2022-013175

ア 引用文献１及びその記載事項

原査定の拒絶の理由で引用された、本願の出願前に頒布された又は電気通信回線を通じて公衆に利用可能となった引用文献１の韓国公開特許第１０－２０１９－００６９３０１号公報には、次の記載がある。

なお、引用文献１は韓国語で記載されているため、当審合議体による訳文にて摘記する。また、「・・・」は摘記の省略を示す。

（ア）「請求範囲

請求項１

幹細胞由来のエクソソームを有効成分として含む、敏感性皮膚の予防、抑制、緩和又は改善用組成物。

請求項２

第１項において、

上記幹細胞由来のエクソソームが皮膚で酸化ストレスを減少させる、敏感性皮膚の予防、抑制、緩和又は改善用組成物。」

（イ）「技術分野

[0001] 本発明は、幹細胞由来のエクソソームを有効成分として含む新しい敏感性皮膚の予防、抑制、緩和又は改善用組成物に関するものである。

[0002] また、本発明は、上記組成物を含む敏感性皮膚の予防、抑制、緩和又は改善用機能性化粧料組成物及び皮膚外用剤に関するものである。

背景技術

続きを表示（全14行）

[0003] 外部成分や環境変化などに過敏な反応を示す皮膚を敏感性皮膚という。一般的に、敏感性皮膚とは大部分の人々には問題にならない物質に特異的に反応して皮膚トラブルを起こしやすい皮膚、皮膚障壁機能が低下していてアレルギー性物質や刺激性物質に体質的に敏感な皮膚、睡眠不足、過労、生理、季節の変り目、精神的なストレスなどによって皮膚本来の抵抗力又は皮膚の生理機能が弱くなるときに、刺激物質に対して一時的に皮膚トラブルが起きやすい皮膚などを意味する。場合によっては敏感性皮膚を平均的集団に比べて接触性刺激やアレルギー反応をさらによく示す皮膚と定義することもある。

[0004] 皮膚状態が敏感になる要因としては、皮膚障壁機能の低下、皮膚刺激臨界値の低下、皮膚の乾燥、物理化学的刺激、ストレス、体調、季節変化、紫外線、生理などを挙げることができる。また、誤った皮膚管理によって皮膚を敏感にさせるか、心理的不安により皮膚を敏感にさせる場合もある。

[0005] 一般的に敏感性皮膚保有者は、紅斑、皮膚乾燥、肌荒れ、暖かさ、痒みなどを訴える。敏感性皮膚の改善のための皮膚用化粧品は、刺激を起こす余地がある物質を前もって除去して副作用を最小化している。より積極的な方法として最近開発された機能性化粧品や医薬部外品は、サイトカイン及び炎症媒介物質の発現抑制、皮膚障壁強化機能などを通じて敏感性皮膚を改善している。

[0006] しかしながら、サイトカインの調節及び炎症媒介分子の発現抑制のために効果的な非ステロイド系抗癌剤、ステロイド系抗癌剤、神経ペプチド拮抗剤、ＣＯＸ抑制剤等は、副作用が深刻で、化粧料に配合する場合、安定性側面で問題がある。このような問題点を勘案して天然物を原料にする敏感性皮膚改善用の皮膚外用剤や化粧料組成物に対する研究が活発である。例えば、スイカ内皮抽出物、インド乳香レジン抽出物、ラベンダー抽出物、黒豆抽出物、ヒジキ抽出物などを使用して敏感性皮膚を改善しようとする努力がある。

[0007] しかし、このような天然物を原料とする敏感性皮膚改善用化粧品の場合、天然抽出物内の有効成分含量が少ない関係で、敏感性皮膚の実質的な改善のためには多くの量の使用が必要であり、これらの大部分は、天然物素材という点をマーケティングに活用しているだけで、敏感性皮膚改善の実質的効能に対しては科学的研究がさらに必要な状況である。

[0008] 一方、最近、細胞分泌物（ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）に細胞の行動（ｂｅｈａｖｉｏｒ）を調節する多様な生体活性因子が含まれているという研究が報告されており、特に細胞分泌物内には細胞の間信号伝達機能を有する‘エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）’が含まれていて、その成分と機能に対する研究が活発に進行中である。

[0009] 細胞は、細胞の外環境に多様な膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）類型の小胞体を放出するが、通常このような放出小胞体を細胞の外小胞体（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ、ＥＶ）と呼んでいる。細胞の外小胞体は、細胞膜由来小胞体、エクトソーム（ｅｃｔｏｓｏｍｅｓ）、シェディング小胞体（ｓｈｅｄｄｉｎｇ ｖｅｓｉｃｌｅｓ）、マイクロパーティクル（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、エクソソームなどと呼ばれ、場合によってはエクソソームとは区別されて使われたりする。

[0010] エクソソームは、細胞膜の構造と等しい二重リン脂質膜からなる数十ないし数百ナノメートルサイズの小胞体として内部にエクソソームカーゴ（ｃａｒｇｏ）と呼ばれるタンパク質、核酸（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）などが含まれている。エクソソームカーゴには、広範囲な信号伝達要素（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ）が含まれ、これら信号伝達要素は細胞タイプに特異的で分泌細胞の環境によって相違するように調節されることが知られている。エクソソームは、細胞が分泌する細胞の間信号伝達媒介体としてこれを通じて伝達された多様な細胞信号は標的細胞の活性化、成長、移動、分化、脱分化、死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）、壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）を含んだ細胞行動を調節することが知られている。エクソソームは、由来した細胞の性質及び状態によって特異的な誘電物質と生体活性因子が含まれている。増殖する幹細胞由来エクソソームの場合、細胞の移動、増殖及び分化のような細胞行動を調節して、組織再生と関わる幹細胞の特性が反映されている（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００２（２） ５６９－５７９）。

[0011] しかしながら、エクソソームを利用した特定疾患の治療に対する可能性の提示など多様な研究が行われているにもかかわらず、エクソソームを安定的に維持・保管することができる新しい剤形開発と、エクソソームの使用便宜性及び効能増大などのための多様な医療あるいは美容技術との繋がりは、相対的に注目されていない。

[0012] 本発明者らは、人体に副作用がなく、化粧料配合時安定性問題を解決することができる、新しい敏感性皮膚改善物質を開発しようと努力した。よって、本発明者らは、幹細胞に由来するエクソソームが敏感性皮膚の予防、抑制、緩和または改善に効果的であることを確認し、本発明を完成した。」

（ウ）「解決しようとする課題

[0015] 本発明の目的は、幹細胞由来のエクソソームを有効成分として含む、新しい敏感性皮膚の予防、抑制、緩和又は改善用組成物を提供することにある。

[0016] また、本発明の目的は、前記組成物を含む敏感性皮膚の予防、抑制、緩和または改善用機能性化粧料組成物及び皮膚外用剤を提供することにある。

・・・

課題の解決手段

[0019] 上記のような目的を達成するために、本発明は、幹細胞由来のエクソソームを有効成分として含む、敏感性皮膚の予防、抑制、緩和又は改善用組成物を提供する。

・・・

[0021] 一方、本明細書で使用された“エクソソーム”という用語は、幹細胞から分泌され、細胞の外空間に放出されたナノサイズのベシクル構造を有しており、エクソソームと類似する組成を有するベシクル（例えば、エクソソーム－類似ベシクル）を全て含むことを意味する。上記幹細胞の種類は制限されないが、本発明を限定しない一つの例示として、望ましくは間葉系幹細胞、例えば、脂肪、骨髄、臍帯又は臍帯血由来の幹細胞であることができ、より望ましくは、脂肪由来幹細胞であることができる。上記脂肪由来幹細胞の種類は、病原体による感染の危険がなく、免疫拒否反応を起こさないならば、制限されないが、望ましくはヒト脂肪由来幹細胞であることができる。」

（エ）「発明の効果

[0057] 本発明の敏感性皮膚の予防、抑制、緩和又は改善用組成物は、敏感性皮膚関連サイトカインの発現又は生成を減少させ、酸化ストレスを予防または抑制し、敏感性皮膚を効果的に予防、抑制、緩和又は改善することができる。また、本発明の敏感性皮膚の予防、抑制、緩和又は改善用組成物を人の皮膚に直接適用した場合、敏感性皮膚と関わる皮膚トラブル、紅潮症状及び紅斑などを著しく緩和あるいは改善させることができる。

[0058] よって、本発明の敏感性皮膚の予防、抑制、緩和又は改善用組成物は、敏感性皮膚の予防、抑制、緩和又は改善用皮膚外用剤及び機能性化粧料組成物として有用に使われることができる。」

（オ）「0065] 実施例１： 細胞の培養

・・・

[0067] ヒト皮膚線維芽細胞（ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）であるＨＳ６８細胞は、ＡＴＣＣから購入し、１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃで購入）及び１％抗生剤－抗真菌剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ－ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓ：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）が含有されたＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃで購入）培地で、５％ＣＯ２、３７℃の条件で継代培養した。

[0068] 当該発明が属する技術分野に知られた細胞培養方法によって、５％ＣＯ２、３７℃の条件で脂肪由来幹細胞を培養した。その後、リン酸塩緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）で洗浄後、無血清、無フェノールレッド培地と入れ替えて、１日ないし１０日間培養し、その上清液（以下、培養液）を回収した。

続きを表示（全15行）

[0069] エクソソームの分離過程で粒径分布が均一で純度が高いエクソソームを取得するために、培養液にトレハロースを２重量％添加した。トレハロースを添加した後、培養液を０．２２μｍフィルターで濾過して細胞残骸物、老廃物及び巨大粒子などの不純物を除去した。濾過された培養液は直ちに分離過程を通じてエクソソームを分離した。また、濾過された培養液は冷蔵庫（零度以上１０℃以下）で保管した後、エクソソーム分離に使用した。また、濾過された培養液は－６０℃以下の超低温冷凍庫で凍結保管してから解凍させた後、エクソソーム分離を実行した。以後、培養液から接線流濾過装置（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ；ＴＦＦ）を用いてエクソソームを分離した。

[0071] 実施例２： ＴＦＦ方法によるエクソソームの分離及び錠剤

[0072] 実施例１から０．２２μｍフィルターに濾過された培養液からエクソソームを分離、濃縮、脱塩とバッファー交換（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）のためにＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）方法を用いた。ＴＦＦ方法のためのフィルターではカートリッジフィルター（ｃａｒｔｒｉｄｇｅ ｆｉｌｔｅｒ、別名ｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ ｆｉｌｔｅｒ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入）又はカセットフィルター（ｃａｓｓｅｔｔｅ ｆｉｌｔｅｒ；Ｐａｌｌ又はＳａｒｔｏｒｉｕｓ又はＭｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入）を用いた。ＴＦＦフィルターは多様な分子量遮断（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ；ＭＷＣＯ）によって選択されうる。選択されたＭＷＣＯによって選別的にエクソソームを分離、濃縮し、ＭＷＣＯより小さな粒子やタンパク質、地質、核酸、低分子化合物などは除去した。

[0073] エクソソームを分離、濃縮するために、ＭＷＣＯ１００，０００Ｄａ（Ｄａｌｔｏｎ）、３００，０００Ｄａ、または５００，０００ＤａのＴＦＦフィルターを使用した。 培養液をＴＦＦ方法を利用して１／１００ないし１／２５程度の体積になるまで濃縮しながら、ＭＷＣＯより小さな物質は除去してエクソソームを分離した。

[0074] 分離、濃縮されたエクソソーム溶液は、ＴＦＦ方法を利用して追加で脱塩とバッファー交換（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を実行した。

・・・

[0108] 実施例８： 過酸化水素による酸化ストレスの予防効果

[0109] ヒト皮膚線維芽細胞であるＨＤＦ細胞を１２ウェルプレート（１２－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）の各ウェルに６．５×１０４細胞の密度で分注した。無血清培地に希釈した本発明の１具体例のエクソソーム（実施例２で準備されたエクソソーム）を濃度別に処理して２２時間の間培養した。その後、１ｍＭの過酸化水素（Ｓｉｇｍａから購入）を追加処理して２時間の間培養した。

[0110] 本発明の１具体例のエクソソームが過酸化水素によって誘導された酸化ストレスによる細胞死滅を防止することができるか確認するために、フローサイトメーター（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を利用して次のようにＨＤＦ細胞生残率を測定した。先に培養培地を除去してＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）（Ｇｉｂｃｏから購入）１ｍＬで洗浄した後、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏから購入）１５０μＬを入れて３７℃、５％ＣＯ２培養基で４分間静置した。以後培養培地４５０μＬを入れて細胞を懸濁させた後、１，５００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清液を除去してＤＰＢＳ５００μＬで２回洗浄した後、１ＸアネキシンＶバインディングバッファー（ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（ＢＤから購入）２５μＬを利用して細胞を懸濁した。懸濁された細胞サンプルあたり２５μＬの１ＸアネキシンＶバインディングバッファー、ＦＩＴＣアネキシンＶ（ＢＤから購入）及びＰＩ染色溶液（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ＢＤから購入）混合液を入れて室温で１５分間、暗反応した。サンプルあたり１ＸアネキシンＶバインディングバッファー１５０μＬを入れてフローサイトメーター（ＮｏｖｏＣｙｔｅ）で細胞死滅の程度を測定した。

[0111] その結果、本発明の１具体例のエクソソーム共に処理された群で過酸化水素によって誘導された酸化ストレスによる細胞死滅が著しく減少することを確認した（図１４及び図１５）。このような実験結果は、本発明の１具体例のエクソソームを含む組成物が抗酸化ストレス効果があり、酸化ストレスによって発生する敏感性皮膚を抑制、緩和あるいは改善することができることを強力に示唆する。

[0112] よって、本発明の１具体例のエクソソームを有効成分で含む組成物は酸化ストレスを予防あるいは抑制する効果があることが分かり、敏感性皮膚の予防、抑制、緩和又は改善において優れた効果を示すといえる。」

（カ）「図１４

［図：0001407185000001.jpg］

図１５

［図：0001407185000002.jpg］

」

イ 引用文献１に記載された発明

引用文献１は、幹細胞由来のエクソソームを有効成分として含む、新しい敏感性皮膚の予防、抑制、緩和又は改善用組成物に関する文献であり（摘記（イ））、摘記（ア）には、請求項１を引用する請求項２に係る発明として、幹細胞由来のエクソソームを有効成分として含み、該幹細胞由来のエクソソームが皮膚で酸化ストレスを減少させる、敏感性皮膚の予防、抑制、緩和又は改善用組成物の発明が記載され、摘記（オ）に記載されるとおり、対応する具体例によって、エクソソームが過酸化水素によって誘導された酸化ストレスによる細胞死滅を防止することができるか確認するために、ＨＤＦ細胞生残率を測定し、その結果として、エクソソーム共に処理された群で過酸化水素によって誘導された酸化ストレスによる細胞死滅が著しく減少することを確認し（図１４及び図１５）（摘記（カ））、１具体例のエクソソームを含む組成物が抗酸化ストレス効果があり、酸化ストレスによって発生する敏感性皮膚を抑制、緩和あるいは改善することができることが示されている。

そうすると、引用文献１には、次の発明（以下「引用発明」という。）が記載されていると認められる。

「幹細胞由来のエクソソームを有効成分として含み、該幹細胞由来のエクソソームが皮膚で酸化ストレスを減少させる、敏感性皮膚の予防、抑制、緩和又は改善用組成物。」