。脂溶性はシェイクフラスコlog Dを用いて測定し、膜透過性はRRCK (ラルフ・ラス イヌ腎細胞株、低流出特性を求めて選択されたマディン・ダービーイヌ腎細胞株由来) を用いて測定し、クリアランスはHLMを用いて測定した。以前に報告された化合物1および2に、新規な8つの化合物を加えた結果を表lに示した。この化学空間のADME特性に関する知識をさらに広げるために、6種類の非天然Nーメチル化アミノ酸を合成し、それらを環状ヘキサペプチドに組み込んで化合物11-16を作製した（表2）。」（第２頁第５パラグラフ～第３頁第１パラグラフ） 甲２ｃ 「このシリーズのin vitro物性は、log D値によって大きく変化した。この位置に芳香族または極性脂肪族側鎖を導入した場合（化合物4-8）、log Dは有意に低下せず (log Dは 3.64～4.57) 、HLM値は高いままであり、CLint,app,scaled値は29.4 mL min-1 kg-1かそれ以上であった。イオン化可能なアスパラギン酸およびリジンの側鎖を導入した場合（化合物9および10）、log Dとクリアランスが劇的に低下したが、その代償として膜透過性が低下した。脂肪族アルコールであるスレオニン側鎖（3）は、中程度の膜透過性（RRCK Papp=4.69×10-6 cm s-1-1）を維持しながら、log Dを低下させた（3.17）。化合物3は、log Dが低下したにもかかわらず、in vitro HLM値は高く（CLint,app,scaled=88.9 mL min-1 kg-1）、他の脂肪族アルコールであるセリンの誘導体2に見られるものと同様の値であった。」（第３頁第３パラグラフ） 甲２ｄ 「16種類の環状ペプチドにわたって、log DとRRCK膜透過性（図1）、log DとHLMクリアランス（図2）の間に良好な相関が見られた。3付近のlog Dが特に好ましいように思われ、化合物3（log D=3.17）は中程度の膜透過性（RRCK Papp=4.69×10-6 cm s-1）を、化合物15（log D=2.7）は中程度のクリアランス（HLM CLint,app,scaled=15.8 mL min-1 kg-1）を示した。我々は、この有望な化学領域におけるN－メチル化環状ペプチドのプロファイリングをさらに進めていく予定である。」（第４頁第２パラグラフ） 甲２ｅ 「要約と結論 本研究の目的は、同じコア足場に基づく一連の化合物のPK特性に対する側鎖機能性の影響を評価することであった。具体的には、極性側鎖を組み込んだ結果、幅広いlog D値を持つ1の構造モチーフを持つ分子の特徴を明らかにしようとした。我々は、log Dを調節することで、in vitroでのクリアランスと透過性を最適化するための特性空間を定義できると考えた。このような本質的に経口的に生物学的に利用可能な足場に極性基を導入する能力は、構造の多様性と特性空間に劇的な影響を与えることができるため、環状ペプチドベースの治療薬の設計に示唆を与える。誘導体の5つから得られたin vivoバイオアベイラビリティのデータに基づくと、側鎖の極性、透過性、%Fの間には明らかな傾向があった。Leuを正（Lys）または負（Asp）に荷電した残基で置換すると、in vitroでの透過性、ひいては経口バイオアベイラビリティが著しく低下したが、LeuからThrへの置換では％Fがわずかに低下しただけであった。驚くべきことに、β-メチルを除去してSer誘導体を作製すると、細胞透過性と経口バイオアベイラビリティの両方が劇的に低下した。この結果は、2級および3級のβ-ヒドロキシル基は親油性の環状ペプチド天然物（多くの場合、β-ヒドロキシバリンやβ-ヒドロキシロイシンのような非タンパク質性残基の形をしている）によく見られるが、1級のヒドロキシル基（例えば、Ser残基）は比較的稀であるという逸話的観察と一致する（55,000以上の海洋および陸上の天然物のAntimarinデータベースでの環状ペプチド天然物の調査に基づく）。 これらは別々に開発されたが、Kesslerとその共同研究者によって報告されたソマトスタチンアナログであるcyclo-[LPro-LPhe-DTrp(NMe)-LLys(NMe)-LThr-LPhe(NMe)]は、N-メチル化のパターンが同じであり、化合物1と同じβ-ヘアピン様骨格構造を共有している。このKesslerペプチドは、Lys残基を1つ含むという点で、われわれの化合物10と似ているが、10とは異なり、Caco-2透過性はよく、ラットでの経口バイオアベイラビリティはまあまあ（10％）であった。このペプチドはCaco-2アッセイにおいて、頂端側から基底膜側への透過率と基底膜側から頂端側への透過率が同じであったことから、あり得る透過性のメカニズムとして能動輸送は除外された。上記の方法でKesslerペプチドをモデル化したところ（データは示していない）、発表されたNMR構造と類似した膜結合型コンフォメーションが予測された。しかし、予測された透過性は低く（log Pm=-0.36）、10で観察された透過性と経口バイオアベイラビリティの低さと一致していた。KesslerペプチドはThr残基を含んでおり、Thr変異体3が示すように有利な内部水素結合を形成する可能性があるが、このペプチドはカチオン性のLys残基も持っており、10とそのNε-Me変異体11では細胞透過性を劇的に低下させる。Kesslerペプチドには、Lys残基に隣接するDTrpを含む3つの芳香族残基があり、これらの芳香族残基が陽イオン-π相互作用を介して疎水性膜環境からプロトン化Lys側鎖を遮蔽し、このペプチドの予想外に高い透過性と経口バイオアベイラビリティに寄与していると推測される。今後の研究では、LeuからXへの置換（ここで、X＝Phe、Trp、Tyrなど）が10の透過性に及ぼす影響を調べることによって、この仮説に取り組む予定である。」（第７頁第２パラグラフ～第８頁第１パラグラフ） 甲２ｆ 「 ［図：0001406724000042.jpg］ ［図：0001406724000043.jpg］ ［図：0001406724000044.jpg］ ［図：0001406724000045.jpg］ 」（表1、2） ３．申立理由１（進歩性）について （１）本件発明１について ア 甲１発明 甲１の実施例２５（特に段落[1710]、[1720]）（甲１ｉ）の記載からすると、甲１には、以下の発明が記載されていると認められる。 「ピューロマイシンリンカーと連結したＭＭＬ－１、ＭＭＬ－２、ＭＭＬ－３をそれぞれモル比１：２１：４４１となるように混合して得られるinitiation suppression翻訳用ｍＲＮＡ－ピューロマイシンリンカーライゲーション産物混合物を含むＳ用翻訳液から得られる翻訳混合物に対して、環化反応、脱硫反応、逆転写反応を行って得られるペプチド－mRNA複合体溶液」 （以下「甲１発明１」という。） 「ピューロマイシンリンカーと連結したＭＭＬ－４、ＭＭＬ－５、ＭＭＬ－６をそれぞれモル比１：２１：４４１となるように混合して得られるRead throuth翻訳用ｍＲＮＡ－ピューロマイシンリンカーライゲーション産物混合物を含むＴ用翻訳液から得られる翻訳混合物に対して、環化反応、脱硫反応、逆転写反応を行って得られるペプチド－mRNA複合体溶液」 （以下「甲１発明２」という。） イ 甲１発明１の「ペプチド－mRNA複合体」の「ペプチド」部分の解釈 （ア）甲１発明１の「ペプチド－mRNA複合体」の「ペプチド」は環状であること 甲１の段落[1710]（甲１ｉ）には、「PCRにより調製したＤＮＡライブラリー(配列番号 ＤＭＬ－１～ＤＭＬ－３(Initiation suppression翻訳用)、ＤＭＬ－４～ＤＭＬ－６(Read throuth翻訳用)) を鋳型に、in vitro転写により以下のmRNA（配列番号ＭＭＬ－１～ＭＭＬ－３(Initiation suppression翻訳用)、配列番号ＭＭＬ－４～ＭＭＬ－６(Read throuth翻訳用))を調製し、RNeasy mini kit (Qiagen社)を用いて精製した。」と記載されていることから、ＭＭＬ－１、ＭＭＬ－２、ＭＭＬ－３が、initiation suppression翻訳用ｍＲＮＡ－ピューロマイシンリンカーライゲーション産物混合物におけるmRNA部分である。そうすると、甲１発明１の「ペプチド－mRNA複合体」の「ペプチド」部分は、initiation suppression翻訳用ｍＲＮＡ－ピューロマイシンリンカーライゲーション産物混合物のＭＭＬ－１～３からの翻訳産物に由来するものであると解される。 そこで、ＭＭＬ－１～３からどのような翻訳産物が翻訳され得るのか、その後の環化反応、脱硫反応、逆転写反応を経ることで、甲１発明１の「ペプチド－mRNA複合体」の「ペプチド」部分がどのような構造を有するものになるのかについて、以下に検討する。 ａ ＭＭＬ－１～３の配列におけるオープンリーディングフレーム 一般に開始コドンがAUGであり、終止コドンがUAA、UAG、UGAであることからすると、甲１の段落[1712]～[1714]（甲１ｉ）に記載されたＭＭＬ－１～３の配列におけるオープンリーディングフレームは、それぞれ以下のとおりであると解される。 ・ＭＭＬ－１：AUG(RRR)7CGU(YYY)(RRR)AGCGGCUCUGGCUCUGGCUCUUAG ・ＭＭＬ－２：AUG(RRR)8CGU(YYY)(RRR)AGCGGCUCUGGCUCUGGCUCUUAG ・ＭＭＬ－３：AUG(RRR)9CGU(YYY)(RRR)AGCGGCUCUGGCUCUGGCUCUUAG ｂ 開始コドンAUGがコードするアミノ酸 甲１の段落 [1638]の表21及び段落[1712]（甲１ｉ）の記載によると、Ｓ用翻訳液には、initiatorアミノアシル化tRNAとして化合物ＡＴＬ－１３が用いられている。そして、甲１の段落 [1652]（甲１ｉ）の記載よれば、化合物ＡＴＬ－１３は、アンチコドンとしてCAU（対応するコドンはAUG）を有するtRNAに、tBuSSEtGABAをアミノアシル化させたものであることから、ＭＭＬ－１～３の開始コドンAUGがコードするアミノ酸は、tBuSSEtGABAであると解される。 ｃ CGUがコードするアミノ酸 甲１の段落[1712]（甲１ｉ）の記載によると、Ｓ用翻訳液には、翻訳液Ｓ用アミノアシル化ｔＲＮＡ混合物が含まれており、段落[1637]の表20（甲１ｉ）によると、この翻訳液Ｓ用アミノアシル化ｔＲＮＡ混合物には、アミノアシル化ｔＲＮＡとして化合物ＡＴＬ－１～１０、１２が含まれることが示されている。このうち、化合物ＡＴＬ－２は、甲１の段落[1641]（甲１ｉ）を参照すると、アンチコドンとしてACG（対応するコドンはCGU）を有するtRNAに、Asp(SMe)がアミノアシル化されたものであることから、ＭＭＬ－１～３の配列中、(YYY)の直前に位置するCGUがコードするアミノ酸は、Asp(SMe)であると解される。 ｄ RRRがコードするアミノ酸 甲１の段落[1711]（甲１ｉ）には、（RRR）と示した箇所は、UUU、AUU、GUU、AGU、CCG、ACU、GCU、CAU、UGG、GGU、UAC、CAG、AAC、CGG、AGG、UUG、CUU、CUA、UAG、UGC、GAA がランダムに出現することを意味すると記載されている。 そして、翻訳液Ｓ用アミノアシル化ｔＲＮＡ混合物に含まれる化合物ＡＴＬ－１～１０、１２が有するアンチコドンの配列との対応関係、及び、Ｓ用翻訳液に含まれるアミノ酸に対応するコドンとの対応関係を考慮すると、RRRと示した箇所においてランダムに出現するUUU、AUU、GUU、AGU、CCG、ACU、GCU、UGG、GGU、UAC、CAG、AAC、CGG、AGG、UUG、CUU、CUA、UAG、UGC、GAAがコードするアミノ酸は、それぞれMePhe、Ile、Val、Ser、Pro、Thr、MeAla、Trp、Gly、D-Tyr、β-Ala、nPrGly、MeSer、MePhe(3-Cl)、MeGly、Phg、MePhe(4-CF3)、Hyp(Et)、Met(O2)、MeAla(4-Thz)であると解される。 なお、CAUについては、これに対応するアンチコドン（AUG）を有するアミノアシル化ｔＲＮＡないし通常CAUがコードするHisがＳ用翻訳液に含まれていないため、CAUがコードするアミノ酸は不明である。 したがって、甲１発明１の「ペプチド－mRNA複合体」の「ペプチド」部分のRRRと示した箇所に対応する位置には、ランダムにインドール骨格を有するTrp、無置換のヒドロキシフェニル基を有するD-Tyrが存在することとなる。 ｅ YYYがコードするアミノ酸 甲１の段落[1711]（甲１ｉ）には、（YYY）と示した箇所には、UUU、CCG、GCU、CAU、AAC、CGG、AGG、UUG、UAG、GAAがランダムに出現することを意味すると記載されている。 そして、YYYと示した箇所においてランダムに出現するUUU、CCG、GCU、AAC、CGG、AGG、UUG、UAG、GAAがコードするアミノ酸は、上記ｄで検討したとおり、それぞれMePhe、Pro、MeAla、nPrGly、MeSer、MePhe(3-Cl)、MeGly、Hyp(Et)、MeAla(4-Thz)であると解される。 なお、上記ｄでも述べたとおり、CAUがコードするアミノ酸は不明である。 ｆ AGCGGCUCUGGCUCUGGCUCUがコードするアミノ酸配列 ＭＭＬ－１～３の配列中の(YYY)(RRR)の直後に位置する、AGCGGCUCUGGCUCUGGCUCUがコードするアミノ酸配列は、上記ｄと同様に対応関係を検討すると、Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Serであると解される。 ｇ 環化反応 甲１の段落[0549]～[0551]（甲１ｆ）及び図２７（甲１ｇ）には、鋳型ＤＮＡであるKA03 DNA配列（配列番号 Ｄ－６）に、転写翻訳液、ＭｅｔおよびＬｅｕを除く各０．３ｍＭの１８種類のタンパク質性アミノ酸，および２５μＭ tBuSSEtGABA-tRNAfMetCAU（化合物番号 ＡＴ－６－Ｃ）と５０μＭ Asp(SMe)-tRNAEnAsnGAG（化合物番号 ＡＴ－１－ＩＡ２）を加え３７℃で３時間翻訳して得た翻訳産物に、１／２０（ｖ／ｖ）量の２００ｍＭ ＴＣＥＰ（ｐＨ６．６）を添加し、３７℃で１５分反応させ、Asp(SMe)部位と分子内環化反応を行ったこと、その結果、目的の環状ペプチド（ペプチド配列Ｐ－４３）がＭＳスペクトルで確認されたことが記載されている。 ここで、甲１の段落[0390]（甲１ｅ）に示されたKA03 DNA配列（配列番号 Ｄ－６）と、転写翻訳液に含まれるアミノアシルtRNAが有するアンチコドンの配列ないし転写翻訳液に含まれるアミノ酸に対応するコドンとの対応関係を考慮すると、KA03 DNA配列からの転写翻訳産物のアミノ酸配列は、ペプチド配列Ｐ－４２のとおりであると解される。この翻訳産物が環化することにより、段落[0551]（甲１ｆ）に記載の環状ペプチドが得られるのであるから、上記環化反応では、ペプチド配列Ｐ－４２におけるtBuSSEtGABAの主鎖窒素原子とAsp(SMe)の側鎖チオエステル基とがアミド結合により環化するとともに、tBuSSEtGABAのtBuS基が脱保護され、HSEtGABAになるものと解される。 そうすると、ＭＭＬ－１～３からの翻訳産物とペプチド配列Ｐ－４２とは、そのアミノ酸配列に開始アミノ酸としてのtBuSSEtGABAに加えて、Asp(SMe)を有している点で一致しており、かつ、同様の条件で環化反応が行われていることから、ＭＭＬ－１～３からの翻訳産物は、甲１発明１の「環化反応」により、tBuSSEtGABAの主鎖窒素原子とAsp(SMe)の側鎖チオエステル基とがアミド結合により環化するとともに、tBuSSEtGABAのtBuS基が脱保護され、HSEtGABA になることで、環状ペプチド化合物が生成するものと解される。 ｈ 脱硫反応 甲１の段落[0068]（甲１ａ）には、「得られた環状ペプチドのＳＨ基をＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシルエチル）ホスフィン）とＶＡ－０４４（２，２'－アゾビスー２－（２－イミダゾリン－２－イル）プロパン）などの試薬を加えるＲＮＡが反応しない温和な反応条件で脱硫させることができる。」と記載されていることから、甲１発明１の「脱硫反応」では、環化反応で得られた環状ペプチド化合物中のHSEtGABAが有するＳＨ基を脱硫する反応であると解される。 ｉ 逆転写反応 逆転写反応は、RNAを鋳型にしてcDNAを合成する反応であるから、ペプチドの構造には影響しないと解される。 以上の検討から、甲１発明１の「ペプチド－mRNA複合体」の「ペプチド」部分は、ＭＭＬ－１～３の翻訳産物が、tBuSSEtGABAの主鎖窒素原子とAsp(SMe)の側鎖チオエステル基とがアミド結合により環化するとともに、tBuSSEtGABAのtBuS基が脱保護され、HSEtGABAになり、さらにHSEtGABAが有するＳＨ基が脱硫された環状ペプチド化合物であると解される。 （イ）甲１発明１の「ペプチド－mRNA複合体」の「環状ペプチド」がライブラリであること 上記（ア）で検討したとおり、甲１発明１の「ペプチド－mRNA複合体」の「ペプチド」部分は、環状ペプチド化合物であるから、甲１発明１の「ペプチド－mRNA複合体」は、環状ペプチド化合物－mRNA複合体である。 また、本件明細書等の【０２１４】（本ｈ）の「本開示におけるライブラリには、環状ペプチド化合物、又はこれらをコードする核酸が複数含まれる。」との記載からすると、環状ペプチド化合物、又はこれらをコードする核酸が複数含まれていれば、ライブラリであるといえる。 ここで、甲１発明１の「ペプチド－mRNA複合体溶液」は、ＭＭＬ－１～３中に (RRR)や(YYY)の配列を有することで、アミノ酸配列の異なる多数の環状ペプチド化合物を含み得るものであるから、ライブラリであるといえる。 さらに、甲１の実施例２５（特に段落[1721]～[1728]）（甲１ｉ）には、甲１発明１の「ペプチド－mRNA複合体溶液」を用いて、ビオチン化タンパク質に対するパニングをラウンド６まで繰り返すことにより、標的タンパク質特異的な結合を示すｃＤＮＡの濃縮を行い、濃縮されたＤＮＡプールの塩基配列解析を行い、濃縮されたペプチド配列を同定した旨記載されているから、甲１発明１の「ペプチド－mRNA複合体溶液」は、標的分子に特異的に結合できる化合物の同定に使用されるものである。 そして、上記（ア）ｄで検討したとおり、甲１発明１の「ペプチド－mRNA複合体」の「ペプチド」部分のRRRと示した箇所に対応する位置には、ランダムにインドール骨格を有するTrp、置換又は無置換のヒドロキシフェニル基を有するD-Tyrが存在する。 そうすると、甲１発明１の「ペプチド－mRNA複合体」の「環状ペプチド」は、標的分子に特異的に結合できる化合物の同定に使用されるライブラリであり、ライブラリには、環状部の側鎖に（１）インドール骨格、及び（２）無置換のヒドロキシフェニル基を有する環状ペプチド化合物が含まれているといえる。 （ウ）甲１発明１の「ペプチド－mRNA複合体」の「環状ペプチド」のアミノ酸の数と多様性 甲１発明１の「ペプチド－mRNA複合体」の「ペプチド」部分は、ＭＭＬ－１～３からの翻訳産物が、tBuSSEtGABAの主鎖窒素原子とAsp(SMe)の側鎖チオエステル基とがアミド結合により環化したものであるから、その環状部を構成するアミノ酸は、ＭＭＬ－１に由来する環状ペプチド化合物であれば９個、ＭＭＬ－２に由来するものであれば１０個、ＭＭＬ－３に由来するものであれば１１個である。 甲１発明１の「ＭＭＬ－１」には、そのコード領域に、RRRを８個、YYYを１個含むものであり、RRR、YYYに出現する配列はそれぞれ２１種類、１０種類である。しかし、上記（ア）ｄ、ｅで述べたとおり、RRR、YYYに出現する配列のうちCAUはコードするアミノ酸が不明であり、CAUをコードするアミノ酸を含む環状ペプチド化合物が製造されないものとしてＭＭＬ－１に由来する環状ペプチド化合物の多様性を計算すると、２０８×９となる。そして、甲１発明１の「ペプチド－mRNA複合体溶液」には、ＭＭＬ－１に由来する環状ペプチド化合物のほか、ＭＭＬ－２、３に由来するペプチド化合物も含まれるので、甲１発明１の「ペプチド－mRNA複合体」の「環状ペプチド」は、少なくとも２０８×９の多様性を有するといえる。 そうすると、甲１発明１の「ペプチド－mRNA複合体」の「環状ペプチド」の環状部を構成するアミノ酸の数は９～１１個であり、甲１発明１の「ペプチド－mRNA複合体」の「環状ペプチド」のライブラリは、少なくとも２０８×９の多様性を有するものであるといえる。 （エ）小括 上記の（ア）～（ウ）をまとめると、甲１発明１の「ペプチド－mRNA複合体」の「ペプチド」部分は、環状部を構成するアミノ酸の数が９～１１個の環状ペプチドであり、標的分子に特異的に結合できる化合物の同定に使用される、少なくとも２０８×９の多様性を有するライブラリであり、ライブラリには、環状部の側鎖に（１）インドール骨格、及び（２）無置換のヒドロキシフェニル基を有する環状ペプチド化合物が含まれるものであるといえる。 ウ 本件発明１と甲１発明１の対比 本件明細書等の段落【００８３】（本ｃ）の「本開示におけるペプチド化合物には、ペプチド、ペプチドと核酸の複合体（ペプチド－核酸複合体）、ペプチドとリボソームと核酸の複合体等が含まれる。」の記載によると、本件発明１の「ペプチド化合物」には、ペプチドと核酸の複合体（ペプチド－核酸複合体）が含まれるので、甲１発明１の「ペプチド－mRNA複合体」は、本件発明１の「環状ペプチド化合物」に相当する。 そして、甲１発明１の「ペプチド－mRNA複合体」の「ペプチド」部分は、上記イ（エ）で示したとおり、「環状部を構成するアミノ酸の数が９～１１個の環状ペプチド」であって「標的分子に特異的に結合できる化合物の同定に使用される」、「少なくとも２０８×９の多様性を有するライブラリ」というものであり、それらは、本件発明１の「環状ペプチド化合物の環状部を構成するアミノ酸の数の平均が７～１４」、「標的分子に特異的に結合できる化合物の同定に使用する」、「ライブラリが、１×１０3以上の多様性を有する」に相当する。 そうすると、本件発明１と甲１発明１は、 「標的分子に特異的に結合できる化合物の同定に使用するための、環状ペプチド化合物のライブラリであって、 前記ライブラリに含まれる環状ペプチド化合物の環状部を構成するアミノ酸の数の平均が７～１４であり、 前記ライブラリが、１×１０3以上の多様性を有する、 ライブラリ。」 である点で一致し、以下の点で相違する。 ＜相違点１＞ 本件発明１では、「ライブラリが、環状部の側鎖に、（１）インドール骨格、及び（２）置換又は無置換のヒドロキシフェニル基、を有しない環状ペプチド化合物から実質的にな」ることが特定されているのに対し、 甲１発明１では、「ライブラリに、環状部の側鎖に、（１）インドール骨格、及び（２）無置換のヒドロキシフェニル基、を有する環状ペプチド化合物が含まれる」点 ＜相違点２＞ 本件発明１では、「ライブラリが、長さが５．４～１３オングストロームの長側鎖を環状部に有する環状ペプチド化合物を含」むことが特定されているのに対し、 甲１発明１では、そのような特定がない点 ＜相違点３＞ 本件発明１では、「ライブラリに、環状部に酸性の側鎖を有する環状ペプチド化合物が含まれる場合、同環状ペプチド化合物が、該酸性の側鎖のｐＫａが３．５～１０である環状ペプチド化合物から実質的にな」ること、及び、「ライブラリに、環状部に塩基性の側鎖を有する環状ペプチド化合物が含まれる場合、同環状ペプチド化合物が、該塩基性の側鎖のＢａｓｉｃ ｐＫａが４．０～１０である環状ペプチド化合物から実質的にな」ることが特定されているのに対し、 甲１発明１では、そのような特定がない点 エ 相違点１の判断 甲１発明１の「ペプチド－mRNA複合体」の「環状ペプチド」には、環状部の側鎖に（１）インドール骨格、及び（２）無置換のヒドロキシフェニル基を有する環状ペプチド化合物が含まれるところ、甲１には、これらの環状ペプチド化合物のみを排除し、環状部の側鎖に、（１）インドール骨格、及び（２）置換又は無置換のヒドロキシフェニル基を有しない「環状ペプチド化合物」から実質的になるものにすることを動機付ける記載や示唆は何ら見当たらない。 一方、甲２の第３頁第１パラグラフ（甲２ｂ）には、「この環状ヘキサペプチドテンプレートの膜透過性とクリアランス特性に対する個々のアミノ酸置換の影響をより詳細に理解するために、Rを、さまざまなイオン化状態およびlog D値の範囲にまたがる8つの追加の標準アミノ酸側鎖（化合物3-10) で置換した。これらの化合物をin vitroでプロファイリングし、脂溶性、膜透過性、クリアランス特性を評価した。・・・以前に報告された化合物1および2に、新規な8つの化合物を加えた結果を表lに示した。この化学空間のADME特性に関する知識をさらに広げるために、6種類の非天然Nーメチル化アミノ酸を合成し、それらを環状ヘキサペプチドに組み込んで化合物11-16を作製した（表2）。」ことが記載されており、甲２の表1、2（甲２ｆ）には、化合物1～16について、膜透過性の指標となるRRCK Papp等の値が示されている。 ここで、甲２において、膜透過性が低下したと明示的に記載されている箇所は、イオン化可能なアスパラギン酸およびリジン側鎖 (化合物9および10 ) を組み込んだ場合（甲２ｃ、甲２ｅ）についてと、化合物10のNε-Me変異体11についてのみであって（甲２ｅ）、特にインドール骨格とヒドロキシフェニル基の側鎖に着目した記載は見られない。また、甲２の表1、2を参照すると、環状部の側鎖にアスパラギン酸側鎖を有する環状ペプチド（化合物9）のRRCK Papp値は0.4、環状部の側鎖にリジン側鎖を有する環状ペプチド（化合物10）のRRCK Papp値は0.3、環状部の側鎖にリジン側鎖のNε-Me変異体を有する環状ペプチド（化合物11）のRRCK Papp値は0.2である一方、環状部の側鎖にヒドロキシフェニル基を有する環状ペプチド（化合物6）のRRCK Papp値は1.3とこれら膜透過性が低下したとされる化合物9～11とはRRCK Papp値が相当異なっており、化合物6については、log Dは有意に低下せず （log Dは 3.64～4.57）、HLM値は高いままであり、CLint,app,scaled値は29.4 mL min-1 kg-1かそれ以上であったと評価されているのみで（甲２ｃ）、膜透過性が低下しているとは記載されていない。 さらに、環状ヘキサペプチドテンプレートは、もともと別の位置にもヒドロキシフェニル基を有するが（甲２ｆ）、当該位置のヒドロキシフェニル基を他の残基に変更することについては記載も示唆もない。また、甲２では、芳香族残基が陽イオン-π相互作用を介して疎水性膜環境からプロトン化Lys側鎖を遮蔽し、ペプチドの予想外に高い透過性と経口バイオアベイラビリティに寄与しているとも論じている（甲２ｅ）。 そうすると、甲２の上記記載は、膜透過性の観点で、甲２に記載される環状ペプチド化合物の環状部の側鎖として、特に、インドール骨格及びヒドロキシフェニル基を排除することを当業者に示唆するものとは認められない。 また、甲２には、「ペプチド－mRNA複合体」や「ライブラリ」について記載も示唆も見当たらないから、甲１、２の記載に接した当業者が、甲２の表1、2の結果を、ライブラリである甲１発明１の「ペプチド－mRNA複合体」の「環状ペプチド」の膜透過性に関連付けることはできないといえる。 そうすると、甲１、２の記載を勘案しても、ライブラリである甲１発明１の「ペプチド－mRNA複合体」の「ペプチド」部分において、特に、環状部の側鎖が、（１）インドール骨格、及び（２）置換又は無置換のヒドロキシフェニル基である環状ペプチド化合物を排除すること、すなわち、相違点１として挙げた本件発明１の発明特定事項である「ライブラリが、環状部の側鎖に、（１）インドール骨格、及び（２）置換又は無置換のヒドロキシフェニル基、を有しない環状ペプチド化合物から実質的にな」るものにすることが当業者に動機づけられるとは認められない。 一方、本件明細書等の段落【０００８】～【００１２】（本ｂ）、実施例４（本ｑ。特に段落【０８５４】～【０８５８】）及び実施例５（本ｒ。特に【０８７４】等）によると、本件発明１は、相違点１と相違点２を備えることで、膜透過性が高く、標的分子に特異的に結合できる環状ペプチド化合物を効率よくスクリーニングすることができるという甲１、２の記載からでは当業者が予測できない効果を奏するものである。 したがって、本件発明１は、相違点２、３の容易想到性について検討するまでもなく、甲１、甲２の記載を勘案しても、甲１発明１に基づき、当業者が容易に想到し得たものとは認められない。 また、本件発明１と甲１発明２とを対比した場合も、両者は少なくとも上記相違点１で相違しているから、上記説示したとおりの理由により、本件発明１は、甲１、甲２の記載を勘案しても、甲１発明２に基づき、当業者が容易に想到し得たものとは認められない。 以上のことから、本件発明１は、甲１、２に記載された発明に基づいて、当業者が容易に発明することができたものとはいえない。 （２）本件発明２～１３について 本件発明１を直接又は間接的に引用する本件発明２～１０は、本件発明１と同様の理由により、甲１、２に記載された発明に基づいて、当業者が容易に発明することができたものとはいえない。 （３）小括 以上のとおりであるから、申立理由１（進歩性）は、理由がない。 ４．申立理由２（実施可能要件、サポート要件）について （１）実施可能要件、サポート要件の考え方 発明の詳細な説明の記載が実施可能要件に適合するというためには、明細書の発明の詳細な説明に、当業者が、明細書の発明の詳細な説明の記載及び出願時の技術常識に基づいて、過度の試行錯誤を要することなく、その発明を実施することができる程度に発明の構成等の記載があることを要する。 また、特許請求の範囲の記載が明細書のサポート要件に適合するか否かは、特許請求の範囲の記載と発明の詳細な説明の記載とを対比し、特許請求の範囲に記載された発明が、発明の詳細な説明に記載された発明で、発明の詳細な説明の記載又はその示唆により当業者が当該発明の課題を解決できると認識できる範囲のものであるか否か、また、その記載や示唆がなくとも当業者が出願時の技術常識に照らし当該発明の課題を解決できると認識できる範囲のものであるか否かを検討して判断すべきものである。 （２）本件発明が解決しようとする課題 本件明細書等の【０００７】（本ａ）の記載によると、本件発明が解決しようとする課題は、細胞膜透過性（「膜透過性」ともいう。）の高い環状ペプチド化合物をスクリーニングするための、環状ペプチド化合物のライブラリを提供すること、及び、標的分子に特異的に結合できる環状ペプチド化合物を効率的にスクリーニングするための、環状ペプチド化合物のライブラリを提供することにあるものと認められる。 （３）本件発明１のサポート要件の判断 本件明細書等の段落【０００８】～【００１２】（本ｂ）には、標的分子に特異的に結合できる環状ペプチド化合物をスクリーニングする際に、長い側鎖を環状部に有する環状ペプチド化合物を含むライブラリを用いることで、標的分子に特異的に結合できる環状ペプチド化合物のヒット率が向上し得ること、すなわちスクリーニングの効率を高め得ることを見出したこと、及び、インドール骨格やヒドロキシフェニル基を有するペプチドは高い膜透過性を発揮することが難しくなることを見出したことから、膜透過性が高く、標的分子に特異的に結合できる環状ペプチド化合物を効率よくスクリーニングすることができるライブラリの一態様として、環状部に長い側鎖を有し、かつ、高い膜透過性を発揮しにくい側鎖を有しない環状ペプチド化合物のライブラリを見出し、本発明を完成するに至ったことが記載されている。 そして、本件明細書等の実施例４（特に段落【０８５４】～【０８５８】）（本ｑ）では、ペプチド化合物ライブラリをコードするランダム化された二本鎖ＤＮＡライブラリと翻訳液を使用し、ＷＯ２０１３／１００１３２に倣ってパニングを実施して、ランダム領域の各アミノ酸グループ(長側鎖を有するアミノ酸、長側鎖を有しない芳香族アミノ酸、長側鎖を有しない非芳香族アミノ酸)の出現頻度をパニングごとに計算し、標的によらず長側鎖のアミノ酸の出現頻度が高い傾向があったことが具体的に示されている。そして、表１５（本ｑ）のアミノ酸分類表において、長側鎖を有するアミノ酸としてグループ分けされた各アミノ酸について、その側鎖の長さは、本件明細書等の表１－１、１－２（本ｅ）を参照すると、いずれも本件発明１において規定された範囲内である。そうすると、長さが５．４～１３オングストロームの長側鎖を環状部に有する環状ペプチドを含むライブラリを用いることで、標的分子に特異的に結合できる環状ペプチド化合物のヒット率が向上し得ること、すなわちスクリーニングの効率を高め得ることが理解できる。 また、本件明細書等の実施例５（特に【０８７４】等）（本ｒ）では、Trp、Tyr、及びTyr(3-F)の側鎖を有する環状ペプチド化合物は、修飾を加えClogP/total aaを上昇させても、Papp≧1.0×10-6 cm/秒の基準を満たす環状ペプチド化合物を得ることは難しかった一方で、その他の長側鎖を有する環状ペプチド化合物は、修飾を加えClogP/total aaを上昇させることで、Papp≧1.0×10-6 cm/秒の基準を満たす化合物を多数得ることができたことが具体的に示されていることから、ライブラリが、環状部の側鎖に、（１）インドール骨格、及び（２）置換又は無置換のヒドロキシフェニル基、を有しない環状ペプチド化合物から実質的になることにより、細胞膜透過性の高い環状ペプチド化合物をスクリーニングし得る環状ペプチド化合物のライブラリを提供できることが理解できる。 よって、本件発明１は、当業者が、本件明細書等の発明の詳細な説明の記載から、上記（２）で示した課題を解決できると認識できる範囲のものであると認められる。 したがって、本件発明１は、サポート要件を満たすものである。 （４）本件発明１の実施可能要件の判断 本件明細書等の段落【０２２９】～【０２４６】（本ｋ）には、ペプチド化合物の化学合成方法及び翻訳合成方法が記載されており、段落【０２５０】～【０２５３】（本ｌ）には、ペプチド化合物の環化方法が記載されている。そして、本件明細書等の実施例１の１－４（本ｏ）では、化学合成により環状ペプチド化合物を合成したことが、実施例２の２－３，２－４（本ｐ）では、環化させてはいないものの、翻訳合成によりペプチド化合物を合成したことがそれぞれ記載されている。さらに、本件明細書等の段落【０２５９】～【０２７０】（本ｍ）には、ペプチド化合物のライブラリの製造方法が記載されており、実施例４（本ｑ）では、ペプチド化合物ライブラリをコードするランダム化された二本鎖ＤＮＡライブラリと翻訳液を使用し、ＷＯ２０１３／１００１３２に倣ってパニングを実施している。 ここで、ＷＯ２０１３／１００１３２（すなわち、甲１）の実施例２５（甲１ｉ）では、ランダム化されたＤＮＡライブラリを鋳型in vitro転写によりｍＲＮＡを調製し、それにピューロマイシンリンカーを連結したものを用いて、翻訳を実施した後、環化反応、脱硫を行って、ペプチド－ｍＲＮＡ複合体溶液を調製し、これを用いてビオチン化標的タンパク質に対するパニングを実施していることを勘案すると、本件明細書等の実施例４では、ＷＯ２０１３／１００１３２と同様の方法により、ペプチド－ｍＲＮＡ複合体溶液が調製されているものと解される。そして、このペプチド－ｍＲＮＡ複合体のペプチド部分は、上記二本鎖ＤＮＡライブラリのランダム化された配列に起因して、さまざまなアミノ酸配列を有するものと解されるので、本件明細書等の実施例４では、ペプチド化合物のライブラリが実際に製造されているといえる。 したがって、本件発明１のライブラリは、本件明細書等の上記記載及びＷＯ２０１３／１００１３２の記載に基づき当業者が過度の試行錯誤を要することなく、製造し得るものである。 また、上記（３）で説示したとおり、本件明細書等の実施例４、５（本ｑ、ｒ）の記載から、本件発明１のライブラリは、標的分子に特異的に結合できる環状ペプチド化合物のスクリーニングの効率を高め得るものであって、細胞膜透過性の高い環状ペプチド化合物をスクリーニングし得るものであるから、本件発明１のライブラリは、当業者が過度の試行錯誤を要することなく、標的分子に特異的に結合できる化合物の同定のために使用し得るものであるといえる。 したがって、当業者であれば、本件明細書等の発明の詳細な説明の記載及び本件特許の出願時の技術常識に基づいて、過度の試行錯誤を要することなく、本件発明１を実施することができるものと認められるので、本件発明１は、実施可能要件を満たすものである。 （５）申立人の主張について 申立人は、「（１）インドール骨格、及び（２）置換又は無置換のヒドロキシフェニル基」以外の環状部の側鎖に有するとすると膜透過性が低くなると推認される基、例えばアミノブチル基、を側鎖として有するペプチド化合物を含むライブラリを使用する場合、又は、実施例に記載された特定の4種類以外の標的の場合に、膜透過性の高い環状ペプチド化合物をスクリーニングできるとする根拠が不明であると主張する。 また、申立人は、ライブラリに含まれる、長側鎖を環状部に有する環状ペプチド化合物の比率が少なくなると、標的分子に特異的に結合できる環状ペプチド化合物のヒット率が低下するものと推測されるとも主張する。 しかしながら、４．（２）で示したとおり、本件発明が解決しようとする課題は、膜透過性の高い環状ペプチド化合物をスクリーニングするための、環状ペプチド化合物のライブラリを提供することだけでなく、標的分子に特異的に結合できる環状ペプチド化合物を効率的にスクリーニングするための環状ペプチド化合物のライブラリを提供することにあるから、アミノブチル基等を側鎖として有することや長側鎖を環状部に有する環状ペプチド化合物の比率が変わることで膜透過性やスクリーニングの効率性に多少の影響が生じる可能性があったとしても、本件発明の上記課題の達成や本件発明の実施において支障が生じるとまではいえない。 また、４．（３）で示したとおり、本件明細書等の実施例に、本件発明のライブラリが、複数の標的分子において、細胞膜透過性の高い環状ペプチド化合物を効率的にスクリーニングできることが記載されている以上、他の標的分子に対しても、同様の方法で本件発明のライブラリが適用可能であることは当業者が通常認識し得ることであり、このことを否定するような具体的な反証、例えば、追試実験や本件特許の優先日の技術常識等の客観的証拠は、申立人から何ら提示されていない。 したがって、申立人の上記主張は、いずれも理由がない。 （６）本件発明２～１２について 本件発明２～１２は、いずれも、本件発明１の発明特定事項を含む発明であるので、本件発明１と同様の理由により、実施可能要件及びサポート要件を満たすものである。 （７）小括 以上のとおりであるから、申立理由２（実施可能要件、サポート要件）は、理由がない。 ５．申立理由３（実施可能要件）について （１）実施可能要件の考え方 上記４．（１）に記載のとおりである。 （２）本件発明１３の実施可能要件の判断 本件明細書等の【０１８６】（本ｆ）には、本開示におけるライブラリには、特に環状ペプチド－ｍＲＮＡ複合体のライブラリが好ましいこと、ライブラリとしては、ディスプレイライブラリが好ましいこと、ディスプレイライブラリとしては、ディスプレイを利用したライブラリが例示され、中でもｍＲＮＡディスプレイライブラリ、ＤＮＡディスプレイライブラリ、リボソームディスプレイライブラリが好ましく、ｍＲＮＡディスプレイライブラリがより好ましいことが記載されている。 また、本件明細書等の【０２２２】～【０２２３】（本ｉ）には、ディスプレイライブラリは表現型であるペプチドとその遺伝子型であるペプチドをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡが対応付けられているライブラリであること、このライブラリを使用して、標的分子に特異的に結合できるペプチド化合物を同定することができ、このような過程を経て選択されたペプチドに対応付けられている遺伝子情報を解析することで標的に結合したペプチドの配列を明らかにすることができることが記載されるとともに、ｍＲＮＡディスプレイ法について、「Ｔ７プロモーターなどのプロモーターを含むＤＮＡライブラリから転写にて得たｍＲＮＡのライブラリの３'端にピューロマイシンなどのスペーサーを結合しておき、無細胞翻訳系でｍＲＮＡをタンパク質に翻訳させるとピューロマイシンがリボソームによってアミノ酸と間違ってタンパク質に取り込まれ、ｍＲＮＡとこれにコードされる蛋白質が連結され、ｍＲＮＡとその産物が対応付けられたライブラリになる。この過程では大腸菌などの形質転換を含まないため高い効率が実現され、大規模なディスプレイライブラリを構築することが出来る。パニングで濃縮、選択された分子についている遺伝子情報を含むタグであるｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ増幅し、塩基配列を解析することで結合した蛋白の配列を明らかにすることが出来る。」と記載されている。 さらに、本件明細書等の【０２７２】（本ｎ）には、本開示におけるスクリーニング方法は、本開示における環状ペプチド化合物のライブラリと標的分子を接触させ、標的分子に結合しないペプチド化合物を洗い流すことで標的分子に結合するペプチド化合物を濃縮することができること、及び、このようにして選択されたペプチド化合物に含まれる塩基配列情報を含むタグであるｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ増幅し、塩基配列を解析することで、結合したペプチドのアミノ酸配列を明らかにすることができることが記載されている。 以上の本件明細書等の記載によれば、当業者は、ｍＲＮＡディスプレイライブラリのようなディスプレイライブラリを用いることにより、標的に結合した環状ペプチド化合物のアミノ酸配列を明らかにでき、その明らかになったアミノ酸配列に基づいて、過度の試行錯誤を要することなく、本件発明１３の環状ペプチド化合物を製造することができるといえる。 したがって、「工程（ｉ）で用いられる多様な環状ペプチド化合物群からどのようなものが選択されるか当業者は理解することができない」、実施例「以外の標的分子を用いた場合の環状ペプチド化合物のアミノ酸配列を類推できるといえない。」との申立人の主張は理由がない。 （３）本件発明１の実施可能要件の判断 申立人は、本件発明１が実施可能要件を満たさない理由として、環状部にｐＫａ３．５～１０である酸性の側鎖を有する環状ペプチド化合物がライブラリに含まれる場合、及び、環状部にＢａｓｉｃ ｐＫａが４．０～１０である塩基性の側鎖を有する環状ペプチド化合物がライブラリに含まれる場合において、膜透過性の高い環状ペプチド化合物をスクリーニングできるとの根拠が不明である点を挙げる。 しかし、上記４．（４）で説示したとおり、本件発明１が実施可能要件を満たすことは、本件明細書等の実施例４、５（本ｑ、ｒ）の記載からも明らかである。 確かに本件明細書等の発明の詳細な説明には、実測値のｐＫａが３．８であるＧｌｎ（Ｍｓ）を含む配列や、実測値のＢａｓｉｃ ｐＫａが９．１であるＳｅｒ（Ｅｔ－２－ＮＭｅ２）を含む配列が、膜透過性に関してＰａｐｐ≧１．０×１０－６cm／秒を達成することが困難であったことが記載されているが（本ｓ）、本件発明１は、膜透過性に関してＰａｐｐ≧１．０×１０－６cm／秒を達成することを発明特定事項とする発明でないから、申立人による上記の根拠が不明である旨の指摘は失当である。 したがって、申立人の上記主張は、理由がない。 （４）本件発明３、８の実施可能要件の判断 本件明細書等の段落【０１０９】～【０１１０】（本ｄ）には、ClogPは、コンピューターで計算した分配係数であって、Daylight Chemical Information Systems, Inc.のDaylight Version 4.9を用いて計算できること、及び、「total aa」 (「total AA」とも表記される。) とは、ペプチド化合物の核酸連結部以外のペプチド部位を構成するアミノ酸の数を意味することが記載されている。 そして、本件明細書等の段落【０２２８】（本ｊ）には、ペプチド化合物を含むライブラリの製造方法としては、例えば化学合成、翻訳合成、又はこれらの組み合わせを利用できることが記載されている。 ここで、環状ペプチド化合物を化学合成してライブラリを製造する場合であれば、合成する１つ１つの環状ペプチド化合物について、total aaは決まった値であり、また、ClogPは計算可能なものであるため、ClogP/total aaの値は把握することができる。したがって、当業者は、化学合成した個々の環状ペプチド化合物のClogP/total aaの値に留意しながら、ライブラリに含ませる環状ペプチド化合物を選択することで、過度の試行錯誤を強いることなく、ライブラリに含まれる環状ペプチド化合物のClogP/total aaの平均を所定の範囲内に調節することができるといえる。 また、環状ペプチド化合物を翻訳合成してライブラリを製造する場合であれば、鋳型の配列に応じて、翻訳合成される環状ペプチド化合物の化学構造は予測可能であって、その化学構造から、total aaが一義的に定まるし、ClogPも計算により求めることが可能である。すなわち、鋳型の配列が決まればClogP/total aaの値も決まるといえる。したがって、当業者は、鋳型の配列に対応する環状ペプチド化合物のClogP/total aaの値に留意しながら、翻訳合成に用いる鋳型の配列を設計することにより、過度の試行錯誤を強いることなく、ライブラリに含まれる環状ペプチド化合物のClogP/total aaの平均を所定の範囲内に調節することができる。 そうすると、いずれの方法でライブラリを製造する場合であっても、当業者であれば、過度の試行錯誤を要することなく、ライブラリに含まれる環状ペプチド化合物のClogP/total aaの平均を所定の範囲に調節できるといえるから、本件発明３、８は、実施可能要件を満たすといえる。 したがって、「１×１０3以上の多様性を有し、かつＣｌｏｇＰ／ｔｏｔａｌ ａａの平均が１．０～１．８であるライブラリ」について「当業者が作製できるとも理解できない。」との申立人の主張は理由がない。 （５）小括 以上のとおりであるから、申立理由３（実施可能要件）は、理由がない。 第５ むすび 本件特許に係る特許異議申立てにおいて申立人が主張する申立理由は、いずれも理由がないから、本件発明１～１３に係る特許は、取り消すことができない。 ほかに、本件発明１～１３に係る特許を取り消すべき理由も発見しない。 よって、結論のとおり決定する。