2023-000306

特願２０２０－１６０５０７「リプログラミングＴ細胞および造血細胞」拒絶査定不服審判事件〔令和 ３年 １月 ７日出願公開、特開２０２１－ １３１〕について、次のとおり審決する。

結 論 本件審判の請求は、成り立たない。

理 由 第１ 手続の経緯 本願は、平成２２年６月４日（パリ条約による優先権主張 ２００９年６月５日、２００９年９月４日、いずれも米国）を国際出願日とする特願２０１２－５１４１６９号の一部を新たな特許出願とした特願２０１７－０５２５４２号の一部をさらに新たな特許出願とした特願２０１８－１３８４３２号の一部をさらに新たな特許出願としたものであって、その手続の主な経緯は次のとおりである。 令和２年 ９月２５日 翻訳文提出書 令和２年１０月２３日 手続補正書 令和３年１１月２２日付け 拒絶理由通知書 令和４年 ５月２４日 意見書・手続補正書 同年 ９月１２日付け 拒絶査定 令和５年 １月１０日 審判請求書・手続補正書 第２ 令和５年１月１０日にされた手続補正についての補正の却下の決定 ［補正の却下の決定の結論］ 令和５年１月１０日にされた手続補正（以下「本件補正」という。）を却下する。 ［理由］ １ 本件補正について （１）本件補正後の特許請求の範囲の記載 本件補正により、特許請求の範囲の請求項１の記載は、次のとおり補正された（下線部は補正箇所である。）。 「【請求項１】 ＣＤ３４＋造血始原細胞から人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を作製する方法であって、 （ａ）ＣＤ３４＋造血始原細胞の増大を可能にする１つ以上のサイトカインと共に低接着プレートを用いた接着培養においてｉｎ ｖｉｔｒｏで培養して、その中で前記ＣＤ３４＋造血始原細胞の集団を増大させている精製されたＣＤ３４＋造血始原細胞を含む細胞集団を入手する工程であって、前記ＣＤ３４＋造血始原細胞が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から精製されたものであり、前記末梢血単核細胞が、健常なヒト被験体の末梢血サンプルから単離されたものであり、前記健常なヒト被験体の細胞が、外的に加えられる因子で動員されていない、工程と、 （ｂ）Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２、ならびにｃＭｙｃ、Ｋｌｆ４、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８から選択されるリプログラミング因子の少なくとも２つをコードする１つ以上の発現カセットを含む１つ以上のエピソーム複製ベクターの導入を介して前記細胞集団の前記ＣＤ３４＋造血始原細胞からｉＰＳ細胞を産生させて、組み込まれた外来性ウイルス要素を本質的に含まないｉＰＳ細胞集団を提供する工程であって、前記１つ以上の発現カセットは、少なくとも２つのリプログラミング因子を含むポリシストロニック転写単位を少なくとも含む、工程、 を含む、方法。」 （２）本件補正の適否について ア 本件補正前の請求項１には「（ａ）ＣＤ３４＋造血始原細胞の増大を可能にする１つ以上のサイトカインと共にｉｎ ｖｉｔｒｏで培養」と記載されていたところ、上記（１）のとおり、本件補正後の請求項１には「（ａ）ＣＤ３４＋造血始原細胞の増大を可能にする１つ以上のサイトカインと共に低接着プレートを用いた接着培養においてｉｎ ｖｉｔｒｏで培養」と記載されているので、本件補正は、ＣＤ３４＋造血始原細胞を低接着プレートを用いた接着培養において培養するとの事項を追加することを含むものである。 イ 翻訳文等の記載 令和２年９月２５日に提出された外国語書面の翻訳文（外国語による明細書、特許請求の範囲及び図面の翻訳文。以下、これらをまとめて「翻訳文等」あるいは「本願明細書等」という。）の段落【０３５４】には「…ＣＤ３４＋細胞のＭＡＣＳ分離を行った。ＣＤ３４＋ＭＡＣＳ精製細胞の画分をＦＡＣＳ分析のために収集し、残った細胞を、以下に示すＣＤ３４＋細胞増大培地を用いて低接着６ウェルプレートに再プレーティングした。…」と記載され、また、同【０３５８】には「…富化ＣＤ３４＋細胞画分を収集する。ＦＡＣＳ分析のために富化集団の画分を収集する。ＣＤ３４＋細胞増大培地を用いて低接着６ウェルプレートに残った細胞を再プレーティングする。…」と記載されていることから、ＣＤ３４＋造血始原細胞を低接着プレートを用いて培養するとの事項は翻訳文等に記載されているといえる。 しかし、ＣＤ３４＋造血始原細胞を「接着培養」において培養するとの事項は翻訳文等に明記されていない。 ウ 技術常識について 下記第３の４（１１）に示す引用文献１２には「精製されたＣＤ３４＋造血前駆細胞を、…７日間培養し、その後、非接着細胞を２つのグループに分けた。…グループＡ…の細胞は４種類のサイトカインとともにさらに７日間培養し、…グループＢ…の細胞はＧ－ＣＳＦのみとともにさらに７日間培養した。１４日目には、非接着細胞の数がグループＡで２２０倍、グループＢで１３０倍増加した。…」（摘記事項（１２ア））と記載され、また、下記第３の４（１２）に示す引用文献１５には「…ヒトＣＤ３４陽性造血系幹細胞は通常浮遊培養で増殖するために、…造血系幹細胞培地（ＨＰＧＭ）で培養することが必要である。微粒子コーティング２４ウェル組織培養プレートにＣＤ３４陽性造血系幹細胞を播種し、…無血清ＨＰＧＭ培地で６日間浮遊培養し、…。」（摘記事項（１５ア））と記載されるように、血液に由来するＣＤ３４＋細胞を培養させる際には「浮遊培養」することが本願出願日当時の技術常識である。 また、下記第３の４（１３）に示す引用文献１６には「細胞低接着表面及び細胞低接着容器で重要な事は、基材から細胞に対する刺激を抑える事であり、本発明においては…細胞がより完全な浮遊状態で培養できる細胞低接着表面を達成している。」（摘記事項（１６ア））と記載され、そして、下記第３の４（１４）に示す引用文献１７には「…まず、腸管細胞を適当な媒体中、低接着性の培養容器上で浮遊培養する。…低接着性の培養容器としては、通常、当分野で用いられている培養容器に低接着性となるような処理を施したものが例示される。培養容器としては、…市販されているものを用いることもできる。」（摘記事項（１７ア））と記載され、さらに、下記第３の４（１５）に示す引用文献１８には「…脂肪前駆細胞の培養は、…低接着培養皿内で当該脂肪前駆細胞を浮遊させた状態で実施してもよい。」と記載されるように、低接着の培養容器は「浮遊培養」で使用されるものであることが本願出願日当時の技術常識である。 エ 本件補正の適否について 上記ウで示した本願出願日当時の技術常識からみて、当業者は、上記イで示した翻訳文等に記載されたＣＤ３４＋造血始原細胞を低接着プレートを用いて培養するとの事項を、ＣＤ３４＋造血始原細胞を低接着プレートを用いて「浮遊培養」するとの事項と理解するから、翻訳文等に当該細胞を低接着プレートを用いて「接着培養」するとの事項が記載されてあったとは認められない。 したがって、ＣＤ３４＋造血始原細胞を低接着プレートを用いた「接着培養」において培養するとの事項を含む本件補正は、翻訳文等のすべての記載を総合することにより導かれる技術的事項との関係において、新たな技術的事項を導入するものであり、翻訳文等に記載された事項の範囲内においてするものであるとは認められない。 ２ 請求人の主張について 審判請求人（以下「請求人」という。）は、上記１（２）イで示した翻訳文等の段落【０３５４】の「ＣＤ３４＋細胞増大培地を用いて低接着６ウェルプレートに再プレーティングした。」との記載、及び同【０３５８】の「ＣＤ３４＋細胞増大培地を用いて低接着６ウェルプレートに残った細胞を再プレーティングする。」との記載の「再プレーティング」との記載から、「接着培養」であることが理解できる旨を主張する。 しかし、「プレーティング」なる文言は、「プレートの中に播種する」程度の意味を有するに過ぎず、上記１（２）ウで示した本願出願日当時の技術常識に基づく、ＣＤ３４＋造血始原細胞を「浮遊培養」することとは異なる、当該細胞を「接着培養」することを示す文言であると、当業者が理解し得る根拠にはなり得ないから、上記請求人の主張は採用できない。 ３ むすび 以上のとおり、本件補正は、翻訳文等に記載した事項の範囲内においてするものとはいえないから、本件補正は、特許法１７条の２第３項の規定に適合しない。 したがって、本件補正は、特許法１５９条１項で読み替えて準用する同法５３条１項の規定により、却下すべきものである。 よって、上記補正の却下の決定の結論のとおり決定する。 第３ 本願発明について １ 本願発明 上記第２のとおり本件補正は却下されたので、本願の請求項１～１９に係る発明は、令和４年５月２４日にされた手続補正によって補正された特許請求の範囲の請求項１～１９に記載されたとおりのものであるところ、その請求項１に係る発明は、次のとおりのものである（以下「本願発明」という。）。 「【請求項１】 ＣＤ３４＋造血始原細胞から人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を作製する方法であって、 （ａ）ＣＤ３４＋造血始原細胞の増大を可能にする１つ以上のサイトカインと共に低接着条件下でｉｎ ｖｉｔｒｏで培養して、その中で前記ＣＤ３４＋造血始原細胞の集団を増大させている精製されたＣＤ３４＋造血始原細胞を含む細胞集団を入手する工程であって、前記ＣＤ３４＋造血始原細胞が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から精製されたものであり、前記末梢血単核細胞が、ヒト被験体の末梢血サンプルから単離されたものであり、前記ヒト被験体の細胞が、外的に加えられる因子で動員されていない、工程と、 （ｂ）Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２、ならびにｃＭｙｃ、Ｋｌｆ４、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８から選択されるリプログラミング因子の少なくとも２つをコードする１つ以上の発現カセットを含む１つ以上のエピソーム複製ベクターの導入を介して前記細胞集団の前記ＣＤ３４＋造血始原細胞からｉＰＳ細胞を産生させて、組み込まれた外来性ウイルス要素を本質的に含まないｉＰＳ細胞集団を提供する工程であって、前記１つ以上の発現カセットは、少なくとも２つのリプログラミング因子を含むポリシストロニック転写単位を少なくとも含む、工程、 を含む、方法。」 ２ 原査定における理由の概要 令和４年９月１２日付け拒絶査定（以下「原査定」という。）の理由は、令和３年１１月２２日付け拒絶理由通知書に記載した理由１であって、本願の請求項１～１９に係る発明は、本願優先日前に頒布された刊行物である引用文献１～１４に記載された発明に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法２９条２項の規定により特許を受けることができないというものである。 ３ 本願の優先権主張について 本願の請求項１～１９に係る発明は、ＣＤ３４＋造血始原細胞からｉＰＳ細胞を作製する方法に係る発明であるが、ＣＤ３４＋造血始原細胞からｉＰＳ細胞を作製することについては、本願の第１の優先権主張の基礎となる米国出願第１８４５４６号（２００９年６月５日出願）の明細書には記載されておらず、本願の第２の優先権主張の基礎となる米国出願第２４０１１６号（２００９年９月４日出願）の明細書においてはじめて記載されたものであるので、本願の請求項１～１９に係る発明については、本願の第２の優先権主張日（以下「本願優先日」という。）である２００９年９月４日を進歩性の基準日として判断を行う。 ４ 引用文献の記載事項 （１）引用文献１ 原査定で引用文献１として引用された、本願優先日前に頒布された刊行物であるＢｌｏｏｄ（２００９．Ｍａｙ）Ｖｏｌ．１１３，Ｎｏ．２２，ｐ．５４７６～５４７９には、次の事項が記載されている（英語で記載されているため、当審による日本語訳で摘記する。また、下線は当審による。）。 （１ア）「ヒト血液からの人工多能性幹細胞の作製」（表題） （１イ）「皮膚生検によって得られたヒト真皮線維芽細胞は、限定された転写因子の異所性発現によって多能性へと直接リプログラムすることができる。ここでは、ＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＫＬＦ４／ＭＹＣのレトロウイルス形質導入を用いた、ＣＤ３４＋動員ヒト末梢血細胞からの人工多能性幹細胞の誘導について記述する。血液由来のヒト誘導多能性幹細胞は、形態学、表面抗原の発現、多能性関連転写因子、多能性細胞特異的遺伝子におけるＤＮＡメチル化状態、及びｉｎ ｖｉｔｒｏや奇形腫における分化能力に関してヒト胚性幹細胞と区別できない。ヒト血液から細胞のリプログラムが可能になれば、疾患を起こす体細胞突然変異が造血系細胞に限定される疾患患者特有の幹細胞の生成が可能になる。」（要約） （１ウ）「方法 詳細な方法は、ドキュメントＳ１（Ｂｌｏｏｄウェブサイトで入手可能、オンライン記事の上部にある補足資料のリンクを参照）に含まれている。簡潔には、Ａｌｌｃｅｌｌｓ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）から入手した動員された末梢血細胞は、２６歳の男性ドナーから収集され、ＣＤ３４＋細胞（ｍＰＢ０１４Ｆ）を単離した。以前に公表された方法９から改変されたプロトコルを使用して、ＣＤ３４ ｉＰＳ細胞の作製を行った。」（５４７６頁右欄１～７行） （１エ）「結果及び考察 …骨髄採取に関連するリスクを回避するため１０に、末梢血から単離した動員されたＣＤ３４＋造血幹細胞／前駆細胞を得た１１。レトロウイルス構築物の組み込み及び発現は、標的細胞の有糸分裂を必要とするので、我々はまず、ＣＤ３４＋細胞をｈＳＣＦ、ｈＦｌｔ３Ｌ及びＩＬ－３サイトカインの組み合わせと共にｉｎ ｖｉｔｒｏで培養して１２、ＣＤ３４＋細胞を数桁のオーダーで増殖及び増大させた（図１Ａ、Ｂ、Ｓ１Ａ）。６日間の培養期間の過程にわたるフローサイトメトリー分析により、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８－造血前駆細胞のパーセンテージの漸進的減少及び分化した表現型（ＣＤ１４、ＣＤ１５；図Ｓ１Ｂ、Ｃ）を有する細胞のパーセンテージの同時的な増加を示した。分化細胞又は成熟細胞の割合が高いと、造血前駆細胞の増大能に対して強い抑制効果が生じる１３。したがって、我々は、大部分の細胞が依然としてＣＤ３４を発現しており、活発に増殖していた培養の４日目に、ＣＤ３４＋細胞のウイルス形質導入を行った（図Ｓ１）。形質導入の３日後、細胞を回収し、フィーダーＭＥＦ細胞上にプレーティングした（図１Ａ）。１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞成長因子を補充したヒトＥＳ（ｈＥＳ）細胞培地を５日目に添加した（図１Ａ）。我々は、形質導入の約１４日後に初めてコロニーを検出した。ほとんどがｈＥＳ細胞特性を有さない顆粒化細胞クラスターに発達し（図１Ｃ）、その他の細胞はｈＥＳ細胞に特徴的な明瞭な丸いエッジを有する平坦でコンパクトな形態を示した（図１Ｄ）。我々は、５×１０４個のＣＤ３４＋細胞から、常に約５～１０個のｈＥＳ細胞様コロニーを観察した（３回の独立した実験からのデータ）。…全部で、８個の独立したＧｆｐ－コロ二ーを選んで増大し、２つの系統、ＣＤ３４ ｉＰＳ１及びＣＤ３４ ｉＰＳ２について十分に特性解析した。」（５４７６頁右欄８行～５４７７頁右欄４行） （１オ）「細胞培養。 動員された末梢血ＣＤ３４＋細胞（Ａｌｌｃｅｌｌｓ、ｍＰＢ０１４Ｆ）を、ｈＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ｈＦｌｔ３Ｌ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びインターロイキン－３（２０ｎｇ／ｍｌ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充した、１５％ウシ胎仔血清（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で維持した。４日間培養で増殖させたＣＤ３４＋細胞を、レトロウイルス形質導入に使用した。胚様体を形成するために、コンフルエントな未分化ＣＤ３４ ｉＰＳ細胞を、ストリップに機械的にこすり付け、２０％ウシ胎仔血清（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）、２ｍｇ／ｍｌヒトホロトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ）及び０．１ｍＭ ｂ－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）を補充した、ノックアウトＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からなる分化培地中で６ウェル低接触プレートに移した。 … ＣＤ３４＋細胞採取。 供給者（Ａｌｌｃｅｌｌｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）に従い、動員された末梢血から以下のように入手した。ドナーを、Ａｍｇｅｎで製造されたＮｅｕｐｏｇｅｎ（Ｇ－ＣＳＦ）で３日間５μ／ｋｇ／日の容量で注射した。４日目に、７血液容量のアフェレーシスを、Ｃｏｂｅアフェレーシス装置で実施し、３００ｍｌの血液を採取した。この採取物の総細胞数は、３．４×１０１０であり、ＣＤ３４＋細胞の収量は～１％であった。リプログラミング実験は、リプログラミング因子を保有するウイルスで感染させる前に４日間培養で増殖させた、５×１０４のＣＤ３４＋細胞で行った。 … レトロウイルス作製及びヒトｉＰＳ細胞誘導。 ヒトＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びＭＹＣレトロウイルスベクターは、線維芽細胞のリプログラミングのために以前使用された１。１５ｃｍプレート中の２９３Ｔ細胞に、６．２５μｇのレトロウイルスベクター、０．７５μｇのＶＳＶ－Ｇベクター及び５．６２５μｇのＧａｇ－ＰｏｌベクターをＦＵＧＥＮＥ６試薬を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、上清を０．４５μｍ酢酸セルロースフィルターで濾過し、２３，０００ｒｐｍで９０分間の遠心分離により濃縮し、使用するまで－８０℃で保存した。形質導入は、記載されているように２フィブロネクチンフラグメントＣＨ－２９６（レトロネクチン；タカラ酒造、大津、日本）でコーティングされた６マルチウェルプレート中のＣＤ３４＋細胞上で行った。ＭＯＩ（感染多重度）５でウイルスを加え、１２時間後に感染を繰り返した。各感染の間、細胞を１，３００ｒｐｍで１．５時間遠心分離した。感染の３日後、細胞をマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）で予め播種したプレートに分割した。感染の５日後に培地をヒトＥＳ培地に交換した。 … フローサイトメトリー。 動員された末梢血ＣＤ３４＋細胞は、２０分間氷上でＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で異なる抗体で染色して２、４、及び６日間培養した後で採取した。ＢＤバイオサイエンス（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）からの抗体は、ＰＥコンジュゲートＣＤ３４（クローン５６３）、ＡＰＣコンジュゲートＣＤ４５（クローンＨＩ３０）、ＦＩＴＣコンジュゲートＣＤ３８（クローンＨＢ７）、及びＦＩＴＣコンジュゲートＣＤ１５（クローンＨＩ９８）を含み、Ｃａｌｔａｇ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）からの抗体は、ＦＩＴＣコンジュゲートＣＤ１４（クローンＴＵＫ４）を含んだ。細胞は、５レーザーＬＳＲ－ＩＩ（ＢＤバイオサイエンス、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で分析し、死んだ細胞は、ヨウ化プロピジウム染色で除いた。 …」（補足資料） （２）引用文献２ 原査定で引用文献２として引用された、本願優先日前に頒布された刊行物であるＮａｔ．Ｇｅｎｅｔ．（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ Ａｕｇ．２００９）Ｖｏｌ．４１，Ｎｏ．９，ｐ．９６８～９７６には、以下の事項が記載されている（英語で記載されているため、当審による日本語訳で摘記する。）。 （２ア）「ヒト造血前駆細胞が等しくｉＰＳ細胞にリプログラミングすることができるかを試すために、我々は、ｒｔＴＡを発現するレンチウイルス構築物（補足の図６）と同様にドキシサイクリン制御下でＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃＭｙｃを発現するヒトポリシストロニックベクターに、ＣＤ３４＋臍帯血前駆細胞を感染させた。…この実験は、ヒト造血前駆細胞からｉＰＳ細胞を誘導する原理の証明を提供する。」（９７３頁右欄２０～３２行） （２イ）「ＣＤ３４＋臍帯血前駆細胞からのヒトｉＰＳ細胞の誘導 ヒトＣＤ３４＋臍帯血細胞は、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入し、ＳｔｅｍＳｐａｎ ＣＣ１００サイトカインカクテル（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で補充したＳｔｅｍＳｐａｎ血清不含増大培地（ＳＦＥＭ）で（解凍後）２４時間培養した。我々は、最近記述されたマウスポリシストロニックレンチウイルスベクターと同じく、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃＭｙｃのヒトｃＤＮＡを発現するポリシストロニックレンチウイルスに、１×１０５細胞を丸底９６穴プレートで感染させた。」（「オンライン方法」の項） （３）引用文献３ 原査定で引用文献３として引用された、本願優先日前に頒布された刊行物であるＳｃｉｅｎｃｅ（２００９．Ｍａｙ）Ｖｏｌ．３２４，Ｎｏ．５９２８，ｐ．７９７～８０１には、以下の事項が記載されている（英語で記載されているため、当審による日本語訳で摘記する。また、下線は当審による。）。 （３ア）「ベクター及び導入遺伝子配列を含まないヒト人工多能性幹細胞」（表題） （３イ）「分化したヒト細胞を人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞にリプログラミングすることは、基礎生物学、薬剤開発、及び移植に応用されている。ヒトｉＰＳ細胞誘導には、以前はゲノムに組み込まれるベクターが必要であり、これは変異を作出し、研究及び臨床応用の両方において細胞の有効性を制限し得る。我々は、非組み込みエピソームベクターの使用によるヒトｉＰＳ細胞の誘導を記載する。エピソームの除去後、増殖及び発生能においてヒト胚性幹（ＥＳ）細胞に類似した、ベクター及び導入遺伝子配列を完全に含まないｉＰＳ細胞が誘導される。これらの結果は、ヒト体細胞のリプログラミングが、外因性リプログラミング因子のゲノムへの組み込み又は継続的な存在を必要とせず、ヒトｉＰＳ細胞の臨床応用への障害の一つを除去することを実証する。」（要約） （３ウ）「ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８は、ヒトの胚性、新生児及び成人の線維芽細胞をｉＰＳ細胞にリプログラミングするのに十分であるが（２、１６）、リプログラミング効率は低い（新生児包皮線維芽細胞について０．０１％未満）（２）。安定なトランスフェクション効率は、我々のレンチウイルスベクターよりもほぼ二桁低いため、このように低い効率ではｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１によるベクターを用いたリプログラミングを困難にする（２）。そのため、我々はまず、レンチウイルスベクターを使用してリプログラミング効率を向上させた。ＯＣＴ４及びＳＯＸ２を共発現するために異なるリンカーを試験することにより、我々は、内部リボソーム進入部位２（ＩＲＥＳ２）がより高いリプログラミング効率を維持することを見出した（図Ｓ１、Ａ及びＢ）。リンカーは、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８を共発現させるために使用した場合、リプログラミング効率に対する影響が小さいので（図Ｓ１Ｂ）、リプログラミング因子を共発現させるためにＩＲＥＳ２を選択した。ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８のＩＲＥＳ２媒介性発現を使用して、我々は、ヒト包皮線維芽細胞についてのリプログラミング効率を、我々が以前に報告したものよりも約１０倍（～約０．１％）向上させた（図Ｓ１Ｃ）。ｃ－Ｍｙｃ及びＫＬＦ４を追加することで、リプログラミング効率は、これらの細胞について我々が達成した最高の効率である１％超へと、さらに向上した（図Ｓ１Ｃ）（１７）。そのため、我々は、共発現のためにＩＲＥＳ２を使用して、６個全てのリプログラミング因子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ｃ－Ｍｙｃ及びＫＬＦ４）をｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１ベクターにクローニングした。」（７９８頁左欄下から９行～右欄５行） （３エ）「エピソームベクター中の６個のリプログラミング遺伝子を用いた最初の試験では、ヒトｉＰＳ細胞コロニーは得られなかった（表Ｓ２）。この遺伝子の組合せでは、おそらく高いｃ－Ｍｙｃ発現の毒性効果のために、トランスフェクション後の１週間の間に実質的な細胞死が観察された（１８）。ｃ－Ｍｙｃ発現の毒性効果を打ち消すために、我々は、いくつかの組合せにＳＶ４０ラージＴ遺伝子（ＳＶ４０ＬＴ）を含ませた（１９）。これらの組合せは全てＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ｃ－Ｍｙｃ、ＫＬＦ４及びＳＶ４０ＬＴを含み、その組合せのうち３つが、ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１によるベクターを用いてヒト包皮線維芽細胞からｉＰＳ細胞を作製することに成功した（図１Ａ、図Ｓ２Ｄ及び表Ｓ２）。それぞれの成功した組合せの中の少なくとも２つのプラスミドはＯＣＴ４及びＳＯＸ２を発現し、このことは、これらの導入遺伝子の高い発現がリプログラミングを向上させるという観察と一致する。これらの組合せのうち２つに由来するクローン（実験３から１９、実験４から６及び表Ｓ２）を増大及び分析のために選択した。これらのｉＰＳ細胞コロニーは、典型的なヒトＥＳ細胞形態（例えば、小型のコロニー、高い核対細胞質比、及び顕著な核）を示し（図１Ｂ）、ヒトＥＳ細胞株と非常に類似した遺伝子発現プロフィールを示したが、親の線維芽細胞とは類似していなかった（図１Ｃ及び表Ｓ３）。これらのｉＰＳ細胞は、免疫減弱化マウスに注射した場合に、ヒトＥＳ細胞と同様に、３つ全ての一次胚葉の分化派生物からなる奇形種を形成した（図１Ｄ）。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析では、ゲノム中のエピソームベクターの組み込みは検出されなかったが、ベクターはエピソーム画分中に残ることが検出された（図１Ｅ）。エピソームベクターの持続性は、長期の導入遺伝子発現がリプログラミングの成功に必要なことを示唆する。」（７９８頁右欄１２行～８００頁左欄７行） （３オ）「 ［図：0001418527000001.jpg］ 」（図１Ａ） （４）引用文献４ 原査定で拒引用文献４として引用された、本願優先日前に頒布された刊行物である国際公開第２００９／０３２４５６号には、以下の事項が記載されている（英語で記載されているため、当審による日本語訳で摘記する。また、下線は当審による。）。 （４ア）「１．リプログラムされた細胞を産生する方法であって、 被験体から細胞を単離し、 少なくとも１つの多能性因子をウイルスを使用しないで細胞に導入し、リプログラムされた細胞を産生し、 リプログラムされた細胞の５％以上の細胞が、Ｏｃｔ－４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ１－６０、Ｓｔｅｌｌａ、アルカリフォスファターゼ、ＶＡＳＡ、ｃＲＥＴ及びＲｅｘ－１からなる群から選択される少なくとも１つの胚性幹細胞マーカーを発現しているかを決定する、ステップを含む方法。 … ７．前記細胞が、体細胞、生殖細胞及び生後幹細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。」（特許請求の範囲） （４イ）「…本方法に有用な成人体細胞の代表例は、繊維芽細胞、上皮細胞のような外胚葉細胞、骨髄細胞、ＣＤ３４＋末梢血幹細胞、心筋細胞、筋細胞、血管平滑筋細胞、肝細胞、腎細胞のような中胚葉組織細胞、血管内皮細胞のような内胚葉上皮細胞を含む。」（［００１０５］） （５）引用文献５の記載 原査定で引用文献５として引用された、本願優先日前に頒布された刊行物であるＮａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．（２００６）Ｖｏｌ．１，Ｎｏ．４，ｐ．２１７８～２１８３には、以下の事項が記載されている（英語で記載されているため、当審による日本語訳で摘記する。また、下線は当審による。）。 （５ア）「本プロトコルは、幹細胞動員処置を使用せずに、正常ドナー由来の末梢血細胞から相当数のヒト肥満細胞を得るための方法を詳述する。磁気セル・ソーティング・システムを用いることによって、健常ドナーから１００ｍ１の血液を採取した場合に、１０４～１０５細胞がＣＤ３４＋画分に回収される。これらの細胞を、幹細胞因子及びインターロイキン６を補充したメチルセルロース培地を使用して培養する場合、１０３～１０４の肥満細胞コロニーが６週間で形成される。培養６週間での総肥満細胞数は、１０６～１０７である。」（要約） （５イ）「手順 １日目 １ １００ｍｌのヒト末梢血を、各々がＰＢＳ中に５ｍｌの１００ｍＭ ＥＤＴＡを含む２つの５０ｍｌシリンジに回収する。 重要工程 本プロトコルには、新しい（４時間以内）試料が必要である。 注意 本研究の被験体は、本研究所の倫理検査評議会により承認された書面のインフォームドコンセントを提出するべきである。 ２ ２容量（１００ｍｌ）のＰＢＳで細胞を希釈する。 ３ ５０ｍｌコニカルチューブ中で１３ｍｌのリンパ球分離培地（１．０７７密度）上に３３ｍｌの希釈した細胞懸濁液を重ね、ブレーキをかけずにスイングバケットローター中で室温（２４℃）で４００ｇで３０分遠心分離する。 ４ 界面の細胞（単核細胞画分）を回収し、６つの新しい５０ｍｌコニカルチューブに移す。 ５ ６つのコニカルチューブをＰＢＳで満たし、室温で４００ｇで１０分遠心分離する。 ６ 上清を捨て、各細胞ペレットを５ｍｌのＰＢＳに再懸濁する。６つのチューブから細胞懸濁液を回収し、１つの５０ｍｌコニカルチューブに移し、４℃で４００ｇで１０分遠心分離する。 ７ 細胞ペレットを２０ｍｌの溶血性溶液中に再懸濁し、赤血球を破壊する。３分後、チューブを製造業者のＭＡＣＳリンス緩衝液（２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）で満たし、室温で４００ｇで１０分遠心分離する。 ８ 細胞ペレットを４０ｍｌのＭＡＣＳリンス緩衝液に再懸濁し、細胞数を計数し、４℃で５００ｇで４分遠心分離する。 ９ 細胞ペレットを１０８の総細胞あたり３００μｌのＭＡＣＳリンス緩衝液の最終容量に再懸濁する。我々は、通常、１００ｍｌの血液から１０８の末梢血単核細胞を得る。 １０ １０８の総細胞あたり１００μｌのＦｃＲブロッキング試薬を細胞懸濁液に添加し、非標的細胞へのＣＤ３４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓの非特異的またはＦｃレセプター媒介性結合を阻害する。 ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓでの細胞の標識 １１ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓでの細胞の標識には、２つのオプション（細胞のポジティブ選択またはネガティブ選択）が利用可能である。 （Ａ）ＣＤ３４＋細胞のポジティブ選択 （ｉ）１０８の総細胞あたり１００μｌのＣＤ３４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓを添加し、ウェルを混合し（１０分ごとに指でチューブをたたく）、４℃で３０分インキュベートすることにより細胞を標識する。 （Ｂ）系統陰性細胞のネガティブ選択 （ｉ）ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６及びＣＤ１９のＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（１０８の総細胞あたり各々１００μｌ）を添加し、ウェルを混合し（１０分ごとに指でチューブをたたく）、４℃で３０分インキュベートすることにより細胞を標識する。 １２ ４℃で５００ｇで４分遠心分離することにより、４０ｍｌのＭＡＣＳランニング緩衝液で細胞を２回洗浄する。 １３ １×１０８の総細胞あたり５ｍｌのＭＡＣＳランニング緩衝液で細胞を再懸濁する。 １４ 細胞を３０μｍナイロンメッシュに通し、凝集塊を除去する。使用前にＭＡＣＳ緩衝液でメッシュを湿らせる。 前駆細胞の分離 １５ 前駆細胞を、ａｕｔｏＭＡＣＳを使用してポジティブ選択（オプションＡ）若しくはネガティブ選択（オプションＢ）、又はＬＳカラムを用いたＳｕｐｅｒＭＡＣＳ ＩＩを使用するポジティブ選択（オプションＣ）若しくはＣＳカラムを用いたＳｕｐｅｒＭＡＣＳ ＩＩを使用するネガティブ選択（オプションＤ）のいずれかにより、細胞懸濁液から単離し得る。 （Ａ）ａｕｔｏＭＡＣＳセパレーターを使用するＣＤ３４＋細胞のポジティブ選択 （ｉ）ポジティブ選択のためにＰｏｓｓｅｌ－Ｄ２プログラムを選択することにより、細胞をａｕｔｏＭＡＣＳカラムにアプライし、細胞をカラムに通過させ、緩衝液で洗浄する。 （Ｂ）ａｕｔｏＭＡＣＳセパレーターを使用する系統陰性細胞ネガティブ選択 （ｉ）Ｄｅｐｌ－０５プログラムを選択することにより、細胞をａｕｔｏＭＡＣＳカラムにアプライし、細胞をカラムに通過させ、緩衝液で洗浄する。 （Ｃ）ＬＳカラムを用いたＳｕｐｅｒＭＡＣＳ ＩＩを使用するポジティブ選択 （ｉ）１×１０８細胞をＭＡＣＳ ＬＳカラムにアプライし、細胞をカラムに通過させ、緩衝液で洗浄する（詳細なプロトコルについては、製造業者のウェブページ：ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ．ｃｏｍ／を参照）。簡単に、磁力での反応の後、セパレーターからカラムを取り外し、カラムを適切なチューブに配置し、カラムの上部に緩衝液をピペットする。カラムを供給したプランジャーを使用することにより圧力で残存細胞を確実に洗い出すことによりＣＤ３４＋細胞を回収する。 （Ｄ）ＣＳカラムを用いたＳｕｐｅｒＭＡＣＳ ＩＩを使用するネガティブ選択 （ｉ）ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６及びＣＤ１９のＭｉｃｒｏＢｅａｄｓで標識した最大１０８細胞をＣＳカラム（ネガティブ選択のために指定される）にアプライする。セパレーターからカラムを取り外す前に、系統陰性細胞を、カラムの上部に緩衝液を繰り返しアプライすることにより完全に回収するべきである。 重要工程 多すぎる細胞をアプライすると標的細胞の回収に影響するので、ＭＡＣＳカラムにアプライする細胞数は重要である。本プロトコルにおける最適細胞数は、１０８～２×１０８である。また、カラムの使用期限の確認も必要である。 １６ ＣＤ３４＋細胞または系統陰性細胞を回収し、４℃で５００ｇで４分で２回基本培養培地で洗浄する。」（２１７９頁下から２５行～２１８０頁２９行） （６）引用文献６ 原査定で引用文献６として引用された、本願優先日前に頒布された刊行物であるＢｌｏｏｄ（１９９５）Ｖｏｌ．８６，Ｎｏ．１，ｐ．１４１～１４６には、以下の事項が記載されている（英語で記載されているため、当審による日本語訳で摘記する。）。 （６ア）「我々は、臨床的に許容できるレトロウイルス上清形質導入プロトコルを用いて、ゴーシェ病患者由来の非動員末梢血（ＰＢ）ＣＤ３４＋細胞に高効率遺伝子導入を達成した。」（要約左欄１～４行） （６イ）「ＣＤ３４＋細胞の単離 形質導入実験は、インフォームドコンセント及び研究所審査会の承認後の、正常志願者又はゴーシェ病患者から得られたＰＢ又はＢＭ細胞を用いて行われた。ＰＢ細胞は、Ｆｅｎｗａｌｌ ＣＳ３０００血液細胞分離装置（バクスター ヘルスケア、Ｉｎｃ、ディアフィールド、ＩＬ）を用いて、８～１０Ｌのアフェレーシスにより、動員せずに集められた。… ＰＢ又はＢＭからの単核（ＭＮ）細胞は、製造者の使用説明書に従って、研究室規模のＣｅｐｒａｔｅ ＬＣ細胞分離システム又は臨床規模のＣｅｐｒａｔｅ幹細胞濃縮装置（ＣｅｌｌＰｒｏ Ｉｎｃ、ボセル、ＷＡ）を用いて、ＣＤ３４＋細胞を濃縮した。」（１４２頁左欄１０～２２行） （７）引用文献７ 原査定で引用文献７として引用された、本願優先日前に頒布された刊行物であるＳｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（２００６）Ｖｏｌ．２４，ｐ．３３３～３３６には、以下の事項が記載されている（英語で記載されているため、当審による日本語訳で摘記する。）。 （７ア）「…我々は、６人のＡＭＩ患者において動員せずに末梢血ＣＤ３４＋細胞の単離をこころみた。大容量細胞吸着及びＣＤ３４＋細胞のポジティブ選択後、３６０～２７６０万個のＣＤ３４＋細胞が得られた。」（要約左欄４～８行） （７イ）「ＣＤ３４＋細胞濃縮 自己末梢血ＨＳＣは、Ｃｏｂｅ Ｓｐｅｃｔｒａ細胞分離装置で実施される大容量（１５～２０Ｌ）細胞吸着後に得られた。ＣＤ３４＋細胞のポジティブ選択は、バクスターＩｓｏｌｅｘ ３００ｉ医療機器で実施した。選択した細胞は、約２０時間４℃で維持した後、標識した。」（３３４頁左欄３０～３５行） （８）引用文献８ 原査定で引用文献８として引用された、本願優先日前に頒布された刊行物であるＢｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．（２００７）Ｖｏｌ．３９，ｐ．５７７～５８８には、以下の事項が記載されている（英語で記載されているため、当審による日本語訳で摘記する。）。 （８ア）「しかし、Ｇ－ＣＳＦ動員には、いくつかの重大な副作用が伴うことがあり、数日の投与レジメンが要求される。」（要約５～７行） （９）引用文献９ 原査定で引用文献９として引用された、本願優先日前に頒布された刊行物である特開２００６－３４２１３１号公報には、以下の事項が記載されている。 （９ア）「Ｇ－ＣＳＦ製剤はタンパク質製剤であるため、経済的に負担が大きい。また、造血幹・前駆細胞の骨髄から末梢血への動員剤としてＧ－ＣＳＦ製剤を使用する場合、入院で連日最低４日間の投与が必要であり、骨痛、発熱、頭痛等の副作用が報告されている。また、健常人ドナーの約１０％で造血幹・前駆細胞の動員効果が低いといわれており、移植に十分な造血幹・前駆細胞を採取するのは困難である。さらに、白血球増加剤としての使用は、頻回投与が必要であり、患者及び医師は苦痛と負担を強いられてきた。」（【０００５】） （１０）引用文献１０ 原査定で引用文献１０として引用された、本願優先日前に頒布された刊行物である特開２００６－６７８５８号公報には、以下の事項が記載されている。 （１０ア）「最近、骨髄に代わる造血幹細胞源として末梢血がしばしば用いられている。造血幹細胞を含むＣＤ３４陽性細胞は、健常人の末梢血にはごく少数しか存在していないが、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）を連続投与すると骨髄から末梢血に動員される。このＧ－ＣＳＦの連続投与によって造血幹細胞を動員した末梢血から、血液成分分離装置を用いて末梢血造血幹細胞／造血前駆細胞が採取され、移植に用いられている。しかし、この末梢血幹細胞移植は、Ｇ－ＣＳＦをドナーに投与する必要があり、それに伴う副作用などドナーへの負担が大きい。また、Ｇ－ＣＳＦ投与により骨髄から末梢血への造血幹細胞の動員が増えるとはいえ、その効率は低い。」（【０００３】） （１１）引用文献１２ 原査定で引用文献１２として引用された、本願優先日前に頒布された刊行物であるＢｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ（２０００）Ｖｏｌ．１０９，ｐ．３１４～３２１には、以下の事項が記載されている（英語で記載されているため、当審による日本語訳で摘記する。また、下線は当審による。）。 （１２ア）「精製されたＣＤ３４＋造血前駆細胞を、幹細胞因子、インターロイキン３（ＩＬ－３）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、および顆粒球ＣＳＦ（Ｇ－ＣＳＦ）とともに７日間培養し、その後、非接着細胞を２つのグループに分けた。一方のグループ（グループＡ）の細胞は４種類のサイトカインとともにさらに７日間培養し、もう一方のグループ（グループＢ）の細胞はＧ－ＣＳＦのみとともにさらに７日間培養した。１４日目には、非接着細胞の数がグループＡで２２０倍、グループＢで１３０倍増加した。これらの細胞調製物には、グループＡでは６５％の顆粒球、グループＢでは９５％の顆粒球が含まれていた。…」（要約） （１２）引用文献１５ 本願優先日当時の技術常識を示すものとして、当審で新たに引用文献１５として引用する、本願優先日前に頒布された刊行物である国際公開第２００９／０６６４６８号には、以下の事項が記載されている（下線は当審による。）。 （１５ア）「…ヒトＣＤ３４陽性造血系幹細胞は通常浮遊培養で増殖するために、…造血系幹細胞培地（ＨＰＧＭ）で培養することが必要である。微粒子コーティング２４ウェル組織培養プレートにＣＤ３４陽性造血系幹細胞を播種し、…無血清ＨＰＧＭ培地で６日間浮遊培養し、…。」（［００５９］） （１３）引用文献１６ 本願優先日当時の技術常識を示すものとして、当審で新たに引用文献１６として引用する、本願優先日前に頒布された刊行物である特開２００８－６１６０９号公報には、以下の事項が記載されている（下線は当審による。）。 （１６ア）「細胞低接着表面及び細胞低接着容器で重要な事は、基材から細胞に対する刺激を抑える事であり、本発明においては超親水性表面による疎水性相互作用の低減、及びハイドロゲル層の最適な厚みを構築する事による物理的な刺激の低減、更に水不溶性の硬化皮膜とする事で溶出物による刺激の低減、の３つの効果によって細胞がより完全な浮遊状態で培養できる細胞低接着表面を達成している。」（【００１２】） （１４）引用文献１７ 本願優先日当時の技術常識を示すものとして、当審で新たに引用文献１７として引用する、本願優先日前に頒布された刊行物である特開２００８－２０６５１０号公報には、以下の事項が記載されている（下線は当審による。）。 （１７ア）「腸管細胞の凝集体は、具体的には以下のようにして調製することができる。まず、腸管細胞を適当な媒体中、低接着性の培養容器上で浮遊培養する。例えば低接着性の培養容器として９６ウェルの丸底ディッシュを用いた場合には、１ウェルあたり２０～４０万細胞を播種し、形成した凝集体を低接着性の６ｃｍディッシュ等に移したりしながら、３７℃で、２～１０日間、好ましくは７日間、適当な媒体中で培養する。低接着性の培養容器としては、通常、当分野で用いられている培養容器に低接着性となるような処理を施したものが例示される。培養容器としては、培養ディッシュ、培養フラスコ、回転培養用器具（スピナーフラスコ等）等が挙げられる。低接着性となるような処理としては、ハイドロゲルを共有結合させること（コーティング）によって蛋白質や細胞の接着を抑制するような処理が用いられる。又、市販されているものを用いることもできる。」（【００１４】） （１５）引用文献１８ 本願優先日当時の技術常識を示すものとして、当審で新たに引用文献１８として引用する、本願優先日前に頒布された刊行物である国際公開第２００８／０３８５７２号には、以下の事項が記載されている（下線は当審による。）。 （１８ア）「上記脂肪前駆細胞を培養する条件については特に制限されないが、通常、３７℃、５％二酸化炭素存在下で、１～３０日間、好ましくは２～１４日間培養を行えばよい。このように培養を行うことによって、上記脂肪前駆細胞を歯周硬組織細胞に分化誘導させることができる。 なお、上記脂肪前駆細胞の培養は、培地中で当該脂肪前駆細胞が基材に付着させた状態で実施してもよく、また低接着培養皿内で当該脂肪前駆細胞を浮遊させた状態で実施してもよい。」（［００２８］、［００２９］） ５ 対比 （１）引用発明 摘記事項（１オ）の記載中、「ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びＭＹＣレトロウイルスベクター」は、その前の「リプログラミング因子を保有するウイルス」との記載より、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びＭＹＣのリプログラミング因子を発現させるためのウイルスベクターといえるから、該ベクターがＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びＭＹＣのリプログラミング因子をコードする発現カセットを含むものであることは明らかである。 また、摘記事項（１オ）の「動員された末梢血ＣＤ３４＋細胞」及び「ＣＤ３４＋細胞採取。…ドナーを、Ａｍｇｅｎで製造されたＮｅｕｐｏｇｅｎ（Ｇ－ＣＳＦ）で３日間５μ／ｋｇ／日の容量で注射した。４日目に、７血液容量のアフェレーシスを、Ｃｏｂｅアフェレーシス装置で実施し、３００ｍｌの血液を採取した。」との記載より、ヒト被験体の末梢血サンプルから採取された、ＣＤ３４＋造血前駆細胞を含む細胞は、Ｇ－ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）で動員されたものであり、かかる細胞より単離されたＣＤ３４＋造血前駆細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されているといえる。 そうすると、摘記事項（１ア）～（１オ）によると、引用文献１には、次の発明が記載されていると認める（以下「引用発明」という。）。 「ＣＤ３４＋造血前駆細胞から人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を作製する方法であって、 ＣＤ３４＋造血前駆細胞をｈＳＣＦ、ｈＦｌｔ３ＬおよびＩＬ－３サイトカインの組み合わせと共にｉｎ ｖｉｔｒｏで培養して、前記ＣＤ３４＋造血前駆細胞の集団を増大させている単離されたＣＤ３４＋造血前駆細胞を含む細胞集団を入手する工程であって、前記ＣＤ３４＋造血前駆細胞が、ヒト被験体の末梢血サンプルから単離されたものであり、前記ヒト被験体の細胞が、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）で動員されたものである、工程と、 ヒトＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びＭＹＣのリプログラミング因子をコードする発現カセットを含むレトロウイルスベクターの導入を介して前記細胞集団の前記ＣＤ３４＋造血前駆細胞からｉＰＳ細胞を産生させる工程、 を含む、方法。」 （２）対比 引用発明の「ＣＤ３４＋造血前駆細胞」及び「単離」は、本願発明の「ＣＤ３４＋造血始原細胞」及び「精製」にそれぞれ相当する。 そして、引用発明の「ＣＤ３４＋造血前駆細胞」は、ヒト被験体の末梢血サンプルから単離されたものであるから、本願発明の「末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から精製されたもの」に相当する。 また、引用発明の「ＯＣＴ４」、「ＳＯＸ２」、「ＫＬＦ４」及び「ＭＹＣ」は、本願発明の「Ｏｃｔ４」、「Ｓｏｘ２」、「Ｋｌｆ４」及び「ｃＭｙｃ」にそれぞれ相当する。 さらに、摘記事項（１エ）には、「ＣＤ３４＋細胞をｈＳＣＦ、ｈＦｌｔ３Ｌ及びＩＬ－３サイトカインの組み合わせと共にｉｎ ｖｉｔｒｏで培養して１２、ＣＤ３４＋細胞を数桁のオーダーで増殖及び増大させた」と記載されているから、引用発明の「ｈＳＣＦ、ｈＦｌｔ３ＬおよびＩＬ－３サイトカインの組み合わせ」は、本願発明の「ＣＤ３４＋造血前駆細胞の増大を可能にする１つ以上のサイトカイン」に相当する。 そうすると、本願発明と引用発明とは、 「ＣＤ３４＋造血始原細胞から人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を作製する方法であって、 （ａ）ＣＤ３４＋造血始原細胞の増大を可能にする１つ以上のサイトカインと共にｉｎ ｖｉｔｒｏで培養して、その中で前記ＣＤ３４＋造血始原細胞の集団を増大させている精製されたＣＤ３４＋造血始原細胞を含む細胞集団を入手する工程であって、前記ＣＤ３４＋造血始原細胞が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から精製されたものであり、前記末梢血単核細胞が、ヒト被験体の末梢血サンプルから単離されたものである、工程と、 （ｂ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃＭｙｃおよびＫｌｆ４のリプログラミング因子をコードする発現カセットを含むベクターの導入を介して前記細胞集団の前記ＣＤ３４＋造血始原細胞からｉＰＳ細胞を産生させる工程、 を含む、方法。」 である点で一致し、次の点で相違する。 相違点１：ヒト被験体の細胞が、本願発明では、「外的に加えられる因子で動員されていない」ものであるのに対し、引用発明では、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）で動員されたものである点。 相違点２：ベクターが、本願発明では、リプログラミング因子をコードする１つ以上の発現カセットを含む１つ以上のエピソーム複製ベクターであり、前記１つ以上の発現カセットは、少なくとも２つのリプログラミング因子を含むポリシストロニック転写単位を少なくとも含むものであり、組み込まれた外来性ウイルス要素を本質的に含まないｉＰＳ細胞集団を提供するものであるのに対し、引用発明では、レトロウイルスベクターであり、また、発現カセットが、少なくとも２つのリプログラミング因子を含むポリシストロニック転写単位を含むものであることは特定されておらず、さらに、組み込まれた外来性ウイルス要素を本質的に含まないｉＰＳ細胞集団を提供することも特定されていない点。 相違点３：ＣＤ３４＋造血始原細胞のサイトカインとの培養が、本願発明では「低接着条件下」で行うものであるのに対し、引用発明ではそのような特定がなされていない点。 ６ 当審の判断 （１）相違点１について 引用文献２には、ＣＤ３４＋臍帯血前駆細胞からｉＰＳ細胞を作製することができたことが記載されているところ（摘記事項（２ア）、（２イ））、ＣＤ３４＋臍帯血前駆細胞が「外的に加えられる因子で動員されていない」ことは明らかなので、引用文献２は、「外的に加えられる因子で動員されていない」ＣＤ３４＋造血始原細胞からｉＰＳ細胞を作製することができたことを実証するものといえる。 また、引用文献４には、ＣＤ３４＋末梢血幹細胞からｉＰＳ細胞を作製することが記載されている（摘記事項（４ア）、（４イ））ところ、ｉＰＳ細胞の作製に使用するＣＤ３４＋末梢血幹細胞として、Ｇ－ＣＳＦで動員された末梢血から精製されたものを使用することは記載されていないから、引用文献４は、「外的に加えられる因子で動員されていない」ＣＤ３４＋造血始原細胞からｉＰＳ細胞を作製することを記載するものである。 さらに、引用文献５～７に記載されているように、Ｇ－ＣＳＦなどの因子で動員されていない末梢血からＣＤ３４＋造血始原細胞を単離する方法は、本願優先日前に当業者に広く知られている（摘記事項（５ア）、（５イ）、（６ア）、（６イ）、（７ア）、（７イ））。 よって、以上の引用文献２、４、５～７の記載からすると、ｉＰＳ細胞を作製する際の原料となるＣＤ３４＋造血始原細胞を末梢血から得る場合に、末梢血にＧ－ＣＳＦなどの外的因子による動員が不可欠であるとの技術常識が、本願優先日当時に存したとは認められない。 一方、引用文献８～１０に記載されているように、Ｇ－ＣＳＦによる動員を使用した場合には、副作用が報告されており、また、動員に日数を要する等の問題があったことは、本願優先日前に当業者に周知であったと認められる（摘記事項（８ア）、（９ア）、（１０ア））。 そうすると、引用発明のｉＰＳ細胞の作製方法において、Ｇ－ＣＳＦによる動員を使用する場合の副作用や日数を要する等の問題を避けるために、引用文献５～７に記載されているようなＧ－ＣＳＦなどの「外的に加えられる因子で動員されていない」末梢血を用いることは、当業者が容易に想到し得ることである。 （２）相違点２について 摘記事項（３ア）～（３エ）から、引用文献３に記載されている「エピソームベクター」は、リプログラミング因子をコードする１つ以上の発現カセットを含む１つ以上のエピソーム複製ベクターであり、組み込まれた外来性ウイルス要素を本質的に含まないｉＰＳ細胞集団を提供することができるものである。 また、本願明細書等には、「具体的な実施形態では、１つ以上の発現カセットは、１つ以上のポリシストロニック転写単位を含み得る。ポリシストロニック単位は、例えば、（ｉ）少なくとも２つのリプログラミング遺伝子、例えば、Ｓｏｘ－Ｏｃｔ、ｃ－Ｍｙｃ－Ｋｌｆ、またはＮａｎｏｇ－Ｌｉｎ２８；あるいは、（ｉｉ）選択可能なまたはスクリーニング可能なマーカーに連結されたリプログラミング遺伝子などの作動可能に連結されたコード領域の異なる組み合わせを含み得る。」（【００１７】）と記載されており、本願発明の「ポリシストロニック転写単位」は、少なくとも２つのリプログラミング遺伝子の転写単位を含むものであるといえるところ、摘記事項（３オ）から、引用文献３に記載されている「エピソームベクター」は、「少なくとも２つのリプログラミング因子を含むポリシストロニック転写単位を少なくとも含む」ものである。 そして、摘記事項（３イ）によると、引用文献３に記載されている「エピソームベクター」は、引用発明で採用されている「レトロウイルスベクター」と異なり、ベクター及び導入遺伝子配列を含まないｉＰＳ細胞を作製できるという利点を有し、ヒトｉＰＳ細胞の臨床応用への障害の一つを除去するものであると説明されている。 そうすると、上記の引用文献３の記載に接した当業者であれば、引用発明のｉＰＳ細胞の作製方法において使用される「レトロウイルスベクター」に代えて、臨床応用への利点を備える、引用文献３に記載されているエピソーム複製ベクター、すなわち、「リプログラミング因子をコードする１つ以上の発現カセットを含む１つ以上のエピソーム複製ベクターであり、前記１つ以上の発現カセットは、少なくとも２つのリプログラミング因子を含むポリシストロニック転写単位を少なくとも含むものであり、組み込まれた外来性ウイルス要素を本質的に含まないｉＰＳ細胞集団を提供するものである」ベクターを用いることは、容易に想到し得ることである。 （３）相違点３について 上記第２の１（２）ウで検討したとおり、引用文献１２及び１５からみて、血液に由来するＣＤ３４＋細胞を培養させる際には「浮遊培養」すること（以下「技術常識１」という。）が、また、引用文献１６～１８からみて、低接着の培養容器は「浮遊培養」で使用されるものであること（以下「技術常識２」という。）が、本願優先日当時の技術常識である。 本願発明は、「ＣＤ３４＋造血始原細胞の増大を可能にする１つ以上のサイトカインと共に低接着条件下でｉｎ ｖｉｔｒｏで培養」して、当該ＣＤ３４＋造血始原細胞の集団を増大させるものであるところ、「ＣＤ３４＋造血始原細胞の集団を増大させる」こと、及び「低接着条件下でｉｎ ｖｉｔｒｏで培養」することという特定は、上記の本願優先日当時の技術常識１及び２に照らすと、「ＣＤ３４＋造血始原細胞」の培養を、「浮遊培養」で行うことを意味するものと認められる。 ここで、引用発明は、「ＣＤ３４＋造血前駆細胞をｈＳＣＦ、ｈＦｌｔ３ＬおよびＩＬ－３サイトカインの組み合わせと共にｉｎ ｖｉｔｒｏで培養」して、当該ＣＤ３４＋造血前駆細胞の集団を増大させるのであることから、上記の技術常識１からみて、引用発明においても、「ＣＤ３４＋造血前駆細胞」の培養を「浮遊培養」で行うものといえる。 そうすると、ＣＤ３４＋造血始原細胞のサイトカインとの培養は、本願発明及び引用発明のいずれでも「浮遊培養」で行うものであるといえるから、相違点３は実質的な相違点でない。 （４）本願発明の効果について 本願明細書等の記載を検討しても、本願発明が、引用発明、引用文献１～１４に記載された事項、及び本願優先日当時の周知技術や技術常識からでは予測できない顕著な効果を奏するものとは認められない。 （５）小括 以上からみて、本願発明は、引用発明、引用文献１～１４に記載された事項、及び本願優先日当時の引周知技術や技術常識に基づいて、当業者が容易になし得たものである。 ７ 請求人の主張について （１）審判請求書での主張について ア 請求人は、本件補正後の請求項１では、工程（ａ）において、低接着プレートを用いた接着培養において培養することが規定されているところ、血液由来細胞は浮遊培養することが周知慣用であったことからみて、それを接着培養に変更する動機付けはない旨、また、引用文献４におけるＣＤ３４＋末梢血幹細胞は患者由来の細胞であるところ、本件補正後の請求項１においては、健常なヒト被験体であることが規定されており相違点１は容易に想到できるものではない旨を主張する。 しかし、上記主張は、本件補正が適法であることを前提になされたものであるところ、上記第２のとおり、本件補正は却下されているので、上記主張アは、採用できない。 イ 請求人は、臍帯血始原細胞からｉＰＳ細胞を製造する引用文献２の知見を、末梢血を使用する場合にそのまま当てはめることはできず、相違点１は容易に想到できるものではないと主張する。 しかし、引用文献２に記載されたＣＤ３４＋臍帯血前駆細胞と、引用発明の末梢血に由来するＣＤ３４＋造血前駆細胞とは、いずれもＣＤ３４＋前駆細胞である点で共通するし、引用文献２以外にも、引用文献４で「外的に加えられる因子で動員されていない」ＣＤ３４＋造血始原細胞からｉＰＳ細胞を作製することが記載され、引用文献５～７より、Ｇ－ＣＳＦなどの因子で動員されていない末梢血からＣＤ３４＋造血始原細胞を単離する方法が、本願優先日前に当業者に広く知られているので、引用発明のｉＰＳ細胞の作製方法において、末梢血由来の非動員の細胞を用いることに格別の創意を要するとは認められない。 したがって、上記主張イは、採用できない。 ウ 請求人は、本願発明において、外的因子で動員されていない少量の細胞を出発細胞として使用し、かつ染色体に組み込まれるベクターと比較した場合には初期化の達成が困難と考えらえるエピソーマルベクターを用いてｉＰＳ細胞を製造できることが実証されたところ、本願発明で実証された事実は、当業者には全く予想外の知見であると主張する。 しかし、本願明細書等には、外的因子で動員されていないＣＤ３４＋造血始原細胞からｉＰＳ細胞を作製した実施例は実施例１１のみであるところ、当該実施例１１で使用されているベクターはＭＭＬＶレトロウイルスベクターであって（【０３５７】～【０３６０】）、エピソーマルベクターではないから、外的因子で動員されていない少量の細胞を出発細胞として使用し、エピソーマルベクターを用いてｉＰＳ細胞を製造できることが本願発明で実証されたとの主張は、そもそも、本願明細書等の記載に基づくものとはいえない。 もっとも、上記主張が本願明細書等の記載に基づくものであるとしても、末梢血由来の非動員の細胞とエピソーマルベクターの両者を用いることによる効果が全くの予想外であることは、実施例１１の実験結果及び令和４年５月２４日付け意見書に添付された参考資料をみても確認できない。 したがって、上記主張ウは、採用できない。 エ 請求人は、エピソーマルベクターを使用する場合には初期化の効率は低下することが予想されることから、細胞数が少なくなることが想定される「外的因子で動員されていない細胞」を使用することには大きな阻害要因があり、本願発明は引用文献から容易想到であるとはいえないと主張する。 しかし、引用文献５には、１００ｍlの末梢血から１０４～１０５の非動員ＣＤ３４＋細胞を得ることができること（摘記事項（５ア））が記載され、末梢血由来の非動員の細胞を用いた場合、ｉＰＳ細胞の作製に支障が生じるほどにＣＤ３４＋細胞の数が少なくなることは確認できない。また、末梢血由来の非動員の細胞を用いることでＣＤ３４＋細胞の数が幾分少なくなったとしても、ヒト被験体から採取する血液量を増やせば（採血１回分の量を増やす、同一人から複数回採血する等）、得られるＣＤ３４＋細胞の細胞数を増やすことは可能であるといえる。 そうすると、引用発明で、エピソーマルベクターと末梢血由来の非動員の細胞を組み合わせることに阻害事由があるとは認められない。 したがって、上記主張エは、採用できない。 （２）令和４年５月２４日付け意見書での主張について 上記第２のとおり本件補正は却下され、上記第３の１のとおり、本願発明は、令和４年５月２４日にされた手続補正によって補正された特許請求の範囲の請求項１に係るものであるから、念のため、令和４年５月２４日付け意見書における請求人（出願人）の主な主張についても検討する。 ア 請求人は、本願発明によると、低接着条件下においてＣＤ３４＋細胞を培養することにより、ｉＰＳ細胞の産生に適したＣＤ３４＋造血始原細胞を拡大することができ、ＣＤ３４＋造血始原細胞からｉＰＳ細胞を作製することが可能になったと主張する。 しかし、本願明細書等には、低接着条件下とそのほかの条件で培養したＣＤ３４＋造血始原細胞からｉＰＳ細胞を作製して、その作製効率等を比較した実験結果は示されていないので、上記主張アは本願明細書等の記載に基づかないものである。 また、上記６（３）で検討したとおり、本願発明において、「ＣＤ３４＋造血始原細胞の集団を増大させる」こと、及び、「低接着条件下でｉｎ ｖｉｔｒｏで培養」することという特定は、上記６（３）で示した本願優先日当時の技術常識１及び２に照らすと、「ＣＤ３４＋造血始原細胞」の培養を、「浮遊培養」で行うことを意味するものに過ぎないので、上記主張アの効果が、当業者の予測を超えるものとは認められない。 したがって、上記主張アは、採用できない。 イ 請求人は、本願発明によると、ＣＤ３４＋造血前駆細胞とｉＰＳ細胞の間の接着性の差異を利用して、リプログラミング後にｉＰＳ細胞のみを効率的に分別することができると主張する。 しかし、接着性を示すｉＰＳ細胞と、接着性を示さないＣＤ３４＋造血始原細胞との分別が容易になるという効果は、本願発明によらずとも、当業者が認識できるものであり、格別なものではない。 したがって、上記主張イは、採用できない。 ウ 相違点１に関する請求人の主張について （ア）請求人は、参考資料２（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ（１９９７）Ｖｏｌ．９７，ｐ．１４６～１５２）に、Ｇ－ＣＳＦ動員によりＣＤ３４＋細胞のアポトーシスが抑制されることが記載され、参考資料３（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ（１９９４）Ｖｏｌ．４０，ｐ．１０～１８）に、非動員末梢血から得られるＣＤ３４＋細胞の数は極めて少ないことが記載されていることから、得られるＣＤ３４＋細胞が少なくなる非動員の末梢血を引用文献１に採用する動機付けはないと主張する。 しかし、参考資料２はＧ－ＣＳＦにより動員されていないＣＤ３４＋細胞はアポトーシスにより死滅してしまうことまでを記載した文献ではなく、動員されたＣＤ３４＋細胞はアポトーシス性が低いことを示すにとどまるものである。また、参考資料３も、非動員末梢血から得られるＣＤ３４＋細胞が、動員末梢血よりも少ないことを示すに過ぎないものであり、参考資料２、３が、末梢血由来の非動員の細胞を用いた場合、ｉＰＳ細胞の作製に支障が生じるほどにＣＤ３４＋細胞の数が少なくなることを実証するものであるとは認められない。 さらに、末梢血由来の非動員の細胞を用いることでＣＤ３４＋細胞の数が幾分少なくなっても、ヒト被験体から採取する血液量を増やせば、得られるＣＤ３４＋細胞の細胞数を増やすことは可能なので、引用発明で、末梢血由来の非動員の細胞を使用することに阻害事由があったとはいえない。 したがって、上記主張（ア）は、採用できない。 （イ）請求人は、当業者であれば、Ｇ－ＣＳＦのデメリットを解消するために、非動員の末梢血を用いる方法を採用するよりも、むしろ引用文献８に記載されているＡＭＤ３１００など他の動員剤の使用を考えるはずであると主張する。 しかし、上記６（１）で示したとおり、動員剤の使用には副作用等の問題が想定されるので、かかる問題に着目すれば、当業者は別の動員剤の使用を検討するより、動員剤自体の使用を回避することを動機づけられるといえる。 したがって、上記主張（イ）は、採用できない。 （ウ）請求人は、参考資料４（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．（２００９）Ｖｏｌ．１６，ｐ．３５～４０）に、Ｇ－ＣＳＦの動員の有無でＣＤ３４＋細胞の生物学的な性質が異なることが記載され、リプログラミングに影響を及ぼすことが考えられるため、リプログラミング効率を変化させる可能性のある非動員末梢血細胞を引用発明に採用する動機付けがないと主張する。 しかし、参考資料４を参照しても、Ｇ－ＣＳＦによる動員が無いことで、ｉＰＳ細胞の作製に支障が生じるほどに、ＣＤ３４＋細胞の生物学的な性質に相違が生じ、リプログラミング効率に影響を与えることは記載されていないので、参考資料４が、引用発明で、末梢血由来の非動員の細胞を使用することを躊躇させるに足りるものであるとは認められない。 したがって、上記主張（ウ）は、採用できない。 ８ むすび 以上のとおりであるから、本願発明は、引用文献１～１４に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであり、特許法２９条２項の規定により特許を受けることができないので、本願は、その余の請求項について論及するまでもなく、拒絶すべきものである。 よって、結論のとおり審決する。